Name: Misura High Throughput di extracellulare DNA di uscita e quantitativa NET Formazione in neutrofili umani In Vitro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 3 s
Description: Impara a quantificare i NET rilasciati dai neutrofili umani con saggi high throughput. Questo metodo consente di studiare i meccanismi dell'infiammazione e identificare molecole regolatorie.

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Un ringraziamento speciale al personale del laboratorio del Centro Sanitario dell'Università della Georgia per il loro continuo supporto al nostro lavoro sull'isolamento dei neutrofili umani. Questo lavoro è stato sostenuto dal fondo di avviamento del Dr. Rada fornito dall'Ufficio del Vice Presidente per la Ricerca dell'UGA.

L&#39;Institutional Review Board della Università della Georgia ha approvato lo studio soggetto umano per raccogliere sangue periferico di volontari sani (UGA # 2012-10769-06). 5,7,8 I volontari hanno firmato il modulo di consenso informato richiesto prima di prelievo di sangue. La ricerca svolta in questo articolo è in conformità con le linee guida etiche per la ricerca medica che coinvolge soggetti umani della Dichiarazione di Helsinki. 1. Isolamento di neutrofili dal sangue periferico umano (Figura 1) Nota: Ci sono diversi modi per isolare neutrofili dal sangue periferico. Il protocollo che segue fornisce una possibilità. Questo protocollo produce un gran numero di neutrofili non attivati ​​umani capaci di liberare NET dopo stimolazione esterna. Utilizzare 40 ml di sangue intero ottenuto da volontari sani mediante prelievo venoso. 7,9 <ol><li> Aliquota del sangue 20 ml in due provette da 50 ml coniche. Aggiungere 10 ml 6% destrano. Mescolare delicatamente. </li><li> Dopo 20 min di trasferimento del leucociti-rich fase superiore senza prendere i globuli rossi pellet in clean 50 ml provette coniche, e riempire con PBS sterile. </li><li> Centrifugare a 400 xg 10 min. Risospendere il pellet in 4 ml di PBS sterile. </li><li> Preparare un 5-passo gradiente di Percoll 85% -80% -75% -70% -65% in due provette da 15 ml coniche e strato 2 ml di sospensione di leucociti in cima ad ogni sfumatura. </li><li> Centrifuga 800 xg per 30 minuti con freni sbloccati. </li><li> Raccogliere tutte le cellule (neutrofili) negli strati al 75% / 80% e l&#39;interfaccia 70% / 75%. </li><li> Lavare le cellule due volte in PBS (350 xg, 10 min, RT) e contare le cellule utilizzando un emocitometro. </li></ol> 2. Misura di Cinetica di extracellulare DNA di uscita Utilizzando un micropiastre fluorimetro Nota: Questo metodo consente la misurazione delle variazioni nella fluorescenza di una membrana impermeabile DNA-binding dye indicativa di rilascio DNA su un formato micropiastra a 96 pozzetti (Figura 2). <ol><li> Preparare una sospensione di neutrofili nel terreno di coltura (HBSS +1% (v / v) di siero autologo + 5 mM di glucosio) ad una concentrazione di 2 x 10 6 cellule / ml. </li><li> Aggiungere 5 mmol / L del impermeabile tintura DNA-binding membrana. Mescolare delicatamente. </li><li> Aliquota neutrofili umani (50 pl / pozzetto) sui 96 pozzetti nero, fondo trasparente micropiastre. Assicurarsi che il terreno di coltura copre l&#39;intero fondo del pozzo. In caso contrario, toccare delicatamente la piastra sul lato. </li><li> Riscaldare i neutrofili piatto contenente per 10 minuti a 37 ° C. </li><li> Nel frattempo preparare soluzioni di stimoli al doppio della loro concentrazioni finali da utilizzare (in 37 ° C terreno di coltura caldo). Come utilizzare un controllo positivo netto neutrofili umani con 100 nM forbolo-miristato-acetato (PMA) per 4 ore a innescare il rilascio massima NET. 5,8 stimolazione PMA per 4 ore assicura rilascio massima NET mentre la formazione NET spontanea rimane bassa 5,8. </li><li> Preparare il fluorimetro micropiastra per la misurazione (4 ore, 37 ° C, 530 nm per l&#39;eccitazione e 590 nm per l&#39;emissione). &lt;/ Li&gt; <li> Stimolare neutrofili con l&#39;aggiunta di una soluzione di stimolo 50 ml a 50 sospensioni neutrofili microlitri. Utilizzare 0,5 mg / ml saponina in un pozzetto per misurare segnale di rilascio del DNA massima. </li><li> Mettere piatto in lettore e misurare le variazioni di fluorescenza per 4 ore ad ogni 2 min senza agitazione. </li><li> Per l&#39;analisi dei dati, calcolare gli aumenti normalizzati a fluorescenza nel tempo. <ol><li> Sottrarre basale fluorescenza dai valori endpoint per tutti i pozzetti compresi saponina (Figura 2A, B). Aumento della saponina fluorescenza dovrebbe essere il segnale più alto. Si è indicato come &quot;rilascio DNA massima&quot; (Figura 2A). </li><li> Calcolare le percentuali di rilascio di DNA nei campioni sconosciuti dividendo