Name: Una nuova applicazione della penetrazione Elettrica Graph (EPG) per lacquisizione e la misurazione dei segnali elettrici in Floema Sieve Elements (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-02T09:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 16 s
Description: Scopri la tecnica EPG per registrare segnali elettrici intracellulari negli elementi cribrosi delle piante durante l'alimentazione degli afidi. Questo metodo rivela la comunicazione elettrica a lunga distanza nelle piante in risposta all'erbivoria.

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VSR è stato sostenuto da una sovvenzione Marie Curie IIF (FERITE IN TERRA, acronimo di: ferita indotta segnali elettrici in Arabidopsis thaliana).

1. afide allevamento Nota: La scelta delle specie vegetali e afidi per le registrazioni EPG dipende dalla finalità di ricerca. Per gli studi sulla Arabidopsis thaliana, il brassicae afide Brevicoryne è appropriato. <ol><li> Posteriore B. afidi brassicae in una serra su Brassica oleracea. Mantenere le piante utilizzate per afide allevamento in gabbie, per evitare di contaminare altre piante. Mantenere le piante-afidi allevamento e impianti sperimentali (nel nostro caso B. oleracea e A. thaliana) in stanze separate, al fine di evitare la contaminazione di impianti sperimentali con gli afidi. </li><li> Trasferimento afidi di piante fresche su ogni 2 settimane, prima di causare danni significativi pianta, o raggiungere la sovrappopolazione. Trasferire 10-20 afidi adulti ad un impianto di allevamento fresca per iniziare una nuova colonia. </li><li> Monitorare allevamento piante regolarmente per contaminazione da specie indesiderate di afidi, altri erbivori insetti parassitoidi, afidi e fungi che possa influenzare la salute della colonia di afidi. </li><li> Raccogliere adulti, afidi senza ali fino a una settimana dopo la loro muta finale per la registrazione EPG. </li><li> Dopo gli esperimenti, restituire le piante sperimentali che non sono stati utilizzati per la camera di crescita, come spesso hanno alcune progenie che è stata prodotta durante la registrazione, che potrebbe contaminare inavvertitamente altre piante. </li></ol> 2. Insect cablaggio per la registrazione EPG <ol><li> Per elettrodi di insetti, ottenere i pin del connettore ottone (chiodi, Ø 1,2 mm), sottile filo di rame (Ø 0,2 mm), di filo d&#39;oro molto sottile (Ø circa 20 micron), a base di acqua d&#39;argento colla, un semplice piccolo bullone di saldatura con fluido saldatura e filo di saldatura in resina animato, stereomicroscopio con ingrandimento 10X, piccole forbici o bisturi, due pinza sottile, e un foglio di polistirolo o scatola. Nota: un vortex potrebbe essere utile. Nota: Il protocollo passo-passo per rendere elettrodi è indicato nella figura 2. </li><li> Per afidemanipolazione e l&#39;applicazione della colla, ottengono: un piccolo e morbido pennello acquerello cammello (formato 2 o più piccolo) e perni di insetti, come quelli usati per le collezioni di insetti, anche se un ago da cucito multa o uno stuzzicadenti può funzionare così. Fase 4 mostra come avviare la registrazione EPG. </li><li> Passo 1. Nota: I passi 1 e 2 qui di seguito mostrano come preparare elettrodi insetti meno la afide. Passo 3 illustra come collegare un afide all&#39;elettrodo. Vacuum fissaggio del afidi è raccomandato durante il cablaggio, ma non sempre necessaria per specie movimento lento (ad esempio, B. brassicae). <ol><li> Accendere il bullone di saldatura e sciogliere qualche filo di saldatura alla sua punta (Figura 2A). Bagnare la testa del perno connettore di ottone con un fluido di saldatura (Figura 2B) ed immergerlo nel metallo di saldatura fuso (Figura 2C). </li><li> Applicare una guaina di metallo fuso di saldatura su una estremità di un lungo pezzo di filo di rame sottile 1-2 cm (Figura2D). Quindi portare il filo di perno e di rame insieme contro il bullone caldo (Figura 2E) e spostarli insieme via raffreddare e solidificare (Figura 2F). </li></ol></li><li> Passo 2. <ol><li> Agitare bene (o vortex), il flacone con colla d&#39;argento per alcuni minuti fino a visualizzare una emulsione liscia. Cut (forbici o bisturi) un paio di pezzi di filo d&#39;oro (di circa 1,5 cm di lunghezza) sul piatto oggetto della stereomicroscopio (Figura 2G). </li><li> Dai pin ottone con filo di rame saldato (realizzato in sezione 2.3) e immergere l&#39;estremità libera del filo di rame nel piccolo serbatoio di collante argento che sono riuniti in all&#39;interno del coperchio della fiala dopo l&#39;apertura (Figura 2H). Nota: E &#39;necessaria solo una piccola goccia. </li><li> Spostare fine colla-tuffato del filo di rame al pezzo di filo d&#39;oro, mentre si solleva un&#39;estremità per evitare sbavature la colla sulla piastra oggetto stereomicroscopio. Provate a sovrapporsi copper e filo d&#39;oro per pochi mm (figura 2I), distribuire la colla lungo la sovrapposizione dei due fili. </li><li> Attendere che la colla si è asciugata abbastanza per tenere i fili uniti. Verificare il contatto colla dopo l&#39;essiccazione e aggiungere un po &#39;di colla fresca con un piccolo spillo o un altro pezzo di filo di rame se alcune parti dei fili uniti mostrano parti senza colla. </li><li> Dopo l&#39;elettrodo insetto è pronto, conservarlo, ad esempio inserito in un pezzo di polistirolo. Nota: La lunghezza del filo d&#39;oro determinerà la libertà di movimento del afidi: se è troppo breve (meno di 5 mm), l&#39;afide può sentirsi vincolata e non si comporterà normalmente; se è troppo lungo (&gt; 2 cm), l&#39;afide si muove liberamente. Afidi tendono a spostarsi verso il lato adaxial delle foglie, se lasciati. Se il filo d&#39;oro tocca la foglia, il segnale sarà cortocircuitato. </li></ol></li><li> Fase 3. <ol><li> L&#39;afide può essere tenuto in posizione mediante aspirazione luce, utilizzando un vuoto; in questo caso, installare tegli dispositivo di aspirazione con lo stereomicroscopio. Posizionare la bocca di aspirazione al centro del campo. </li><li> Agitare bene il flacone con colla d&#39;argento per alcuni minuti (o vortex) fino a quando si forma un&#39;emulsione liscia. Raccogliere un afide con il pennellino. </li><li> Accendere il dispositivo di aspirazione e montare l&#39;afide sull&#39;apertura di aspirazione (figura 2J), con la parte posteriore del ventre rivolto allo sperimentatore. Con il pennello fine, rimuovere ogni residuo di cera con l&#39;addome (abbondante in afidi cavolo). </li><li> Aprire il flacone colla e bagnare un perno con una piccola goccia di colla argento (Figura 2K). Applicare la goccia di colla argento sul retro dell&#39;addome del afidi (Figura 2L-M). Sia