Misura High Throughput di extracellulare DNA di uscita e quantitativa NET Formazione in neutrofili umani In Vitro

L'obiettivo generale di questa procedura è quantificare le trappole extracellulari dei neutrofili, o NET, rilasciate dai neutrofili umani su una scala ad alto rendimento. I metodi qui presentati possono aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'infiammazione e dell'alterazione delle malattie infiammatorie attraverso lo studio del meccanismo e della regolazione della formazione di trappole extracellulari in vitro di neutrofili nei neutrofili umani. Le implicazioni di questa tecnica riguardano l'identificazione di un NET centrale che media le vie di segnalazione e di molecole inibitorie o stimolanti il NET NET .

Per isolare i neutrofili dal sangue, aliquotare 20 millilitri di sangue umano in provette coniche da 250 millilitri. Aggiungere 10 millilitri di destrano al 6%, quindi mescolare delicatamente e lasciare riposare le soluzioni a temperatura ambiente per 20 minuti. Trasferire con cura la fase superiore ricca di leucociti in provette coniche pulite da 50 millilitri e utilizzare PBS sterile per riempire la provetta fino in cima.

Quindi centrifugare il campione a 400 volte G per dieci minuti e utilizzare 15 millilitri di PBS sterile per risospendere il pellet. Ripetere questa fase di lavaggio ancora una volta. Successivamente, preparare gradienti di percoll in cinque fasi dell'85, 80, 75, 70 e 65 percento in tubi conici da 215 millilitri e sovrapporre due millilitri di sospensione leucocitaria sopra ogni gradiente.

Quindi, centrifugare le pendenze a 800 volte G per 30 minuti con la pausa. Dopo la centrifugazione, raccogliere le cellule negli strati alle interfacce 75-80% e 70-75%. Utilizzare PBS per lavare le cellule due volte, quindi utilizzare un emocitometro per contare le cellule.

Per misurare la cinetica del rilascio di DNA extracellulare, preparare una sospensione di neutrofili in terreno di saggio a una concentrazione di due volte dieci per sei cellule per millilitro. Aggiungere cinque micromoli per litro di arancio SYTOX, che è un colorante legante il DNA impermeabile alla membrana e mescolare delicatamente. Aliquotare i neutrofili umani in micropiastre sterili a 96 pozzetti, nere e trasparenti, assicurando che il terreno di analisi copra l'intero fondo del pozzetto.

In caso contrario, picchiettare delicatamente la piastra sul lato. Scaldare la piastra a 37 gradi Celsius per 10 minuti. Nel frattempo, utilizzare un terreno di saggio a 37 gradi Celsius per preparare soluzioni contenenti stimoli al doppio delle loro concentrazioni finali da utilizzare.

Come controllo NET positivo, preparare 100 nanomolari di forbolo miristato acetato, o PMA, per trattare i neutrofili umani per quattro ore per innescare il massimo rilascio di NET. Quindi, preparare il fluorimetro per micropiastre per la misurazione. Stimolare i neutrofili aggiungendo 50 microlitri di soluzione di stimolo a 50 microlitri di sospensioni di neutrofili.

Aggiungere una concentrazione finale di 0,5 milligrammi per millilitro di saponina a un pozzetto, per misurare il segnale di rilascio massimo del DNA. Posizionare la piastra nel lettore e misurare le variazioni di fluorescenza a intervalli di due minuti per quattro ore senza agitare. Per analizzare i dati, calcolare gli aumenti normalizzati della fluorescenza nel tempo sottraendo la fluorescenza basale dai valori finali per tutti i pozzetti, inclusa la saponina.

L'aumento della fluorescenza delle saponine dovrebbe essere il segnale più alto ed è indicato come il massimo rilascio di DNA. Fare la media dei risultati delle repliche e presentarli come percentuale del massimo rilascio di DNA. Per quantificare la formazione di NET utilizzando i saggi ELISA MPO-DNA e HNE-DNA, aggiungere anticorpi anti-MPO o anti-cattura HNE a piastre ELISA ad alta capacità di legame a 96 pozzetti e incubarle durante la notte per rivestirle.

La mattina successiva utilizzare 200 microlitri per pozzetto di PBS per lavare le piastre ELISA tre volte. Quindi utilizzare 200 microlitri di albumina sierica bovina al 5%, o BSA, e lo 0,1% di albumina sierica umana, o HSA, per bloccare i pozzetti a temperatura ambiente per due ore. Nel frattempo, seminare i neutrofili in 100 microlitri di terreno di prova su una piastra a 96 pozzetti a una densità di 100.000 cellule per pozzetto e indurre la formazione di NET dopo l'aggiunta di stimoli incubando a 37 gradi Celsius per quattro ore.

