Name: Infuso stereotassico di Oligomeric amiloide-beta nelle Hippocampus mouse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: Scopri l'infusione stereotassica di oligomeri di amiloide-beta 1-42 nel giro dentato dell'ippocampo di topo. Questo metodo permette di studiare gli effetti tossici dell'Aβ42 sui neuroni in vivo con precisione spaziale e temporale.

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Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institute of Neurological Disorder and Stroke concedere NS081333 (CMT), Alzheimer sovvenzione dell&#39;Associazione NIRG-10-171.721 e Istituto Nazionale di Salute Mentale concessione MH096702 (UH), e National Institute on Aging, finanziato la ricerca sulle malattie di Alzheimer Center presso la Columbia University di sovvenzione pilota AG008702 (a YYJ e JB).

Nota: Per tutti sperimentazione animale, istituzionale e le linee guida nazionali per la cura e l&#39;uso di animali da laboratorio sono stati seguiti. 1. Preparare Strumenti chirurgici e soluzioni per la chirurgia <ol><li> Autoclavare tutti gli strumenti chirurgici in acciaio inox. </li><li> Preparare 70% di etanolo diluendo 200 prova etanolo assoluto con grado molecolare acqua distillata deionizzata sterile. </li><li> Attaccare l&#39;ago G 29 alla siringa Hamilton. Pulire l&#39;interno della siringa Hamilton e l&#39;ago attraverso l&#39;elaborazione e l&#39;acqua espulsione Nanopure ripetutamente per 1 min. Ripetere questa procedura con il 70% di etanolo. <ol><li> Rimuovere il pistone e l&#39;ago dalla siringa Hamilton. Asciugare le parti in una cappa O / N a flusso laminare. </li><li> Irradiare l&#39;ago e la siringa con la luce ultravioletta per 30 minuti prima dell&#39;uso. </li></ol></li><li> Preparare la soluzione salina sciogliendo NaCl in acqua grado molecolare ad un peso finale di concentrazione in volume del 0,9%. SteriliZE la soluzione filtrandola attraverso 0,2 micron filtro pori. </li></ol> 2. Preparare oligomerica Ap 1-42 <ol><li> Monomerize e risospendere ricombinante umana Ap 1-42 in DMSO a 5 mM esattamente come descritto nella pubblicazione di Fa &#39;altri 13. </li><li> Diluire 5mM Ap 1-42 con sterile (1x) PBS a 100 micron per il giorno prima dell&#39;intervento. </li><li> Mescolare bene la soluzione per triturazione. </li><li> Incubare Ap soluzione 1-42 per 12 ore a 4 ° C. Nota: Le soluzioni di controllo come la diluizione DMSO in PBS o strapazzate / retromarcia Ap 1-42 peptide dovrebbe essere preparato allo stesso modo di Ap 1-42. </li></ol> 3. Determinare coordinate iniezione <ol><li> Utilizzare i adulto atlante del cervello mouse per determinare l&#39;esatta antero-posteriore (AP), medio-laterale (ML), e dorso-ventrale (DV) coordina per la regione del cervello di interessi 14. Note: per illustrare la tecnica abbiamo scelto il giro dentato dell&#39;ippocampo, come l&#39;obiettivo con le seguenti coordinate dal bregma: AP, -2.00 mm; ML, ± 1,3 millimetri; DV, -2.2 mm. Il segno negativo che precede il valore AP indica che 2,00 mm posteriormente del bregma. Il segno che precede il valore ± ML indica la direzione a destra ea sinistra dal centro. Infine, il segno negativo che precede la DV indica si sta muovendo ventralmente dalla superficie del cervello. </li></ol> 4. stereotassico Impostazione cornice <ol><li> Indossare una maschera chirurgica faccia, camice da laboratorio pulito, e guanti chirurgici sterili. </li><li> Pulire strumento stereotassico e l&#39;adattatore di mouse con il 70% di etanolo. </li><li> Adagiare sterile telo chirurgico sul bancone. </li><li> Posizionare lo strumento stereotassico con adattatore mouse sulla parte superiore del telo chirurgico sterile. </li><li> Pulire il rilievo di riscaldamento di mouse con il 70% di etanolo. Posizionare il pad riscaldamento sopra il letto telaio stereotassico. Utilizzare labora general purposetory nastro con etichette su nastro lungo la piastra elettrica sul letto adattatore del mouse. <ol><li> Fissare la piastra elettrica alla pompa ricircolatore acqua calda secondo le istruzioni del produttore. </li><li> Accendere la pompa ricircolatore acqua calda e impostare la temperatura a 37 ° C, e poi attendere fino a raggiungere la temperatura. </li></ol></li><li> Fissare la siringa da 50 microlitri Hamilton con un ago G 29 sul telaio stereotassico avvitandolo sull&#39;albero iniezione verticale motorizzato secondo le istruzioni del produttore. </li><li> Accendere lo sterilizzatore tallone e attendere fino a raggiungere la temperatura preimpostata del produttore. Nota: Questo è usato per la sterilizzazione degli strumenti in acciaio inossidabile tra animali. Prende strumenti 20 sec di contatto con i granuli di sterilizzazione. </li><li> Accendere piastra calda e impostarlo a 42 ° C e posizionare una gabbia vuota pulito in cima. </li><li> Mentre la siringa Hamilton è fissato sul telaio stereotassico utilizzare il stereotassica i motorizzatonjector di elaborare la soluzione Ap 1-42. Nota: Elaborare più di 4 ml di soluzione nella siringa e quindi utilizzare l&#39;iniettore stereotassica per impostare il volume d&#39;iniezione. Azionare l&#39;iniettore secondo le istruzioni del produttore. </li></ol> 5. Preparazione degli animali <ol><li> Determinare il peso del mouse usando la scala pesare. </li><li> Anestetizzare mouse con ketamina / xilazina cocktail a 100 mg / kg ketamina e 10 mg / kg xilazina iniettando per via intraperitoneale (IP). Monitorare la profondità dell&#39;anestesia dalla perdita di pinch toe reflex. </li><li> Dopo che il mouse è sedato prendere il tagliatore di capelli e radersi la testa per esporre la pelle sopra il cranio. </li><li> Posizionare il mouse sulla parte superiore del pad riscaldamento sulla cima del letto stereotassico. </li><li> Utilizzare la spatola per aprire la bocca e posizionare i denti incisivi dentro la guardia denti. Fissare il revolver sulla faccia del mouse. Fissare con delicatezza e non troppo stretto. </li><li> PosiTion traverse orecchio bilaterali in meato uditivo per fissare la testa. Spostare ogni traversina fino a raggiungere il cranio, e poi girare la vite per bloccarlo. <ol><li> Per assicurarsi che la testa è assicurato usa il dito indice per spingere delicatamente sulla testa. Se la testa è correttamente protetto, non darà fuori o muoversi quando viene premuto. </li></ol></li><li> Applicare una goccia di crema per gli occhi o