aumenti di fluorescenza dei campioni sconosciuti dal rilascio del DNA massima. </li><li> Risultati medi di repliche e li presentano come &quot;% del rilascio di DNA massima&quot; (Figura 2C). </li></ol></li></ol> 3. La quantificazione della Forma NETzione da MPO-DNA e HNE-DNA ELISA saggi Nota: Questi test modificato (MPO-DNA) o stabilito (HNE-DNA) nel nostro laboratorio di quantificare la formazione NET misurando i livelli di MPO-DNA e complessi HNE-DNA 5. <ol><li> Coat 96 pozzetti di alto vincolante capacità piastre per una notte con anticorpi di cattura (50 ml / pozzetto): anti-MPO (1: 2.000 diluizione) o anti-HNE (1: 2.000). </li><li> Lavare le piastre ELISA tre volte con PBS (200 pl / pozzetto) e bloccarli con 5% di BSA e 0,1% di albumina di siero umano per 2 ore a temperatura ambiente (200 pl / pozzetto). Lavare tre volte con PBS. </li><li> neutrofili seme su 96 pozzetti ad una densità di 100.000 cellule / pozzetto in 100 microlitri terreno di coltura, e stimolare la formazione NET. Incubare le cellule: 4 ore per i 37 ° C. </li><li> Eseguire un digestione DNasi limitata con l&#39;aggiunta di 2 U / ml DNasi per supernatanti neutrofili, mescolare bene. Tenerli a temperatura ambiente. </li><li> Arrestare il DNasi dopo 15 min con l&#39;aggiunta di 11 ml di 25 mM EGTA (concentrazione finale 2,5 mm). Mescolare bene. raccogliere supernatants in tubi microcentrifuga pulite. campioni Spin per sbarazzarsi di detriti cellulari a 300 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. Trasferire le loro surnatanti in tubi microcentrifuga pulito. Tenerli in ghiaccio fino al momento. </li><li> Utilizzare una aliquota di un preparato in precedenza &quot;standard NET&quot;. Nota: Il NET-standard è un mix di surnatanti DNasi-digerito di neutrofili PMA-stimolati ottenuti da almeno 5 diversi donatori umani indipendenti. <ol><li> Per utilizzare lo stesso standard per lungo tempo, raccogliere e un&#39;aliquota un grande volume di surnatanti neutrofili dal singolo donatore. Raccolta per esempio 2 ml di surnatanti DNasi-digerito di neutrofili PMA-stimolati si tradurrà in 200 aliquote (10 ml ciascuno) sufficienti per 200 piastre ELISA. Dati che caratterizzano lo standard NET si trovano in figura 5. </li><li> Stimolare neutrofili umani con 100 nM PMA per 4 ore e applicare DNasi digerire ai loro surnatanti secondo passi 3.4-3.5. </li><li> Raccogliere, piscina, aliquota (10 ml) e la connessionesurnatanti ze (-20 ° C) dei neutrofili. </li><li> Per preparare il &quot;NET-standard&quot;, disgelo un&#39;aliquota / donatore ottenuto da almeno cinque donatori separati, mescolarli e tenerli in ghiaccio. </li><li> Eliminare i campioni scongelati e usare quelli freschi per il prossimo esperimento. </li><li> Preparare una diluizione 1: 2 di serie del NET standard in PBS + EGTA. </li></ol></li><li> Diluire i campioni DNase1-digerite (standard e supernatanti sconosciuti) 20 volte in PBS + EGTA e li aliquota su piastre ELISA rivestiti con anticorpi di cattura. </li><li> Incubare le piastre ELISA per tutta la notte a 4 ° C e lavarli tre volte con PBS. </li><li> Applicare la soluzione anticorpo di rilevazione (100 l / pozzetto): perossidasi di rafano coniugato anticorpo anti-DNA (1: 500, mouse). Incubare per 1 ora al buio. </li><li> Dopo quattro lavaggi con PBS aggiungere TMB substrato della perossidasi: 100 ml / pozzetto, 30 min. Colorazione blu è un&#39;indicazione per l&#39;attività perossidasi (NET presenti). </li><li> Arrestare reazione aggiungendo 100 microlitri / pozzetto 1 M HCl. IlLe soluzioni blu si accende di colore giallo (Figura 5A). </li><li> Leggere l&#39;assorbanza a 450 nm con un fotometro per micropiastre. </li><li> Per l&#39;analisi dei dati, calcolare la quantità di MPO-DNA o complessi HNE-DNA rispetto allo standard NET. <ol><li> Sottrarre il valore di densità ottica sfondo del terreno di coltura da tutti i campioni. </li><li> Tracciare i valori di assorbanza (asse X) dei campioni di riferimento diluiti contro il loro contenuto netto relativa (asse Y) (Figura 5A). </li><li> Utilizzando la gamma insaturi di questa curva standard stabilire una linea di tendenza (usare soluzione migliore esponenziale dal software utilizzato) (Figura 5A). L&#39;equazione di questa linea di tendenza determina la conversione dei valori di DO per quantitativi quantità di reti. </li><li> Inserire i valori OD misurati dei incognite nell&#39;equazione trend-line da 3.13.3 che darà la quantità di reti nel campione sconosciuto come percentuale del prezzo netto standard (Figura 5A). </li><li> Calcolaremedie di repliche (triplicato) e presentare i dati finali come &quot;quantità di MPO-DNA o complessi HNE-DNA (% del campione)&quot; (figura 5c). </li></ol></li></ol>

