Metodo per la misurazione dell'attività di Deubiquitinating enzimi in linee di cellule e tessuti Campioni

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di visualizzare l'attività degli enzimi deubiquitinati nelle cellule. Ciò si ottiene coltivando le cellule ad alta cofluenza e raccogliendole per facilitare la produzione di un lisato concentrato come seconda fase. La lisi meccanica delicata viene utilizzata per produrre un lisato che mantiene un quadro metabolico del citoplasma della cellula.

Successivamente, gli enzimi vengono incubati con sonde derivate dall'emoagglutinina al fine di marcare gli enzimi de ubiquitina reagendo con il residuo di cisteina del sito attivo, i risultati mostrano i profili di attività di molti enzimi de ubiquitina basati sul Western blotting e sulla successiva rilevazione chemiluminescente. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come il normale western blotting, è che consente all'utente di visualizzare le attività di più enzimi. In un esperimento, Prepare cell culture medium di Ali, citando 30 millilitri di dobe docos, medium aquile modificate, o DMEM più il 10% di siero bovino fetale in un tubo conico da 50 millilitri per la coltura.

Le cellule per l'esperimento trasferiscono le cellule M 17 o he A congelate dal deposito di azoto liquido a un piccolo becher con acqua tiepida. Quindi trasferire le cellule nella provetta conica da 50 millilitri contenente 30 millilitri di terreno. Quindi, aggiungere un po' di terreno alla fiala di cellule e trasferire le cellule risospese entro cinque secondi dallo scongelamento.

Centrifugare la sospensione cellulare a 450 Gs per cinque minuti per ottenere un pellet di cella. Quindi aggiungere 20 millilitri di terreno in un pallone T 75. Rimuovere il terreno dalle celle mediante aspirazione.

Aggiungere cinque millilitri di terreno fresco al pellet di cella e sospendere il resus. Trasferire i cinque millilitri di sospensione cellulare nei 20 millilitri di terreno nel pallone T 75 e incubare a 37 gradi Celsius. Cambio del terreno ogni tre giorni per raccogliere le cellule.

Rimuovere il supporto tramite aspirazione, facendo attenzione a non toccare le celle. Lavare le cellule con cinque millilitri di soluzione salina tamponata con fosfato o PBS. Rimuovere il PBS utilizzando l'aspirazione.

Quindi, aggiungere tre millilitri di tripsin EDTA al pallone T 75 e incubare a 37 gradi Celsius per tre minuti. Dopo l'incubazione, aggiungere sei millilitri di terreno fresco al pallone e risus. Sospendi le celle.

Trasferire la sospensione in una provetta conica da 15 millilitri e centrifugare a 290 Gs per cinque minuti, rimuovere il surnatante e aggiungere cinque millilitri di PBS. Picchiettare delicatamente il fondo del tubo per rompere il pellet prima di centrifusion a 290 Gs per cinque minuti. Dopo aver ripetuto il lavaggio con PBS tre volte, rimuovere il vecchio PBS e risospendere le cellule in un millilitro di PBS fresco.

Quindi trasferire le cellule in una provetta einor e centrifugare a 290 GS per cinque minuti. Per eseguire la lisi cellulare, misurare il volume approssimativo del pellet utilizzando una pipetta e pesare le perle di vetro e un rapporto massa/volume di uno a uno. Aggiungere il tampone di lisi al pellet al doppio del volume del pellet.

Quindi aggiungere le perle di vetro al pellet e lisi. Tamponare le cellule nella provetta einor alla massima agitazione per 30 minuti a quattro gradi Celsius agitando in una cella frigorifera. Centrifugare brevemente a 200 GS per 30 secondi.

Per sistemare le perline e raccogliere il surnatante. Aggiungere lo stesso volume di perle di vetro di prima al vortice surnatante, ancora una volta alla massima agitazione per 30 minuti a quattro gradi Celsius dopo la centrifusione brevemente a 200 Gs per 30 secondi. Per depositare le perle di vetro, raccogli il surnatante.