questo droplet completamente asciutta per parecchi minuti, agitare vigorosamente il flaconcino colla di nuovo e aggiungere una seconda goccia di colla d&#39;argento in cima al primo. Nota: Mentre la colla argento è un conduttore elettrico, non provoca significativedanni alla cuticola dell&#39;insetto. </li><li> Dopo aver chiuso la fiala colla, inserire l&#39;estremità libera del filo oro nella gocciolina bagnato e mantenere il filo ancora consentendo la colla si asciughi completamente (Figura 2N). Evitare sbavature colla sulla gambe o antenne e scartare un afide se questo è successo. </li><li> Spegnere il dispositivo di fissaggio di aspirazione e sollevare con attenzione l&#39;insetto (Figura 2O). Se necessario, utilizzare un pennello fine di contribuire alla revoca del afide dal dispositivo di aspirazione. Nota: Cablaggio B. brassicae non richiede un vuoto, in quanto possono essere collegati su un pezzo di un tessuto precisione da laboratorio, la superficie ruvida che fornisce l&#39;afide con abbastanza impugnatura in modo che non venga sollevato dopo l&#39;applicazione di una goccia di colla a freddo al suo addome. Dopo asciugatura della colla si può sollevare l&#39;afide dal tessuto con l&#39;aiuto di un pennello fine. </li><li> Inserire il perno in ottone con l&#39;insetto cablata in polistirolo e, se necessario, continuarecablaggio tutti gli altri insetti da utilizzare per la sessione di registrazione EPG. Nota: Questi protocolli per il cablaggio afidi funzionano bene per noi. L&#39;utente può trovare la sua / suo proprio metodo di cablaggio afidi. </li></ol></li><li> Passo 4. <ol><li> Mettere piante nella gabbia di Faraday (Figura 2P) su un supporto non conduttivo: utilizzare capsule Petri o una lastra di vetro o di plastica. </li><li> Inserire un elettrodo pianta nel terreno di ogni piatto. Inserire il perno di ottone dell&#39;insetto metallico nel connettore di ingresso della EPG preamplificatore (Figura 2Q). Nota: l&#39;elettrodo terreno non corrisponde all&#39;elettrodo terra utilizzato in altre tecniche elettrofisiologiche. Ha la tensione di offset necessaria per regolare e compensare le tensioni di polarizzazione dell&#39;elettrodo. </li><li> Nell&#39;interfaccia del software di acquisizione mandrino +, con frequenza di campionamento fissa di 100 Hz, immettere un nome file, specificare il tempo di registrazione, e scrivere il testo di specificare i dettagli dell&#39;esperimento (trattamento, impianti / inse<html> specie ct, ecc) in commento linee 2 e 3. </li><li> Abbassare gli insetti su una zona di atterraggio adeguata dell&#39;impianto e avviare la sessione di registrazione facendo clic sul pulsante Start del software di acquisizione di interfaccia (Stylet +). Nota 1: un massimo di 8 canali può essere utilizzata contemporaneamente in un EPG istituito. Un EPG elettrodi o più EPG-elettrodi per ogni impianto può essere utilizzato. Nota 2: quando il focus dello studio è il comportamento afide, avviare la registrazione prima di accedere pianta degli afidi per evitare di perdere le prime attività di penetrazione pianta. </li><li> Per studiare le risposte elettrofisiologiche delle SE a stimoli, attendere almeno 10 minuti dopo l&#39;afide è entrato in fase floema, al fine di garantire che il afidi è in una fase di sostenuta ingestione floema, e che la linea di base del segnale è stabile. Solo allora, avviare qualsiasi esperimento di stimolazione della pianta. </li></ol></li></ol>tp_upload / 52826 / 52826fig2.jpg &quot;/&gt; Figura 2. Fare EPG-elettrodi con afidi o altri insetti hemipteran per grafico elettrica penetrazione (EPG) registrazioni. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52826/52826fig2highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> Pannelli AI, passaggi necessari per preparare EPG-elettrodi meno la afide. Innanzitutto, sciogliere un pezzo di metallo di saldatura sulla punta di un bullone di saldatura (A). Poi, immergere la testa del perno di ottone in una goccia di liquido saldatura (B), e in contatto con il metallo fuso sulla punta del bullone di saldatura (C). Immediatamente dopo questo passo, contattare l&#39;estremità di un filo di rame alla punta del bullone di saldatura, per l&#39;incollaggio alla testa del perno in ottone (EF). Con un bisturi o una lama, tagliare un pezzo di filo d&#39;oro (G). Tuffol&#39;estremità libera del filo di rame (unito all&#39;altra estremità al perno ottone) sulla colla d&#39;argento (H), e rapidamente uniscono il filo d&#39;oro ad esso (I) prima l&#39;argento asciuga. Il filo d&#39;oro è un ottimo conduttore, e può essere polarizzata. In realtà, nella maggior parte dei casi, la polarizzazione è troppo piccolo per essere rilevato, e in tal caso, può essere compensata con l&#39;offset di tensione (V). Pannelli JO, passaggi necessari per collegare un afide (o altro hemipteran insetto) all&#39;elettrodo. Innanzitutto, sollevare accuratamente un afide con un pennello acquarello fine e posizionarlo sulla apertura del dispositivo di aspirazione di vuoto (J). Accendere la pompa di aspirazione e coprire il foro valvola dell&#39;aria con un pezzo di carta per applicare il vuoto. Immergere la punta del perno dell&#39;insetto nella colla argento (K), e mettere una piccola goccia di colla sulla parte superiore dell&#39;addome del afidi, allo stereomicroscopio (LM). All&#39;interno delprossimi ~ 20 sec, prima della gocciolina colla argento si asciuga afide, inserire l&#39;estremità del filo d&#39;oro dell&#39;elettrodo insetto nella gocciolina bagnato di colla d&#39;argento, e tenerlo in posizione per 1-3 minuti, fino a quando la colla argento ha completamente essiccata all&#39;aria (N). A questo punto, disattivare aspirazione rimuovendo il pezzo di carta che copre il foro di sfiato del dispositivo di aspirazione e rimuovere accuratamente l&#39;afide, dal dispositivo di aspirazione: sollevamento afide dopo il cablaggio spesso richiede qualche aiuto da un pennellino (O). Pannello P mostra una panoramica di tutta la EPG allestito all&#39;interno della gabbia di Faraday, e Panel Q mostra una panoramica della combinazione impianto-afide per EPG. Vedere sezione 2 sopra per una spiegazione più dettagliata di questo processo. Piccole lettere sono etichette che alludono alle voci che bisogna fare EPG-elettrodi: un: Bullone di saldatura; b: fuso in metallo di saldatura;c: il fluido di saldatura; d: connettore d&#39;ottone perno (unghie); e: filo di rame; f: filo d&#39;oro Ø 18μm; g: dispositivo di aspirazione; h: afide; i: colla d&#39;argento a base d&#39;acqua; j: Gabbia di Faraday; k: impianto dell&#39;elettrodo; l: connettore di ingresso (BNC) dell&#39;EPG preamplificatore.

