Name: Una nuova applicazione della penetrazione Elettrica Graph (EPG) per lacquisizione e la misurazione dei segnali elettrici in Floema Sieve Elements (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-02T09:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 16 s
Description: Scopri la tecnica EPG per registrare segnali elettrici intracellulari negli elementi cribrosi delle piante durante l'alimentazione degli afidi. Questo metodo rivela la comunicazione elettrica a lunga distanza nelle piante in risposta all'erbivoria.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

VSR è stato sostenuto da una sovvenzione Marie Curie IIF (FERITE IN TERRA, acronimo di: ferita indotta segnali elettrici in Arabidopsis thaliana).

1. afide allevamento Nota: La scelta delle specie vegetali e afidi per le registrazioni EPG dipende dalla finalità di ricerca. Per gli studi sulla Arabidopsis thaliana, il brassicae afide Brevicoryne è appropriato. <ol><li> Posteriore B. afidi brassicae in una serra su Brassica oleracea. Mantenere le piante utilizzate per afide allevamento in gabbie, per evitare di contaminare altre piante. Mantenere le piante-afidi allevamento e impianti sperimentali (nel nostro caso B. oleracea e A. thaliana) in stanze separate, al fine di evitare la contaminazione di impianti sperimentali con gli afidi. </li><li> Trasferimento afidi di piante fresche su ogni 2 settimane, prima di causare danni significativi pianta, o raggiungere la sovrappopolazione. Trasferire 10-20 afidi adulti ad un impianto di allevamento fresca per iniziare una nuova colonia. </li><li> Monitorare allevamento piante regolarmente per contaminazione da specie indesiderate di afidi, altri erbivori insetti parassitoidi, afidi e fungi che possa influenzare la salute della colonia di afidi. </li><li> Raccogliere adulti, afidi senza ali fino a una settimana dopo la loro muta finale per la registrazione EPG. </li><li> Dopo gli esperimenti, restituire le piante sperimentali che non sono stati utilizzati per la camera di crescita, come spesso hanno alcune progenie che è stata prodotta durante la registrazione, che potrebbe contaminare inavvertitamente altre piante. </li></ol> 2. Insect cablaggio per la registrazione EPG <ol><li> Per elettrodi di insetti, ottenere i pin del connettore ottone (chiodi, Ø 1,2 mm), sottile filo di rame (Ø 0,2 mm), di filo d&#39;oro molto sottile (Ø circa 20 micron), a base di acqua d&#39;argento colla, un semplice piccolo bullone di saldatura con fluido saldatura e filo di saldatura in resina animato, stereomicroscopio con ingrandimento 10X, piccole forbici o bisturi, due pinza sottile, e un foglio di polistirolo o scatola. Nota: un vortex potrebbe essere utile. Nota: Il protocollo passo-passo per rendere elettrodi è indicato nella figura 2. </li><li> Per afidemanipolazione e l&#39;applicazione della colla, ottengono: un piccolo e morbido pennello acquerello cammello (formato 2 o più piccolo) e perni di insetti, come quelli usati per le collezioni di insetti, anche se un ago da cucito multa o uno stuzzicadenti può funzionare così. Fase 4 mostra come avviare la registrazione EPG. </li><li> Passo 1. Nota: I passi 1 e 2 qui di seguito mostrano come preparare elettrodi insetti meno la afide. Passo 3 illustra come collegare un afide all&#39;elettrodo. Vacuum fissaggio del afidi è raccomandato durante il cablaggio, ma non sempre necessaria per specie movimento lento (ad esempio, B. brassicae). <ol><li> Accendere il bullone di saldatura e sciogliere qualche filo di saldatura alla sua punta (Figura 2A). Bagnare la testa del perno connettore di ottone con un fluido di saldatura (Figura 2B) ed immergerlo nel metallo di saldatura fuso (Figura 2C). </li><li> Applicare una guaina di metallo fuso di saldatura su una estremità di un lungo pezzo di filo di rame sottile 1-2 cm (Figura2D). Quindi portare il filo di perno e di rame insieme contro il bullone caldo (Figura 2E) e spostarli insieme via raffreddare e solidificare (Figura 2F). </li></ol></li><li> Passo 2. <ol><li> Agitare bene (o vortex), il flacone con colla d&#39;argento per alcuni minuti fino a visualizzare una emulsione liscia. Cut (forbici o bisturi) un paio di pezzi di filo d&#39;oro (di circa 1,5 cm di lunghezza) sul piatto oggetto della stereomicroscopio (Figura 2G). </li><li> Dai pin ottone con filo di rame saldato (realizzato in sezione 2.3) e immergere l&#39;estremità libera del filo di rame nel piccolo serbatoio di collante argento che sono riuniti in all&#39;interno del coperchio della fiala dopo l&#39;apertura (Figura 2H). Nota: E &#39;necessaria solo una piccola goccia. </li><li> Spostare fine colla-tuffato del filo di rame al pezzo di filo d&#39;oro, mentre si solleva un&#39;estremità per evitare sbavature la colla sulla piastra oggetto stereomicroscopio. Provate a sovrapporsi copper e filo d&#39;oro per pochi mm (figura 2I), distribuire la colla lungo la sovrapposizione dei due fili. </li><li> Attendere che la colla si è asciugata abbastanza per tenere i fili uniti. Verificare il contatto colla dopo l&#39;essiccazione e aggiungere un po &#39;di colla fresca con un piccolo spillo o un altro pezzo di filo di rame se alcune parti dei fili uniti mostrano parti senza colla. </li><li> Dopo l&#39;elettrodo insetto è pronto, conservarlo, ad esempio inserito in un pezzo di polistirolo. Nota: La lunghezza del filo d&#39;oro determinerà la libertà di movimento del afidi: se è troppo breve (meno di 5 mm), l&#39;afide può sentirsi vincolata e non si comporterà normalmente; se è troppo lungo (&gt; 2 cm), l&#39;afide si muove liberamente. Afidi tendono a spostarsi verso il lato adaxial delle foglie, se lasciati. Se il filo d&#39;oro tocca la foglia, il segnale sarà cortocircuitato. </li></ol></li><li> Fase 3. <ol><li> L&#39;afide può essere tenuto in posizione mediante aspirazione luce, utilizzando un vuoto; in questo caso, installare tegli dispositivo di aspirazione con lo stereomicroscopio. Posizionare la bocca di aspirazione al centro del campo. </li><li> Agitare bene il flacone con colla d&#39;argento per alcuni minuti (o vortex) fino a quando si forma un&#39;emulsione liscia. Raccogliere un afide con il pennellino. </li><li> Accendere il dispositivo di aspirazione e montare l&#39;afide sull&#39;apertura di aspirazione (figura 2J), con la parte posteriore del ventre rivolto allo sperimentatore. Con il pennello fine, rimuovere ogni residuo di cera con l&#39;addome (abbondante in afidi cavolo). </li><li> Aprire il flacone colla e bagnare un perno con una piccola goccia di colla argento (Figura 2K). Applicare la goccia di colla argento sul retro dell&#39;addome del afidi (Figura 2L-M). Sia