<ol><li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303, 1532-1535 (2004).</li>
<li>Fuchs, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+cell+death+program+leads+to+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps.</a> J Cell Biol. 176, 231-241 (2007).</li>
<li>Kessenbrock, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Netting+neutrophils+in+autoimmune+small-vessel+vasculitis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Netting neutrophils in autoimmune small-vessel vasculitis.</a> Nat Med. 15, 623-625 (2009).</li>
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<li>Yoo, D. G., Floyd, M., Winn, M., Moskowitz, S. M., Rada, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NET+formation+induced+by+Pseudomonas+aeruginosa+cystic+fibrosis+isolates+measured+as+release+of+myeloperoxidase-DNA+and+neutrophil+elastase-DNA+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Lett%22%5BJournal%5D)">NET formation induced by Pseudomonas aeruginosa cystic fibrosis isolates measured as release of myeloperoxidase-DNA and neutrophil elastase-DNA complexes.</a> Immunol Lett. 160, 186-194 (2014).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+hypercitrullination+mediates+chromatin+decondensation+and+neutrophil+extracellular+trap+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Histone hypercitrullination mediates chromatin decondensation and neutrophil extracellular trap formation.</a> J Cell Biol. 184, 205-213 (2009).</li>
<li>Pang, L., Hayes, C. P., Buac, K., Yoo, D. G., Rada, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudogout-associated+inflammatory+calcium+pyrophosphate+dihydrate+microcrystals+induce+formation+of+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Pseudogout-associated inflammatory calcium pyrophosphate dihydrate microcrystals induce formation of neutrophil extracellular traps.</a> J Immunol. 190, 6488-6500 (2013).</li>
<li>Yoo, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Release+of+cystic+fibrosis+airway+inflammatory+markers+from+Pseudomonas+aeruginosa-stimulated+human+neutrophils+involves+NADPH+oxidase-dependent+extracellular+DNA+trap+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Release of cystic fibrosis airway inflammatory markers from Pseudomonas aeruginosa-stimulated human neutrophils involves NADPH oxidase-dependent extracellular DNA trap formation.</a> J. Immunol. 192, 4728-4738 (2014).</li>
<li>Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed,, Goosmann, U., Zychlinsky, C., A, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps%2C+how+to+generate+and+visualize+them%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps, how to generate and visualize them.</a> J. Vis. Exp. , (2010).</li>
<li>Rada, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyocyanin-enhanced+neutrophil+extracellular+trap+formation+requires+the+NADPH+oxidase%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Pyocyanin-enhanced neutrophil extracellular trap formation requires the NADPH oxidase.</a> PLoS One. 8, e54205(2013).</li>
<li>Neumann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+antimicrobial+peptide+LL-37+facilitates+the+formation+of+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">The antimicrobial peptide LL-37 facilitates the formation of neutrophil extracellular traps.</a> Biochem J. 464, 3-11 (2014).</li>
<li>Leon, S. A., Shapiro, B., Sklaroff, D. M., Yaros, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Free+DNA+in+the+serum+of+cancer+patients+and+the+effect+of+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Free DNA in the serum of cancer patients and the effect of therapy.</a> Cancer Res. 37, 646-650 (1977).</li>
<li>Raptis, L., Menard, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+and+characterization+of+plasma+DNA+in+normals+and+patients+with+systemic+lupus+erythematosus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Quantitation and characterization of plasma DNA in normals and patients with systemic lupus erythematosus.</a> J Clin Invest. 66, 1391-1399 (1980).</li>
<li>Chang, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+cell-free+serum+DNA+detected+in+patients+with+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chim+Acta%22%5BJournal%5D)">Elevated cell-free serum DNA detected in patients with myocardial infarction.</a> Clin Chim Acta. 327, 95-101 (2003).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