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</ol>

WFT ha lanciato EPG Systems come attività di pensionamento ed è affiliata finanziariamente ad essa.

Questo articolo fornisce un protocollo dettagliato per rendere elettrico Penetrazione Graph (EPG) registrazioni. La tecnica EPG è ben definito, con 100-200 utenti attivi in tutto il mondo, ed è stato implementato per molti studi su diversi argomenti, ad esempio: a) la resistenza pianta ospite di afidi e altri insetti stiletto-cuscinetto 13; b) impianti e virus patogeni meccanismi di trasmissione 14; c) Modalità di insetticida di azione, (tossicità e comportamento cambia) 15; d) EPG sono ...

La capacità di produrre segnali elettrici a lunga distanza è una caratteristica vantaggiosa di organismi pluricellulari che permette risposte efficaci agli stimoli esterni. Questa caratteristica si è evoluto in maniera indipendente in piante e animali, e rappresenta quindi un caso di evoluzione convergente. Dato che i segnali elettrici sono accoppiati con funzioni importanti in animali come trasmissione neurale e la contrazione muscolare, la base molecolare, il meccanismo di trasmissione, e la funzione di segnali elettrici di stimolo indotto negli animali sono oggetto di ricerca intensiva. Al contrario, lo stimolo indotto la segnalazione elettrica nelle centrali ha ricevuto scarsa attenzione della ricerca. Anche se le piante non hanno i nervi o muscoli, ci sembra essere prove sufficienti per supporre che i segnali elettrici di stimolo indotto nelle piante svolgono un ruolo chiave nelle loro risposte ai fattori ambientali. Il floema, la componente vivente del sistema vascolare delle piante, è stata postulata come uno dei principali substrate per la trasmissione di segnali elettrici di stimolo indotto, da stimolato / danneggiato ad aree non stimolato / integri 2. Le principali cellule del floema sono gli elementi setaccio (Ses),, cellule allungate relativamente semplici. Le estremità delle SE sono collegati ad altre SE, formando una continua, a bassa resistenza, sistema del tubo setaccio che si sviluppa per tutta la pianta. Vi sono, tuttavia, molto pochi studi sulle proprietà elettriche di queste cellule altamente specializzate. In questi studi precedenti, i ricercatori accessibili SE o con vetro micro-elettrodi 3 mandrini o con elettrodi di vetro che sono stati accoppiati a piantare-inseriti di afidi, dopo stylectomy (taglio) 4. Microelettrodi di vetro sono realizzati da capillari di vetro che sono tirati ad una estremità con il calore in una punta sottile inferiore a 1 micron di diametro, e successivamente riempito con una soluzione di KCl. A Ag / AgCl o platino filo, inserito nel elettrodo di vetro KCl-riempita viene quindi collegato all&#39;ingresso dell&#39;amplificatore, e un referenteelettrodo viene inserito nella vasca che circonda la cella di interesse, completando il circuito. Questa configurazione registra la differenza di potenziale tra l&#39;elettrodo extracellulare referente e l&#39;elettrodo di misura intracellulare, cioè, il potenziale di membrana della cellula 5. Con questo metodo, Umrath fatto la prima registrazione intracellulare da una cellula vegetale, utilizzando le alghe Nitella 6,7. Nitella è relativamente semplice organismo a grandi cellule, e quindi suscettibili di esperimenti elettrofisiologia intracellulari. Al contrario, l&#39;inserimento degli elettrodi di vetro intracellulari nelle piccole cellule, piante terrestri tridimensionali multicellulari è tecnicamente impegnativo, richiede un ricercatore altamente qualificato, nonché visualizzazione sofisticato, micromanipolazione e apparecchiature antivibrazione. Sebbene elettrodi di vetro sono adatti a registrare da cellule superficiali nelle piante, come le cellule epidermiche radice 8, recordin intracellularegs dalle cellule profondamente radicate nel tessuto della pianta, come la SE, causa danno risposte indotte molto probabilmente, confondendo i risultati. Nel 1989, Fromm e Eschrich segnalato l&#39;uso di un metodo alternativo, chiamato il &#39;metodo di afide&#39;, in cui gli elettrodi di vetro sono accoppiati a stiletti afidi dopo stylectomy 4. Il metodo afide è minimamente invasiva, perché mandrini flessibili non causano tessuti o cellule danni elettrodi in vetro fanno. Mandrini afidi sono grande invenzione della natura per la penetrazione pianta, e gli afidi sono molto più abili di esseri umani nella ricerca di SE. Sfortunatamente, questo metodo afide è anche molto esigente in termini di competenze tecniche e attrezzature. Inoltre, il successo di ogni esperimento che implementa questa tecnica dipende interamente l&#39;afide essere in modalità di alimentazione - con il mandrino stabilmente inserita in una SE, al momento della stylectomy. Pensare in retrospettiva, si può vedere che le probabilità di successo di questa tecnica avrebbe potuto essere improved aggiungendo al setup sperimentale uno strumento che consente di identificare se il mandrino