collirio per gli occhi per mantenerli umidi. Assicurarsi che gli occhi sono umidi durante tutta la procedura chirurgica. </li><li> Per disinfettare il sito chirurgico utilizzare tamponi di cotone sterili per applicare la soluzione betadine per la pelle sopra il cranio, seguito dal 70% di etanolo. Eseguire la betadine alternata e il 70% di pulizia 2 volte etanolo. </li></ol> 6. Chirurgia e Infusion <ol><li> Utilizzare un bisturi per fare un&#39;incisione 2-3 mm sulla linea mediana del cuoio capelluto, e quindi utilizzare un dritto forbici multa di estendere la linea di incisione di 1,0-1,5 cm per esporre la sutura sagittale, bregma e lambda del cranio, punto di riferimentos che le coordinate stereotassica si basano su. Utilizzare micro pinze per mantenere la pelle a parte. Nota: Le posizioni bregma e lambda sono spiegati nel topo cervello atlante &quot;Il cervello di topo in stereotassico coordinate&quot; 14. </li><li> Prendete un batuffolo di cotone, immergerlo in soluzione salina sterile, e usarlo per pulire il cranio. Quindi, utilizzare un tampone di cotone pulito e asciutto per asciugare il cranio. </li><li> Utilizzare una penna a punta fine sterile per segnare un punto sulla bregma. Utilizzare il micromanipolatore stereotassica per posizionare la siringa Hamilton modo che la punta dell&#39;ago tocca appena il punto sulla bregma. <ol><li> Registra la coordinata DV. </li><li> Per verificare se l&#39;asse AP del cranio è livello di spostare la siringa Hamilton posteriormente in modo che la punta dell&#39;ago tocca il punto lambda. </li><li> Registrare la posizione di DV. Assicurarsi che coordina il DV per bregma e lambda sono entro 0,5 mm. Nota: L&#39;obiettivo è di ridurre al minimo la differenza tra il DV bregma e lambda. </li></ol></li><li> Usaliicromanipulator per tornare alla punta siringa Hamilton torna al punto bregma. </li><li> Registrare la posizione di partenza di AP. </li><li> Calcolare la posizione di AP fine sottraendo 2,00 millimetri dalla AP partire coordinate. </li><li> Utilizzare il micromanipolatore per riposizionare l&#39;ago della siringa Hamilton alla finale AP coordinate. </li><li> Registra la coordinata corrente ML. </li><li> Calcolare sinistra e destra termina ML coordinate aggiungendo o sottraendo 1,3 millimetri dalla partire ML coordinate. </li><li> Utilizzare il micromanipolatore per spostare l&#39;ago della siringa Hamilton sia coordinata ML finale. <ol><li> Toccare la punta dell&#39;ago sulla superficie del cranio su entrambi terminano coordinate ML e registrare le coordinate DV e assicurarsi che i valori sono entro 0,5 mm. Nota: L&#39;obiettivo è di ridurre al minimo la differenza DV tra i due termina coordinate ML. </li><li> Mentre a un finale coordinata tirare l&#39;ago su 0,5-1 cm sopra il cranio. Prendete una penna a punta fine sterile per segnare un punto su the superficie del cranio. Ripetere questa operazione per il lato controlaterale del cranio. </li></ol></li><li> Ruotare la siringa Hamilton chiara fuori strada. </li><li> Fissare 0,8 millimetri testa di perforazione per il trapano. Prendere il trapano con entrambe le mani, impostare gomiti sulla superficie del tavolo per la stabilità, e posizione leggermente la testa di perforazione sopra il punto sharpie sulla sinistra o destra ML coordinate. Attivare il trapano, abbassare la punta della fresa sulla superficie del cranio di introdurre un foro nel cranio. Ripetere questa operazione per il lato controlaterale. Nota: Alcuni sanguinamento può avvenire dai fori di nuova introduzione. Se c&#39;è sanguinamento quindi utilizzare un batuffolo di cotone pulito e asciutto per tamponare il sangue. </li><li> Spostare la siringa Hamilton di nuovo in posizione su uno dei due fori ML di nuova introduzione. Abbassare l&#39;ago Hamilton appena passato il cranio. A questo punto fare attenzione a non forare il cervello. Per assicurarsi che l&#39;ago è passato il cranio prendere il dito indice e spingere delicatamente l&#39;ago contro il cranio per fare sure l&#39;ago non uscire dal buco. </li><li> Registra la coordinata DV partenza. </li><li> Calcola la coordinata DV fine sottraendo 2,2 millimetri dal DV partire coordinate. </li><li> Abbassare l&#39;ago verso il DV fine di coordinate. </li><li> Attivare la pompa iniettore stereotassica per pompare 4 ml di Ap 1-42 nel giro dentato ad una velocità di 0,5 ml / min. </li><li> Quando l&#39;infusione è completo lasciare l&#39;ago rimanga in vigore per un ulteriore 1 min per ridurre al minimo il riflusso di soluzione fuori del sito di iniezione. </li><li> Spostare l&#39;ago verso l&#39;altro lato del cervello e ripetere i passaggi 6,13-6,18. </li></ol> 7. Rimozione animali e Cura postoperatoria <ol><li> Allentare le barre orecchio e guardia faccia / naso. Rimuovere il mouse dall&#39;apparecchio. </li><li> Utilizzare uno studente pinza modello standard per tirare chiudere il cuoio capelluto e quindi sigillare la ferita con sutura. </li><li> Iniettare 1 ml di soluzione salina sterile nel mouse tramite IP per l&#39;idratazione. </li><li> Ingetto buprenorfina (0,1 mg / kg) per via sottocutanea per alleviare il dolore. </li><li> Mantenere il mouse nella gabbia vuota pulito sulla cima di 42 ° C piastra fino a quando non si sveglia, per poi tornare alla sua gabbia alloggiamento con abbondante acqua e cibo. </li><li> Somministrare buprenorfina per via sottocutanea ogni 12 ore per 3 giorni per alleviare il dolore. </li></ol> 8. sutura rimozione <ol><li> Anestetizzare il mouse con ketamina / xylazina cocktail a 100 mg / kg di ketamina e 10 mg / kg xlyazine da IP. Nota: Questo viene fatto 7-10 giorni dopo l&#39;intervento chirurgico. </li><li> Utilizzare uno studente pinza modello standard e diritte forbici sottili per rimuovere la sutura. </li><li> Iniettare 1 ml di soluzione salina sterile nel mouse tramite IP per l&#39;idratazione. </li><li> Mantenere il mouse in una gabbia vuota pulito sulla cima di 42 ° C piastra fino a quando non si sveglia, e poi tornare alla sua gabbia alloggiamento con abbondante acqua e cibo. </li></ol> 9. Animal sacrificio e Tissue Processing <ol><li> Anestetizzare il mouse e perfuse con 4% paraformaldeide 15, rimuovere il cervello, ed elaborare per criosezionamento 16. Nota: I tempi di sacrificio animale dipende sperimentatore. Tuttavia, per i nostri studi abbiamo scelto 7 e 14 giorni dopo l&#39;intervento chirurgico. </li></ol>

