Name: Imaging non invasiva della risposta immunitaria innata in un modello di Zebrafish larvale Streptococcus iniae Infezione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 16 s
Description: Scopri la microiniezione di Streptococcus iniae nella vescicola otica di larve di Danio rerio per l'imaging non invasivo della risposta immunitaria innata. Questo protocollo consente di visualizzare le interazioni ospite-patogeno in vivo mediante microscopia confocale e fotoetichettatura delle cellule immunitarie.

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Gli autori desiderano ringraziare i membri del laboratorio per la cura e la manutenzione zebrafish. Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health, National Research Service Award A155397 di EA Harvie e NIH R01GM074827 Anna Huttenlocher.

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<li>Deng, Q., Harvie, E. A., Huttenlocher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+signaling+mechanisms+mediate+neutrophil+attraction+to+bacterial+infection+and+tissue+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Distinct signaling mechanisms mediate neutrophil attraction to bacterial infection and tissue injury.</a> Cell. Microbiol. , (2012).</li>
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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Il metodo di infezione usato qui è utile per lo studio della risposta immunitaria ad un&#39;infezione inizialmente localizzata in 2-3 embrioni DPF e larve. L&#39;obiettivo di uno stimolo infiammatorio, come l&#39;infezione, in una cavità chiuso come vescicola otica consente lo studio di neutrofili e macrofagi chemiotassi e fagocitosi. Un avvertimento di iniettare batteri nella vescicola otica è che la capacità dei neutrofili di fagocitare batteri efficientemente in cavità piene di liquido può dipendere dal particolare m...