è afidi in SE nell&#39;applicazione stylectomy. Nel 1964, McLean e Kinsey descritto un &#39;sistema di monitoraggio elettronico&#39; per lo studio del comportamento alimentare di afidi in tempo reale 9,10. In questo sistema, l&#39;afide e l&#39;impianto mandrino-penetrato sono stati integrati in un circuito elettrico. Successivamente, nel 1978, Tjallingii ideato una versione modificata del sistema, denominato sistema &#39;Electrical Penetrazione Graph&#39; (EPG) 11,12. Considerando che il sistema di controllo elettronico originale era sensibile alle potenzialità resistenza origine solo, con il sistema EPG, la forza elettromotrice (fem) originato potenziali, cioè, in un impianto o l&#39;insetto, potrebbero essere registrati in aggiunta alle potenzialità derivanti dal resistenza (R) nella insetto. Questo rappresenta un miglioramento importante, perché sia ​​il segnale componenti, EMF e R,fornire biologico informazioni rilevanti sugli eventi durante la penetrazione pianta dagli afidi. Ciò che rende la EPG preamplificatore sensibile alle componenti R è relativamente bassa resistenza di ingresso 1 GΩ, che è vicino alla media della resistenza delle piante / afidi. Una piccola tensione di offset (Figura 1, V) di circa +100 mV viene applicato alla pianta, che viene poi suddivisa su piante e insetti da un lato, e la resistenza di ingresso sull&#39;altro. Le tensioni e le loro variazioni sono misurate in un punto (Figura 1A, B) tra l&#39;insetto e la resistenza di ingresso. Pertanto, le componenti R rappresentano modulazioni resistenza vegetale afide della tensione di offset, mentre i EMF-componenti sono una certa frazione di potenziali di piante al punta del mandrino e potenzialità causati nella insetto. I potenziali vegetali - più importanti qui - sono potenziali principalmente membrane delle cellule vegetali forati dai stiletti afidi. I potenziali insetti sembrano essere principalmentepotenziale di streaming causate da movimenti fluidi nei due canali stiletto, cioè, il cibo ei canali salivari; nessun potenziale nervose o muscolari interne sono registrate nel EPG. In pratica, le funzioni punta del mandrino come una punta dell&#39;elettrodo. Tutte le cellule vegetali sono caricati negativamente all&#39;interno rispetto all&#39;esterno positiva della cellula. La corrente elettrica (cioè, il movimento di ioni in soluzione acquosa) scorre dall&#39;interno verso l&#39;esterno e vice versa è molto limitato a causa della elevata resistenza della membrana cellulare. Normalmente il potenziale di riposo viene mantenuta costante. Tuttavia, quando gli ioni negativi muovono fuori o ioni positivi si muovono attraverso la membrana cellulare, il potenziale di membrana è ridotto, cioè, &#39;depolarizza&#39;. Depolarizzazione si verifica in caso di eccitazione delle cellule. Ioni quindi spostare avanti o indietro quando specifici canali ionici nella membrana vengono aperti o quando la membrana è danneggiata e ioni perdite dentro e fuori. Tutte le cellule hanno canali ionici e pompe in tegli membrana plasmatica che portano il potenziale di membrana al suo livello di riposo ripristinando la concentrazione originale di vari ioni all&#39;interno della cellula. Il potenziale di riposo e le sue variazioni sono componenti EMF, e di conseguenza, la tecnica EPG è adatto a misurare loro. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52826/52826fig1.jpg" /> Figura 1. EPG-elettrodi. L&#39;EPG-elettrodo è un afide vivente integrato nel circuito elettrico Penetrazione Graph (EPG), il cui mandrino viene inserito in un elemento di setaccio (SE) in modalità di alimentazione stabile. Se il mandrino SE-infilzata è a riposo (pannello A), la tensione nel circuito, registrato da EPG, è stabile e al potenziale livello di riposo (pannello C, Rest). Se la SE è entusiasta, i suoi depolarizza membrana (pannello B), che viene visualizzato nella EPG come un graduale aumento della tensione (pannello C, Depolarizzazione). Come l&#39;equilibrio ionico nella SE torna a riposare, cioè, repolarizes, la tensione registrata da EPG diminuisce gradualmente al potenziale livello di riposo (Panel C, ripolarizzazione). Nel pannello C, &quot;A&quot; e &quot;B&quot; si riferiscono agli scenari illustrati in pannelli A e B, rispettivamente. V = regolabile sorgente di tensione di offset. Ri = resistenza di ingresso. In parallelo alla resistenza esterna 1 GΩ, l&#39;amplificatore ha un interno (nel OpAmp) alto 1,5 resistore TΩ (pannelli A e B, in grigio). Con il controllo remoto dello switch EPG pre-amp può essere cambiata da normale a EMF-mode, che permette di ottenere valori di tensione ad alta precisione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52826/52826fig1highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> Nella sezione successiva, mettiamo a disposizione il lettore con un protocollo di base per l&#39;esecuzione di esperimenti EPG che sia valido per entrambi gli studi insetti focalizzati e vegetali a fuoco.

