Una nuova applicazione della penetrazione Elettrica Graph (EPG) per l'acquisizione e la misurazione dei segnali elettrici in Floema Sieve Elements

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di studiare i segnali elettrici a lunga distanza trasmessi attraverso gli elementi del setaccio a flusso da un'area mangiata da un bruco a un'area intatta in una pianta. Ciò si ottiene assemblando un grafo di penetrazione elettrica o un circuito EPG che integra un insetto emina, come un afide e una pianta. L'afide inserisce il suo stilo nella pianta, chiudendo così il circuito, e inizia la registrazione EPG.

Alla fine l'afide inserisce il suo stilo in un elemento setaccio e vi saliva per alcuni minuti, seguita dalla fase di ingestione di lunga durata, sia la fase di salivazione o E una fase che l'ingestione o E due fasi contengono piccoli e ritmici potenziali di flusso. Successivamente, un bruco viene posto su una foglia e lasciato nutrirsi da una foglia. Mentre l'afide registrato dall'EPG continua a nutrirsi dal flusso in una foglia vicina, il danno inflitto dal bruco alla vena centrale avvierà un segnale elettrico che verrà trasmesso tramite il phem alle altre foglie, compresa la foglia da cui si nutre l'afide cablato EPG.

La dimensione del segnale può essere misurata confrontandola con un impulso di calibrazione di dimensione nota, che è stato applicato in precedenza durante la fase E 2 o di ingestione. I risultati mostrano che il danno mediato da Caterpillar di una foglia induce costantemente un segnale elettrico complesso e significativamente grande nel flusso di una foglia vicina con una prima componente lenta e una seconda e sovrapposta alla prima componente veloce. La tecnica del grafo di penetrazione elettrica è stata introdotta negli anni '60.

Il monitoraggio EPG ha contribuito in modo sostanziale alla nostra conoscenza della penetrazione delle piante da parte di afidi e altri insetti dell'orlo. Il principale interesse economico è lo studio dei meccanismi di resistenza delle piante ospiti, nonché dei meccanismi di trasmissione dei virus delle piante. Così mi è venuto in mente l'idea di utilizzare l'EPG come metodo per l'elettrofisiologia intracellulare nelle piante, facendo un'associazione tra le registrazioni EPG e le registrazioni intracellulari realizzate con elettrodi di vetro convenzionali riempiti di cloruro di potassio sia nelle registrazioni EPC che nelle registrazioni convenzionali fatte con elettrodi di vetro.

Ci sono due livelli di tensione, un livello di tensione relativamente alto che corrisponde alla posizione intracellulare della punta dell'elettrodo di vetro o della punta dello stile AE, e un livello di tensione relativamente basso, che corrisponde alla posizione intracellulare dell'elettrodo di vetro o dell'occhiello AEs. Nel caso dell'EPG. Quando si allevano afidi per una registrazione PG, la scelta della pianta e delle specie di afidi dipende dalla ricerca Obiettivo per gli studi sull'opana rapida, l'afide è appropriato, allevarli in una serra sulle gabbie che circondano l'allevamento.

Le piante devono essere rese a prova di afidi e parassitoidi utilizzando una rete a maglie fini con aperture inferiori al millimetro, ma le cime delle gabbie devono essere di materiale trasparente per consentire la fotosintesi. Ogni due settimane, la popolazione di afidi deve essere spostata su piante fresche. Da 10 a 20 adulti sono tutto ciò che è necessario, gli afidi rimanenti possono essere smaltiti.

Per le registrazioni EPG di insetti, un elettrodo specializzato deve essere costruito con pin di connettore in ottone, una lunghezza di uno o due centimetri di filo di rame, come i filamenti di un cavo elettrico, e un pezzo di filo d'oro molto sottile di circa 1,5 centimetri di lunghezza. Inoltre, usa una colla d'argento a base d'acqua e un semplice piccolo bullone di saldatura con liquido di saldatura e filo di saldatura per cavi in resina. Per iniziare, fondere un pezzo di filo metallico saldante sulla punta di un bullone di saldatura.