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<li>Brashear, H. R., Zaborszky, L., Heimer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+GABAergic+and+cholinergic+neurons+in+the+rat+diagonal+band%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Distribution of GABAergic and cholinergic neurons in the rat diagonal band.</a> Neuroscience. 17 (2), 439-451 (1986).</li>
<li>Clarke, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholinergic+innervation+of+the+rat+dentate+gyrus%3A+an+immunocytochemical+and+electron+microscopical+study%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+research%22%5BJournal%5D)">Cholinergic innervation of the rat dentate gyrus: an immunocytochemical and electron microscopical study.</a> Brain research. 360 (1-2), 349-354 (1985).</li>
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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Per ottenere un successo Ap 1-42 iniezione lo sperimentatore o chirurgo deve: 1) utilizzare una tecnica asettica; 2) identificare correttamente la regione del cervello di interessi con coordinate precise; 3) essere in grado di rendere sicure le mouse nella telaio stereotassico con il cervello livellato sull&#39;asse AP e ML; 4) avere la capacità di operare il micromanipolatore con precisione; 5) assicurare una corretta assistenza post-operatoria. Osservando tali passaggi chiave il mouse dovrebbe sopravvivere ...

Depositi di placca amiloide, che sono composti di beta-amiloide (A? 1-42), sono un elemento chiave della patologia della malattia di Alzheimer (AD). Numerosi studi hanno dimostrato che i livelli elevati o tossici di ricombinante oligomeri Ap 1-42 suscitare morte neuronale, sinaptica la distrofia, perdita e disfunzioni; così come apprendimento e memoria deficit 1-4. Regioni cerebrali colpite sono l&#39;ippocampo, la corteccia, e le strutture sottocorticali, come prosencefalo basale e il 5,6 amigdala. Ad oggi, ci sono più modelli di topi transgenici che tentano di simulare l&#39;Ap 1-42 patologia di AD. A seconda del ceppo questi animali rivelarsi utile in esame selezionare caratteristiche patologiche di AD. Purtroppo, con l&#39;eccezione di 2 linee transgeniche, APP23 e 5XFAD, questi topi non replicano completamente perdita neuronale, un aspetto fondamentale di AD. Anche con la perdita neuronale osservata in APP23 e 5XFAD, l&#39;osser morte neuronaleved era sottile, l&#39;età dipendente, e isolato di un paio di regioni selezionate 7,8. L&#39;infusione diretta di oligomerica Ap 1-42 nel cervello di topo wild-type fornisce un&#39;eccellente modello in vivo che riproduce l&#39;aspetto morte neuronale di amyloidopathy 1,9,10. A differenza dei modelli di topo transgenico comunemente utilizzate il oligomerica Ap 1-42 modello infusione è ideale per acutamente elevare Ap 1-42 livelli in modo spaziale e temporale. Il vantaggio di utilizzare topi wild-type per questo modello evita di compensazione o collaterali potenziali effetti delle mutazioni introdotte nelle linee di topi transgenici. Studi precedenti hanno mostrato che l&#39;infusione livelli tossici di Ap 1-42 nell&#39;ippocampo provoca la morte dei neuroni in prossimità del sito di iniezione entro 1 settimana 1. Inoltre, in linea con l&#39;osservazione che Ap 1-42 è tossica per i neuroni colinergici 11 del prosencefalo basalecolinergici neurone (BFCN) Popolazione quali progetti l&#39;ippocampo è diminuita del 20-50% entro 7-14 giorni seguenti beta-amiloide infusione 1,10 nei topi, in modo efficace che consente per gli esami di isolato circuiti neuronali nel cervello. Dal progetto BFCN ipsilaterale al giro dentato dell&#39;ippocampo 12, per il massimo controllo parte / veicolo e oligomeri Ap 1-42 soluzioni possono essere iniettati su entrambi i lati del cervello che permette di effettuare confronti tra l&#39;emisfero destro e sinistro 1. In questo rapporto ci fornirà una metodologia chirurgica e iniezione dettagliato per adulti wild-type C57BL / 6J. Questo ceppo di topi è stato scelto a causa del suo largo uso nel campo della ricerca. Tecnicamente, ogni regione del cervello può essere mirata per infusione, ma qui useremo il giro dentato dell&#39;ippocampo, come l&#39;obiettivo di illustrare la tecnica.