Streptococcus iniae è un importante agente patogeno acquatica che è in grado di causare una malattia sistemica, sia di pesce e gli esseri umani 1. Mentre S. iniae è responsabile per le grandi perdite nel settore dell&#39;acquacoltura, è anche un potenziale patogeno zoonotico, in grado di causare malattie in ospiti umani immunocompromessi con patologie cliniche simili a quelli causati da altri agenti patogeni umani streptococco. Date le sue somiglianze con agenti patogeni umani, è importante studiare S. malattia iniae patogenesi nel contesto di un ospite naturale. Un modello zebrafish adulto di S. infezione iniae rivelato robusto infiltrazione di leucociti host al sito di infezione localizzata nonché un rapido time per ospitare la morte, un tempo troppo breve per coinvolge il sistema immunitario adattativo 7. Al fine di ottenere uno sguardo approfondito nella risposta immunitaria innata di S. iniae infezione in vivo, è necessario utilizzare un modello che è più suscettibile di non-invasive immagini dal vivo. Il pesce zebra larvale ha una serie di vantaggi che lo rendono un modello vertebrato sempre più interessante per lo studio delle interazioni ospite-patogeno. Zebrafish sono relativamente economico e facile da usare e mantenere rispetto ai modelli di mammifero. Immunità adattativa non è funzionalmente maturo fino 4-6 settimane dopo la fecondazione, ma larve hanno un sistema immunitario innato vertebrati altamente conservata con complemento, recettori Toll-like, citochine e dei neutrofili e macrofagi con capacità antimicrobiche tra cui la fagocitosi e burst respiratorio 2-6, 8-11. Inoltre, la trattabilità genetica e trasparenza ottica delle fasi embrionali e larvali di sviluppo consentono la generazione di linee transgeniche stabili con cellule immunitarie fluorescente rendendo possibile esaminare interazioni ospite-patogeno in tempo reale in vivo. La generazione di queste linee transgeniche utilizzando una proteina fotoconvertibile come Dendra2 consente il tracciamento di origine della cellula ospite individuale e destino nel corso di infezione 12. Nello sviluppo di un modello di infezione larvale zebrafish, il sito scelto di microiniezione determinerà se l&#39;infezione è localizzata inizialmente o sistemica. Infezioni del sangue sistemiche nella vena caudale o condotto di Cuvier sono più comunemente utilizzati per studiare patogeni microbici in zebrafish e sono utili per lo studio delle interazioni tra ospite e cellule microbiche, risposte citochine, e le differenze nella virulenza tra i ceppi patogeni. Per la crescita di microorganismi lenti, iniezione presto nel sacco vitellino di un embrione allo stadio 16-1,000 cella può essere utilizzato per generare una infezione sistemica 13,14, con lo stadio di sviluppo ottimale per microiniezione di un microrganismo a crescita lenta trovato essere tra la fase di 16-128 cellule 15. Tuttavia, tuorlo iniezioni sac di molti microbi nelle fasi successive di sviluppo accoglienza tendono ad essere letale per tegli ospitare dovuto l&#39;ambiente ricco di sostanze nutritive per il microbo e la mancanza di infiltrazione leucociti 16-18. Una infezione localizzata di solito si traduce nella migrazione dei leucociti diretto verso il sito di infezione che possono essere facilmente quantificata con imaging non invasivo. Questo tipo di infezione può permettere per la dissezione dei meccanismi che mediano la migrazione dei leucociti, nonché le ricerche delle diverse capacità migratorie e fagocitosi delle diverse popolazioni di leucociti. Infezioni localizzate sono utili anche quando si esaminano le differenze di virulenza tra ceppi batterici oltre a studiare i meccanismi di invasione dal microbo barriere host fisici devono essere attraversate per una infezione localizzata di diventare sistemica. Zebrafish sono tipicamente sollevato a temperature di 25-31 ° C 19, ma possono anche essere mantenuto a temperature di 34-35 ° C per studi di invasività di alcuni agenti patogeni umani con requisiti di temperatura severiper la virulenza 20, 21. Molti siti differenti sono stati utilizzati per generare un&#39;infezione batterica inizialmente localizzata compresa ventricolo hindbrain 22, dorsale coda muscolare 18, pericardio cavità 23, e vescicole otica (orecchio) 5, 16, 24. Tuttavia, si è trovato che l&#39;iniezione di batteri nel muscolo coda può causare danni ai tessuti e infiammazione indipendente dei batteri, che possono alterare i risultati in cui si esamina risposta leucocitaria 13. Anche se meno danno è associato iniezione nel romboencefalo e anche se inizialmente privo di leucociti nei giovani embrioni, il ventricolo hindbrain guadagna costantemente più cellule immunitarie nel tempo microglia prendono la residenza. Il ventricolo rombencefalo è anche una posizione più difficile da immagine. La vescicola otica è una cavità chiusa senza accesso diretto alla vascolarizzazione 25, 26. Normalmente è privo di leukocytes, ma leucociti possono essere reclutati per vescicola otica in risposta a stimoli infiammatori come l&#39;infezione. E &#39;anche un sito preferito per microiniezione di batteri in zebrafish età 2-3 giorni dopo la fecondazione (dpf) a causa della facilità di imaging e la visualizzazione di iniezione. Pertanto, abbiamo scelto la vescicola otica come il nostro sito di infezione batterica localizzata.