questo droplet completamente asciutta per parecchi minuti, agitare vigorosamente il flaconcino colla di nuovo e aggiungere una seconda goccia di colla d&#39;argento in cima al primo. Nota: Mentre la colla argento è un conduttore elettrico, non provoca significativedanni alla cuticola dell&#39;insetto. </li><li> Dopo aver chiuso la fiala colla, inserire l&#39;estremità libera del filo oro nella gocciolina bagnato e mantenere il filo ancora consentendo la colla si asciughi completamente (Figura 2N). Evitare sbavature colla sulla gambe o antenne e scartare un afide se questo è successo. </li><li> Spegnere il dispositivo di fissaggio di aspirazione e sollevare con attenzione l&#39;insetto (Figura 2O). Se necessario, utilizzare un pennello fine di contribuire alla revoca del afide dal dispositivo di aspirazione. Nota: Cablaggio B. brassicae non richiede un vuoto, in quanto possono essere collegati su un pezzo di un tessuto precisione da laboratorio, la superficie ruvida che fornisce l&#39;afide con abbastanza impugnatura in modo che non venga sollevato dopo l&#39;applicazione di una goccia di colla a freddo al suo addome. Dopo asciugatura della colla si può sollevare l&#39;afide dal tessuto con l&#39;aiuto di un pennello fine. </li><li> Inserire il perno in ottone con l&#39;insetto cablata in polistirolo e, se necessario, continuarecablaggio tutti gli altri insetti da utilizzare per la sessione di registrazione EPG. Nota: Questi protocolli per il cablaggio afidi funzionano bene per noi. L&#39;utente può trovare la sua / suo proprio metodo di cablaggio afidi. </li></ol></li><li> Passo 4. <ol><li> Mettere piante nella gabbia di Faraday (Figura 2P) su un supporto non conduttivo: utilizzare capsule Petri o una lastra di vetro o di plastica. </li><li> Inserire un elettrodo pianta nel terreno di ogni piatto. Inserire il perno di ottone dell&#39;insetto metallico nel connettore di ingresso della EPG preamplificatore (Figura 2Q). Nota: l&#39;elettrodo terreno non corrisponde all&#39;elettrodo terra utilizzato in altre tecniche elettrofisiologiche. Ha la tensione di offset necessaria per regolare e compensare le tensioni di polarizzazione dell&#39;elettrodo. </li><li> Nell&#39;interfaccia del software di acquisizione mandrino +, con frequenza di campionamento fissa di 100 Hz, immettere un nome file, specificare il tempo di registrazione, e scrivere il testo di specificare i dettagli dell&#39;esperimento (trattamento, impianti / inse<html> specie ct, ecc) in commento linee 2 e 3. </li><li> Abbassare gli insetti su una zona di atterraggio adeguata dell&#39;impianto e avviare la sessione di registrazione facendo clic sul pulsante Start del software di acquisizione di interfaccia (Stylet +). Nota 1: un massimo di 8 canali può essere utilizzata contemporaneamente in un EPG istituito. Un EPG elettrodi o più EPG-elettrodi per ogni impianto può essere utilizzato. Nota 2: quando il focus dello studio è il comportamento afide, avviare la registrazione prima di accedere pianta degli afidi per evitare di perdere le prime attività di penetrazione pianta. </li><li> Per studiare le risposte elettrofisiologiche delle SE a stimoli, attendere almeno 10 minuti dopo l&#39;afide è entrato in fase floema, al fine di garantire che il afidi è in una fase di sostenuta ingestione floema, e che la linea di base del segnale è stabile. Solo allora, avviare qualsiasi esperimento di stimolazione della pianta. </li></ol></li></ol>tp_upload / 52826 / 52826fig2.jpg &quot;/&gt; Figura 2. Fare EPG-elettrodi con afidi o altri insetti hemipteran per grafico elettrica penetrazione (EPG) registrazioni. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52826/52826fig2highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> Pannelli AI, passaggi necessari per preparare EPG-elettrodi meno la afide. Innanzitutto, sciogliere un pezzo di metallo di saldatura sulla punta di un bullone di saldatura (A). Poi, immergere la testa del perno di ottone in una goccia di liquido saldatura (B), e in contatto con il metallo fuso sulla punta del bullone di saldatura (C). Immediatamente dopo questo passo, contattare l&#39;estremità di un filo di rame alla punta del bullone di saldatura, per l&#39;incollaggio alla testa del perno in ottone (EF). Con un bisturi o una lama, tagliare un pezzo di filo d&#39;oro (G). Tuffol&#39;estremità libera del filo di rame (unito all&#39;altra estremità al perno ottone) sulla colla d&#39;argento (H), e rapidamente uniscono il filo d&#39;oro ad esso (I) prima l&#39;argento asciuga. Il filo d&#39;oro è un ottimo conduttore, e può essere polarizzata. In realtà, nella maggior parte dei casi, la polarizzazione è troppo piccolo per essere rilevato, e in tal caso, può essere compensata con l&#39;offset di tensione (V). Pannelli JO, passaggi necessari per collegare un afide (o altro hemipteran insetto) all&#39;elettrodo. Innanzitutto, sollevare accuratamente un afide con un pennello acquarello fine e posizionarlo sulla apertura del dispositivo di aspirazione di vuoto (J). Accendere la pompa di aspirazione e coprire il foro valvola dell&#39;aria con un pezzo di carta per applicare il vuoto. Immergere la punta del perno dell&#39;insetto nella colla argento (K), e mettere una piccola goccia di colla sulla parte superiore dell&#39;addome del afidi, allo stereomicroscopio (LM). All&#39;interno delprossimi ~ 20 sec, prima della gocciolina colla argento si asciuga afide, inserire l&#39;estremità del filo d&#39;oro dell&#39;elettrodo insetto nella gocciolina bagnato di colla d&#39;argento, e tenerlo in posizione per 1-3 minuti, fino a quando la colla argento ha completamente essiccata all&#39;aria (N). A questo punto, disattivare aspirazione rimuovendo il pezzo di carta che copre il foro di sfiato del dispositivo di aspirazione e rimuovere accuratamente l&#39;afide, dal dispositivo di aspirazione: sollevamento afide dopo il cablaggio spesso richiede qualche aiuto da un pennellino (O). Pannello P mostra una panoramica di tutta la EPG allestito all&#39;interno della gabbia di Faraday, e Panel Q mostra una panoramica della combinazione impianto-afide per EPG. Vedere sezione 2 sopra per una spiegazione più dettagliata di questo processo. Piccole lettere sono etichette che alludono alle voci che bisogna fare EPG-elettrodi: un: Bullone di saldatura; b: fuso in metallo di saldatura;c: il fluido di saldatura; d: connettore d&#39;ottone perno (unghie); e: filo di rame; f: filo d&#39;oro Ø 18μm; g: dispositivo di aspirazione; h: afide; i: colla d&#39;argento a base d&#39;acqua; j: Gabbia di Faraday; k: impianto dell&#39;elettrodo; l: connettore di ingresso (BNC) dell&#39;EPG preamplificatore.