NET rappresentano un affascinante romanzo meccanismo attraverso il quale i neutrofili uccidere gli agenti patogeni. 1 Sebbene la letteratura di NET ha continuato ad ampliarsi nel corso degli ultimi dieci anni dalla loro scoperta, diverse questioni importanti relative al loro ruolo nella biologia, meccanismo e regolazione rimangono poco chiari. metodologia appropriata deve essere sviluppato per misurare NET, questo meccanismo antimicrobico molto singolare. Questo articolo vengono descritti metodi che possono e...

NET è un nuovo meccanismo con cui i neutrofili combattono i patogeni. 1 Il nucleo dei NET è il DNA nucleare. 1 Questa rete di DNA è associata alle proteine dei granuli neutrofili e agli istoni. 1 La principale forma di formazione di NET richiede la morte dei neutrofili caratterizzata dalla decondensazione della cromatina, dalla scomparsa delle membrane granulari e nucleari, dalla traslocazione dei neutrofili elastasi al nucleo, dalla citrullinazione degli istoni e infine dalla fuoriuscita di NET basati sul DNA. numero arabo I NET intrappolano e uccidono un'ampia varietà di microbi e sono una parte essenziale del repertorio delle armi immunitarie innate. La formazione incontrollata di NET è stata, tuttavia, collegata a numerose malattie autoinfiammatorie. 3,4 Nonostante la loro rilevanza sempre più consolidata, si sa poco sul meccanismo e sulla regolazione del rilascio di NET. 
I neutrofili che muoiono rilasciando NET sono diversi dai neutrofili apoptotici o necrotici. 3,5 I neutrofili che rilasciano NET mostrano diverse caratteristiche che sono caratteristiche per la formazione di NET. I componenti dei granuli sono associati al DNA nei NET. 1 La mieloperossidasi (MPO) e la neutrofila elastasi umana (HNE) si trovano entrambe nei granuli primari delle cellule a riposo, ma vengono traslocate nel nucleo per legarsi al DNA nei NET. 1 I complessi MPO-DNA e HNE-DNA sono specifici per i NET, non si trovano nei neutrofili apoptotici o necrotici. La decondensazione della cromatina è un'altra caratteristica tipica della NETosis. numero arabo NET richiede anche la citrullinazione degli istoni da parte della peptidil aminidasi 4 (PAD4). 6 Gli istoni citrullinati sono segni distintivi dei neutrofili che hanno subito il rilascio di NET. 6
Qui vengono introdotti tre metodi che, in combinazione, forniscono strumenti eccellenti per quantificare le NET su una scala ad alto rendimento. Il primo test è stato utilizzato sul campo con diverse modifiche e quantifica il rilascio di DNA extracellulare in un formato micropiastra. Il secondo e il terzo saggio forniscono la conferma dei NET misurando i complessi MPO-DNA e HNE-DNA specifici per NET.