<table><tbody><tr><td>1,7 ml Eppendorfs</td><td>MidSci</td><td>AVSS1700</td><td></td></tr><tr><td>14 ml Provetta Falcon</td><td>BD Falcon</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>ago da 27 G x &frac12; pollici</td><td>BD Biosciences</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>96 pozzetti Plate</td><td>Corning Incorporated</td><td>3596</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>BD Biosciences</td><td>214030</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker Red</td><td>Molecular Probes, Invitrogen</td><td>C34552</td><td></td></tr><tr><td>CNA agar</td><td>Dot Scientific, Inc</td><td>7126A</td><td></td></tr><tr><td>Pipette di trasferimento monouso</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-7m</td><td></td></tr><tr><td>Cannocchiale da dissezione</td><td>Nikon</td><td>SMZ745</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo 200 proof</td><td>MDS</td><td>2292</td><td></td></tr><tr><td>Pinzetta fine</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Pettine in gel</td><td>VWR</td><td>27372-482</td><td>4,2 mm di larghezza, 1,5 mm di spessore</td></tr><tr><td>Piastre</td><td></td><td></td> con fondo in vetro <td>Realizzato su misura praticando un foro da 16 - 18 mm al centro del fondo di una piastra per coltura tissutale da 35 mm e posizionando un vetrino coprioggetto rotondo #1 da 22 mm nel foro e sigillando con un sottile strato di Norland Optical Adhesive 68 polimerizzato con luce UV.</td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>Fisher Scientific</td><td>G33-4</td><td></td></tr><tr><td>Agarosio ad alto punto di fusione</td><td>Denville Scientific, Inc.</td><td>CA3510-6</td><td></td></tr><tr><td>Perossido di idrogeno</td><td>Fisher Scientific</td><td>H325</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocale a scansione laser</td><td>Olympus</td><td>con sistema</td><td></td>FV-1000</tr><tr><td>Agarosio a basso punto di fusione</td><td>Fisher</td><td>BP165-25</td><td></td></tr><tr><td>Supporto magnetico</td><td>Tritech (Narishige)</td><td>GJ-1</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di microiniezione</td><td>Parker</td><td>Picospritzer III</td><td></td></tr><tr><td>Puntali per pipette Microloader</td><td>Eppendorf</td><td>930001007</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipolatore</td><td>Tritech (Narishige)</td><td>M-152</td><td></td></tr><tr><td>Estrattore per micropipette</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>Flaming/Brown P-97</td><td></td></tr><tr><td>Spettrofofometro Nanodrop</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-1000</td><td></td></tr><tr><td>N-Feniltiourea (PTU)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldheyde</td><td>Microscopia elettronica Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>piastre di Petri</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td>100 x 15 mm</td></tr><tr><td>Fenolo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P-4557</td><td></td></tr><tr><td>Fenolo Rosso</td><td>Ricca Chemoical Company</td><td>572516</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP665-1</td><td></td></tr><tr><td>Idrossido di potassio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P-6310</td><td></td></tr><tr><td>Pronase</td><td>Roche</td><td>165921</td><td></td></tr><tr><td>Proteasi peptone</td><td>Fluka Biochemika</td><td>29185</td><td></td></tr><tr><td>Piatto per coltura cellulare di piccole dimensioni</td><td>Corning Incorporated</td><td>430165</td><td>35 x 10 mm</td></tr><tr><td>Sudan Black</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2380</td><td></td></tr><tr><td>Aghi per iniezione capillare in vetro a parete sottile World</td><td>Precision Instruments, Inc.</td><td>TW100-3</td><td></td></tr><tr><td>Todd Hewitt</td><td>Sigma Aldrich/Fluka Analytical</td><td>T1438</td><td></td></tr><tr><td>Tricaina (etile 3-amminobenzoato)</td><td>Argent Chemical Laboratory/Finquel</td><td>C-FINQ-UE-100G</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>Estratto di lievito</td><td>Fluka Biochemika</td><td>Codice 92144</td><td></td></tr></tbody></table>

imaging non invasiva della risposta immunitaria innata in un modello di zebrafish larvale<em&gt; streptococcus iniae</em&gt; infezione

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

L&#39;agente patogeno acquatica, Streptococcus iniae, è responsabile di oltre 100 milioni di dollari di perdite annuali per il settore dell&#39;acquacoltura ed è in grado di causare la malattia sistemica sia di pesce e gli esseri umani. Una migliore comprensione del S. malattia iniae patogenesi richiede un sistema di modello appropriato. La trattabilità genetica e la trasparenza ottica delle prime fasi di sviluppo di zebrafish permettono la generazione e non invasiva di imaging di linee transgeniche con fluorescente contrassegnati cellule immunitarie. Il sistema immunitario adattativo, non è pienamente funzionale fino a qualche settimane dopo la fecondazione, ma larve di pesce zebra hanno un sistema immunitario innato vertebrati conservati sia con neutrofili e macrofagi. Così, la generazione di un modello di infezione larvale consente lo studio del contributo specifico di immunità innata nel controllo S. infezione iniae. Il sito di microiniezione determinerà se l&#39;infezione èsistemica o inizialmente localizzato. Qui, vi presentiamo i nostri protocolli di iniezione vescicola otica di zebrafish età 2-3 giorni dopo la fecondazione e le nostre tecniche per l&#39;imaging confocale a fluorescenza di infezione. Un sito di infezione localizzata permette l&#39;osservazione di invasione microbo iniziale, reclutamento di cellule ospiti e la diffusione di infezioni. I nostri risultati utilizzando il modello larvale zebrafish di S. infezione iniae indicano che zebrafish può essere utilizzato per esaminare i contributi diversi di neutrofili e macrofagi ospitanti in infezioni batteriche localizzate. Inoltre, viene descritto come photolabeling di cellule immunitarie possono essere utilizzati per monitorare il destino della cellula ospite individuale nel corso di infezione.