<ol><li>Salvador-Recatalà, V., Tjallingii, W. F., Farmer, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time%2C+in+vivo.+intracellular+recordings+of+caterpillar-induced+depolarization+waves+in+sieve+elements+using+aphid+electrodes%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">Real-time, in vivo. intracellular recordings of caterpillar-induced depolarization waves in sieve elements using aphid electrodes.</a> New Phytologist. 203 (2), 674-684 (2014).</li>
<li>Van Bel, A. J., Knoblauch, M., Furch, A. C., Hafke, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%28Questions%29n+on+phloem+biology.+1.+Electropotential+waves%2C+Ca2%2B+fluxes+and+cellular+cascades+along+the+propagation+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Science%22%5BJournal%5D)">(Questions)n on phloem biology. 1. Electropotential waves, Ca2+ fluxes and cellular cascades along the propagation pathway.</a> Plant Science. 181 (3), 210-218 (2011).</li>
<li>Rhodes, J. D., Thain, J. F., Wildon, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathway+for+electrical+signal+conduction+in+the+wounded+tomato+plant%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">The pathway for electrical signal conduction in the wounded tomato plant.</a> Planta. 200, 50-57 (1996).</li>
<li>Fromm, J., Eschrich, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+of+ionic+movements+with+phloem+unloading+and+loading+in+barley+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology+and+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Correlation of ionic movements with phloem unloading and loading in barley leaves.</a> Plant Physiology and Biochemistry. 27, 577-585 (1989).</li>
<li>Brette, R., Destexhe, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+Recordings%5BTitle%5D)+AND+%22Handbook+of+Neural+Activity+Measurement%22%5BJournal%5D)">Intracellular Recordings.</a> Handbook of Neural Activity Measurement. Brette, R., Destexhe, A. , Cambridge University Press. 44-91 (2012).</li>
<li>Umrath, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Untersuchungen+%C3%BCber+Plasma+und+Plasamstromung+an+Characeen.+IV.+Potentialmessungen+an+Nitella+mucronata.+mit+besonderer+Ber%C3%BCcksichtingung+der+Erregungserscheinungen%5BTitle%5D)+AND+%22Protoplasma%22%5BJournal%5D)">Untersuchungen über Plasma und Plasamstromung an Characeen. IV. Potentialmessungen an Nitella mucronata. mit besonderer Berücksichtingung der Erregungserscheinungen.</a> Protoplasma. 9, 576-597 (1930).</li>
<li>Umrath, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Der+Erregungsvorgang+bei+Nitella+mucronata%5BTitle%5D)+AND+%22Protoplasma%22%5BJournal%5D)">Der Erregungsvorgang bei Nitella mucronata.</a> Protoplasma. 17, 258-300 (1932).</li>
<li>Carden, D. E., Walker, D. J., Flowers, T. J., Miller, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+measurements+of+the+contribution+of+cytosolic+Na%2B+and+K%2B+to+salt+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Single-cell measurements of the contribution of cytosolic Na+ and K+ to salt tolerance.</a> Plant Physiology. 131 (2), 676-683 (2003).</li>
<li>Miles, P. W., McLean, D. L., Kinsey, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+that+two+species+of+aphid+ingest+food+through+an+open+stylet+sheath%5BTitle%5D)+AND+%22Experientia%22%5BJournal%5D)">Evidence that two species of aphid ingest food through an open stylet sheath.</a> Experientia. 20 (10), 582(1964).</li>
<li>McLean, D. L., Kinsey, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+technique+for+electronically+recording+aphid+feeding+and+salivation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A technique for electronically recording aphid feeding and salivation.</a> Nature. 202, 1358-1359 (1965).</li>
<li>Tjallingii, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electronic+recording+of+penetration+behaviour+by+aphids%5BTitle%5D)+AND+%22Entomologia+Experimentalis+et+Applicata%22%5BJournal%5D)">Electronic recording of penetration behaviour by aphids.</a> Entomologia Experimentalis et Applicata. 24, 721-730 (1978).</li>
<li>Tjallingii, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+potentials+as+an+indication+for+plant+cell+penetration+by+aphid+stylets%5BTitle%5D)+AND+%22Entomologia+Experimentalis+et+Applicata%22%5BJournal%5D)">Membrane potentials as an indication for plant cell penetration by aphid stylets.</a> Entomologia Experimentalis et Applicata. 38, 187-193 (1985).</li>
<li>Alvarez, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+Solanum+stoloniferum.+responses+to+probing+by+the+green+peach+aphid+Myzus+persicae.+and+the+potato+aphid+Macrosiphum+euphorbiae%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Science%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of Solanum stoloniferum. responses to probing by the green peach aphid Myzus persicae. and the potato aphid Macrosiphum euphorbiae.</a> Insect Science. 20 (2), 207-227 (2013).</li>
<li>Carmo-Sousa, M., Moreno, A., Garzo, E., Fereres, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+non-persistently+transmitted+virus+induces+a+pull-push+strategy+in+its+aphid+vector+to+optimize+transmission+and+spread%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Research%22%5BJournal%5D)">A non-persistently transmitted virus induces a pull-push strategy in its aphid vector to optimize transmission and spread.</a> Virus Research. 186, 38-46 (2014).</li>
<li>Jacobson, A. L., Kennedy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+Penetration+Graph+studies+to+investigate+the+effects+of+cyantraniliprole+on+feeding+behavior+of+Myzus+persicae.+%28Hemiptera%3A+Aphididae%29+on+Capsicum+annuum%5BTitle%5D)+AND+%22Pest+Management+Science%22%5BJournal%5D)">Electrical Penetration Graph studies to investigate the effects of cyantraniliprole on feeding behavior of Myzus persicae. (Hemiptera: Aphididae) on Capsicum annuum.</a> Pest Management Science. 70 (5), 836-840 (2014).</li>
<li>Morris, G., Foster, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duelling+aphids%3A+electrical+penetration+graphs+reveal+the+value+of+fighting+for+a+feeding+site%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Duelling aphids: electrical penetration graphs reveal the value of fighting for a feeding site.</a> Journal of Experimental Biology. 211 (9), 1490-1494 (2008).</li>
</ol>