<table><tbody><tr><td>Elastasi neutrofila anti-umana&nbsp; Coniglio Ab&nbsp;</td><td>Calbiochem</td><td>481001</td><td>1:2.000x rivestito</td></tr><tr><td>Anti-mieloperossidasi Ab (Coniglio)</td><td>Millipore</td><td>07-496</td><td>1:2.000x rivestito</td></tr><tr><td>DNasi-1</td><td>Roche</td><td>10-104-159-001</td><td>1 &#181; g/ml utilizzato per la digestione</td></tr><tr><td>20 mM EGTA/ PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889-25G</td><td></td></tr><tr><td>2,5 mM EGTA/PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889-25G</td><td></td></tr><tr><td>Rilevamento della morte cellulare ELISA Anti-DNA POD</td><td>Roche</td><td>11544675001</td><td>1:500x&nbsp;</td></tr><tr><td>Spettrofotometro per micropiastre Eon</td><td>Biotek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gen5 Software per micropiastre all-in-one</td> Strumento analitico <td>Biotek</td><td></td><td>(ELISA)</td></tr><tr><td>Sytox orange</td><td>Life Technology</td><td>S11368</td><td>0,2% concentrazione/volume finale</td></tr><tr><td>1 M Hepes</td><td>Cellgro</td><td>25-060-Cl</td><td>Utilizzare 10 mM di concentrazione finale.</td></tr><tr><td>1 M di glucosio</td><td>Sigma</td><td></td><td>Utilizzare 5 mM di concentrazione finale.</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Corning</td><td>21-023-CM</td><td></td></tr><tr><td>Varioskan Flash Ver.2.4.3</td><td>Thermoscientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PMA</td><td>Sigma</td><td>P 8139</td><td>100 nM finale usato</td></tr><tr><td>ELISA Plate</td><td>Greiner bio-one</td><td>655061</td><td></td></tr><tr><td>Provette coniche 15 ml</td><td>Thermoscientific</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td>Provette coniche 50 ml</td><td></td><td>Thermoscientific 339652</td><td></td></tr><tr><td>Percoll (pH 8,5-9,5)&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P 1644</td><td>Cloruro di sodio, Sigma, S7653-250G</td></tr><tr><td>Spettro destrano</td><td></td><td>D1004</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 terreni</td><td>Corning Cellgro</td><td>17-105-CV</td><td></td></tr><tr><td>96 pozzetti piastra nera fondo trasparente</td><td>Costar</td><td>3603</td><td></td></tr></tbody></table>

misura high throughput di extracellulare dna di uscita e quantitativa net formazione in neutrofili umani<em&gt; in vitro</em

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

I granulociti neutrofili sono i leucociti più abbondanti nel sangue umano. I neutrofili sono i primi ad arrivare nel sito dell'infezione. I neutrofili hanno sviluppato diversi meccanismi antimicrobici tra cui la fagocitosi, la degranulazione e la formazione di trappole extracellulari dei neutrofili (NET). I NET sono costituiti da un'impalcatura di DNA decorata con istoni e diversi marcatori di granuli, tra cui la mieloperossidasi (MPO) e l'elastasi neutrofila umana (HNE). Il rilascio di NET è un processo attivo che coinvolge cambiamenti morfologici caratteristici dei neutrofili che portano all'espulsione del loro DNA nello spazio extracellulare. I NET sono essenziali per combattere i microbi, ma il rilascio incontrollato di NET è stato associato a diversi disturbi. Per saperne di più sulla rilevanza clinica e sul meccanismo di formazione del NET, è necessario disporre di strumenti affidabili in grado di quantificare il NET. 
Qui vengono presentati tre metodi in grado di valutare il rilascio di NET da neutrofili umani in vitro. Il primo è un test ad alto rendimento per misurare il rilascio di DNA extracellulare da neutrofili umani utilizzando un colorante legante il DNA impermeabile alla membrana. Inoltre, sono descritti altri due metodi in grado di quantificare la formazione di NET misurando i livelli di complessi MPO-DNA e HNE-DNA specifici per NET. Questi metodi basati su micropiastre in combinazione forniscono ottimi strumenti per studiare in modo efficiente il meccanismo e la regolazione della formazione di NET nei neutrofili umani.

Le figure in questo manoscritto descrivono il metodo di isolamento dei neutrofili, procedure sperimentali, e presentano risultati rappresentativi con spiegazione di analisi dei dati. La Figura 1 mostra le fasi sequenziali di preparazione neutrofili umani. Questo protocollo rappresenta solo un modo possibile di isolamento dei neutrofili. Si produce grandi quantità di neutrofili in grado di rilasciare NET sulla stimolazione di riposo. La figura 2 mostra co...

Vengono presentati saggi ad alto rendimento che, in combinazione, forniscono strumenti eccellenti per quantificare il rilascio di NET dai neutrofili umani.

Misura High Throughput di extracellulare DNA di uscita e quantitativa NET Formazione in neutrofili umani<em&gt; In Vitro</em