<table><tbody><tr><td>Ketamina HCl (100 mg/ml)</td><td>Henry Schein Medical</td><td>1049007</td><td>100 mg di ketamina per 1 kg di</td></tr><tr><td>xilazina animale (20 mg/ml)</td><td>Henry Schein Medical</td><td>non disponibile</td><td>10 mg di xilazina per 1 kg di</td></tr><tr><td>buprenex (0,3 mg/ml)</td><td>Henry Schein Medical</td><td>1217793</td><td>0,1 mg di buprenex per 1 kg di</td></tr><tr><td>A&beta animale; 1-42</td><td>David Teplow/UCLA</td><td>non disponibile</td><td>100 &mu; M; Questa amiloide è stata utilizzata nell'articolo</td></tr><tr><td>A&beta; 1-42</td><td>Bachem</td><td>H-1368</td><td>Può essere utilizzato al posto dell'amiloide dal laboratorio Teplow</td></tr><tr><td>A&beta; 1-42</td><td>American Peptide</td><td>62-0-80B</td><td>Può essere utilizzato al posto dell'amiloide proveniente dal laboratorio Teplow</td></tr><tr><td>Scrambled A&beta; 1-42</td><td>American Peptide</td><td>62-0-46B</td><td>Può essere utilizzato come peptide di controllo per confrontare A&beta; 1-42</td></tr><tr><td>Anticorpo NU4 (anticorpo amiloide oligomerico)</td><td>Dono di William Klein/Northwestern U.</td><td>non disponibile</td><td>Diluizione 1:2.000</td></tr><tr><td>Anticorpo oligomerico anti-amiloide&nbsp; (Coniglio policlonale)</td><td>EMD Millipore</td><td>AB9234</td><td>Può essere utilizzato al posto di Nu4; deve essere testato dall'utente finale</td></tr><tr><td>6E10 Anticorpo (topo monoclonale) (anticorpo amiloide)</td><td>Biolegend</td><td>sig-39320</td><td>Diluizione 1:1.000</td></tr><tr><td>Anticorpo ChAT (capra policlonale)</td><td>Millipore</td><td>AB144P</td><td>Diluizione 1:100</td></tr><tr><td>DeadEnd Sistema TUNEL fluorimetrico</td><td>Promega</td><td>G3250</td><td>Seguire le indicazioni del produttore per utilizzare</td></tr><tr><td>il reagente antisbiadimento Prolong Gold con DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>P36935</td><td>Utilizzare quando si scivolano i vetrini</td></tr><tr><td>Fluorogold</td><td>Fluorochrome, LLC</td><td>non disponibile</td><td>soluzione al 2%</td></tr><tr><td>Etanolo assoluto (200 proof)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2818-4</td><td>Per produrre etanolo al 70% per la sanificazione e la disinfezione del</td></tr><tr><td>gel di tricina Novex 10-20%</td><td>Life Technologies</td><td>EC6625BOX</td><td>Per separare A&beta; 1-42</td></tr><tr><td>Novex Tricine SDS Running Buffer (10X)</td><td>Life Technologies</td><td>LC1675</td><td>Per l'esecuzione di gel di tricina al 10-20% Tampone</td></tr><tr><td>di trasferimento Novex Tris-glicina (25X)</td><td>Life Technologies</td><td>LC3675</td><td>Per il trasferimento di gel di tricina al 10-20% SuperSignal</td></tr><tr><td>Western Blot Enhancer</td><td>Thermo Scientific</td><td>46640</td><td>Per migliorare A&beta; segnale 1-42; seguire il protocollo del produttore</td></tr><tr><td>Protran BA79 Membrana per tamponamento alla nitrocellulosa, 0,1 &mu; m</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>10402088</td><td>Per il trasferimento del 10-20% di gel di tricina</td></tr><tr><td>Xcell SureLock Mini-Cell</td><td>Life Technologies</td><td>EI0001</td><td>Elettroforesi aparato per l'esecuzione di gel di tricina al 10-20%</td></tr><tr><td>GenTeal Lubricant Eye Gel</td><td>Novartis</td><td>non disponibile</td><td>Per mantenere gli occhi del topo umidi durante l'intervento chirurgico; può essere trovato nei negozi di farmacia locale &#160; </td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>Refresh Optive Lubrificante Collirio</td><td>Allergan</td><td>non disponibile</td><td>Per mantenere umidi gli occhi del topo durante l'intervento chirurgico; può essere trovato nelle farmacie locali; Può essere utilizzato al posto di GenTeal</td></tr><tr><td>Betadine</td><td>Stoelting</td><td>50998</td><td>Per igienizzare e disinfettare</td></tr><tr><td>la spatola rotonda/conica.