WFT ha lanciato EPG Systems come attività di pensionamento ed è affiliata finanziariamente ad essa.

Questo articolo fornisce un protocollo dettagliato per rendere elettrico Penetrazione Graph (EPG) registrazioni. La tecnica EPG è ben definito, con 100-200 utenti attivi in tutto il mondo, ed è stato implementato per molti studi su diversi argomenti, ad esempio: a) la resistenza pianta ospite di afidi e altri insetti stiletto-cuscinetto 13; b) impianti e virus patogeni meccanismi di trasmissione 14; c) Modalità di insetticida di azione, (tossicità e comportamento cambia) 15; d) EPG sono ...

La capacità di produrre segnali elettrici a lunga distanza è una caratteristica vantaggiosa di organismi pluricellulari che permette risposte efficaci agli stimoli esterni. Questa caratteristica si è evoluto in maniera indipendente in piante e animali, e rappresenta quindi un caso di evoluzione convergente. Dato che i segnali elettrici sono accoppiati con funzioni importanti in animali come trasmissione neurale e la contrazione muscolare, la base molecolare, il meccanismo di trasmissione, e la funzione di segnali elettrici di stimolo indotto negli animali sono oggetto di ricerca intensiva. Al contrario, lo stimolo indotto la segnalazione elettrica nelle centrali ha ricevuto scarsa attenzione della ricerca. Anche se le piante non hanno i nervi o muscoli, ci sembra essere prove sufficienti per supporre che i segnali elettrici di stimolo indotto nelle piante svolgono un ruolo chiave nelle loro risposte ai fattori ambientali. Il floema, la componente vivente del sistema vascolare delle piante, è stata postulata come uno dei principali substrate per la trasmissione di segnali elettrici di stimolo indotto, da stimolato / danneggiato ad aree non stimolato / integri 2. Le principali cellule del floema sono gli elementi setaccio (Ses),, cellule allungate relativamente semplici. Le estremità delle SE sono collegati ad altre SE, formando una continua, a bassa resistenza, sistema del tubo setaccio che si sviluppa per tutta la pianta. Vi sono, tuttavia, molto pochi studi sulle proprietà elettriche di queste cellule altamente specializzate. In questi studi precedenti, i ricercatori accessibili SE o con vetro micro-elettrodi 3 mandrini o con elettrodi di vetro che sono stati accoppiati a piantare-inseriti di afidi, dopo stylectomy (taglio) 4. Microelettrodi di vetro sono realizzati da capillari di vetro che sono tirati ad una estremità con il calore in una punta sottile inferiore a 1 micron di diametro, e successivamente riempito con una soluzione di KCl. A Ag / AgCl o platino filo, inserito nel elettrodo di vetro KCl-riempita viene quindi collegato all&#39;ingresso dell&#39;amplificatore, e un referenteelettrodo viene inserito nella vasca che circonda la cella di interesse, completando il circuito. Questa configurazione registra la differenza di potenziale tra l&#39;elettrodo extracellulare referente e l&#39;elettrodo di misura intracellulare, cioè, il potenziale di membrana della cellula 5. Con questo metodo, Umrath fatto la prima registrazione intracellulare da una cellula vegetale, utilizzando le alghe Nitella 6,7. Nitella è relativamente semplice organismo a grandi cellule, e quindi suscettibili di esperimenti elettrofisiologia intracellulari. Al contrario, l&#39;inserimento degli elettrodi di vetro intracellulari nelle piccole cellule, piante terrestri tridimensionali multicellulari è tecnicamente impegnativo, richiede un ricercatore altamente qualificato, nonché visualizzazione sofisticato, micromanipolazione e apparecchiature antivibrazione. Sebbene elettrodi di vetro sono adatti a registrare da cellule superficiali nelle piante, come le cellule epidermiche radice 8, recordin intracellularegs dalle cellule profondamente radicate nel tessuto della pianta, come la SE, causa danno risposte indotte molto probabilmente, confondendo i risultati. Nel 1989, Fromm e Eschrich segnalato l&#39;uso di un metodo alternativo, chiamato il &#39;metodo di afide&#39;, in cui gli elettrodi di vetro sono accoppiati a stiletti afidi dopo stylectomy 4. Il metodo afide è minimamente invasiva, perché mandrini flessibili non causano tessuti o cellule danni elettrodi in vetro fanno. Mandrini afidi sono grande invenzione della natura per la penetrazione pianta, e gli afidi sono molto più abili di esseri umani nella ricerca di SE. Sfortunatamente, questo metodo afide è anche molto esigente in termini di competenze tecniche e attrezzature. Inoltre, il successo di ogni esperimento che implementa questa tecnica dipende interamente l&#39;afide essere in modalità di alimentazione - con il mandrino stabilmente inserita in una SE, al momento della stylectomy. Pensare in retrospettiva, si può vedere che le probabilità di successo di questa tecnica avrebbe potuto essere improved aggiungendo al setup sperimentale uno strumento che consente di identificare se il mandrino è afidi in SE nell&#39;applicazione