Neutrophil granulocytes are the most abundant leukocytes in the human blood. Neutrophils are the first to arrive at the site of infection. Neutrophils ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quantificare le trappole extracellulari dei neutrofili, o NET, rilasciate dai neutrofili umani su larga scala ad alto rendimento. I metodi presentati qui possono contribuire a rispondere a domande fondamentali nei campi dell'infiammazione e delle malattie infiammatorie attraverso lo studio dei meccanismi e della regolazione della formazione in vitro delle trappole extracellulari nei neutrofili umani. Le implicazioni di questa tecnica riguardano l'identificazione di vie di segnalazione centrali mediatrici delle NET e di molecole inibitorie o stimolanti delle NET.Per isolare i neutrofili dal sangue, aliquotare 20 millilitri di sangue umano in provette coniche da 250 millilitri. Aggiungere 10 millilitri di dextrano al 6%, quindi mescolare delicatamente e lasciare riposare le soluzioni a temperatura ambiente per 20 minuti. Trasferire con attenzione la fase superiore ricca di leucociti in provette coniche da 50 millilitri pulite, e utilizzare PBS sterile per riempire la provetta fino all'orlo.Quindi centrifugare il campione a 400 volte G per dieci minuti e utilizzare 15 millilitri di PBS sterile per risospendere il pellet. Ripetere questo passaggio di lavaggio un'altra volta. Successivamente, preparare cinque gradienti di percoll a step del 85, 80, 75, 70 e 65 percento in provette coniche da 215 millilitri e sovrapporre due millilitri della sospensione di leucociti su ciascun gradiente.Quindi, centrifugare i gradienti a 800 volte G per 30 minuti con la frenata disattivata. Dopo la centrifugazione, raccogliere le cellule negli strati alle interfacce 75-80% e 70-75%. Lavare le cellule due volte con PBS e quindi contare le cellule utilizzando un emocitometro.Per misurare la cinetica del rilascio di DNA extracellulare, preparare una sospensione di neutrofili nel mezzo di saggio a una concentrazione di due per dieci alla sesta cellule per millilitro. Aggiungere cinque micromoli per litro di SYTOX orange, un colorante per il DNA impermeabile alla membrana, e mescolare delicatamente. Aliquotare i neutrofili umani in micropiastre sterili a 96 pozzetti con fondo nero trasparente, assicurandosi che il mezzo di saggio ricopra l'intero fondo di ogni pozzetto.Se necessario, battere leggermente sulla piastra lateralmente. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius per 10 minuti. Nel frattempo, utilizzare il mezzo per saggio a 37 gradi Celsius per preparare soluzioni contenenti gli stimoli a concentrazioni doppie rispetto a quelle finali da utilizzare.Come controllo positivo per i NET, preparare 100 nanomolar di ftalato di miristato, o PMA, per trattare i neutrofili umani per quattro ore al fine di indurre il rilascio massimo di NET. Successivamente, preparare il fluorimetro a micropiastre per la misurazione. Stimolare i neutrofili aggiungendo 50 microlitri di soluzione stimolante a 50 microlitri di sospensioni di neutrofili.Aggiungere una concentrazione finale di 0,5 milligrammi per millilitro di saponina a una pozzetta, per misurare il segnale massimo di rilascio di DNA. Posizionare la piastra nel lettore e misurare le variazioni di fluorescenza a intervalli di due minuti per quattro ore senza agitazione. Per analizzare i dati, calcolare gli aumenti normalizzati della fluorescenza nel tempo sottraendo la fluorescenza di base dai valori finali di tutte le pozzette, inclusa quella con saponina.L'aumento della fluorescenza dei saponini dovrebbe corrispondere al segnale più alto ed è indicato come rilascio massimo di DNA. Calcolare la media dei risultati delle repliche e presentarli come percentuale del rilascio massimo di DNA. Per quantificare la formazione di NET mediante saggi ELISA MPO-DNA e HNE-DNA, aggiungere anticorpi di cattura anti-MPO o anti-HNE su piastre ELISA da 96 pozzetti ad alta capacità di legame e incubarli tutta la notte per ricoprire la superficie.La mattina successiva, utilizzare 200 microlitri per pozzetto di PBS per lavare le piastre ELISA per tre volte. Quindi utilizzare 200 microlitri di albumina sierica bovina al 5%, o BSA, e albumina sierica umana allo 0,1%, o HSA, per bloccare i pozzetti a temperatura ambiente per due ore. Nel frattempo, seminare i neutrofili in 100 microlitri di mezzo di saggio su una piastra a 96 pozzetti a una densità di 100.000 cellule per pozzetto e indurre la formazione di NET aggiungendo gli stimoli e incubando a 37 gradi Celsius per quattro