</td><td>VWR</td><td>82027-490</td><td>Per l'apertura della bocca di un animale</td></tr><tr><td>Bulldog Serrefines Clamps (Dim. ganascia 9X1,6 mm; Lunghezza 28 mm)</td><td>Strumenti per le scienze fini</td><td>18050-28</td><td>Opzionale; Per tenere la pelle del cuoio capelluto separata durante l'iniezione</td></tr><tr><td>Forbici dritte e fini (tagliente 25 mm; Lunghezza 11,5 cm)</td><td>Fine Science Tools</td><td>14060-11</td><td>Per tagliare il cuoio capelluto</td></tr><tr><td>#3 Manico per bisturi</td><td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>#11 Lama chirurgica</td><td>Fine Science Tools</td><td>10011-00</td><td>Per eseguire l'incisione del cuoio capelluto</td></tr><tr><td>Student Standard Pattern Forcep (Tip Dims. 2,5x1,5 mm; Lunghezza 11,5 cm)</td><td>Fine Science Tools</td><td>91100-12</td><td>Per tenere chiuso il cuoio capelluto durante la sutura</td></tr><tr><td>Kit combinato rifinitore</td><td>Kent</td><td>Scientific CL9990-1201</td><td>Per la rasatura dei capelli</td></tr><tr><td>T/Pump Ricircolatore d'acqua calda&nbsp;</td><td>Kent Scientific&nbsp;</td><td>TP-700</td><td>Per riscaldare l'animale durante l'intervento chirurgico</td></tr><tr><td>Tappetino da guerra riutilizzabile (5" x 10")</td> <td>Kent Scientific&nbsp;</td><td>TPZ-0510FEA</td><td>Per collegarlo al ricircolo dell'acqua calda T/Pump per riscaldare l'animale durante l'intervento chirurgico</td></tr><tr><td>Micro trapano a batteria</td><td>Stoelting</td><td>58610</td><td>Utilizzare frese in acciaio da 0,8 mm per praticare fori nel cranio</td></tr><tr><td>Strumento stereotassico standard da laboratorio con mouse e Adattatore per ratto neonatale</td><td>Stoelting</td><td>51615</td><td></td></tr><tr><td>Solo per lo strumento stereotassico del topo</td><td>Stoelting</td><td>51730</td><td>Può usarlo al posto di Stoelting Cat. #51615</td></tr><tr><td>Quintessential Stereotassico Iniettore</td><td>Stoelting</td><td>53311</td><td></td></tr><tr><td>Sterilizzatore per perline di vetro secco</td><td>Stoelting</td><td>50287</td><td>Per la sterilizzazione di strumenti in acciaio inossidabile</td></tr><tr><td>Telo chirurgico sterile (18 "x 26")</td><td>Stoelting</td><td>50981</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton Siringa 50 ml, modello 705 RN SYR, NDL</td><td>Hamilton Company</td><td>7637-01</td><td>Per iniezione cerebrale; utilizzare siringhe diverse per soluzioni diverse</td></tr><tr><td>29 G Ago, mozzo piccolo RN NDL</td><td>Hamilton Company</td><td>7803-06</td><td>Per il collegamento alla siringa Hamilton per iniezione cerebrale</td></tr><tr><td>1 ml BD Siringhe per tubercolina</td><td>VWR</td><td>BD309659</td><td>Per la somministrazione di anestesia e soluzione salina</td></tr><tr><td>Ago da 30 g (0,5")</td> <td>VWR</td><td>BD305106</td><td>Per la somministrazione di anestesia e soluzione salina</td></tr><tr><td>Bilancia elettronica portatile serie CS (Ohaus)</td><td>VWR</td><td>65500-202</td><td>Per pesare gli animali per determinare la dose di anestesia</td></tr><tr><td>Piastra riscaldante (Dim. piastra superiore 7,25x7,25 pollici)</td><td>VWR</td><td>47751-148</td><td>Per il riscaldamento degli animali dopo l'intervento chirurgico</td></tr><tr><td>Sutura in seta di seta Sofsilk Taglio C-1 3/8, 12 mm</td><td>Covidien</td><td>S1173</td><td>Per la chiusura della ferita</td></tr><tr><td>Vetbond Adesivo tissutale (3M)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-361931</td><td>Opzionale: per facilitare la chiusura della ferita; Utilizzare con sutura.</td></tr><tr><td>Applicatori sterili con stelo in legno con punta in cotone</td><td>Fisher scientific</td><td>22-029-488</td><td>Per la pulizia e l'asciugatura di ferite chirurgiche</td></tr><tr><td>Fisherbrand Superfrost Plus Vetrini per microscopio</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>12-550-15</td><td>Per la raccolta di sezioni cerebrali</td></tr><tr><td>VWR Micro Cover Glass 24 X 50 mm</td><td>VWR</td><td>48393241</td><td>Per il montaggio di vetrini per microscopio</td></tr><tr><td>Thermo Scientific Nalgene Filtro per siringa 0,2 &mu; m</td><td>Fisher Scientific</td><td>194-2520</td><td>Per la sterilizzazione della soluzione salina</td></tr><tr><td>Marcatori cutanei sterili a doppia punta di Viscot Medical</td><td>Medline</td><td>VIS1422SRL91</td><td>Per la marcatura delle coordinate sul cranio</td></tr></tbody></table>