<table><tbody><tr><td>Perni connettore in ottone</td><td>EPG Systems/hardw.shop</td><td></td><td>&Phi; 1,2 mm</td></tr><tr><td>Filo di rame sottile</td><td>EPG Systems/hardw.shop</td><td></td><td>circa &Phi; 0,2 mm</td></tr><tr><td>Filo d'oro sottile</td><td>EPG Systems</td><td></td><td>&Phi; 18 &; m</td></tr><tr><td>Negozio</td><td></td> di <td>ferramenta</td> per liquidi di saldatura <td>corrispondenti al filo di saldatura</td></tr><tr><td>Negozio</td><td></td><td></td>di ferramenta<td>per fili di saldatura con anima in resina</td></tr><tr><td>Polistirolo</td><td>qualsiasi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Colla d'argento a base d'acqua</td><td>Sistemi</td><td></td> EPG<td><a href="http://www.epgsystems.eu/">ricetta in: www.epgsystems.eu</a></td></tr><tr><td>Salviette di carta</td><td>Kimberly-Clark</td><td>5511</td><td></td></tr><tr><td>Bullone di saldatura</td><td>qualsiasi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscopio</td><td>Hund Wetzlar</td><td></td><td>l'ingrandimento minimo è 10X</td></tr><tr><td>Forbici piccole</td><td>Strumenti di scienza fine</td><td>14088-10</td><td></td></tr><tr><td>Bisturi</td><td>Strumenti di scienza fine</td><td>10050-00</td><td></td></tr><tr><td>Pinze fini</td><td>Strumenti di scienza fine</td><td>11231-20</td><td></td></tr><tr><td>Vortice</td><td>A. Hartenstein</td><td>L46</td><td></td></tr><tr><td>Pennelli per acquerello</td><td>qualsiasi</td><td></td><td>Numero 1 o 2</td></tr><tr><td>Dispositivo</td><td></td><td></td> di aspirazione dell'aria <td>vedi descrizione in: www.epgsystems.eu</td></tr><tr><td>Perni per insetti</td><td>qualsiasi</td><td></td><td>N. 1 o 2</td></tr><tr><td>Tavolo</td><td></td><td></td><td></td>solido</tr><tr><td>Gabbia</td><td></td><td></td> di Faraday <td>Computer fatto a mano</td></tr><tr><td></td><td>Fujitsu Siemens</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software di acquisizione dati</td><td>EPG Systems</td><td></td><td>Stylet+d</td></tr><tr><td>Giga-4 (-8) Sistema completo</td><td>EPG Systems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>comprende:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centralina principale con uscita</td><td></td> USB <td>Di155/Di710</td><td>12/14 bit, velocità 100&nbsp; Hz (softw. fisso)</td></tr><tr><td>Sonde EPG 4 (8)</td><td></td><td></td><td>50x preamplificatore DC</td></tr><tr><td>Morsetti girevoli su asta</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adattatore</td><td></td><td></td> di alimentazione DC <td>bipolare, 230/115 VAC a -/+8 VDC</td></tr><tr><td>Elettrodi e cavi</td><td></td><td></td><td></td>di impianto</tr><tr><td>Cavi di prova e di terra aggiuntivi&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

una nuova applicazione della penetrazione elettrica graph (epg) per l&#39;acquisizione e la misurazione dei segnali elettrici in floema sieve elements