ore.Successivamente, eseguire una digestione limitata con DNasi aggiungendo due unità per millilitro di DNasi ai supernatanti dei neutrofili, quindi mescolare accuratamente e incubare a temperatura ambiente per 15 minuti. Arrestare quindi la reazione aggiungendo 15 microlitri di EGTA 25 millimolare e mescolare accuratamente. Raccogliere i supernatanti in provette microcentrifuga pulite e centrifugare i campioni per eliminare i detriti cellulari a 300 × g e a temperatura ambiente per cinque minuti.La raccolta di NET senza digestione limitata provoca dati non costanti. Il passaggio di digestione limitata del DNA è fondamentale per ottenere risultati riproducibili. Pertanto, la concentrazione dell'enzima DNasi I e la durata della digestione sono state ottimizzate.Trasferire il sopranatante in provette microcentrifuga pulite e mantenere in ghiaccio. Successivamente, utilizzando un'aliquote del NET-standard precedentemente preparato, preparare una diluizione da uno a due in PBS e EGTA. Ora, utilizzare PBS con EGTA per diluire venti volte i campioni digeriti con DNase I e distribuirli in aliquote sulle piastre ELISA rivestite con anticorpi di cattura.Incubare le piastre tutta la notte a quattro gradi Celsius. Prima di lavare le piastre tre volte con PBS, aggiungere 100 microlitri per pozzetto di una soluzione di anticorpo di rilevamento, come un anticorpo anti-DNA coniugato con perossidasi del rafano, e incubare al buio per un'ora. Dopo quattro lavaggi con PBS, aggiungere 100 microlitri per pozzetto di substrato TMB per la perossidasi e incubare per 30 minuti.La colorazione blu indica l'attività della perossidasi e la presenza di NET. Per arrestare la reazione, aggiungere 100 microlitri di HCl uno molare. Le soluzioni blu diventeranno gialle.Utilizzando un fotometro per micropiastre, leggere l'assorbanza a 450 nanometri. Per confrontare la quantità di complessi MPO-DNA o HNE-DNA misurata rispetto allo standard di NET, sottrarre la densità ottica di fondo da tutti i campioni e riportare in grafico i valori di assorbanza dei campioni standard diluiti in funzione del loro contenuto relativo di NET. Utilizzando il range non saturato di questa curva standard, stabilire una linea di tendenza mediante l'adattamento esponenziale migliore fornito dal software utilizzato.Inserire i valori di densità ottica misurati degli sconosciuti nell'equazione della retta di taratura, che fornirà la quantità di NETs nel campione sconosciuto espressa come percentuale rispetto allo standard di NETs. Calcolare infine le medie delle repliche e presentare i dati finali come quantità di complessi MPO-DNA o HNE-DNA. Qui vengono mostrati dati rappresentativi di un saggio fluorimetrico di rilascio di DNA di neutrofili umani lasciati non stimolati o attivati con PMA o P-aeruginosa.P-aeruginosa induce la formazione di NET nei PMN umani. Questo grafico illustra che le medie dell'aumento della fluorescenza di pozzetti replicati vengono calcolate, normalizzate rispetto alla fluorescenza massima ed espresse come rilascio di DNA. Queste immagini di fluorescenza rappresentano neutrofili lasciati non trattati o stimolati con PMA.Qui sono mostrate immagini di immunofluorescenza di neutrofili umani non stimolati e attivati con PMA e PA01, ottenute mediante un saggio Elisa per MPO-DNA e HNE-DNA. Il DNA extracellulare mostra una tipica morfologia di NET e colocalizza con MPO e con l'istone H4 citrullinato, un marcatore della formazione di NET. Questo esperimento dimostra il rilascio di MPO-DNA e HNE-DNA nei neutrofili umani utilizzando lo stesso saggio.Il campione standard di NET contiene in media 19,5 microgrammi per millilitro di DNA extracellulare, 399 nanogrammi per millilitro di MPO e 103,4 nanogrammi per millilitro di HNE. Sulla base dei pesi molecolari di MPO e HNE, e considerando che un microgrammo di DNA contiene 9,91 × 10¹⁴ nucleotidi, lo standard di NET contiene 109 molecole di HNE e 147 molecole di MPO ogni 1.000 nucleotidi. Infine, esperimenti di diluizione seriale a due raddoppi dello standard di NET rivelano che i range dinamici dei saggi ELISA MPO-DNA e HNE-DNA sono compresi tra 19 e 609 nanogrammi per millilitro di DNA.Una volta acquisita padronanza, l'acido a base di SYTOX orange può essere facilmente e rapidamente assemblato in un'ora, fornendo risultati già il giorno successivo. Anche il saggio di quantificazione dei NET è semplice da eseguire e produrrà dati il giorno seguente se eseguito correttamente. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come quantificare la naturalasi nei neutrofili umani in modo ad alto rendimento.