Microiniezione di S. iniae nella vescicola otica (Figura 1 e Figura 2) si traduce in una risposta dell&#39;ospite inizialmente localizzata. Quando iniettato correttamente, i batteri dovrebbero essere viste soltanto vescicola otica e non nel tessuto circostante o sangue. Questo può essere visualizzato durante microiniezione utilizzando colorante rosso fenolo (Figura 1A). In alternativa, se i batteri etichettati vengono iniettate, una rapida scansione delle larve...

Qui, presentiamo un protocollo per la generazione e l'imaging di un'infezione batterica localizzata nella vescicola otica del pesce zebra.

Imaging non invasiva della risposta immunitaria innata in un modello di Zebrafish larvale<em&gt; Streptococcus iniae</em&gt; Infezione

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di microiniettare larve di pesce zebra con un patogeno batterico, Streptococcus IEA, al fine di ottenere immagini in vivo non invasive della risposta immunitaria dell'ospite. Questo viene realizzato caricando innanzitutto l'ago da microiniezione con una sospensione batterica e allineando le larve di pesce zebra anestetizzate sullo stampo per iniezione in agarosio. Successivamente, la sospensione batterica viene microiniettata nella vescicola otica delle larve.Successivamente, le larve iniettate vengono montate in agarosio a bassa fusione. Infine, le cellule immunitarie dell'ospite vengono marcate con un'etichetta fotoattivabile per un facile tracciamento e l'infezione viene osservata mediante microscopia confocale. In definitiva, l'iniezione microscopica di Streptococcus ina in vescicola otica e il successivo marcamento fotoattivabile insieme alla microscopia confocale vengono utilizzati per studiare la risposta immunitaria dell'ospite nelle larve di pesce zebra.Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'iniezione nella vena codale, è che l'iniezione nella vescicola otica genera un'infezione batte

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Embrioni di zebrafish trasparente si sono dimostrati padroni di casa modello utile per la visualizzazione e lo studio delle interazioni funzionali tra cellule immunitarie innate e batteri patogeni intracellulari, come ad...

L&#39;infezione di embrioni di zebrafish con batteri patogeni intracellulari

Il rapido sviluppo, di piccola dimensione e la trasparenza delle zebrafish sono vantaggi enormi per lo studio del sistema immunitario innato il controllo delle...

Non invasiva Imaging di candidosi disseminata nelle larve Zebrafish

Fonte: Zhang, X., et al. Un modello di embrione di pesce zebra per la visualizzazione in vivo e l'analisi intravitale dell'infezione da Staphylococcus aureus associata a biomateriali. J. Vis. Exp. (2019)Questo video mostra l'imaging a fluorescenza di embrioni di zebrafish iniettati con Staphylococcus aureus, consentendo la quantificazione della progressione dell'infezione e della distribuzione batterica per valutare l'impatto delle microsfere di biomateriali sulle interazioni ospite-patogeno in...

 Imaging a fluorescenza dell'infezione batterica associata a biomateriale in embrioni di zebrafish

Fonte: Zhang, X. et. al., Un modello di embrione di pesce zebra per la visualizzazione in vivo e l'analisi intravitale dell'infezione da Staphylococcus aureus associata a biomateriali. J. Vis. Exp. (2019)Questo video mostra un modello di embrione di zebrafish per lo studio delle infezioni legate ai biomateriali impiantati. L'iniezione di Staphylococcus aureus con microsfere di polistirene migliora la sopravvivenza batterica, confermando il ruolo di promozione delle infezioni dei materiali...

