Infuso stereotassico di Oligomeric amiloide-beta nelle Hippocampus mouse

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di iniettare stereotassicamente una Liga meric a beta 1 42, nel giro dentato dell'ippocampo. Ciò si ottiene preparando prima una liga meric, una soluzione beta 1 42. Il secondo passo consiste nel determinare le coordinate di iniezione.

Successivamente, chirurgicamente, esporre il cranio dell'animale e introdurre due fori per l'inserimento dell'ago. Il passaggio finale consiste nello spostare l'ago della siringa nella sua posizione finale e nell'infusione di un beta 1 42. In definitiva, il metodo di iniezione stereotassica di Abeta 1 42 viene utilizzato per esaminare gli effetti tossici di Abeta 1 42 in un animale vivo.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai modelli murini transgenici esistenti di Abeta 42 è che l'ALA 42 oligomerico può essere elevato in modo speciale e temporale e riprodurre in modo affidabile la patologia di morte cellulare che manca nei modelli murini transgenici. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'Alzheimer, come ad esempio come si diffondono i processi patologici nella malattia di Alzheimer. Per iniziare questa procedura, radere la testa di un topo anestetizzato per esporre la pelle.

Quindi, posiziona il mouse su un termoforo in una cornice stereotassica. Quindi fissare i suoi incisivi nella protezione dei denti e un nasello sul viso del topo. Successivamente, posiziona le barre auricolari nel mauss uditivo per fissare la testa da controllare.

Se la testa è fissata, premerla delicatamente e assicurarsi che non si muova. Quindi applicare un unguento su entrambi gli occhi per mantenere l'umidità. Successivamente, disinfettare il sito chirurgico applicando Betadine sulla pelle sopra il cranio, seguito da etanolo al 70% con tamponi di cotone sterili.

Eseguire la pulizia alternata di betadina ed etanolo altre due volte. Ora fai un'incisione di due o tre millimetri nella linea mediana del cuoio capelluto con un bisturi. Usa le forbici sottili dritte per estendere la linea di incisione a circa 1,0 centimetri per esporre la sutura sagittale bgma e lambda del cranio.

Dopodiché, usa il forcipe per separare la pelle. Pulisci il cranio con un batuffolo di cotone sterile, imbevuto di soluzione fisiologica sterile. Quindi usa un batuffolo di cotone pulito e asciutto per asciugare il cranio.

Quindi, segna un punto. Sul Brema posizionare la siringa Hamilton utilizzando il micromanipolatore in modo che la punta dell'ago tocchi appena il punto sul bgma. Quindi registrare la coordinata DV, segnare un punto sul punto Lambda, assicurarsi che l'asse AP del cranio sia a livello spostando la siringa posteriormente al punto Lambda.

La punta dell'ago dovrebbe toccare il punto Lambda come ha fatto con il punto bgma. Successivamente, registra la posizione DV. Le coordinate DV per Bre, MA e Lambda devono essere entro 0,5 millimetri.

Ora riporta la punta dell'ago sul punto BMA. Registra la posizione AP di partenza. Quindi calcola la posizione AP finale sottraendo due millimetri dall'ap iniziale.

Coordinare e riposizionare l'ago della siringa alla coordinata AP finale. Quindi, registra la coordinata ML corrente. Calcola le coordinate ml finali sinistra e destra aggiungendo o sottraendo 1,3 millimetri dal ml iniziale.

Coordinare e spostare l'ago della siringa alle coordinate ML finali. Tocca la punta dell'ago sulla superficie del cranio su entrambe le coordinate ML finali e assicurati che le coordinate DV siano entro 0,5 millimetri. Mentre sei alla coordinata ml finale, tira l'ago verso l'alto, da 0,5 a un centimetro sopra il cranio.

Segna un punto sul cranio con un pennarello extra fine di colore scuro. Ripeti questo passaggio per il lato controlaterale del cranio. Quindi allontanare la siringa.

Praticare un foro sul ml sinistro o destro. Coordinare sul cranio usando una punta da trapano da 0,8 millimetri. Ripetere questo passaggio per il lato controlaterale.

Successivamente, sposta la siringa in uno dei fori appena introdotti. Abbassa l'ago appena oltre il cranio e fai attenzione a non perforare il cervello per assicurarti che l'ago abbia superato il cranio. Spingi delicatamente l'ago contro il cranio per assicurarti che l'ago non fuoriesca dal foro.

Quindi, registra la coordinata DV iniziale. Calcola il dv. finale. Coordinare sottraendo 2,2 millimetri dal DV iniziale. Coordinare e abbassare l'ago fino al db finale.

Coordinare quindi impostare la pompa dell'iniettore stereotassico per infondere quattro microlitri di un beta 1 42 nel giro dentato a una velocità di 0,5 microlitri al minuto. Dopo l'infusione, lasciare che l'ago rimanga in posizione per un ulteriore minuto per ridurre al minimo il riflusso della soluzione fuori dal sito di iniezione. Successivamente, sposta l'ago sull'altro lato del cervello e ripeti la procedura.

Ora, svita le barre auricolari. Usa le pinze standard degli studenti per chiudere il cuoio capelluto e sigillare la ferita con la sutura. Togli il paranaso e rimuovi il mouse.

Iniettare un millilitro di soluzione fisiologica sterile nel topo per idratazione e iniettare buprenorfina a 0,1 milligrammi per chilogrammo per via sottocutanea per alleviare il dolore. Successivamente, trasferisci il mouse in una gabbia vuota e pulita posta sopra una piastra riscaldante a 42 gradi Celsius fino a quando non si sveglia. Quindi rimetti il topo nella sua gabbia con cibo e acqua in abbondanza.

Questa figura mostra l'infusione di un beta 1 42 e di un veicolo nei rispettivi giri dentati sinistro e destro di un topo di nove mesi. Le linee tratteggiate raffigurano l'iniezione estratta e le frecce mostrano il giro dentato collassato. Entro una settimana dall'iniezione di Abeta 1 42, il giro dentato mostrava livelli elevati di Abeta 1 42 nello strato molecolare e nello strato cellulare polimorfico vicino al sito di iniezione a sette e 14 giorni.

Abeta 1 42 ha suscitato un aumento della colorazione positiva del tunnel e una diminuzione dello spessore del giro dentato, confermando gli effetti neurodegenerativi di Abeta 1 42. Qui, un fluoro oro tracciante retrogrado è stato co-iniettato con Abeta 1 42 nel giro dentato. Sette giorni dopo l'iniezione, il fluorogold è stato rilevato nel proencefalo basale, suggerendo il trasporto retrogrado dell'etichetta attraverso i neuroni colinergici.

Per la quantificazione sono stati scelti neuroni positivi al fluoro nel proencefalo basale. Sette giorni dopo l'iniezione, Abeta 1 42 ha suscitato aumenti del tunnel e diminuzioni della chat. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in circa 30 minuti se eseguita correttamente.

Seguendo questa procedura, altri metodi possono essere utilizzati per rispondere a ulteriori domande, come gli studi sui meccanismi molecolari per affrontare l'effetto meccanicistico dell'infusione di amiloide sul cervello. Vi ringrazio per aver guardato il nostro video e spero che il metodo vi sia utile nei vostri esperimenti.