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Questo video dimostra una tecnica in vitro per generare e isolare trappole extracellulari (NET) di neutrofili. I neutrofili vengono isolati dal sangue periferico e stimolati con forbolo miristato acetato (PMA) per produrre NET. Durante l'incubazione, i neutrofili subiscono un processo di morte cellulare (NETosi) per rilasciare NET che comprendono cromatina decondensata mescolata con proteine citoplasmatiche granulari.

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L'adesione dei neutrofili all'endotelio attivato nei siti di infezione è una componente integrale della risposta infiammatoria dell'ospite. Descritto in questo rapporto è un saggio di legame dei neutrofili che permette...

Quantitative<em&gt; In vitro</em&gt; Assay misurare Adesione neutrofili attivati ​​per primarie umane endoteliali microvascolari in condizioni statiche

trappole extracellulari dei neutrofili (NET) sono reti di DNA, istoni e proteine ​​neutrofili. Sebbene un componente della risposta immunitaria innata, NET sono implicati in autoimmunità e trombosi. Questo protocollo descrive un metodo semplice per l'isolamento dei neutrofili canina e la quantificazione di NET utilizzando un saggio micropiastra fluorescenza.

Un semplice test di fluorescenza per la quantificazione del Canine neutrofili extracellulare Trappola di uscita

Descriviamo i metodi per isolare canini neutrofili dal sangue intero e visualizzare formazione netta nei neutrofili dal vivo utilizzando la microscopia a fluorescenza. Sono anche descritti protocolli per quantificare la formazione netta e citrullinato istone H3 (citH3) espressione usando la microscopia di immunofluorescenza.

In Vitro Canini trappola extracellulari del neutrofilo formazione: Analisi dinamica e quantitativa mediante microscopia a fluorescenza

Qui, presentiamo un protocollo per la generazione di trappole extracellulari neutrode (NETT) e il funzionamento di NETQUANT, un'opzione software completamente automatica per la quantificazione dei NET nelle immagini di immunofluorescenza.

Quantificazione automatizzata basata su immagini di trappole extracellulari neutrophil utilizzando NETQUANT

Questo protocollo descrive un'analisi di trappola extracellulari del neutrofilo (NET) altamente sensibile e ad alto rendimento per la quantificazione semiautomatizzata di ex vivo NET formazione mediante microscopia confocale tridimensionale di immunofluorescenza. Questo protocollo può essere utilizzato per valutare la formazione netta e degrado dopo stimoli diversi e può essere utilizzato per lo studio di potenziali terapie mirate al NET.

Un'analisi di High-throughput per valutare e quantificare la trappola extracellulari del neutrofilo formazione

Presentiamo un protocollo per una tecnica di saggio di immunoassorbimento enzimatico a sandwich modificata per misurare quantitativamente due componenti dei residui di trappole extracellulari dei neutrofili, i complessi di DNA coniugato a DNA coniugato con mieloperossidasi e DNA coniugato con elastasi neutrofila, derivati da neutrofili attivati.

Quantificazione dei complessi mieloperossidasi-DNA e elastasi-DNA neutrofili da trappole extracellulari di neutrofili utilizzando un ELISA a sandwich modificato

Presentiamo un metodo automatizzato ad alto rendimento per quantificare le trappole extracellulari dei neutrofili (NET) utilizzando il sistema di analisi delle cellule vive, accoppiato con un approccio a doppio colorante dipendente dalla permeabilità della membrana.

Tecnica real-time ad alto rendimento per quantificare la formazione di trappole extracellulari di neutrofili nei neutrofili umani

Questo protocollo definito descrive un approccio di microscopia ad alto rendimento in tempo reale per visualizzare e quantificare il rilascio di trappole extracellulari (NET) di neutrofili umani in vitro. Il metodo riproducibile consente di studiare le caratteristiche e la cinetica del rilascio di NET dopo stimolazione con induttori distinti di NETosi e consente di valutare la farmacologia degli antagonisti di NETosi.

Quantificazione microscopica in tempo reale e ad alto rendimento del rilascio di trappole extracellulari di neutrofili umani e valutazione della farmacologia degli antagonisti

Mostriamo, come utilizzare 2-fotoni microscopia per l'osservazione delle dinamiche di granulociti neutrofili nei polmoni infettati mentre fagocitare agenti patogeni o di produrre dei neutrofili trappole extracellulare (NET).

Osservazione diretta di fagocitosi e NET-formazione da parte dei neutrofili nei polmoni infetti utilizzando 2-fotoni Microscopia

Impara a quantificare i NET rilasciati dai neutrofili umani con saggi high throughput. Questo metodo consente di studiare i meccanismi dell'infiammazione e identificare molecole regolatorie.

Misura High Throughput di extracellulare DNA di uscita e quantitativa NET Formazione in neutrofili umani

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