Diretto Protein Consegna a cellule di mammifero Utilizzando Cell-permeabile Cys

L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare come utilizzare domini a dita di zinco per veicolare proteine funzionali, come la proteina fluorescente verde, all'interno di cellule di mammifero. Questo viene ottenuto innanzitutto generando un plasmide di espressione contenente la proteina fluorescente verde smeraldo MGFP fusa in modo traduttivo a domini a dita di zinco. Il secondo passaggio consiste nell'esprimere la proteina di fusione fluorescente nei batteri.

Successivamente, le cellule batteriche vengono lisate e la proteina di fusione fluorescente viene purificata. L'ultimo passaggio consiste nell'incubare cellule mammifere con la proteina di fusione fluorescente purificata per consentirne l'assorbimento. Infine, la fluorescenza delle cellule trattate può essere quantificata mediante citometria a flusso per determinare l'efficienza del rilascio della proteina di fusione all'interno delle cellule.

Il principale vantaggio del dominio di trasduzione proteica come il peptide stretto derivato da HIV o l'oligo-arginina, è che può facilitare un'elevata consegna nel citosol senza compromettere l'attività del carico enzimatico trasportato. Per iniziare la PCR, amplificare la sequenza di emerald GFP o MGFP da un plasmide secondo il protocollo indicato, purificare il prodotto della PCR utilizzando un kit di estrazione da gel e quindi quantificare la concentrazione del DNA mediante spettrofotometro. Successivamente, ottenere un vettore di espressione PET 28 contenente la sequenza dell'alanina.

Sostituire due dita, dita di zinco o due domini FZ, il vettore digerito e il prodotto MG F-P-P-C-R con gli enzimi di restrizione XMA e SAC, utilizzando 10 unità di enzima per microgrammo di DNA e incubare le digestioni per tre ore a 37 gradi Celsius. Purificare i frammenti di DNA mediante estrazione su gel e misurare le concentrazioni del vettore e del prodotto MG F-P-P-C-R. Utilizzando uno spettrofotometro, combinare il prodotto MG F-P-P-C-R e da 50 a 100 nanogrammi del vettore in un singolo tubo in un rapporto molare di sei a uno tra inserto e vettore.

Quindi aggiungere un'unità di ligasi T4 del DNA e incubare la reazione per un'ora a temperatura ambiente per trasformare i batteri con il plasmide ligato. Scongelare un'aliquota di 50 microlitri di cellule di e. coli chimicamente competenti sul ghiaccio. Successivamente, mescolare delicatamente le cellule con da 100 a 20 nanogrammi di DNA ligato e incubare le cellule con il DNA sul ghiaccio per 30 minuti.

Dopo l'incubazione, sottoporre le cellule a shock termico a 42 gradi Celsius per 90 secondi. Aggiungere due millilitri di mezzo SOC al tubo e lasciare che le cellule si riprendano per un'ora a 37 gradi Celsius sotto agitazione, al fine di selezionare i trasformanti. Piastrare 100 microlitri della coltura su piastre di agar LB contenenti 50 microgrammi per millilitro di canamicina e incubare le piastre durante la notte a 37 gradi Celsius il giorno seguente.

Inoculare una coltura di sei millilitri di LB contenente 50 microgrammi per millilitro di canamicina con una colonia isolata dalla piastra dell'incubazione notturna. Incubare la coltura tutta la notte a 37 gradi Celsius con agitazione. Il giorno successivo, raccogliere e preparare in miniatura le cellule per isolare il plasmide, quindi confermare il plasmide mediante sequenziamento con il primer.

Per il promotore T sette, il plasmide deve contenere una fusione traduzionale N-terminale dei due domini FZ a MGFP. Per iniziare la purificazione delle proteine, trasformare prima cellule BL 21 equalize con 100 nanogrammi del plasmide purificato.

Selezionare i trasformanti su agar LB contenente canamicina; il giorno successivo, inoculare una coltura di 10 millilitri di brodo LB contenente canamicina con una singola colonia dalla piastra dell'over-night e incubare la coltura per tutta la notte a 37 gradi Celsius con agitazione. Diluire l'intera coltura notturna in un litro di brodo LB, integrato con canamicina, glucosio 0,2% e cloruro di zinco 100 micromolare. Incubare la coltura a 37 gradi Celsius con agitazione fino al raggiungimento di una densità ottica a 600 nanometri pari a 0,8, quindi aggiungere IPTG a una concentrazione finale di due millimolari per indurre l'espressione. Dopo sei ore di induzione, centrifugare la coltura a 5.000 ×g per 10 minuti a quattro gradi Celsius per raccogliere le cellule.