Quindi immergere la testa del chiodo di ottone in una goccia di liquido di saldatura. Toccare immediatamente la punta del filo di rame con la punta del bullone di saldatura, fondendolo così con il perno di ottone. Ora agitare accuratamente o agitare la colla d'argento in modo che l'emulsione non si depositi.

Apri la bottiglia e immergi l'estremità libera del filo di rame nella colla sul coperchio sotto uno stereoscopio. Unire la maglia dorata con una sovrapposizione di almeno un millimetro e lasciare asciugare la colla d'argento. Cerca di non spalmare la colla sulla piastra del microscopio dopo che la colla si è asciugata, controlla il contatto tra la colla d'argento e il filo d'oro dove parti dei fili di giunzione non sono incollate.

Aggiungi la colla fresca con uno spillo o un filo di rame fino a quando l'insetto non è pronto. L'elettrodo completato può essere conservato in modo sicuro su polistirolo. Per riparare l'afide, usa un semplice dispositivo di aspirazione costruito in casa.

L'aspirazione è controllata da un piccolo pezzo di carta su un foro di ingresso. Accendere il dispositivo a vuoto e spostarlo sulla piastra dello stereomicroscopio per centrare la punta di aspirazione. Raccogli un afide su un pennello per acquerello di piccole dimensioni o più piccolo e monta l'afide sul lato ventrale verso la punta di aspirazione per un facile accesso al dorso.

Usando il pennello, rimuovere la cera superficiale dall'addome, che è abbondante nell'afide del cavolo. Ora agita accuratamente o agita la colla d'argento e, usando uno spillo per insetti fine, applica una piccola goccia di colla d'argento sugli afidi dorso. Lascia asciugare per due o tre minuti.

Agitare nuovamente il flaconcino e applicare una goccia di colla sopra la prima goccia essiccata. Quindi collegare il filo d'oro dell'elettrodo dell'insetto preparato nella seconda goccia di colla d'argento. Mentre è ancora bagnato, tieni fermo il filo mentre la colla si asciuga.

Se la colla si deposita sulle zampe o in uno qualsiasi degli afidi, ricomincia da capo con il nuovo animale. L'elettrodo dell'insetto può essere riciclato. Una volta che la colla si è asciugata.

Spegnere l'aspirazione e liberare l'afide dal dispositivo di aspirazione. L'insetto cablato è ora pronto per essere utilizzato per le registrazioni EPG. Alcuni afidi possono essere cablati senza fissazione a vuoto.

In questo caso, posizionare l'afide su un pezzo di tessuto di laboratorio, che sia abbastanza ruvido da consentire all'afide di rimanere afferrato. Durante l'applicazione della colla, un filo d'oro può essere inserito nella prima goccia di colla d'argento. Se questa gocciolina è troppo piccola o se si asciuga troppo rapidamente, il filo d'oro non si attaccherà correttamente.

In tal caso, è sufficiente posizionare una piccola goccia di colla d'argento sopra la prima e inserire il filo d'oro, attendere che la colla si asciughi. Quindi sollevare l'afide dalla carta velina con l'aiuto di un pennello sottile. Conserva gli afidi cablati inserendo il chiodo di ottone nel polistirolo fino a quando non è necessario.

Per iniziare, metti le piante sperimentali nella gabbia di Faraday su un supporto non conduttivo come una capsula di Petri. Ora, inserisci un elettrodo per piante nel terreno di ogni vaso. L'elettrodo della pianta non è un elettrodo di terra che deve essere raccolto nella gabbia di Faraday.

Quindi inserire il perno di ottone dell'elettrodo nell'EPG. Pre regolare la posizione della pianta e dell'insetto fino a quando non sono a contatto con l'insetto nella posizione desiderata sulla pianta. Utilizzando il software di interfaccia Style plus, che ha una frequenza di campionamento fissa di 100 hertz, inserire un nome per il file, specificare il tempo di registrazione e scrivere il testo per specificare i dettagli dell'esperimento nelle righe di commento.