infuso stereotassico di oligomeric amiloide-beta nelle hippocampus mouse

Stereotaxic Infusion of Oligomeric Amyloid-beta into the Mouse Hippocampus

Malattia di Alzheimer è una malattia neurodegenerativa che colpisce la popolazione. Una caratteristica neuropathological fondamentale della malattia è l&#39;eccessiva produzione di beta-amiloide e la deposizione di beta-amiloide placche nelle regioni del cervello degli individui afflitti. Nel corso degli anni gli scienziati hanno generato numerosi modelli del mouse della malattia di Alzheimer che tentano di replicare il beta-amiloide patologia. Purtroppo, i modelli di topo solo selettivamente imitano le caratteristiche della malattia. La morte neuronale, un effetto importante nel cervello dei pazienti con malattia di Alzheimer, è notevolmente carente in questi topi. Quindi, noi ed altri abbiamo impiegato un metodo di infondere direttamente solubili specie oligomeriche di beta-amiloide - forme di beta-amiloide, che hanno dimostrato di essere più tossico per i neuroni - stereotaxically nel cervello. In questo rapporto utilizziamo maschi C57BL / 6J per documentare questa tecnica chirurgica di aumentare i livelli di beta-amiloide in una selezione regione del cervello. Ilbersaglio infusione è il giro dentato dell&#39;ippocampo perché questa struttura cerebrale, insieme al proencefalo basale che è collegata dal circuito colinergico, rappresenta una delle aree di degenerazione nella malattia. I risultati di elevare beta-amiloide nel giro dentato tramite infusione stereotassica rivelano aumenti di perdita di neuroni nel giro dentato entro 1 settimana, mentre vi è un concomitante aumento della morte cellulare e la perdita di neuroni colinergici nel ramo verticale della banda diagonale di Broca del proencefalo basale. Questi effetti sono stati osservati fino a 2 settimane. I nostri dati suggeriscono che il beta-amiloide modello infusione attuale prevede un modello alternativo del mouse per affrontare regione specifica morte dei neuroni in una base a breve termine. Il vantaggio di questo modello è che amiloide-beta può essere elevato in modo spaziale e temporale.

L&#39;attuale metodo di preparazione umana ricombinante oligomeric Ap 1-42 produce specie oligomeriche solubili costituiti da monomeri, dimeri, trimeri e tetrameri (Figura 1A). Questi a basso peso molecolare Ap 1-42 specie, ma non le fibrille e placche, sono state esposte in numerose impostazioni per essere più tossico per i neuroni 1,4,9,17-19. Per determinare se oligomerica Ap 1-42 induce la morte dei neuroni nel cervello di topo Ap 1-42 (4 ml di ...

Qui, presentiamo un protocollo per l'infusione diretta stereotassica cerebrale di amiloide-beta. Questa metodologia fornisce un modello murino alternativo in vivo per affrontare gli effetti a breve termine dell'amiloide-beta sui neuroni cerebrali.