stylectomy. Nel 1964, McLean e Kinsey descritto un &#39;sistema di monitoraggio elettronico&#39; per lo studio del comportamento alimentare di afidi in tempo reale 9,10. In questo sistema, l&#39;afide e l&#39;impianto mandrino-penetrato sono stati integrati in un circuito elettrico. Successivamente, nel 1978, Tjallingii ideato una versione modificata del sistema, denominato sistema &#39;Electrical Penetrazione Graph&#39; (EPG) 11,12. Considerando che il sistema di controllo elettronico originale era sensibile alle potenzialità resistenza origine solo, con il sistema EPG, la forza elettromotrice (fem) originato potenziali, cioè, in un impianto o l&#39;insetto, potrebbero essere registrati in aggiunta alle potenzialità derivanti dal resistenza (R) nella insetto. Questo rappresenta un miglioramento importante, perché sia ​​il segnale componenti, EMF e R,fornire biologico informazioni rilevanti sugli eventi durante la penetrazione pianta dagli afidi. Ciò che rende la EPG preamplificatore sensibile alle componenti R è relativamente bassa resistenza di ingresso 1 GΩ, che è vicino alla media della resistenza delle piante / afidi. Una piccola tensione di offset (Figura 1, V) di circa +100 mV viene applicato alla pianta, che viene poi suddivisa su piante e insetti da un lato, e la resistenza di ingresso sull&#39;altro. Le tensioni e le loro variazioni sono misurate in un punto (Figura 1A, B) tra l&#39;insetto e la resistenza di ingresso. Pertanto, le componenti R rappresentano modulazioni resistenza vegetale afide della tensione di offset, mentre i EMF-componenti sono una certa frazione di potenziali di piante al punta del mandrino e potenzialità causati nella insetto. I potenziali vegetali - più importanti qui - sono potenziali principalmente membrane delle cellule vegetali forati dai stiletti afidi. I potenziali insetti sembrano essere principalmentepotenziale di streaming causate da movimenti fluidi nei due canali stiletto, cioè, il cibo ei canali salivari; nessun potenziale nervose o muscolari interne sono registrate nel EPG. In pratica, le funzioni punta del mandrino come una punta dell&#39;elettrodo. Tutte le cellule vegetali sono caricati negativamente all&#39;interno rispetto all&#39;esterno positiva della cellula. La corrente elettrica (cioè, il movimento di ioni in soluzione acquosa) scorre dall&#39;interno verso l&#39;esterno e vice versa è molto limitato a causa della elevata resistenza della membrana cellulare. Normalmente il potenziale di riposo viene mantenuta costante. Tuttavia, quando gli ioni negativi muovono fuori o ioni positivi si muovono attraverso la membrana cellulare, il potenziale di membrana è ridotto, cioè, &#39;depolarizza&#39;. Depolarizzazione si verifica in caso di eccitazione delle cellule. Ioni quindi spostare avanti o indietro quando specifici canali ionici nella membrana vengono aperti o quando la membrana è danneggiata e ioni perdite dentro e fuori. Tutte le cellule hanno canali ionici e pompe in tegli membrana plasmatica che portano il potenziale di membrana al suo livello di riposo ripristinando la concentrazione originale di vari ioni all&#39;interno della cellula. Il potenziale di riposo e le sue variazioni sono componenti EMF, e di conseguenza, la tecnica EPG è adatto a misurare loro. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52826/52826fig1.jpg" /> Figura 1. EPG-elettrodi. L&#39;EPG-elettrodo è un afide vivente integrato nel circuito elettrico Penetrazione Graph (EPG), il cui mandrino viene inserito in un elemento di setaccio (SE) in modalità di alimentazione stabile. Se il mandrino SE-infilzata è a riposo (pannello A), la tensione nel circuito, registrato da EPG, è stabile e al potenziale livello di riposo (pannello C, Rest). Se la SE è entusiasta, i suoi depolarizza membrana (pannello B), che viene visualizzato nella EPG come un graduale aumento della tensione (pannello C, Depolarizzazione). Come l&#39;equilibrio ionico nella SE torna a riposare, cioè, repolarizes, la tensione registrata da EPG diminuisce gradualmente al potenziale livello di riposo (Panel C, ripolarizzazione). Nel pannello C, &quot;A&quot; e &quot;B&quot; si riferiscono agli scenari illustrati in pannelli A e B, rispettivamente. V = regolabile sorgente di tensione di offset. Ri = resistenza di ingresso. In parallelo alla resistenza esterna 1 GΩ, l&#39;amplificatore ha un interno (nel OpAmp) alto 1,5 resistore TΩ (pannelli A e B, in grigio). Con il controllo remoto dello switch EPG pre-amp può essere cambiata da normale a EMF-mode, che permette di ottenere valori di tensione ad alta precisione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52826/52826fig1highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> Nella sezione successiva, mettiamo a disposizione il lettore con un protocollo di base per l&#39;esecuzione di esperimenti EPG che sia valido per entrambi gli studi insetti focalizzati e vegetali a fuoco.