Analisi in vivo delle infezioni batteriche associate all'impianto utilizzando embrioni di zebrafish

Questo video dimostra il monitoraggio del reclutamento dei leucociti utilizzando larve di pesce zebra transgenico che esprimono proteina fluorescente verde fotoconvertibile. La pre-iniezione di batteri marcati con colorante fluorescente rosso nella vescicola otica e l'induzione della fotoconversione consentono di osservare la migrazione, la fagocitosi e la dispersione dei leucociti in tutto il corpo, fornendo preziose informazioni sulle dinamiche della risposta immunitaria.

Tracciamento dei leucociti basato sulla fotoconversione in zebrafish transgenico infetto da batteri

Il video mostra una tecnica di ferimento e intrappolamento del pesce zebra per osservare l'infezione da patogeni fungini marcati in modo fluorescente nelle larve di pesce zebra. L'infezione iniziale attira i macrofagi e, man mano che l'infezione persiste, il reclutamento dei neutrofili progredisce nel sito di iniezione.

Una tecnica zWEDGI per visualizzare le larve di pesce zebra infettate da agenti patogeni fungini

La risposta immunitaria innata protegge contro l'infezione da organismi patogeni. Una componente fondamentale della risposta immunitaria innata, il burst respiratorio dei fagociti, genera specie reattive dell'ossigeno che uccidono i microrganismi invasori. Descriviamo un saggio burst respiratorio che quantifica specie reattive dell'ossigeno prodotte quando la risposta immunitaria innata è indotta chimicamente.

Quantificazione della risposta Burst respiratoria come un indicatore di Innate Immune Salute in Zebrafish

Studiando i primi eventi di progressione delle cellule preneoplastiche e interazione innata cellule immunitarie è fondamentale per comprendere e curare il cancro. Qui si descrive un metodo per indurre condizionale trasformazioni cellule epiteliali e la successiva di immagini dal vivo di interazione innata cellule immunitarie con HRAS G12V esprimono le cellule della pelle in larve di zebrafish.

Immagini dal vivo di Innata immunitario e preneoplastiche interazioni cella utilizzando un / UAS Expression System inducibile GAL4 in Zebrafish larvale pelle

Gli embrioni di pesce zebra otticamente trasparenti sono ampiamente utilizzati per studiare e visualizzare in tempo reale le interazioni tra microrganismi patogeni e cellule immunitarie innate. La microiniezione di Mycobacterium abscessus, combinata con l'imaging a fluorescenza, viene utilizzata per esaminare le caratteristiche patogene essenziali come la formazione del cordone negli embrioni di zebrafish.

Decifrare e Imaging Patogenesi e Cording di<em&gt; Mycobacterium abscessus</em&gt; In Zebrafish embrioni

Vengono dimostrati modelli di infezione sistemica e localizzata da zebrafish per il virus dell'influenza umana A. Utilizzando un modello di infezione sistemica, il pesce zebra può essere utilizzato per lo screening di farmaci antivirali. Utilizzando un modello di infezione localizzata, il pesce zebra può essere utilizzato per caratterizzare le risposte delle cellule immunitarie dell'ospite.

Utilizzando modelli di Zebrafish di umana virus infezioni allo schermo farmaci antivirali e caratterizzare host immune cellulo Risposte

Il presente studio descrive un modello di embrione di zebrafish per videomicroscopia analisi di biomateriale infezione nel corso del tempo basato su microscopia di fluorescenza e la visualizzazione in vivo. Questo modello è un promettente sistema integrando modelli animali mammiferi quali modelli murini per lo studio delle infezioni associate al biomateriale in vivo.

Un modello di embrione di Zebrafish per nel Vivo visualizzazione e analisi videomicroscopia del biomateriale-collegata dello stafilococco aureo infezione

Scopri la microiniezione di Streptococcus iniae nella vescicola otica di larve di Danio rerio per l'imaging non invasivo della risposta immunitaria innata. Questo protocollo consente di visualizzare le interazioni ospite-patogeno in vivo mediante microscopia confocale e fotoetichettatura delle cellule immunitarie.

Imaging non invasiva della risposta immunitaria innata in un modello di Zebrafish larvale

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