Imaging non invasiva della risposta immunitaria innata in un modello di Zebrafish larvale

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di microiniettare larve di pesce zebra con un patogeno batterico, Streptococcus IEA, al fine di ottenere immagini in vivo non invasive della risposta immunitaria dell'ospite. Questo viene realizzato caricando innanzitutto l'ago da microiniezione con una sospensione batterica e allineando le larve di pesce zebra anestetizzate sullo stampo per iniezione in agarosio. Successivamente, la sospensione batterica viene microiniettata nella vescicola otica delle larve.

Successivamente, le larve iniettate vengono montate in agarosio a bassa fusione. Infine, le cellule immunitarie dell'ospite vengono marcate con un'etichetta fotoattivabile per un facile tracciamento e l'infezione viene osservata mediante microscopia confocale. In definitiva, l'iniezione microscopica di Streptococcus ina in vescicola otica e il successivo marcamento fotoattivabile insieme alla microscopia confocale vengono utilizzati per studiare la risposta immunitaria dell'ospite nelle larve di pesce zebra.

Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'iniezione nella vena codale, è che l'iniezione nella vescicola otica genera un'infezione batterica localizzata, consentendo l'analisi non invasiva delle interazioni tra ospite e patogeno nella larva trasparente di zebrafish. Per iniziare, preparare una soluzione di agarosio ad alto punto di fusione al 1,5-2% nel mezzo E3, riscaldandola al microonde fino a quando la soluzione diventa limpida. Dopo il raffreddamento, versare una certa quantità di agarosio in una piastra di Petri, aggiungendo solo quella necessaria a coprire il fondo della piastra, quindi agitare delicatamente.

Una volta che l'aros si è solidificato, posizionare sopra un pettine per gel risciacquato e asciutto in modo che l'estremità solida poggia appena sulla parte superiore della piastra di Petri e l'estremità scanalata tocchi l'aros. Assicurarsi che il pettine sia il più orizzontale possibile, formando un angolo di 30 gradi rispetto allo strato inferiore di aros. Versare una piccola quantità aggiuntiva di aros all'interfaccia tra il pettine e lo strato inferiore di aros in modo che lo strato fresco di aros copra i pozzetti del pettine.

Lasciarlo raffreddare completamente prima di rimuovere il pettine. Quindi, utilizzando la punta di una pipetta, rimuovere eventuali frammenti sporgenti di aros dai pozzetti. Versare E three medium sopra lo stampo per iniezione e conservare a quattro gradi Celsius.

Dopo aver preparato l'inoculo di SNEA e i larve di zebrafish per le iniezioni seguendo il protocollo descritto nel testo, accendere il microiniettore e impostare l'intervallo di tempo in millisecondi. Aprire la valvola della bombola di anidride carbonica per far entrare il gas nella linea. La pressione del microiniettore dovrebbe essere di circa 20 PSI. Vortexare la coltura di SNEA preparata in fenolo rosso e PBS e utilizzare una punta micro loader per caricare da due a tre microlitri della coltura in un ago capillare per iniezioni, montato su un micro manipolatore collegato a un supporto magnetico, posizionandolo sotto un microscopio stereoscopico in modo che l'ago formi un angolo compreso tra 45 e 65 gradi rispetto alla base del microscopio.

Staccare innanzitutto la punta dell'ago utilizzando una pinzetta fine, quindi premere il pedale dell'elettroiniettore per rilasciare una goccia dell'inoculo sulla punta dell'ago. Utilizzare la barra della scala nell'oculare del microscopio per misurare il diametro della goccia. Il diametro della goccia dovrebbe essere di circa 0,10 millimetri, pari a un volume di circa un nanolitro.

Per regolare la dimensione delle gocce, modificare l'impostazione della durata sul microiniettore oppure utilizzare pinzette fini per tagliare ulteriormente la punta dell'ago. Il tempo di iniezione deve essere compreso tra 20 e 35 millisecondi per evitare danni eccessivi ai tessuti. Successivamente, utilizzando una pipetta di trasferimento in plastica, trasferire un pesce per pozzetto in ciascuna delle 12 pozze dello stampo per iniezioni.

Quindi, con una bacchetta di vetro, un anello di capello o una punta di plastica, posizionare delicatamente le larve in modo che le teste siano rivolte verso la parte posteriore del microscopio e le sacche del tuorlo siano appoggiate contro il lato sinistro della pozzetta. Orientare l’orecchio sinistro delle larve verso l’alto, in direzione del soffitto. Quando le larve sono pronte per l’iniezione, utilizzare le manopole del micromanipolatore per allineare l’ago caricato con la vescicola otica, in modo che entrambi siano nello stesso campo visivo.

Con la punta dell'ago perforare lo strato epiteliale esterno della vescicola otica in modo che la punta si trovi appena all'interno della vescicola. A questo punto, utilizzando una pressione sufficientemente bassa da non rompere la cavità, premere il pedale per iniettare un nanolitro della dose desiderata di SNEA. Se l'iniezione ha successo, la vescicola otica, ma non i tessuti circostanti, si riempirà di un inoculo di rosso fenolo.

Ritirare con attenzione l'ago dalle larve e, sotto una magnificazione di cinque volte, spostare manualmente la piastra di iniezione in modo che la larva sia in vista. Se si stanno iniettando batteri marcati con fluorescenza sotto un microscopio a fluorescenza, esaminare visivamente le larve iniettate e conservare solo quelle in cui il deposito di batteri è avvenuto esclusivamente all'interno della vescicola otica, per garantire che il volume di iniezione rimanga costante durante l'esperimento. Dopo aver iniettato ogni 48° embrione, iniettare una goccia di sospensione batterica in un tubo da centrifuga da 1,7 millilitri contenente 100 microlitri di PBS sterile.

