Hybrid Imaging μCT-FMT e analisi delle immagini

La tomografia mediata da fluorescenza è una tecnica di imaging altamente sensibile per valutare quantitativamente la distribuzione della fluorescenza. In topi anestetizzati, sono disponibili molte sonde fluorescenti mirate, che permettono l'imaging di angiogenesi, apoptosi, infiammazione e altri processi. In questo filmato, mostreremo come viene eseguita presso il nostro istituto l'imaging ibrido con FMT e Micro City.

Nel capitolo uno, i dispositivi, questo è il nostro F-M-T-F-M-T che sta per tomografia molecolare a fluorescenza. Tomografia significa che vengono generate immagini tridimensionali. La TMT è altamente sensibile per l'imaging della fluorescenza intrinseca nei topi.

Ora il pannello frontale è aperto per mostrare l'interno del FMT. In basso è montato un laser su un servomotore 2D. Il laser emette luce nel topo, che viene trattenuto in un lettino per topi parzialmente trasparente.

Sopra il letto per mouse è posizionato un array di LED che funge da sorgente luminosa alternativa, consentendo alla FMT di operare come un normale dispositivo di imaging a riflettanza. La ruota portafiltri è montata sotto l'obiettivo, che cattura la luce destinata al rivelatore posto nella parte superiore del dispositivo. Questo è il nostro micro CT.

La micro CT è dotata di due tubi a raggi X e di due rilevatori a pannello piatto, che permettono l'acquisizione di scansioni a doppia energia. Capitolo due, protocollo di scansione micro CT FMT. Sia la FMT che la micro CT sono progettate per acquisire immagini di topi; prima dell'imaging, i topi vengono anestetizzati con isoflurano.

Per la scansione FMT, i peli del mouse devono essere rimossi, operazione che funziona bene con la crema alla senape. Alcune linee di mouse possono sviluppare eruzioni cutanee a causa della crema depilatoria. Pertanto, si raccomanda di monitorare i mouse per eventuali cambiamenti della pelle e di contattare il personale veterinario per le cure necessarie.

Inoltre, testare inizialmente la tolleranza su un piccolo lotto di qualsiasi nuova ceppa di topi. Per evitare l'ipotermia, il topo viene posizionato su un tappetino riscaldante. Per iniettare l'agente di contrasto, un catetere viene inserito nella vena della coda a causa delle ridotte dimensioni.

Questo è piuttosto difficile e richiede una certa esperienza. Se il sangue refluisce nel catetere, significa che è posizionato correttamente attraverso il catetere. È possibile iniettare agenti di contrasto fluorescenti e agenti di contrasto per TC per evitare un sovraccarico di volume.

Al massimo, devono essere iniettati cinque millilitri per chilogrammo di peso corporeo, il che corrisponde a 150 microlitri per un topo di 30 grammi. Per la scansione, il topo viene posizionato all'interno di un lettino multimodale per topi.

Alcuni simboli possono essere disegnati sulla coda del topo per l'identificazione. È importante evitare tali elementi sul tronco poiché potrebbero influire sulla scansione ottica. Il lettino per il topo viene chiuso e la profondità regolata in modo da trattenere saldamente il topo in una posizione fissa.

Stia attento e monitori la respirazione, poiché stringere troppo il letto può soffocare il topo. I topi nudi sono comunemente utilizzati nella ricerca oncologica a causa della loro immunosoppressione. Il fatto che siano privi di pelo è un effetto collaterale fortunato della mutazione genetica.

Pertanto, la laboriosa procedura di rimozione dei peli può essere omessa. Si deve verificare che il topo respiri correttamente e, se necessario, il letto del topo deve essere regolato di conseguenza. Successivamente, il letto del topo viene posizionato all'interno della micro CT.

I tubi che trasportano il gas di fluoro ISO vengono commutati per mantenere il flusso di gas all'interno del dispositivo. Successivamente, il micro C viene chiuso per attivare la schermatura ai raggi X. L'acquisizione mediante micro C inizierà soltanto se il coperchio è chiuso.

Utilizzando i pulsanti del micro CT, il mouse può essere posizionato all'interno del micro CT. Sul computer di controllo del micro CT, viene acquisito un topogramma e visualizzato; le impostazioni di finestramento vengono regolate per visualizzare meglio il mouse. È possibile posizionare una o più scansioni ZUP. La loro posizione è indicata dalle aree di colore azzurro chiaro.