<table><tbody><tr><td>Perni connettore in ottone</td><td>EPG Systems/hardw.shop</td><td></td><td>&Phi; 1,2 mm</td></tr><tr><td>Filo di rame sottile</td><td>EPG Systems/hardw.shop</td><td></td><td>circa &Phi; 0,2 mm</td></tr><tr><td>Filo d'oro sottile</td><td>EPG Systems</td><td></td><td>&Phi; 18 &; m</td></tr><tr><td>Negozio</td><td></td> di <td>ferramenta</td> per liquidi di saldatura <td>corrispondenti al filo di saldatura</td></tr><tr><td>Negozio</td><td></td><td></td>di ferramenta<td>per fili di saldatura con anima in resina</td></tr><tr><td>Polistirolo</td><td>qualsiasi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Colla d'argento a base d'acqua</td><td>Sistemi</td><td></td> EPG<td><a href="http://www.epgsystems.eu/">ricetta in: www.epgsystems.eu</a></td></tr><tr><td>Salviette di carta</td><td>Kimberly-Clark</td><td>5511</td><td></td></tr><tr><td>Bullone di saldatura</td><td>qualsiasi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscopio</td><td>Hund Wetzlar</td><td></td><td>l'ingrandimento minimo è 10X</td></tr><tr><td>Forbici piccole</td><td>Strumenti di scienza fine</td><td>14088-10</td><td></td></tr><tr><td>Bisturi</td><td>Strumenti di scienza fine</td><td>10050-00</td><td></td></tr><tr><td>Pinze fini</td><td>Strumenti di scienza fine</td><td>11231-20</td><td></td></tr><tr><td>Vortice</td><td>A. Hartenstein</td><td>L46</td><td></td></tr><tr><td>Pennelli per acquerello</td><td>qualsiasi</td><td></td><td>Numero 1 o 2</td></tr><tr><td>Dispositivo</td><td></td><td></td> di aspirazione dell'aria <td>vedi descrizione in: www.epgsystems.eu</td></tr><tr><td>Perni per insetti</td><td>qualsiasi</td><td></td><td>N. 1 o 2</td></tr><tr><td>Tavolo</td><td></td><td></td><td></td>solido</tr><tr><td>Gabbia</td><td></td><td></td> di Faraday <td>Computer fatto a mano</td></tr><tr><td></td><td>Fujitsu Siemens</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software di acquisizione dati</td><td>EPG Systems</td><td></td><td>Stylet+d</td></tr><tr><td>Giga-4 (-8) Sistema completo</td><td>EPG Systems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>comprende:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centralina principale con uscita</td><td></td> USB <td>Di155/Di710</td><td>12/14 bit, velocità 100&nbsp; Hz (softw. fisso)</td></tr><tr><td>Sonde EPG 4 (8)</td><td></td><td></td><td>50x preamplificatore DC</td></tr><tr><td>Morsetti girevoli su asta</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adattatore</td><td></td><td></td> di alimentazione DC <td>bipolare, 230/115 VAC a -/+8 VDC</td></tr><tr><td>Elettrodi e cavi</td><td></td><td></td><td></td>di impianto</tr><tr><td>Cavi di prova e di terra aggiuntivi&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

una nuova applicazione della penetrazione elettrica graph (epg) per l&#39;acquisizione e la misurazione dei segnali elettrici in floema sieve elements