A New Application of the Electrical Penetration Graph (EPG) for Acquiring and Measuring Electrical Signals in Phloem Sieve Elements

Proprietà elettrofisiologiche di cellule sono spesso studiati in vitro, dopo averli dissociandosi dal loro ambiente naturale. Tuttavia, lo studio di trasmissione elettrica tra le cellule lontane in un organismo è necessario in vivo, registrazioni prive di artefatti di cellule incorporate all&#39;interno del loro ambiente nativo. La trasmissione dei segnali elettrici da ferita a zone illesi in un impianto ha suscitato da tempo l&#39;interesse di botanici. Il floema, la parte viva del sistema vascolare pianta che si sviluppa in tutta la pianta, è stata postulata come un tessuto importante nella trasmissione elettrica negli impianti. La mancanza di adeguati metodi elettrofisiologici pone molte sfide per lo studio delle proprietà elettriche delle cellule floema in vivo. Qui vi presentiamo un nuovo approccio per elettrofisiologia intracellulare di elementi setaccio (SE) che utilizza afidi che vivono, o altri insetti hemipteran floema-alimentazione, integrata nella gra penetrazione elettricoph (EPG) del circuito. La versatilità, la robustezza e la precisione di questo metodo ha permesso di registrare e studiare in dettaglio i segnali elettrici ferita indotta a SE di vene centrali del pianta modello Arabidopsis thaliana 1. Qui mostriamo che EPG-elettrodi possono essere facilmente implementati per intracellulari registrazioni elettrofisiologiche di SE in vene marginali, nonché per studiare la capacità delle SE di rispondere con segnali elettrici a diversi stimoli esterni. L&#39;approccio EPG applicata alla elettrofisiologia intracellulare di SE può essere implementata per una grande varietà di specie vegetali, in un gran numero di combinazioni pianta / insetti, e per molti ricerca mira.

In uno studio precedente, abbiamo implementato la tecnica EPG-elettrodo con lo scopo di caratterizzare i segnali elettrici prodotti in SE della midvein durante l&#39;attacco caterpillar 1. Il midvein è un sito di inserzione preferito per elettrodi in vetro convenzionale, così come per gli elettrodi di vetro-stiletto, perché è SE-denso, e relativamente robusto, quindi suscettibili di fissazione necessaria per attuare queste tecniche. Qui, abbiamo sfruttato la versatilità dell&#39;elettrodo EPG con lo scopo di ...

Il Grafo di Penetrazione Elettrica (EPG) è una tecnica ben consolidata per studiare il comportamento alimentare degli insetti portatori di stiletto. Qui mostriamo una nuova applicazione dell'EPG come strumento non invasivo per l'acquisizione di registrazioni elettrofisiologiche intracellulari degli elementi del setaccio (SE), le cellule che formano il sistema vascolare floematico nelle piante.

Una nuova applicazione della penetrazione Elettrica Graph (EPG) per l&#39;acquisizione e la misurazione dei segnali elettrici in Floema Sieve Elements