Di solito sono sufficienti da uno a tre scansioni ZUP. Dopo l'avvio della scansione, l'avanzamento viene mostrato mediante barre di avanzamento di colore blu scuro. La nostra micro CT a pannello piatto esegue le scansioni ZUP in modo sequenziale, a differenza della TC clinica a spirale.

Utilizzando i pulsanti, il lettino per il topo viene spostato in avanti. Nuovamente, il coperchio di schermatura viene aperto e i tubi anestetici vengono scambiati. Il supporto viene rimosso con attenzione dal lettino per il topo e il tubo anestetico viene estratto.

Questo è necessario perché l'AN e l'FMT non dipendono da questo piccolo tubo. Al contrario, la piccola camera all'interno dell'FMT viene saturata con gas anestetico. Ora il lettino per il topo, con il topo, viene portato vicino all'FMT e inserito nel computer di controllo dell'FMT.

Il campo visivo di scansione viene regolato così come la densità di campionamento. Solitamente si utilizzano circa 120 punti. La scansione inizia premendo un pulsante.

Il primo passaggio della FMT acquisisce un'immagine di illuminazione trasmessa o di eccitazione per ciascun punto sorgente laser. In questo filmato, viene mostrato in modalità avanzamento rapido. Di solito richiede circa cinque minuti.

Si può osservare che una quantità molto minore di luce attraversa il tronco superiore rispetto al tronco inferiore. Questo perché gli organi con un volume ematico relativo più elevato, come cuore, fegato e reni, si trovano prevalentemente nel tronco superiore. Il sangue è l'assorbitore principale della luce nell'infrarosso vicino.

La seconda acquisizione degli stessi punti sorgente viene eseguita con un filtro diverso, che permette il passaggio solo della luce fluorescente. Capitolo tre, olio interattivo e segmentazione. Per fondere i dati provenienti da entrambi i dispositivi, vengono utilizzati marcatori integrati nel lettino del mouse.

I marcatori sono visibili anche in un'immagine di riflessione acquisita mediante FMT. I marcatori sono in realtà semplici fori e non necessitano di essere riempiti con alcun agente fluorescente o di contrasto per TC. Nel nostro istituto, abbiamo sviluppato un programma software che esegue automaticamente la rilevazione dei marcatori e la fusione.

La forma del topo, così come le mappe di assorbimento e scattering eterogenee, viene stimata automaticamente utilizzando i dati di micro-TC come descritto nella nostra recente pubblicazione su Theranostics. Questi parametri sono importanti per la ricostruzione quantitativa della fluorescenza. Per misurare la biodistribuzione della fluorescenza, è necessaria una segmentazione degli organi.

Generiamo una tale segmentazione in modo interattivo utilizzando un software chiamato imulitic preclinical sviluppato presso il nostro istituto, come descritto di seguito. Una tale segmentazione è mostrata in avanzamento rapido e una persona esperta può eseguirla in circa da 10 a 20 minuti. Innanzitutto, viene caricato il set di dati TC.

È possibile esaminarlo in 3D utilizzando una rappresentazione della superficie ISO. Modificando le impostazioni di windowing, si può cambiare il valore ISO. Ad esempio, per visualizzare le ossa dell'intero corpo del mouse insieme al lettino per mouse, viene caricato l'overlay.

Il segnale per questo esempio appare nella vescica. Ora la visualizzazione sovrapposta è disattivata. Per concentrarsi sulla segmentazione anatomica.

Nelle scansioni microt nativas, il polmone è facilmente individuabile grazie al forte contrasto negativo rispetto agli altri tessuti molli. La struttura più grande all'interno del polmone è il cuore. Segmentiamo prima il polmone.

Tutti i voxel al di sotto di un certo valore vengono segmentati mediante sogliatura. Questo appare in verde. Il polmone è una regione connessa, che può essere separata utilizzando un'operazione di riempimento.

Simile al secchio della vernice in un programma di grafica, può essere separato dal polmone mediante taglio e riempimento. Organi convessi, come la vescica, possono essere segmentati disegnando scarabocchi per delineare i bordi dell'organo.