Successivamente, eseguire una digestione limitata della DNasi aggiungendo due unità per millilitro di DNAsi ai surnatanti dei neutrofili, quindi mescolare bene e incubare a temperatura ambiente per 15 minuti. Quindi, fermare la reazione aggiungendo 15 microlitri di EGTA da 25 millimolari e mescolare bene. Raccogliere i surnatanti e pulire le provette per microfugi e centrifugare i campioni per eliminare i detriti cellulari a 300 volte G e a temperatura ambiente per cinque minuti.

La raccolta di NET senza digestione limitata si traduce in dati incoerenti. La fase di digestione del DNA limitata è fondamentale per ottenere risultati riproducibili. Pertanto, la concentrazione dell'enzima DNasi I e la durata della digestione sono state ottimizzate.

Trasferire il surnatante nelle provette di microfuga pulite e tenere in ghiaccio. Quindi, utilizzando un'aliquota di NET-standard precedentemente preparato, preparare una diluizione uno a due in PBS ed EGTA. Ora, utilizzare PBS con EGTA per diluire venti volte i campioni digeriti dalla DNasi I e aliquotarli su piastre ELISA rivestite con anticorpi di cattura.

Incubare le piastre per una notte a quattro gradi Celsius. Prima di utilizzare PBS per lavare le piastre tre volte, applicare 100 microlitri per pozzetto di una soluzione anticorpale di rilevazione come l'anticorpo anti-DNA coniugato con perossidasi di rafano e incubare al buio per un'ora. Dopo quattro lavaggi con PBS, aggiungere 100 microlitri per pozzetto di substrato di perossidasi TMB e incubare per 30 minuti.

La colorazione blu indica l'attività della perossidasi e la presenza di NET. Per fermare la reazione, aggiungere 100 microlitri di un molare di HCL. Le soluzioni blu diventeranno gialle.

Utilizzando un fotometro per micropiastre, leggere l'assorbanza a 450 nanometri. Per confrontare la quantità di complessi MPO-DNA o HNE-DNA misurati rispetto allo standard NET, sottrarre la densità ottimale di fondo da tutti i campioni e tracciare i valori di assorbanza dei campioni standard diluiti rispetto al loro contenuto NET relativo. Utilizzando l'intervallo non saturo di questa curva standard, stabilire una linea di tendenza utilizzando il miglior adattamento esponenziale dal software utilizzato.

Inserire i valori OD misurati delle incognite nell'equazione della linea di tendenza che fornirà la quantità di NET nel campione sconosciuto come percentuale dello standard NET. Infine, calcolare le medie delle repliche e presentare i dati finali come la quantità di complessi MPO-DNA o HNE-DNA. Qui sono mostrati i dati rappresentativi di un saggio di rilascio di DNA basato sulla fluorescenza di neutrofili umani lasciati non stimolati o attivati con PMA o P-aeruginosa.

La P-aeruginosa innesca la formazione di NET nei PMN umani. Questo grafico illustra che le medie di aumento della fluorescenza dei pozzetti replicati sono calcolate, normalizzate sulla fluorescenza massima e sono espresse come rilascio di DNA. Queste immagini a fluorescenza rappresentano neutrofili non trattati o stimolati con PMA.

Qui sono mostrate immagini in immunofluorescenza di neutrofili umani non stimolati, PMA e PA01 attivati da un saggio Elisa MPO-DNA e HNE-DNA. Il DNA extracellulare mostra la tipica morfologia del NET e colocalizza con MPO e l'istone citrullinato H4, un marcatore della formazione di NET. Questo esperimento mostra il rilascio di MPO-DNA e HNE-DNA nei neutrofili umani utilizzando lo stesso test.

Lo standard NET contiene in media 19,5 microgrammi per millilitro di DNA extracellulare, 399 nanogrammi per millilitro di MPO e 103,4 nanogrammi per millilitro di HNE. Sulla base dei pesi molecolari di MPO e HNE, e del fatto che un microgrammo di DNA contiene da 9,91 volte 10 a 14 nucleotidi, lo standard NET contiene 109 molecole di HNE e 147 molecole di MPO per 1.000 nucleotidi. Infine, esperimenti di diluizione seriale a due volte dello standard NET rivelano che gli intervalli dinamici di entrambi i saggi ELISA MPO-DNA e HNE-DNA sono compresi tra 19 e 609 nanogrammi per millilitro di DNA.

Una volta padroneggiato, l'acido a base di arancia SYTOX può essere assemblato facilmente e rapidamente in un'ora, portando a risultati il giorno successivo. I test di quantificazione NET sono anche facili da eseguire e, se eseguiti correttamente, produrranno dati il giorno successivo. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come quantificare la naturalesi nei neutrofili umani in modo ad alto rendimento.