Electrophysiological properties of cells are often studied in vitro, after dissociating them from their native environments. However, the study of ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è studiare i segnali elettrici a lunga distanza trasmessi attraverso gli elementi del setaccio vascolare da una zona della pianta in corso di consumo da parte di una farfalla a un'area intatta della stessa pianta. Questo obiettivo si raggiunge assemblando un circuito per la grafia della penetrazione elettrica (EPG) che integra un insetto ematofago, come un afide, e una pianta. L'afide inserisce lo stile nella pianta, chiudendo così il circuito, e inizia la registrazione EPG.Infine, l'afide inserisce il suo stile in un elemento cribroso e vi rilascia della saliva per alcuni minuti, seguito dalla lunga fase di ingestione; sia la fase di salivazione o fase E1, sia la fase di ingestione o fase E2 presentano potenziali elettrici ritmici e di piccola entità. Successivamente, una larva viene posizionata su una foglia e lasciata nutrirsi da essa. Mentre l'afide registrato tramite EPG continua a nutrirsi del flusso in una foglia adiacente, il danno arrecato dalla larva alla nervatura centrale genererà un segnale elettrico che verrà trasmesso attraverso il floema alle altre foglie, inclusa quella da cui si sta nutrendo l'afide collegato all'EPG.La dimensione del segnale può essere misurata confrontandola con un impulso di calibrazione di dimensione nota, applicato in precedenza durante la fase E due o di ingestione. I risultati mostrano che il danno mediato da una larva di farfalla su una foglia induce in modo costante un segnale elettrico complesso e significativamente ampio nella foglia adiacente, caratterizzato da una prima componente lenta e da una seconda componente rapida sovrapposta alla prima. La tecnica della grafia di penetrazione elettrica è stata introdotta negli anni '60.Il monitoraggio EPG ha notevolmente contribuito alla nostra conoscenza della penetrazione vegetale da parte dei afidi e di altri insetti emipteri. L'interesse principale dal punto di vista economico riguarda lo studio dei meccanismi di resistenza delle piante ospiti, nonché dei meccanismi di trasmissione dei virus vegetali. Così ho elaborato il concetto di utilizzare l'EPG come metodo di elettrofisiologia intracellulare nelle piante, stabilendo un parallelismo tra le registrazioni EPG e le registrazioni intracellulari effettuate con elettrodi di vetro convenzionali riempiti di cloruro di potassio, sia nelle registrazioni EPC che in quelle convenzionali realizzate con elettrodi di vetro.Esistono due livelli di tensione: un livello di tensione relativamente alto, che corrisponde alla posizione intracellulare della punta dell'elettrodo di vetro o della punta in stile AEs, e un livello di tensione relativamente basso, che corrisponde alla posizione intracellulare della punta dell'elettrodo di vetro o dell'occhiello AEs. Nel caso dell'EPG, quando si allevano afidi per registrazioni PG, la scelta della pianta e della specie di afide dipende dall'obiettivo della ricerca; per studi sull'opana rapida, l'afide è appropriato ed è opportuno allevarlo in serra all'interno di gabbie che circondano l'allevamento.Le piante devono essere rese protette da afidi e parassitoidi utilizzando una rete fine con aperture inferiori a un millimetro, ma i coperchi delle gabbie devono essere in materiale trasparente per permettere la fotosintesi. Ogni due settimane, la popolazione di afidi deve essere trasferita su piante fresche. Sono necessari solo da 10 a 20 adulti; gli afidi rimanenti possono essere eliminati.Per le registrazioni EPG negli insetti, è necessario costruire un elettrodo specializzato utilizzando perni in ottone per connettori, un tratto di filo di rame lungo da uno a due centimetri, come ad esempio i filamenti di un cavo elettrico, e un pezzo di filo d'oro molto sottile lungo circa 1,5 centimetri. Inoltre, utilizzare una colla argentata a base d'acqua e un semplice saldatore piccolo con liquido saldante e filo saldante in resina. Per iniziare, fondere un pezzo di filo metallico saldante sulla punta del saldatore.Quindi immergere la punta del chiodo di ottone in una goccia di liquido saldante. Mettere immediatamente a contatto la punta del filo di rame con la punta del bullone saldante, fondendolo così al perno di ottone. Ora agitare accuratamente o vortexare la colla argentata in modo che l'emulsione non si depositi.Aprire la bottiglia e immergere l'estremità libera del filo di rame nella colla presente sul coperchio, utilizzando un stereomicroscopio. Unire la maglia d'oro con un'overlap di almeno un millimetro e lasciare asciugare la colla argentata. Evitare di spalmare la colla sulla piastra del microscopio dopo che questa si è asciugata; verificare il contatto tra la colla argentata e il filo d'oro nelle parti in cui i fili giuntati non sono incollati.Aggiungere colla fresca con un piccolo perno o filo di rame finché l'insetto non è pronto. L'elettrodo completato può essere conservato in modo sicuro sulla schiuma di polistirolo. Per fissare l'afide, utilizzare un semplice dispositivo per vuoto fatto in casa.L'aspirazione è controllata da un piccolo pezzo di carta posizionato sopra un foro di ingresso. Accendere il dispositivo a vuoto e spostarlo sulla piastra del microscopio stereoscopico per centrare la punta di aspirazione. Raccogliere un afide con un piccolo pennello per acquerello di misura due o più piccolo, quindi montare l'afide sul suo lato ventrale rivolto verso la punta di aspirazione per un facile accesso al dorso.Utilizzando il pennello, rimuovere qualsiasi cera superficiale dall'addome, che è abbondante nel afide del cavolo. Agitare accuratamente o vortexare la colla argentata e, utilizzando un ago sottile per insetti, applicare una piccola goccia di colla argentata sul dorso dell'afide. Lasciare asciugare per due o tre minuti.Agitare nuovamente il flacone e applicare una goccia di collante sulla sommità della prima goccia essiccata. Quindi inserire il filo d'oro dell'elettrodo per insetto preparato nella seconda goccia di collante argentato. Mentre è ancora umido, mantenere il filo fermo in posizione durante l'essiccazione della colla.Se per caso la colla dovesse finire sulle zampe o all'interno dell'afide, ricominciare con un nuovo esemplare. L'elettrodo per insetti può essere