Imaging non invasiva della risposta immunitaria innata in un modello di Zebrafish larvale Streptococcus iniae Infezione

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di microiniettare una larva di pesce zebra con un patogeno batterico, lo streptococco IEA, per l'imaging non invasivo della risposta immunitaria dell'ospite. Ciò si ottiene caricando prima l'ago per microiniezione con una sospensione batterica e allineando le larve di zebrafish anestetizzate sullo stampo per iniezione di agarosio. Successivamente, la sospensione batterica viene microiniettata nella vescicola otica delle larve.

Quindi le larve iniettate vengono montate in agarosio a basso punto di fusione. Gus, infine, le cellule immunitarie dell'ospite vengono foto-etichettate per un facile tracciamento e l'infezione viene ripresa utilizzando un microscopio confocale. In definitiva, la microiniezione di streptococcus IEA nella vescicola otica e la successiva fotomarcatura e microscopia confocale sono utilizzate per studiare la risposta immunitaria dell'ospite delle larve di zebrafish.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come l'iniezione di vena di coccodrillo, è che l'iniezione di vescicole otiche genera un'infezione batterica localizzata per consentire l'imaging non invasivo delle interazioni tra patogeni dell'ospite nella larva di pesce zebra trasparente. Per iniziare, preparare una soluzione di aro ad alto punto di fusione dall'1,5 al 2% in mezzo E tre e microonde fino a quando la soluzione non è limpida. Una volta raffreddato, versare un po' di aros in una capsula di Petri, aggiungendo quanto basta per coprire il fondo della pirofila e far roteare.

Una volta che l'aros si è solidificato, posiziona sopra un pettine di gel risciacquato e asciugato in modo che l'estremità solida sia appena appoggiata sulla parte superiore della capsula di Petri e l'estremità dentellata tocchi l'aros. Assicurarsi che il pettine sia il più orizzontale possibile, creando un angolo di 30 gradi rispetto allo strato inferiore dell'aros. Versare un'ulteriore piccola quantità di aros all'interfaccia tra il pettine e lo strato di aros inferiore in modo che lo strato di aros fresco copra i pozzetti del favo.

Lasciarlo raffreddare completamente prima di rimuovere il pettine. Quindi, utilizzando un puntale per pipetta, rimuovere eventuali pezzi di aros sporgenti dai pozzetti. Versare il mezzo E three sopra lo stampo a iniezione e conservare a quattro gradi Celsius.

Dopo aver preparato l'inoculo SNEA e le larve di pesce zebra per le iniezioni secondo il protocollo di testo, accendere il micro iniettore e impostare l'intervallo di tempo su millisecondi. Aprire la valvola sul serbatoio dell'anidride carbonica per far entrare il gas nella linea. La pressione del micro iniettore dovrebbe leggere circa 20 PSI vortex la coltura SNEA preparata in rosso fenolo e PBS e utilizzare una punta del micro caricatore per caricare due o tre microlitri della coltura in un ago per iniezione capillare tirato, montare l'ago caricato su un micro manipolatore collegato a un supporto magnetico e posizionarlo sotto uno stereomicroscopio in modo che l'ago si trovi a un angolo di circa 45-65 gradi rispetto alla base del microscopio.

Per prima cosa rompere la punta dell'ago usando un paio di pinzette sottili, premere il pedale del micro iniettore per erogare una goccia di inoculo sulla punta dell'ago. Utilizzare la barra della scala nella lente oculare del microscopio per misurare il diametro della goccia. Il diametro della goccia dovrebbe essere di circa 0,10 millimetri, che è circa un nanolitro di volume.

Per regolare la dimensione della goccia, regolare l'impostazione della durata sul micro iniettore o utilizzare una pinzetta sottile per tagliare una parte maggiore della punta dell'ago. Il tempo di iniezione dovrebbe essere compreso tra 20 e 35 millisecondi per evitare troppi danni ai tessuti. Successivamente, utilizzando una pipetta di trasferimento in plastica, trasferire un pesce per pozzetto in ciascuno dei 12 pozzetti dello stampo a iniezione.

Quindi, con un'asta di vetro, un anello per capelli o una punta di plastica, posiziona delicatamente le larve in modo che le teste siano rivolte verso la parte posteriore del microscopio e le sacche vitellino siano contro il lato sinistro del pozzetto. Punta l'orecchio sinistro delle larve verso il soffitto. Quando le larve sono pronte per l'iniezione, utilizzare le manopole sul micromanipolatore per allineare l'ago caricato con la vescicola otica in modo che entrambi si trovino nello stesso campo visivo.

Con la punta dell'ago, perforare lo strato epiteliale esterno della vescicola otica in modo che la punta sia appena all'interno della vescicola. Ora, utilizzando una pressione sufficientemente bassa da non rompere la cavità, premere il pedale per iniettare un nanolitro della dose desiderata di SNEA. Se l'iniezione ha successo, la vescicola otica, ma non il tessuto circostante, deve riempirsi con un inoculo di rosso fenolo.

Ritrarre con cautela l'ago dalle larve e, con un ingrandimento di cinque volte, spostare manualmente la piastra di iniezione in modo che le larve siano in vista. Se si iniettano batteri marcati in fluorescenza con un microscopio a fluorescenza, scansionare visivamente le larve iniettate e conservare solo quelle in cui si è verificata la deposizione di batteri solo all'interno della vescicola otica per garantire che il volume di iniezione rimanga lo stesso nel corso dell'esperimento. Dopo aver iniettato ogni 48 embrioni, iniettare una goccia di sospensione batterica in una provetta da centrifuga da 1,7 millilitri contenente 100 microlitri di PBS sterile.