Infine centrifugare a 5,030 GS per cinque minuti. Per rimuovere i nuclei, le membrane e le cellule integre, raccogliere il surnatante, che è il lisato cellulare per la derivatizzazione dei tessuti, eseguita mediante acido Cinconimico o analisi BCA. In una piastra a 96 pozzetti per determinare la concentrazione proteica del lisato utilizzando un lettore di piastre a 96 pozzetti con metrica chole come specificato dal protocollo del kit di analisi delle proteine BCA.

Dopo aver determinato la concentrazione proteica, portare un'aliquota corrispondente a 20 microgrammi di proteine totali a 50 microlitri utilizzando acqua deionizzata. Quindi aggiungere alla soluzione due microlitri di 1,35 micromolari di cellulare in vinile HAUB. Il risultato è 20 microgrammi di lisato per 50 nano molari di sonda nella miscela di reazione finale.

Questo è in eccesso di molari grandi. Per garantire l'etichettatura degli enzimi funzionali de ubiquitina o dubs, lasciare incubare la soluzione per un'ora a 37 gradi Celsius. Quindi, aggiungere il tampone campione di laly alla soluzione.

Per un volume di reazione di 52 microlitri, utilizzare 26 microlitri di due tamponi campione, 13 microlitri di quattro tampone campione o 8,87 microlitri di sei tampone campione. Incubare il campione per cinque minuti a 95 gradi Celsius. Raffreddare con ghiaccio.

Prima di caricare il gel per eseguire il western blot caricare prima un gel di tris glicina da 12, ben quattro al 20% con 40 microlitri del campione preparato. Far funzionare il gel a 95 volt fino a quando il fronte ionico raggiunge il fondo. Successivamente effettuare un trasferimento notturno del gel su una membrana di fluoruro DI di polivite o PVDF.

Trasferimento Innanzitutto, incubare la membrana nella colorazione nera AMDO e scansionare la membrana per ottenere un'immagine che mostri la quantità di proteine in ciascuna corsia. Quindi trattenere la membrana e incubare nel 5% di latte in PBS per un'ora per bloccare. Successivamente, incubare la membrana nell'anticorpo primario anti HA a una concentrazione da uno a 10.000 in latte al 5% in PBS, durante la notte a quattro gradi Celsius o per quattro ore a temperatura ambiente.

Dopo l'incubazione, eseguire tre lavaggi di cinque minuti ciascuno in PBS con lo 0,1% di detersivo tween 20. Quindi incubare la membrana in perossidasi di rafano di topo a una concentrazione da uno a 10.000 in latte al 5% in PBS per almeno due ore. Eseguire tre lavaggi come prima, seguiti da un lavaggio per cinque minuti in PBS.

Infine, incubare la membrana in un reagente di rivelazione chemiluminescente per 10 minuti e rilevare utilizzando un rivelatore luminescente. Utilizzare l'impostazione di esposizione automatica sul rilevatore. Il carico proteico è stato controllato utilizzando la colorazione nera AM mito.

Questa fase di controllo garantisce che le differenze di attività siano dovute a processi cellulari effettivi e non a un carico proteico diseguale. Le corsie mostrate qui indicano che nel primo esperimento sono state utilizzate quantità uguali di proteine. Nel secondo esperimento, sono state caricate quantità di proteine disuguali a causa delle differenze attese nei profili di attività delle linee cellulari diverse.

Ciò è stato fatto per garantire il rilevamento di un profilo di attività per la cellula M 17. Lisati incubati con amila etilica, che è un inibitore della cistina e dovrebbe portare a una riduzione del segnale sul Western blot. Le membrane sono state incubate in anticorpi primari anti HA.

Un topo di rafano perossidasi, e quindi rilevato utilizzando l'imaging chemiluminescente. L'etichettatura corretta dei dub utilizzando le sonde produce un profilo in ogni corsia della membrana. L'intensità delle bande a diversi pesi molecolari corrisponde al livello di attività dell'enzima dub.

Le differenze nei livelli di attività di vari dub tra le linee cellulari diventano evidenti quando proteine simili come U CHL one vengono confrontate nelle cellule he, a e M 17. Dopo questa procedura. Altri metodi, come il frazionamento subcellulare, possono essere eseguiti per rispondere a domande come: in che modo i processi patologici influenzano l'attività dell'enzima ubiquitina negli organelli legati alla membrana?

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come misurare l'attività dell'enzima de ubiquitinato utilizzando sonde dirette al sito attivo.