Valutazione della migrazione delle cellule endoteliali dopo l'esposizione a sostanze chimiche tossiche

L'obiettivo generale del seguente esperimento è esaminare l'influenza di sostanze chimiche tossiche sulla migrazione delle cellule endoteliali utilizzando diversi saggi di migrazione. In primo luogo, viene dimostrato nel prossimo esperimento l'utilizzo di un saggio modificato con camera di evitamento per esaminare la chemocinesi delle cellule endoteliali esposte. Un saggio di guarigione della ferita viene combinato con il tracciamento cellulare per fornire ulteriori informazioni approfondite sulla dinamica della migrazione cellulare.

Nel saggio finale, viene dimostrata l'indagine sul potenziale della membrana mitocondriale al fine di identificare i meccanismi alla base del deficit nella migrazione delle cellule endoteliali. In definitiva, questi saggi di migrazione possono essere utilizzati per valutare gli effetti di agenti alchilanti altamente tossici sul potenziale della membrana mitocondriale e sulla migrazione delle cellule endoteliali. I metodi descritti possono contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo dei disturbi della guarigione delle ferite indotti da sostanze chimiche altamente tossiche. Dimostreranno le procedure Ramat, Voer e Stefan Miller, tutti tecnici del mio laboratorio. Per preparare le provette per colture cellulari, iniziare aggiungendo un volume sufficiente di gelatina appena preparata, in quantità tale da coprire appena il fondo di una provetta sterile per colture cellulari.

Posizionare il matraccio in un'incubatrice per colture cellulari per almeno 30 minuti. Quindi rimuovere la soluzione di gelatina residua e trasferire le cellule endoteliali precoci derivate da cellule staminali embrionali o EEC in quantità sufficiente di mezzo di coltura per coltivare le cellule fino a raggiungere l'80% di confluenza quando le cellule hanno raggiunto la subconfluenza. Rimuovere il mezzo, lavare le cellule con PBS e incubarle in un millilitro di Accutase per ogni 25 centimetri quadrati da due a dieci minuti.

Quando le cellule si sono staccate, suddividerle in rapporto uno a cinque in mezzo fresco per l'analisi della migrazione delle cellule endoteliali mediante saggio in camera di Boyden. Pre-trattare, i filtri inseriti con 500 microlitri di gelatina 0,1% appena preparata. Dopo aver raccolto le EEC come appena illustrato, contare le cellule e aggiungere 500 microlitri di mezzo di coltura cellulare nei compartimenti inferiori della camera di Boyden.

Successivamente, aggiungere esattamente una volta 10 alla quarta EEC in 500 microlitri di mezzo a ciascun filtro. Dopo aver eliminato eventuali bolle d'aria, posizionare la camera di Boyden nell'incubatore per esattamente otto ore. Al termine dell'incubazione, risciacquare i filtri una volta con PBS.

Quindi fissare le cellule aggiungendo 0,5 millilitri di paraformaldeide al 4% in entrambi i compartimenti dopo 20 minuti. Lavare i filtri almeno tre volte con PBS 0,1 molare ed escindere le membrane con il bisturi. Utilizzare un mezzo di montaggio supplementato con DPI per montare ciascuna membrana tra due coprioggetti di vetro.

Prestare attenzione all'orientamento dei filtri. Quindi utilizzare un microscopio a fluorescenza con un'ingrandimento di 400 x per contare solo le cellule che si sono migrate verso il compartimento inferiore, avendo cura di non confondere i pori con le cellule in migrazione.

Per avviare il saggio di guarigione della ferita, staccare manualmente le cellule da una piastra di coltura EEC all'80% di confluenza, spingendo delicatamente una punta sterile da 10 microlitri attraverso la superficie della coltura lungo una linea retta e uniforme da un lato all'altro della piastra. Lavare la piastra due volte con PBS 0,1 molare per rimuovere le cellule staccate. Quindi aggiungere al contenitore di coltura il mezzo integrato con il composto di interesse.

Quindi montare la piastra di coltura sotto un microscopio in grado di effettuare imaging di cellule vive in condizioni di coltura cellulare e acquisire immagini in time-lapse per 24 ore a intervalli di 10 minuti, utilizzando una risoluzione di almeno 10 24 per 10 24 alla fine della sessione di imaging. Utilizzare lo strumento software appropriato per misurare l'ampiezza del gap a 0 e 24 ore al fine di eseguire un saggio di tracciamento cellulare. Importare la sequenza di immagini in ImageJ e attivare il plugin MTTrackJ per ImageJ.

Quindi, utilizzando il comando aggiungi, selezionare casualmente 10 cellule nel campo visivo per tracciare manualmente il movimento delle cellule durante il periodo di acquisizione immagini di 24 ore. Utilizzare il comando misura per visualizzare i risultati. Successivamente, utilizzare il comando video per esportare le tracce al fine di valutare il potenziale della membrana mitocondriale delle cellule dopo il trattamento con il composto sperimentale di interesse; sostituire il mezzo di coltura cellulare con due microlitri di TMRM appena preparato in un millilitro di mezzo di coltura cellulare fresco.

Medio, quindi senza lavaggio immediatamente, posizionare la piastra sotto il microscopio ed acquisire immagini delle cellule di controllo e di quelle trattate sperimentalmente senza modificare i parametri di acquisizione. Per garantire la comparabilità tra i diversi gruppi, la guarigione della ferita richiede l'angiogenesi, processo dipendente dalla migrazione delle cellule endoteliali, come illustrato dal grafico. L'esposizione delle EEC all'agente alchilante clorambucile determina una significativa riduzione della migrazione cellulare, misurata mediante il saggio della camera di Boyden. L'aggiunta dello scavenger delle specie reattive dell'ossigeno (ROS), acido alfa-linolenico, immediatamente dopo 24 ore di esposizione al clorambucile, recupera in modo significativo il fenotipo quasi ai livelli del controllo.

L'assay della camera di Boyden, tuttavia, non fornisce informazioni sul comportamento migratorio delle cellule in questo saggio rappresentativo di ferita e guarigione. Le EEC non esposte sono state in grado di chiudere lo spazio entro 24 ore, mentre le EEC trattate con clorambucile non lo sono state. Inoltre, il tracciamento delle singole EEC ha rivelato che le cellule esposte al clorambucile mostravano un movimento minimo, che è stato ripristinato dopo il trattamento con lo scavenger di ROS.

In effetti, le EEC esposte al clorambucil mostrano una perdita del potenziale di membrana mitocondriale, come evidenziato dalla mancata espressione di TMRM. Il trattamento delle EEC con uno scavenger delle ROS, tuttavia, ha prevenuto questo danno mitocondriale, mantenendo il loro potenziale di membrana mitocondriale. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come analizzare la migrazione di cellule endoteliali alterate chimicamente utilizzando un saggio modificato nel punto della camera mediante un saggio di guarigione della ferita da graffio e di come valutare il loro potenziale di membrana mitocondriale.