Quindi impiattare i 100 microlitri su piastre a coclea THY plus P e incubare a 37 gradi Celsius durante la notte. Per determinare la CFU nel volume di iniezione, quando è stato iniettato un intero gruppo di 12 larve sulla rampa di iniezione, utilizzare con cautela una pipetta di trasferimento in plastica per rimuovere le larve dai pozzetti e metterle in una nuova capsula di Petri. Rimuovere la soluzione di trica e sostituirla con circa due millilitri di terreno fresco di E three per consentire alle larve di riprendersi.

Incubare gli embrioni secondo il protocollo di testo. Dopo aver preparato aros con trica, secondo il protocollo di testo sul tavolino dello stereomicroscopio, utilizzare una pipetta di trasferimento per posizionare da quattro a cinque larve anestetizzate in un piatto con fondo di vetro. Togliete la soluzione di trica e aro dal bagnomaria a 55 gradi Celsius e lasciatela raffreddare a temperatura ambiente per uno o due minuti.

Nel frattempo, rimuovere quanto più liquido possibile dalle larve anestetizzate. Quindi, versare gli agro raffreddati nella pirofila fino a coprire circa metà della superficie. Quindi agitare il piatto per spalmare l'aros.

Raccogli le larve che hanno galleggiato ai lati del piatto e pipettale di nuovo al centro. Quindi, sotto lo stereomicroscopio, utilizzare una lunga punta della pipetta per posizionare delicatamente le larve come desiderato per l'imaging. La vescicola otica posiziona le larve in modo che la vescicola otica destra sia rivolta verso l'alto e la vescicola otica sinistra sia piatta contro il fondo del piatto.

Lasciate raffreddare gli aros per circa 10 minuti prima di spostare il piatto. Quindi pipettare delicatamente un po' di trica e una soluzione di E tre sopra lo strato di aros per mantenerlo umido. Per visualizzare i campioni, utilizzare una scansione Zack con i laser a 488 nanometri e 543 nanometri.

Utilizzare la scansione a linea continua per regolare la potenza del laser e il guadagno del rivelatore. Verificare che non vi siano fluorescenze rosse convertite accidentalmente nella finestra di controllo dell'acquisizione dell'immagine. In Impostazioni stimolo, selezionare lo strumento Usa scanner e scegliere principale, selezionare il laser a 405 nanometri e impostarlo al 70% di potenza.

Quindi, utilizzando l'opzione cerchio, definire la regione di interesse nella vescicola odica sotto l'impostazione di avvio dello stimolo, selezionare l'attivazione in serie con una preattivazione di un fotogramma e un tempo di attivazione di 60.000 millisecondi nella finestra di impostazione dell'acquisizione. Sotto l'intestazione scansione temporale, scegli due intervalli di un minuto ciascuno, uno per la pre e uno per la conversione post-foto. Avvia la serie time-lapse per avviare la conversione fotografica della regione di interesse definita.

Infine, scansiona il campione utilizzando uno Zack e i laser a 488 e 543 nanometri. Per visualizzare la fluorescenza rossa fotoconvertita, così come l'eventuale fluorescenza verde rimanente, la microiniezione di SNEA in rosso fenolo nella vescicola otica provoca una risposta dell'ospite inizialmente localizzata che, se iniettata correttamente, dovrebbe essere visibile solo nella vescicola otica e non nel tessuto o nel sangue circostante. In alternativa, se i batteri marcati vengono iniettati, una rapida scansione delle larve infette immediatamente dopo l'iniezione può confermare che i batteri si trovano solo nella scle otica e non nel tessuto circostante.

I siti di microiniezione dell'infezione inizialmente localizzata sono utili per studiare la chemiotassi leucocitaria, come mostrato qui. Il reclutamento dei leucociti può essere quantificato mediante Sudan, colorazione nera di granuli neutrofili o fissazione con formaldeide di linee transgeniche fluorescenti utilizzando linee transgeniche di zebrafish transgeniche che esprimono la proteina fluorescente verde. Dendra due, in particolare nei macrofagi o nei neutrofili, ha rivelato che l'iniezione di NEA nella vescicola otica ha innescato il reclutamento di neutrofili e macrofagi e la fagocitosi dei batteri entro 60 minuti dall'infezione.

In questa figura, i macrofagi marcati DRA two che sono stati reclutati nella vescicola otica cinque ore dopo l'infezione sono stati fotoconvertiti e quindi monitorati nelle 24 ore successive. Sebbene alcune cellule fotoconvertite rimangano nella vescicola otica o nella regione della testa, alcune sono state trovate anche disseminate in tutto il corpo delle larve, come si vede qui. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come microiniettare lo streptococco n EEA nella vescicola otica del pesce zebra di età pari a tre giorni dopo la fecondazione.

Ciò include l'allineamento delle larve anestetizzate sullo stampo a iniezione e il caricamento dell'ago con l'inoculo batterico. Due batteri che si iniettano nella vescicola otica. Tre, montaggio di larve infette in aero a basso punto di fusione e quattro, utilizzando un microscopio confocale per fotomarcare i leucociti ospiti e visualizzare le interazioni dei patogeni leucocitari in vivo.