Metodo per la misurazione dell'attività di Deubiquitinating enzimi in linee di cellule e tessuti Campioni

L'obiettivo generale del seguente esperimento è visualizzare l'attività degli enzimi deubiquitinanti nelle cellule. Questo risultato si ottiene coltivando le cellule fino a raggiungere un'alta confluenza e successivamente raccogliendole, al fine di facilitare la produzione di un lisato concentrato come secondo passaggio. Viene utilizzata una lisi meccanica delicata per ottenere un lisato che mantenga un profilo metabolico del citoplasma cellulare.

Successivamente, i enzimi vengono incubati con sonde derivate dall'emagglutinina al fine di marcare gli enzimi deubiquitinasi mediante reazione con il residuo di cisteina presente nel sito attivo; i risultati mostrano i profili di attività di numerosi enzimi deubiquitinasi mediante blotting western e successiva rivelazione chemiluminescente. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come il classico blotting western, è che consente all'utente di visualizzare l'attività di più enzimi contemporaneamente. In un esperimento, preparare il terreno di coltura cellulare per Ali, dosando 30 millilitri di dobe docos, terreno minimo essenziale di Eagle modificato, o DMEM, più 10% di siero bovino fetale in un tubo conico da 50 millilitri per la coltura.

Le cellule per l'esperimento vengono trasferite congelate, M 17 oppure cellule he A, dallo stoccaggio in azoto liquido a un piccolo becher contenente acqua tiepida. Successivamente, trasferire le cellule in un tubo conico da 50 millilitri contenente 30 millilitri di terreno. Quindi, aggiungere un po' di terreno al flacone delle cellule e trasferire le cellule risospese entro cinque secondi dal disgelo.

Centrifugare la sospensione cellulare a 450 G per cinque minuti per ottenere un pellet cellulare. Quindi aggiungere 20 millilitri di mezzo in un fiasco T 75. Rimuovere il mezzo dalle cellule mediante aspirazione.

Aggiungere cinque millilitri di mezzo fresco al pellet cellulare e risospendere. Trasferire i cinque millilitri di sospensione cellulare nei 20 millilitri di mezzo nel fiasco T75 e incubare a 37 gradi Celsius. Cambiare il mezzo ogni tre giorni per raccogliere le cellule.

Rimuovere il mezzo mediante aspirazione, avendo cura di non toccare le cellule. Lavare le cellule con cinque millilitri di soluzione salina tamponata al fosfato o PBS. Rimuovere il PBS mediante aspirazione.

Successivamente, aggiungere tre millilitri di tripsina EDTA nel flask T 75 e incubare a 37 gradi Celsius per tre minuti. Dopo l'incubazione, aggiungere sei millilitri di mezzo fresco al flask e risospendere le cellule.

Trasferire la sospensione in una provetta conica da 15 millilitri e centrifugare a 290 G per cinque minuti, rimuovere il soprannatante e aggiungere cinque millilitri di PBS. Toccare delicatamente il fondo della provetta per disperdere il pellet prima della centrifugazione a 290 G per cinque minuti. Dopo aver ripetuto il lavaggio con PBS per tre volte, rimuovere il vecchio PBS e risospendere le cellule in un millilitro di PBS fresco.

Quindi trasferire le cellule in una provetta einor e centrifugare a 290 GS per cinque minuti. Per eseguire la lisi cellulare, misurare il volume approssimativo del pellet utilizzando una pipetta e pesare i microperline di vetro in un rapporto massa/volume di uno a uno. Aggiungere il buffer di lisi al pellet in un volume doppio rispetto a quello del pellet.

Quindi aggiungere le perle di vetro al pellet e lisare le cellule nel tubo da microcentrifuga con il buffer di lisi, agitando al massimo per 30 minuti a quattro gradi Celsius mediante vortex in una stanza fredda. Centrifugare brevemente a 200 ×g per 30 secondi.

Per far sedimentare le perle e raccogliere il sopranatante. Aggiungere al sopranatante lo stesso volume di perle di vetro utilizzato in precedenza, quindi vortexare nuovamente con massima agitazione per 30 minuti a quattro gradi Celsius, dopo aver centrifugato brevemente a 200 G per 30 secondi. Per far sedimentare le perle di vetro, raccogliere il sopranatante.