Quindi avvia la registrazione tramite il software facendo clic sul pulsante di avvio nell'angolo in alto a sinistra. Inizia l'esperimento abbassando l'afide cablato sulla pianta fino a otto canali, il che significa che otto insetti cablati possono essere registrati contemporaneamente da una configurazione EPG, uno per pianta o più afidi su una pianta. Quando l'afide inserisce il suo stilo nella pianta, il circuito è completato.

Le tensioni fluttuanti del segnale EPG appariranno sullo schermo del computer, effettueranno le regolazioni della tensione dell'impianto e guadagneranno per una registrazione ottimale. Nella maggior parte dei casi, un afide impiegherà almeno un'ora per entrare nella fase di flusso. L'alimentazione a flusso sostenuto è indicata da almeno 10 minuti della forma d'onda E due.

A questo punto, l'elettrodo è pronto ad acquisire segnali elettrici dall'elemento del setaccio, che dovrebbero essere indotti solo quando il segnale E due è stabile. È importante fornire uno o più impulsi di calibrazione, che verranno utilizzati in seguito per stimare la dimensione dei segnali elettrici. Tagliare una foglia con le forbici induce costantemente un segnale elettrico a lunga distanza che viene acquisito dall'afide registrato EPG.

In un esperimento più realistico, un bruco affamato viene usato come agente feritore. Il danno inflitto dal bruco induce costantemente segnali elettrici lenti e veloci che viaggiano verso le altre foglie e possono essere acquisiti con elettrodi EPG. Il rumore generato dall'introduzione del bruco non influenzerà la risposta elettrofisiologica della pianta, ma potrebbe mascherarla per ridurre al minimo questo rumore.

Lo sperimentatore deve essere collegato a terra per verificare se un bruco che si nutre induce segnali elettrici nella foglia che viene mangiata. Un bruco affamato viene posizionato sulla foglia che contiene anche l'afide registrato EPG quando due foglie diverse sono state tagliate in sequenza con le forbici alla giunzione della lamina perale. Un elettrodo EPG posizionato sulla vena media di una foglia intatta che era vicina a entrambe le foglie tagliate ha rilevato risposte elettrofisiologiche simili dallo stesso elemento del setaccio a queste ferite.

Questi elettrofisiologici consistevano in una depolarizzazione lenta e in una depolarizzazione veloce sovrapposta a quella lenta. In un altro esperimento, sono state tagliate anche due foglie, ma in questo caso, una era vicina alla foglia contenente l'elettrodo EPG, mentre l'altra non era vicina alla foglia con l'elettrodo EPG. In questo caso, l'elemento del setaccio singolo ha risposto in modo diverso alle ferite.

La ferita alla foglia non vicina indotta per prima induceva solo un segnale elettrico lento, mentre la ferita alla foglia vicina induceva un segnale complesso con componenti lente e veloci. Questi risultati suggeriscono che gli elementi SIV sono in grado di rilevare la posizione del danno qui utilizzando un afide collegato al sistema EPG, le registrazioni intracellulari sono state effettuate da un elemento setaccio marginale in una foglia di una pianta di arabidopsis. Il taglio di una foglia vicina induceva un segnale elettrico che veniva trasmesso all'elemento del setaccio in cui era inserito lo stiletto dell'afide.

A differenza degli elementi del setaccio nelle vene principali, gli elementi del setaccio nelle vene marginali hanno risposto al danno remoto con una sola onda di depolarizzazione lenta che può corrispondere all'onda di depolarizzazione lenta negli elementi del setaccio centrale. Il grafo o ripetizione della penetrazione elettrica è un metodo che può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'elettrofisiologia vegetale e della fisiologia vegetale come, ad esempio, quali sono sui canali, sono alla base dei segnali elettrici a lunga distanza che viaggiano da una foglia all'altra e, soprattutto, quali sono i ruoli di questi segnali nell'adattamento delle piante al loro ambiente? Dopo aver visto questo video, dovresti avere un'idea di come preparare piante e insetti per l'EPG.

Registrare il cablaggio degli insetti sembra complicato, ma abbiamo dimostrato che è piuttosto semplice e potrebbe incoraggiarti a implementarlo nella tua ricerca.