Vengono aggiunti ulteriori scarabocchi finché non si raggiunge un'accuratezza sufficiente. Organi non convessi, come l'intestino, possono essere segmentati pezzo per pezzo. Il fegato appare come una regione omogenea e ha una struttura più complessa.

Essendo composto da più lobi, il segmento può essere salvato su disco e caricato nel programma. Utilizzando tale segmentazione, il segnale fluorescente può essere assegnato agli organi. Il programma calcola queste quantità e le salva come un foglio aggiuntivo per scansioni longitudinali; poiché gli intervalli sono solitamente troppo lunghi per mantenere il topo anestetizzato in una posizione fissa, la segmentazione deve essere eseguita nuovamente per ciascun punto temporale.

Pertanto, la segmentazione è un compito laborioso se sono coinvolti molti topi e molti punti temporali. Per quantificare i risultati, caricare un overlay e una segmentazione. Fare clic su Imposta impostazioni batch per consentire al programma di ricordare le impostazioni correnti.

Ora, fare clic su statistiche per batch per indicare al programma di calcolare i valori per tutte le regioni in tutte le scansioni micro CT FMT. Questa operazione richiederà alcuni secondi. Successivamente, le statistiche verranno salvate in un unico file di foglio elettronico.

Questo è comodo perché l'utente non deve unire personalmente dozzine di file. A partire da questo file, è possibile calcolare le curve dell'organo. Capitolo quattro, risultati rappresentativi.

Per verificare che la fusione funzioni correttamente, abbiamo utilizzato un fantoccio aros. È stata aggiunta una polvere di ossido di titanio per generare scattering. Per ottenere una forma irregolare, abbiamo asportato alcune parti.

Sono state incorporate nel fantoccio diverse piccole inclusioni riempite con agente di contrasto per fluorescenza e TC. Poiché la FMT non conosce la vera forma dell'oggetto e ne assume una forma semplificata, la ricostruzione non è accurata per oggetti con forme irregolari. Pertanto, abbiamo implementato un'altra ricostruzione che utilizza la forma derivata dai dati micro city.

Come si può notare, la localizzazione del segnale nel fantoccio è molto migliore. Per esaminare i dati in vivo, esaminiamo i punti temporali dell'acquisizione. Questa è la pre-acquisizione.

Ciò che vediamo è sostanzialmente solo rumore e artefatti. Se passiamo al punto temporale successivo, quello dopo l'iniezione, osserviamo un segnale molto più intenso, ma le impostazioni di finestra sono troppo rigide. Utilizzando la finestra di dialogo per la regolazione della finestra, è possibile modificare tali impostazioni.

La maggior parte del segnale si osserva nella vescica. Se passiamo al tempo successivo, 0,2 ore dopo l'iniezione, vediamo un certo segnale all'esterno del topo. Questo perché il topo ha urinato la fluorescenza sul letto del topo.

Modificando ulteriormente la finestra, possiamo osservare un segnale a livello della spina dorsale e delle ginocchia. Ora passiamo al tempo di 0,4 ore dopo l'iniezione: il segnale proveniente dall'urina è scomparso e osserviamo fluorescenza a livello della spina dorsale e delle ginocchia nei successivi punti temporali, rispettivamente a sei ore e 24 ore dopo l'iniezione. Osserviamo lo stesso fenomeno.

Ora passiamo al naso successivo. La pre-scan non mostra nulla utilizzando queste impostazioni di windowing. L'acquisizione a 15 minuti dall'iniezione mostra un segnale intenso della vescica e così via.

In questo studio, abbiamo riscontrato alte concentrazioni nella vescica urinaria subito dopo l'iniezione, come conseguenza dell'escrezione renale rapida di questa sonda. Inoltre, il segnale a livello della colonna vertebrale aumenta rapidamente e rimane relativamente stabile durante i successivi punti temporali di imaging. Capitolo cinque, conclusione.

In conclusione, mostriamo un protocollo di imaging multimodale che combina i punti di forza della fluorescenza, della tomografia molecolare e della tomografia microcomputerizzata. I dati anatomici della micro-TC consentono un miglioramento della ricostruzione fluorescente mediante l'utilizzo della forma del topo. Inoltre, risultano utili per generare segmentazioni degli organi, necessarie per estrarre misurazioni quantitative dai dati delle immagini.