Infine, centrifugare a 5.030 ×g per cinque minuti. Per rimuovere i nuclei, le membrane e le cellule non rotte, raccogliere il soprannatante, che costituisce il lisato cellulare per la derivatizzazione del tessuto, eseguita mediante acido cinconico o analisi BCA. In una piastra a 96 pozzetti, determinare la concentrazione proteica del lisato utilizzando un lettore spettrofotometrico per piastre a 96 pozzetti, come specificato dal protocollo del kit per saggio proteico BCA.

Dopo aver determinato la concentrazione proteica, portare un'aliquote corrispondente a 20 microgrammi di proteina totale a 50 microlitri utilizzando acqua deionizzata. Aggiungere quindi due microlitri di HAUB vinyl cell phone 1,35 micromolare alla soluzione. Il risultato è 20 microgrammi di lisato in 50 nanomoli di sonda nella miscela finale di reazione.

Questo è in grande eccesso molare. Per garantire l'etichettatura delle deubiquitinasi funzionali o DUB, lasciare che la soluzione incubi per un'ora a 37 gradi Celsius. Successivamente, aggiungere il buffer campione Laemmli alla soluzione.

Per un volume di reazione di 52 microlitri, utilizzare 26 microlitri di tampone di campione due x, 13 microlitri di tampone di campione quattro x, oppure 8,87 microlitri di tampone di campione sei x. Incubare il campione per cinque minuti a 95 gradi Celsius. Raffreddare sul ghiaccio.

Prima di caricare il gel per eseguire il western blot, caricare inizialmente un gel tris-glicina 12 pozzetti, 4-20% con 40 microlitri del campione preparato. Far correre il gel a 95 volt finché il fronte ionico non raggiunge il fondo. Successivamente, eseguire un trasferimento notturno del gel su una membrana di polivinilidifluoruro o PVDF.

Trasferimento prima, incubare la membrana nel colorante nero AMDO e scansionare la membrana per ottenere un'immagine che mostri la quantità di proteina in ciascuna corsia. Successivamente, lavare la membrana e incubarla in 5% di latte in PBS per un'ora per effettuare il blocco. Poi, incubare la membrana nell'anticorpo primario anti HA a una concentrazione di uno a 10.000 in 5% di latte in PBS, sia durante la notte a quattro gradi Celsius sia per quattro ore a temperatura ambiente.

Dopo l'incubazione, eseguire tre lavaggi di cinque minuti ciascuno in PBS con il detergente 0,1% tween 20. Quindi, incubare la membrana in perossidasi di ravanello daikon murino a una concentrazione di uno a 10.000 in PBS contenente il 5% di latte per almeno due ore. Eseguire tre lavaggi come in precedenza, seguiti da un ulteriore lavaggio di cinque minuti in PBS.

Infine, incubare la membrana in un reagente di rilevamento chemiluminescente per 10 minuti e rilevare utilizzando un detector luminiscente. Utilizzare l'impostazione di esposizione automatica sul detector. Il caricamento proteico è stato verificato utilizzando la colorazione nera mito AM.

Questo passaggio di controllo garantisce che le differenze di attività siano dovute a processi cellulari effettivi e non a un caricamento disuguale di proteine. Le corsie mostrate qui indicano che nella prima esperimento sono state utilizzate quantità uguali di proteine. Nel secondo esperimento, sono state caricate quantità disuguali di proteine a causa delle differenze previste nei profili di attività delle diverse linee cellulari.

Questo è stato fatto per garantire il rilevamento di un profilo di attività per la cellula M 17. I lisati sono stati incubati con etil maide, che è un inibitore della cistina e dovrebbe portare a un segnale ridotto nel Western blot. Le membrane sono state incubate con l'anticorpo primario anti HA.

Un perossidasi di rafano equino murino, quindi rilevata mediante imaging chemiluminescente. L'etichettatura riuscita dei dubs mediante le sonde produce un profilo in ogni corsia della membrana. L'intensità delle bande a diversi pesi molecolari corrisponde al livello di attività dell'enzima dub.

Le differenze nei livelli di attività di vari dubs tra linee cellulari diventano evidenti quando proteine simili come U CHL uno vengono confrontate nelle cellule he a e M 17. Dopo questa procedura, altri metodi come la frazionamento subcellulare possono essere eseguiti per rispondere a domande del tipo: come i processi patologici influenzano l'attività dell'enzima ubiquitina negli organelli legati alla membrana?

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come misurare l'attività enzimatica deubiquitinata utilizzando sonde dirette verso il sito attivo.