Quindi piastrare i 100 microlitri su piastre THY più P auger e incubare a 37 gradi Celsius per tutta la notte. Per determinare le UFC nel volume di iniezione, quando un intero gruppo di 12 larve sul piano di iniezione è stato iniettato, utilizzare con attenzione una pipetta di trasferimento in plastica per rimuovere le larve dalle pozzette e posizionarle in una nuova capsula di Petri. Rimuovere la soluzione trica e sostituirla con circa due millilitri di mezzo E tre fresco per consentire alle larve di riprendersi.

Incubare gli embrioni secondo il protocollo descritto nel testo. Dopo aver preparato gli aros con la trica, secondo il protocollo descritto nel testo, al microscopio stereoscopico, utilizzare una pipetta di trasferimento per posizionare quattro o cinque larve anestetizzate in una piastra di vetro con fondo in vetro. Rimuovere la soluzione di trica e aro dal bagno d'acqua a 55 gradi Celsius e lasciarla raffreddare a temperatura ambiente per uno o due minuti.

Nel frattempo, rimuovere il più possibile il liquido dalle larve anestetizzate. Successivamente, versare l'agarosio raffreddato nella piastra fino a coprirne circa metà della superficie. Quindi, agitare delicatamente la piastra per distribuire l'agarosio.

Prelevare le larve che sono salite ai lati della piastra e riposizionarle al centro con una pipetta. Quindi, sotto il microscopio stereoscopico, utilizzare una punta di pipetta lunga per posizionare delicatamente le larve nella posizione desiderata per l'acquisizione delle immagini. Per la vescicola otica, posizionare le larve in modo che la vescicola otica destra sia rivolta verso l'alto e quella sinistra sia appiattita contro il fondo della piastra.

Lasciare raffreddare gli aros per circa 10 minuti prima di spostare la piastra. Quindi pipettare delicatamente una soluzione di trica e E tre sulla superficie dello strato di aros per mantenerlo umido. Per visualizzare i campioni, utilizzare una scansione Zack con i laser a 488 nanometri e 543 nanometri.

Utilizzare la scansione continua della linea per regolare la potenza del laser e il guadagno del rilevatore. Verificare che non vi sia fluorescenza rossa accidentalmente fotoconvertita nella finestra di controllo dell'acquisizione delle immagini. Nelle impostazioni dello stimolo, selezionare lo strumento utilizza scanner e scegliere principale, selezionare il laser a 405 nanometri e impostarlo al 70% della potenza.

Quindi, utilizzando l'opzione cerchio, definire la regione di interesse nella vescicola odica. Nella finestra delle impostazioni di acquisizione, sotto l'impostazione di inizio stimolo, selezionare l'attivazione in serie con una pre-attivazione di un fotogramma e un tempo di attivazione di 60.000 millisecondi. Sotto il titolo scansione temporale, scegliere due intervalli di un minuto ciascuno, uno per la fase pre e uno per la fase post conversione fotoindotta. Avviare la serie a intervalli per iniziare la conversione fotoindotta della regione di interesse definita.

Infine, scansionare il campione utilizzando un Zack e i laser a 488 e 543 nanometri. Per visualizzare la fluorescenza rossa fotoconvertita, così come qualsiasi fluorescenza verde residua, la microiniezione di SNEA in fenolo rosso nella vescicola otica determina inizialmente una risposta locale dell'ospite che, se iniettata correttamente, dovrebbe essere osservata esclusivamente nella vescicola otica e non nei tessuti circostanti o nel sangue. In alternativa, se vengono iniettati batteri marcati, una rapida scansione delle larve infette immediatamente dopo l'iniezione può confermare che i batteri si trovino soltanto nella vescicola otica e non nei tessuti circostanti.

I siti di microiniezione di un'infezione inizialmente localizzata sono utili per lo studio della chemotassi dei leucociti, come mostrato qui. Il reclutamento dei leucociti può essere quantificato mediante colorazione con Sudan black dei granuli dei neutrofili oppure fissazione con formaldeide di linee transgeniche fluorescenti, utilizzando linee di pesce zebra transgeniche che esprimono la proteina verde fluorescente Dendra due, specificamente nei macrofagi o nei neutrofili. È stato rivelato che l'iniezione di NEA nella vescicola otica induce il reclutamento di neutrofili e macrofagi e la fagocitosi dei batteri entro 60 minuti dall'infezione.

In questa figura, due macrofagi marcanti DRA reclutati nella vescicola otica a cinque ore post-infezione sono stati fotoconvertiti e successivamente monitorati nell'arco delle successive 24 ore. Sebbene alcune cellule fotoconvertite rimangano nella vescicola otica o nella regione della testa, alcune sono state trovate disseminate in tutto il corpo delle larve, come mostrato qui. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come eseguire un'iniezione microscopica di streptococcus n EEA nella vescicola otica di zebrafish di tre giorni post-fecondazione.

Questo include un passaggio in cui si allineano larve anestetizzate sullo stampo per iniezione e si carica l'ago con l'inoculo batterico. Due, microiniettare batteri nella vescicola otica. Tre, montare larve infette in agarosio a basso punto di fusione, e quattro, utilizzare un microscopio confocale per marcare fotoeticamente i leucociti dell'ospite e visualizzare le interazioni tra leucociti e patogeni in vivo.