riutilizzato. Una volta che la colla si è asciugata.Spegnere l'aspirazione e liberare l'afide dal dispositivo a vuoto. L'insetto cablato è ora pronto per essere utilizzato per le registrazioni EPG. Alcuni afidi possono essere cablati senza fissazione a vuoto.In questo caso, posizionare l'afide su un pezzo di carta da laboratorio, abbastanza ruvida da permettere all'afide di rimanere saldamente aggrappato. Durante l'applicazione della colla, un filo d'oro può essere inserito nella prima goccia di colla argentata. Se questa goccia è troppo piccola o si secca troppo rapidamente, il filo d'oro non si attaccherà correttamente.In tal caso, posizionare semplicemente una piccola goccia di colla argentata sopra la prima e inserire il filo d'oro, attendere che la colla si asciughi. Successivamente, sollevare l'afide dalla carta assorbente con l'aiuto di un pennello fine. Conservare gli afidi cablati inserendo il chiodo di ottone nel polistirolo fino al momento dell'utilizzo.Per iniziare, posizionare le piante sperimentali all'interno della gabbia di Faraday su un supporto non conduttivo, come una piastra di Petri. Inserire ora un elettrodo vegetale nel terreno di ogni vaso. L'elettrodo vegetale non è un elettrodo di massa che deve essere collegato alla gabbia di Faraday.Inserire quindi il perno in ottone dell'elettrodo nell'EPG. Regolare preventivamente la posizione della pianta e dell'insetto finché non entrano in contatto, con l'insetto posizionato nella sede desiderata sulla pianta. Utilizzando il software interfaccia Style plus, che ha una frequenza di campionamento fissa di 100 hertz, inserire un nome file, specificare il tempo di registrazione e aggiungere un testo per indicare i dettagli dell'esperimento nelle righe di commento.Quindi avviare la registrazione tramite il software cliccando sul pulsante di avvio nell'angolo in alto a sinistra. Iniziare l'esperimento abbassando l'afide cablato sulla pianta fino a otto canali, il che significa che otto insetti cablati possono essere registrati contemporaneamente mediante un unico apparato EPG, sia uno per pianta sia più afidi su una stessa pianta. Quando l'afide inserisce lo stile nella pianta, il circuito viene completato.Le tensioni fluttuanti del segnale EPG appariranno sullo schermo del computer; regolare la tensione della pianta e il guadagno per una registrazione ottimale. Nella maggior parte dei casi, un afide impiegherà almeno un'ora per entrare nella fase di flusso. L'alimentazione prolungata mediante flusso è indicata da almeno 10 minuti di forma d'onda E due.A questo punto, l'elettrodo è pronto per acquisire i segnali elettrici dallo elemento cribroso, che devono essere indotti solo quando il segnale E2 è stabile. È importante inviare uno o più impulsi di calibrazione, che verranno utilizzati successivamente per stimare l'ampiezza dei segnali elettrici. Tagliare una foglia con le forbici induce in modo costante un segnale elettrico a lunga distanza che viene acquisito dall'afide registrato tramite EPG.In un esperimento più realistico, viene utilizzato un bruco affamato come agente lesivo. I danni provocati dal bruco inducono in modo costante segnali elettrici lenti e veloci che si propagano alle altre foglie e possono essere registrati mediante elettrodi EPG. Il rumore generato dall'introduzione del bruco non influirà sulla risposta elettrofisiologica della pianta, ma potrebbe mascherarla; per ridurre al minimo questo rumore, è necessario adottare opportune precauzioni.L'operatore deve essere messo a terra per verificare se una larva alimentante induca segnali elettrici nella foglia che viene ingerita. Una larva affamata viene posizionata sulla foglia che ospita anche l'afide registrato con la EPG, mentre due foglie diverse vengono tagliate in successione con le forbici alla giunzione tra la lamina e il picciolo. Un elettrodo EPG posizionato sulla nervatura centrale di una foglia integra, adiacente a entrambe le foglie tagliate, ha rilevato risposte elettrofisiologiche simili nello stesso elemento cribroso in risposta a queste ferite.Questi potenziali elettrofisiologici erano costituiti da una depolarizzazione lenta e da una depolarizzazione rapida sovrapposta a quella lenta. In un altro esperimento, furono tagliate anche due foglie, ma in questo caso una era adiacente alla foglia contenente l'elettrodo EPG, mentre l'altra non era adiacente alla foglia con l'elettrodo EPG. In questo caso, l'elemento cribroso singolo rispose in modo diverso alle ferite.La ferita inflitta alla foglia non adiacente, effettuata per prima, ha indotto soltanto un segnale elettrico lento, mentre la ferita alla foglia adiacente ha indotto un segnale complesso con componenti lente e veloci. Questi risultati suggeriscono che gli elementi cribrosi sono in grado di rilevare la posizione del danno; qui, utilizzando un afide collegato al sistema EPG, sono state effettuate registrazioni intracellulari da un elemento cribroso marginale in una foglia di una pianta di arabidopsis. Il taglio di una foglia adiacente ha indotto un segnale elettrico che si è trasmesso all'elemento cribroso in cui era inserito lo stiletto dell'afide.A differenza degli elementi cribrosi delle vene principali, gli elementi cribrosi delle vene marginali hanno risposto a danni lontani con un'unica onda lenta di depolarizzazione che potrebbe corrispondere all'onda lenta di depolarizzazione negli elementi cribrosi centrali. Il grafico della penetrazione elettrica o ripetizione è un metodo che può aiutare a rispondere a domande fondamentali nei campi dell'elettrofisiologia vegetale e della fisiologia vegetale, come, ad esempio, quali canali sono coinvolti nei segnali elettrici a lunga distanza che viaggiano da foglia a foglia, e soprattutto, qual è il ruolo di questi segnali nell'adattamento delle piante al loro ambiente? Dopo aver visto questo video, dovreste avere un'idea di come preparare piante e insetti per l'EPG.Registrare i collegamenti negli insetti può sembrare complicato, ma abbiamo dimostrato che è in realtà piuttosto semplice e potrebbe incoraggiarti ad adottarlo nella tua ricerca.

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Una nuova applicazione della penetrazione Elettrica Graph (EPG) per lacquisizione e la misurazione dei segnali elettrici in Floema Sieve Elements (Video) | JoVE Journal

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