A New Application of the Electrical Penetration Graph (EPG) for Acquiring and Measuring Electrical Signals in Phloem Sieve Elements

Proprietà elettrofisiologiche di cellule sono spesso studiati in vitro, dopo averli dissociandosi dal loro ambiente naturale. Tuttavia, lo studio di trasmissione elettrica tra le cellule lontane in un organismo è necessario in vivo, registrazioni prive di artefatti di cellule incorporate all&#39;interno del loro ambiente nativo. La trasmissione dei segnali elettrici da ferita a zone illesi in un impianto ha suscitato da tempo l&#39;interesse di botanici. Il floema, la parte viva del sistema vascolare pianta che si sviluppa in tutta la pianta, è stata postulata come un tessuto importante nella trasmissione elettrica negli impianti. La mancanza di adeguati metodi elettrofisiologici pone molte sfide per lo studio delle proprietà elettriche delle cellule floema in vivo. Qui vi presentiamo un nuovo approccio per elettrofisiologia intracellulare di elementi setaccio (SE) che utilizza afidi che vivono, o altri insetti hemipteran floema-alimentazione, integrata nella gra penetrazione elettricoph (EPG) del circuito. La versatilità, la robustezza e la precisione di questo metodo ha permesso di registrare e studiare in dettaglio i segnali elettrici ferita indotta a SE di vene centrali del pianta modello Arabidopsis thaliana 1. Qui mostriamo che EPG-elettrodi possono essere facilmente implementati per intracellulari registrazioni elettrofisiologiche di SE in vene marginali, nonché per studiare la capacità delle SE di rispondere con segnali elettrici a diversi stimoli esterni. L&#39;approccio EPG applicata alla elettrofisiologia intracellulare di SE può essere implementata per una grande varietà di specie vegetali, in un gran numero di combinazioni pianta / insetti, e per molti ricerca mira.

In uno studio precedente, abbiamo implementato la tecnica EPG-elettrodo con lo scopo di caratterizzare i segnali elettrici prodotti in SE della midvein durante l&#39;attacco caterpillar 1. Il midvein è un sito di inserzione preferito per elettrodi in vetro convenzionale, così come per gli elettrodi di vetro-stiletto, perché è SE-denso, e relativamente robusto, quindi suscettibili di fissazione necessaria per attuare queste tecniche. Qui, abbiamo sfruttato la versatilità dell&#39;elettrodo EPG con lo scopo di ...

Il Grafo di Penetrazione Elettrica (EPG) è una tecnica ben consolidata per studiare il comportamento alimentare degli insetti portatori di stiletto. Qui mostriamo una nuova applicazione dell'EPG come strumento non invasivo per l'acquisizione di registrazioni elettrofisiologiche intracellulari degli elementi del setaccio (SE), le cellule che formano il sistema vascolare floematico nelle piante.

Una nuova applicazione della penetrazione Elettrica Graph (EPG) per l&#39;acquisizione e la misurazione dei segnali elettrici in Floema Sieve Elements

Electrophysiological properties of cells are often studied in vitro, after dissociating them from their native environments. However, the study of ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è studiare i segnali elettrici a lunga distanza trasmessi attraverso gli elementi del setaccio vascolare da una zona della pianta in corso di consumo da parte di una farfalla a un'area intatta della stessa pianta. Questo obiettivo si raggiunge assemblando un circuito per la grafia della penetrazione elettrica (EPG) che integra un insetto ematofago, come un afide, e una pianta. L'afide inserisce lo stile nella pianta, chiudendo così il circuito, e inizia la registrazione EPG.Infine, l'afide inserisce il suo stile in un elemento cribroso e vi rilascia della saliva per alcuni minuti, seguito dalla lunga fase di ingestione; sia la fase di salivazione o fase E1, sia la fase di ingestione o fase E2 presentano potenziali elettrici ritmici e di piccola entità. Successivamente, una larva viene posizionata su una foglia e lasciata nutrirsi da essa. Mentre l'afide registrato tramite EPG continua a nutrirsi del flusso in una foglia adiacente, il danno arrecato dalla larva alla nervatura centrale genererà un segnale elettrico che verrà trasmesso attraverso il floema alle altre foglie, inclusa quella da cui si sta nutrendo l'afide collegato all'EPG.L

a-new-application-electrical-penetration-graph-epg-for-acquiring

Research

Ricerca

JoVE Journal

Environment

Ambiente

Un Microdevice con potenziale elevato throughput serve a dimostrare tridimensionale (3D) dielettroforesi (DEP) con nuovi materiali. Il grafene carta nanoplatelet e nastro biadesivo sono stati alternativamente accatastati; un micro-ben 700 micron è stato perforato trasversale agli strati. Comportamento DEP di perle di polistirene è stata dimostrata nel micro-bene.