Risospendere il pellet cellulare in cinque millilitri di buffer di lisi, quindi lisare le cellule sul ghiaccio mediante sonificazione utilizzando un'uscita di potenza del 50% e un ciclo di cinque secondi accesi e dieci secondi spenti per quattro minuti. Successivamente, centrifugare il lisato cellulare a 25.000 ×g per 30 minuti a quattro gradi Celsius, quindi trasferire il soprannatante in un nuovo tubo di raccolta posto sul ghiaccio. Per purificare la proteina, caricare il soprannatante su una colonna precedentemente preparata con un millilitro di sospensione di acido nitrilotriacetico al nichel.

Dopo aver fatto passare il sopranatante attraverso la colonna, lavare la resina con 20 millilitri di tampone di lavaggio. Eluire la proteina dalla colonna con cinque millilitri di tampone di eluizione, quindi trasferire la soluzione in un tubo da dialisi, dializzare la proteina e conservare il tampone per tutta la notte dopo la dialisi. Utilizzare un concentratore a centrifuga per concentrare la proteina ad almeno 40 micromolari centrifugando a 3000 ×g per un'ora.

Determinare la concentrazione e la purezza delle proteine come indicato nel protocollo testuale per la conservazione. Aliquotare 200 microlitri della proteina in provette da 1,5 millilitro e coprire le provette con carta d'alluminio per proteggere le proteine di fusione MGFP dal fotobiancamento. Successivamente, congelare rapidamente la proteina in azoto liquido e conservarla a -80 gradi Celsius per prepararsi alla trasduzione proteica; innanzitutto, preriscaldare le pozzette di una piastra a 24 pozzetti con 500 microlitri di una soluzione di 50 microgrammi per millilitro.

Poli-lisina per 30-60 minuti a 25 gradi Celsius. Aspirare la soluzione dalle pozzette prima di seminare la coltura cellulare. Colture cellulari in DMM contenente 10% di FBS e 1% di antibiotico antimicotico a 37 gradi Celsius in un incubatore umidificato con 5% di anidride carbonica.

Raccogliere le cellule e seminarle in una piastra a 24 pozzetti a una densità di 200.000 cellule per pozzetto. Successivamente, posizionare la piastra a 24 pozzetti nell'incubatore dopo circa 24 ore di incubazione, quando le cellule hanno raggiunto una confluenza dell'80-90%. Aspirare il mezzo da ogni pozzetto e lavare le cellule con 500 microlitri di mezzo privo di siero preriscaldato o SFM.

Aggiungere 250 microlitri di SFM contenenti due micromoli di proteina Z-M-G-F-P e 100 micromoli di cloruro di zinco in ogni pozzetto, quindi incubare le cellule a 37 gradi Celsius per un'ora. Successivamente, aspirare il mezzo dai pozzetti e lavare le cellule tre volte con 500 microlitri di soluzione salina fosfato docos priva di calcio e magnesio, nota come DPBS, integrata con 0,5 milligrammi per millilitro di eparina. Poi, aggiungere 200 microlitri di tripsina EDTA allo 0,05% nei pozzetti e incubare a 37 gradi Celsius per due minuti per staccare le cellule dalla piastra.

Trasferire le cellule staccate in un nuovo tubo e centrifugare a 300 ×g per cinque minuti. Successivamente, risospendere le cellule in 500 millilitri di DPBS integrato con FBS al 1% e misurare l'intensità media della fluorescenza del campione mediante citometria a flusso utilizzando il canale fite come descritto in precedenza. Regolare lo scatter anteriore e laterale in modo da posizionare la popolazione di interesse sulla scala.

Successivamente, utilizzare un gating definito per analizzare i campioni di controllo e quelli sperimentali. Raccogliere 10.000 ventricoli vitali per campione e utilizzare il software di analisi della citometria a flusso per elaborare i dati. Normalizzare l'intensità fluorescente delle cellule trattate con la proteina rispetto alle cellule trattate con siero di controllo.

I proteine di fusione Zif MGFP sono state prodotte in e coli, purificate e analizzate mediante elettroforesi SDS-PAGE. Questi risultati mostrano che la proteina di fusione a due dita ZIF MG FP è stata purificata a una omogeneità superiore al 95%. Quando le cellule Helo sono state trattate con concentrazioni crescenti della proteina di fusione ZIFF MG FP.

Hanno mostrato un aumento dipendente dalla dose nell'intensità media della fluorescenza, misurata mediante citometria a flusso; trattamenti consecutivi con la proteina fusa Z-MG-FP a una concentrazione di due micromolar hanno determinato una fluorescenza MGFP in quasi il 100% delle cellule. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare i domini di traslocazione della proteina thief per consegnare proteine funzionali all'interno delle mie cellule.