Infuso stereotassico di Oligomeric amiloide-beta nelle Hippocampus mouse

Alzheimer&#8217;s disease is a neurodegenerative disease affecting the aging population. A key neuropathological feature of the disease is the ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di iniettare stereotassicamente una Liga meric a beta 1 42, nel giro dentato dell'ippocampo. Ciò si ottiene preparando prima una liga meric, una soluzione beta 1 42. Il secondo passo consiste nel determinare le coordinate di iniezione.Successivamente, chirurgicamente, esporre il cranio dell'animale e introdurre due fori per l'inserimento dell'ago. Il passaggio finale consiste nello spostare l'ago della siringa nella sua posizione finale e nell'infusione di un beta 1 42. In definitiva, il metodo di iniezione stereotassica di Abeta 1 42 viene utilizzato per esaminare gli effetti tossici di Abeta 1 42 in un animale vivo.Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai modelli murini transgenici esistenti di Abeta 42 è che l'ALA 42 oligomerico può essere elevato in modo speciale e temporale e riprodurre in modo affidabile la patologia di morte cellulare che manca nei modelli murini transgenici. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'Alzheimer, come ad esempio come si diffondono i processi patologici nella malattia di Alzheimer. Per iniziare questa procedura, radere la testa di un topo anestetizzato per esporre la pelle.Quindi, posiziona il mouse su un termoforo in una cornice stereotassica. Quindi fissare i suoi incisivi nella protezione dei denti e un nasello sul viso del topo. Successivamente, posiziona le barre auricolari nel mauss uditivo per fissare la testa da controllare.Se la testa è fissata, premerla delicatamente e assicurarsi che non si muova. Quindi applicare un unguento su entrambi gli occhi per mantenere l'umidità. Successivamente, disinfettare il sito chirurgico applicando Betadine sulla pelle sopra il cranio, seguito da etanolo al 70% con tamponi di cotone sterili.Eseguire la pulizia alternata di betadina ed etanolo altre due volte. Ora fai un'incisione di due o tre millimetri nella linea mediana del cuoio capelluto con un bisturi. Usa le forbici sottili dritte per estendere la linea di incisione a circa 1,0 centimetri per esporre la sutura sagittale bgma e lambda del cranio.Dopodiché, usa il forcipe per separare la pelle. Pulisci il cranio con un batuffolo di cotone sterile, imbevuto di soluzione fisiologica sterile. Quindi usa un batuffolo di cotone pulito e asciutto per asciugare il cranio.Quindi, segna un punto. Sul Brema posizionare la siringa Hamilton utilizzando il micromanipolatore in modo che la punta dell'ago tocchi appena il punto sul bgma. Quindi registrare la coordinata DV, segnare un punto sul punto Lambda, assicurarsi che l'asse AP del cranio sia a livello spostando la siringa posteriormente al punto Lambda.La punta dell'ago dovrebbe toccare il punto Lambda come ha fatto con il punto bgma. Successivamente, registra la posizione DV. Le coordinate DV per Bre, MA e Lambda devono essere entro 0,5 millimetri.Ora riporta la punta dell'ago sul punto BMA. Registra la posizione AP di partenza. Quindi calcola la posizione AP finale sottraendo due millimetri dall'ap iniziale.Coordinare e riposizionare l'ago della siringa alla coordinata AP finale. Quindi, registra la coordinata ML corrente. Calcola le coordinate ml finali sinistra e destra aggiungendo o sottraendo 1,3 millimetri dal ml iniziale.Coordinare e spostare l'ago della siringa alle coordinate ML finali. Tocca la punta dell'ago sulla superficie del cranio su entrambe le coordinate ML finali e assicurati che le coordinate DV siano entro 0,5 millimetri. Mentre sei alla coordinata ml finale, tira l'ago verso l'alto, da 0,5 a un centimetro sopra il cranio.Segna un punto sul cranio con un pennarello extra fine di colore scuro. Ripeti questo passaggio per il lato controlaterale del cranio. Quindi allontanare la siringa.Praticare un foro sul ml sinistro o destro. Coordinare sul cranio usando una punta da trapano da 0,8 millimetri. Ripetere questo passaggio per il lato controlaterale.Successivamente, sposta la siringa in uno dei fori appena introdotti. Abbassa l'ago appena oltre il cranio e fai attenzione a non perforare il cervello per assicurarti che l'ago abbia superato il cranio. Spingi delicatamente l'ago contro il cranio per assicurarti che l'ago non fuoriesca dal foro.Quindi, registra la coordinata DV iniziale. Calcola il dv. finale. Coordinare sottraendo 2,2 millimetri dal DV iniziale. Coordinare e abbassare l'ago fino al db finale.Coordinare quindi impostare la pompa dell'iniettore stereotassico per infondere quattro microlitri di un beta 1 42 nel giro dentato a una velocità di 0,5 microlitri al minuto. Dopo l'infusione, lasciare che l'ago rimanga in posizione per un ulteriore minuto per ridurre al minimo il riflusso della soluzione fuori dal sito di iniezione. Successivamente, sposta l'ago sull'altro lato del cervello e ripeti la procedura.Ora, svita le barre auricolari. Usa le pinze standard degli studenti per chiudere il cuoio capelluto e sigillare la ferita con la sutura. Togli il paranaso e rimuovi il mouse.Iniettare un millilitro di soluzione fisiologica sterile nel topo per idratazione e iniettare buprenorfina a 0,1 milligrammi per chilogrammo per via sottocutanea per alleviare il dolore. Successivamente, trasferisci il mouse in una gabbia vuota e pulita posta sopra una piastra riscaldante a 42 gradi Celsius fino a quando non si sveglia. Quindi rimetti il topo nella sua gabbia con cibo e acqua in abbondanza.Questa figura mostra l'infusione di un beta 1 42 e di un veicolo nei rispettivi giri dentati sinistro e destro di un topo di nove mesi. Le linee tratteggiate raffigurano l'iniezione estratta e le frecce mostrano il giro dentato collassato. Entro una settimana dall'iniezione di Abeta 1 42, il giro dentato mostrava livelli elevati di Abeta 1 42 nello strato molecolare e nello strato cellulare polimorfico vicino al sito di iniezione a sette e 14 giorni.Abeta 1 42 ha suscitato un aumento della colorazione positiva del tunnel e una diminuzione dello spessore del giro dentato, confermando gli effetti neurodegenerativi di Abeta 1 42. Qui, un fluoro oro tracciante retrogrado è stato co-iniettato con Abeta 1 42 nel giro dentato. Sette giorni dopo l'iniezione, il fluorogold è stato rilevato nel proencefalo basale, suggerendo il trasporto retrogrado dell'etichetta attraverso i neuroni colinergici.Per la quantificazione sono stati scelti neuroni positivi al fluoro nel proencefalo basale. Sette giorni dopo l'iniezione, Abeta 1 42 ha suscitato aumenti del tunnel e diminuzioni della chat. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in circa 30 minuti se eseguita correttamente.Seguendo questa procedura, altri metodi possono essere utilizzati per rispondere a ulteriori domande, come gli studi sui meccanismi molecolari per affrontare l'effetto meccanicistico dell'infusione di amiloide sul cervello. Vi ringrazio per aver guardato il nostro video e spero che il metodo vi sia utile nei vostri esperimenti.