Sviluppo di un dispositivo 3D grafene elettrodi dielettroforetiche

Questa presentazione dimostra un metodo in cui l'elettroporazione di cellule aderenti e coltivate viene utilizzata per lo studio della comunicazione intercellulare e giunzionale, mentre le cellule crescono su un vetrino rivestito con ossido di indio-stagno conduttivo e trasparente.

Un test funzionale per Gap giunzionale esame; Elettroporazione di cellule aderenti su indio-Tin Oxide

I trasportatori nelle membrane cellulari consentono la segregazione differenziale degli ioni attraverso le membrane cellulari o gli strati cellulari e svolgono un ruolo cruciale durante la fisiologia, la riparazione e la patologia dei tessuti. Descriviamo il microelettrodo autoreferenziale iono-selettivo che consente la misurazione di flussi ionici specifici in singole cellule e tessuti in vivo.

Misurazione della extracellulare Ion Flussi Utilizzando il ionoselettivo autoreferenziale microelettrodo Tecnica

Questo manoscritto descrive le applicazioni di elettrodi selettivi protone e patch metodi di bloccaggio per misurare l'attività dei sistemi di trasporto di protoni. Questi metodi di superare alcuni limiti delle tecniche comunemente usate per studiare l'attività di trasporto di protoni, come moderata sensibilità, risoluzione temporale e controllo insufficiente milieu intracellulare.

Applicazione di misura di elettrofisiologia di studiare l'attività dei trasportatori di Electro-neutro

L'articolo descrive un protocollo ottimizzato per fare fette di tessuto vitale del cervello-ipofisi, utilizzando il medaka pesci teleostei (Oryzias latipes), seguita da registrazioni elettrofisiologiche delle cellule ipofisarie utilizzando la tecnica del patch-clamp con il configurazione di patch perforato.

Fette di cervello-ipofisi sane per le indagini elettrofisiologiche delle cellule ipofisarie in pesci teleostei

Questo articolo contiene una serie di protocolli per lo sviluppo di reti di cardiomiociti derivate da cellule staminali derivate da cellule staminali derivate dall'uomo (hiPSC-CM) coltivate su piastre MEA multiwell per elettropolarmente la membrana cellulare per misurazioni potenziali di azione. Le registrazioni ad alta velocità vengono ottenute ripetutamente dagli stessi siti cellulari nel corso di giorni.

Reti di cardiomiociti derivati da umani da iPSC su array di microelettrodi multiwell per registrazioni di potenziali azioni ricorrenti

Viene delineato l'uso combinato della tecnologia microelectrode array e della stimolazione chimica indotta da 4-aminopiridina per studiare l'attività nocicettiva a livello di rete nel corno dorsale del midollo spinale.

Registrazione dell'attività di rete nei circuiti nocicettivi spinali utilizzando array di microelettrodi

Questo protocollo descrive le tecniche di microfabbricazione necessarie per costruire un dispositivo di elettroporazione microfluidica lab-on-a-chip. La configurazione sperimentale esegue trasfezioni controllate a livello di singola cellula in un flusso continuo e può essere estesa a portate più elevate con controllo basato sulla popolazione. Viene fornita un'analisi che mostra la capacità di monitorare elettricamente il grado di permeabilizzazione della membrana cellulare in tempo reale.

La fabbricazione e il funzionamento di un sistema di micro-elettroporazione a flusso continuo con rilevamento di permeabilizzazione

Sono descritte le procedure per studiare i comportamenti di sondaggio e ingestione delle zanzare Culex tarsalis sulle mani umane utilizzando l'elettropenetragrafia AC-DC.

Elettropenetragrafia AC-DC per lo studio dei comportamenti di sondaggio e ingestione delle zanzare Culex tarsalis sulle mani umane

L'elettroporazione del substrato poroso (PSEP) abbina un'erogazione costante e ad alta produttività con un'elevata vitalità cellulare. L'introduzione delle misure dell'impedenza elettrica transepiteliale (TEEI) fornisce informazioni sui processi intermedi del PSEP e consente la somministrazione senza marcatura. Questo articolo illustra un metodo per eseguire contemporaneamente esperimenti di consegna PSEP e analisi delle misure TEEI.

Elettroporazione basata su substrato poroso con monitoraggio dell'impedenza elettrica transepiteliale

Per lo studio delle risposte delle cellule eccitabili in vitro, il protocollo descrive il monitoraggio ottico dei cambiamenti nella generazione del potenziale d'azione dovuti all'elettroporazione su un semplice modello di cellula eccitabile di cellule HEK tet-on spiking geneticamente modificate, nonché i cambiamenti nella tensione transmembrana con estrazione automatizzata dei parametri rilevanti.

Monitoraggio dei cambiamenti indotti dall'elettroporazione nella generazione di potenziale d'azione nelle cellule HEK Tet-On Spiking geneticamente modificate

Scopri la tecnica EPG per registrare segnali elettrici intracellulari negli elementi cribrosi delle piante durante l'alimentazione degli afidi. Questo metodo rivela la comunicazione elettrica a lunga distanza nelle piante in risposta all'erbivoria.

Una nuova applicazione della penetrazione Elettrica Graph (EPG) per lacquisizione e la misurazione dei segnali elettrici in Floema Sieve Elements (Video) | JoVE Journal

Una nuova applicazione della penetrazione Elettrica Graph (EPG) per l'acquisizione e la misurazione dei segnali elettrici in Floema Sieve Elements

Esplora altri video