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Una caratteristica della malattia di Alzheimer è l'elevazione di...

Preparazione di oligomeriche β-amiloide 1-42 E induzione di Impairment plasticità sinaptica in fettine di ippocampo

Questo video mostra una tecnica per l'infusione continua di anticorpi specifici per il peptide amiloide-beta (Aβ) nell'ippocampo di un ratto. Lo studio prevede l'impianto di un sistema di cannule bilaterali per un'infusione controllata di anticorpi specifici per il peptide Aβ accoppiata all'infusione di oligomeri solubili di Aβ (Aβo) nell'ippocampo di ratto per studiare le interazioni tra gli oligomeri e gli anticorpi.

Infusione controllata di anticorpi specifici per il peptide Aβ e oligomeri Aβ nell'ippocampo del ratto

Questo video dimostra la precisa infusione stereotassica di beta amiloide nel giro dentato per stabilire un modello murino della malattia di Alzheimer. L'accurata determinazione delle coordinate e la somministrazione controllata delle proteine beta-amiloidi provocano la degradazione neuronale, interrompendo l'elaborazione della memoria e contribuendo allo sviluppo della malattia di Alzheimer.

Infusione cerebrale stereotassica diretta di proteine beta-amiloidi per un modello di malattia di Alzheimer

Fonte: Arango-Lievano, M. et. al., Imaging longitudinale in vivo della cerebrovascolarizzazione: rilevanza per le malattie del SNC. J. Vis. Exp. (2016)Questo video dimostra l'imaging in vivo a due fotoni per visualizzare placche amiloidi marcate in fluorescenza e vascolarizzazione cerebrale. La fluorescenza blu segna le placche, mentre la fluorescenza verde evidenzia i vasi sanguigni cerebrali. Una mappa 3D della regione di interesse e l'imaging a mosaico ad alta risoluzione rivelano...

Imaging in vivo di vasi cerebrali e placche amiloidi in un modello murino di Alzheimer

Fonte: Slezia, A. et al. La somministrazione elettroforetica di acido γ-aminobutirrico (GABA) nel focolaio epilettico previene le convulsioni nei topi. J. Vis. Exp. (2019)Questo video mostra la somministrazione elettroforetica di acido gamma-aminobutirrico (GABA) per inibire l'attività convulsiva in un topo anestetizzato. Delinea le fasi coinvolte nell'impianto della sonda, nella registrazione dell'attività neurale, nell'induzione delle convulsioni e nella somministrazione controllata di GABA...

Somministrazione elettroforetica di GABA nel focolaio epilettico di un topo anestetizzato

I microRNA hanno un ruolo significativo nella struttura del cervello e la funzione. Qui si descrive un metodo per far rispettare miRNA ippocampale iper-espressione utilizzando l'iniezione stereotassica di lentivirus ingegnerizzati miRNA che esprimono. Questo approccio può servire come un modo relativamente rapido per valutare...

Iniezione stereotassica di microRNA-esprimono lentivirus al mouse Hippocampus CA1 regione e valutazione dei risultati Behavioral

L'amiloide-β (Ap) -injected modello animale consente la somministrazione di una quantità e specie di frammenti Ap definiti e riduce le differenze individuali all'interno di ciascun gruppo di studio. Questo protocollo descrive la intracerebroventricolare (ICV) iniezione di Ap senza strumenti stereotassica, consentendo la produzione di anomalie comportamentali Alzheimer-like nei topi normali.

Iniezione intracerebroventricular dei peptidi beta-amiloide in topi normali per indurre Acutamente Alzheimer-like Deficit cognitivi

Questo articolo illustra come l'espressione dei recettori dei neurotrasmettitori possa essere quantificata e il pattern analizzato nelle sinapsi con elementi pre e postsinaptici identificati utilizzando una combinazione di trasduzione virale di strumenti optogenetici e la tecnica di immunomarcatura della replica della frattura da congelamento.

Combinato optogenetic e Freeze-frattura Replica immunomarcatura per esaminare specifica disposizione-Input di glutammato recettori nell&#39;amigdala mouse

Per studiare gli effetti di Aβo in vivo, abbiamo sviluppato un modello basato su infusioni ippocampali ripetute di Aβo solubile accoppiate con infusione continua di anticorpi Aβo (6E10) nell'ippocampo utilizzando pompe osmotiche per contrastare l'effetto neurotossico di Aβo.

Neurodegenerazione in un modello animale di cronica amiloide-beta Oligomer infusione viene neutralizzata da anticorpi trattamento infuso con pompe osmotiche

Nella chirurgia in utero sopravvivenza in topi permette la manipolazione molecolare dell'espressione genica durante lo sviluppo. Qui si descrive l'utilizzo di alta frequenza ecografia per guidare l'iniezione di vettori retrovirali nel cervello di topo al giorno embrionale (E) 9.5.

Ultrasound-Guided Microiniezione nel proencefalo mouse In Utero A E9.5

Scopri l'infusione stereotassica di oligomeri di amiloide-beta 1-42 nel giro dentato dell'ippocampo di topo. Questo metodo permette di studiare gli effetti tossici dell'Aβ42 sui neuroni in vivo con precisione spaziale e temporale.

Infuso stereotassico di Oligomeric amiloide-beta nelle Hippocampus mouse

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