Generazione di ricombinante umano IgG anticorpi monoclonali da immortalizzate cellule ordinati B

L'obiettivo generale di questa procedura è clonare ed esprimere anticorpi prodotti da cellule B. Questo viene raggiunto isolando innanzitutto le cellule B da un tessuto sorgente rilevante, come il sangue o il timo. Il secondo passaggio consiste nell'eseguire FACS e selezionare la popolazione di cellule B positiva per la produzione di IgG.

Successivamente, le cellule vengono immortalizzate tramite infezione con il virus di Epstein-Barr insieme all'attivazione del recettore simile alla tolla nove da parte del C-P-G-O-D-N 2006 e mantenute in coltura. I passaggi finali consistono nell'isolare l'RNA da cloni risultati positivi alla produzione di IgG mediante ELISA e nel generare DNA copia sia dalle catene leggere che da quelle pesanti dell'IgG. Infine, le sequenze di IgG possono essere clonate in vettori di espressione mammiferi per produrre elevate quantità di IgG umana monoclonale.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la tecnologia di visualizzazione mediante fagi, è che l'accoppiamento originale delle catene pesanti e leggere dell'IgG non viene perso. Questo metodo può fornire risposte a domande fondamentali nel campo dell'autoimmunità, come la scoperta e la caratterizzazione funzionale di autoanticorpi patogeni. Non dimenticare che lavorare con materiale proveniente da pazienti e con il virus EBV può comportare dei rischi.

Il virus EB è un agente patogeno per l'uomo e si devono sempre adottare precauzioni come il livello di sicurezza virale due e l'uso di dispositivi di protezione adeguati durante l'esecuzione di questi passaggi. Prima di colorare i PBMC, seminarli in un'ampolla da 25 centimetri con sei millilitri di mezzo RPMI 1640 completo e lasciarli ripristinare durante la notte. Dopo il bloccaggio e il lavaggio delle cellule, raccogliere i PBMC in un tubo con mezzo millilitro di mezzo e centrifugarli. Quindi risospendere le cellule nel buffer di marcatura e contarle.

Successivamente, preparare due provette da centrifuga con 5 milioni di cellule in 200 microlitri di tampone aggiunti a queste provette. Aggiungere 10 microlitri di anti-CD22 P-E-R-C-P oppure 40 microlitri di anti-IgG PE e lasciare incubare per 30 minuti sul ghiaccio e al buio, quindi lavare, filtrare e separare le cellule. L'obiettivo è contare le cellule doppio positive.

Iniziare diluendo i BMC P ordinati a una cellula per microlitro in mezzo completo RPMI 1640, con aggiunta di CPG 2006 e EBV. Successivamente, in una cappa, seminare 110 microlitri della diluizione cellulare con EBV e CPG 2006 in due pozzetti di una piastra a 96 pozzetti con fondo rotondo, precedentemente rivestita con cellule WI-38 irradiate. L'infezione con 50 cellule per pozzetto è ottimizzata e aumenta la probabilità di ottenere un anticorpo monoclonale.

Tuttavia, raccomandiamo di confermare questo risultato mediante una PCR. Dopo una settimana di incubazione, esaminare le cellule al microscopio per verificare la crescita delle cellule B. Dopo due settimane, sostituire il mezzo: aspirare lentamente 90 microlitri di mezzo da ogni pozzetto e trasferirli in una nuova piastra.

Per verificare la produzione di IgG mediante ELISA. Quindi aggiungere nuovamente 100 microlitri di mezzo fresco supplementato, inclusa l'IL-2, in ciascun pozzetto. Continuare il monitoraggio della crescita delle linee cellulari durante la terza e la quarta settimana di crescita.

Ripetere il cambio del mezzo ogni settimana. Consultare il protocollo scritto per i metodi di espansione clonale. Verificare il surnatante prelevato dai cambi di mezzo per la produzione di IgG mediante saggio immunoenzimatico (ELISA).

Per prima cosa, preparare le piastre ELIZA dispensando in ciascun pozzetto 50 microlitri di anticorpi caprini anti-Fc umano, diluiti uno a 200 in tampone di rivestimento. Dopo l'incubazione e il lavaggio della piastra, bloccare i pozzetti aggiungendo 100 microlitri di tampone di bloccaggio per pozzetto e incubare nuovamente la piastra. Al termine dell'incubazione di blocco, rimuovere il liquido dalla piastra battendola su un foglio di carta assorbente.

Con la piastra pronta, diluire i soprannatanti con quattro volumi di RPMI. Successivamente, per i controlli standard, eseguire una diluizione seriale di soluzione di IgG umana in RPMI da 1000 nanogrammi per millilitro a 15,6 nanogrammi per millilitro.

Includere anche un bianco. Applicare 50 microlitri di supernatante o del campione standard in ogni pozzetto e incubare la piastra ELISA per un'ora a 37 gradi Celsius nello stesso modo; possono essere preparate ulteriori piastre ELISA per analizzare ulteriori diluizioni dei supernatanti al fine di verificare l'affinità dell'anticorpo. Al termine dell'incubazione, lavare la piastra.

Quindi applicare a ciascun pozzetto 50 microlitri di buffer di incubazione contenente fab coniugato con perossidasi due. Dopo un ulteriore periodo di incubazione di un'ora e un altro lavaggio, aggiungere a ciascun pozzetto 100 microlitri di soluzione di substrato con TMB. Incubare quindi la piastra fino a 10 minuti, finché il colore blu che appare non si stabilizza.

Quindi arrestare la reazione e misurare l'assorbanza. Tutti i supernatanti clonali con un'assorbanza misurata superiore di tre deviazioni standard rispetto al bianco sono considerati positivi.

Per gli anticorpi IgG umani, la specificità antigenica può essere rilevata mediante ulteriori saggi. Per iniziare, seguire il protocollo scritto per sintetizzare il DNA copia dai cloni positivi. Successivamente, impostare le reazioni di PCR per le catene pesanti kappa e lambda dell'IgG.

Nel risultato, individuare la catena pesante tra 400 e 550 paia di basi. Individuare la catena leggera tra 300 e 400 paia di basi. Se non sono presenti, utilizzare un microlitro dei prodotti come stampo per una successiva PCR.

I nuovi prodotti dovrebbero trovarsi nell'intervallo appropriato. Procedere quindi con il clonaggio dei migliori prodotti: innanzitutto, sequenziarli. I loro elettroferogrammi dovrebbero essere puliti e corrispondere a una singola sequenza di immunoglobina.

Seguire il protocollo indicato. Clonare il prodotto PCR purificato in un microgrammo di DNA plasmidico. Accertarsi di eseguire la ligazione per tutta la notte a 16 gradi Celsius.

Utilizzando la DNA ligasi T4, preparare le cellule HX in DMEM integrato e coltivarle fino al raggiungimento di una confluenza del 75% in fiaschi da coltura di 75 centimetri quadrati. Per ogni trasfezione di catena pesante e leggera, preparare una miscela con 1,75 millilitri di DMEM senza siero contenente 4,5 microgrammi di vettore per la catena pesante, 3 microgrammi di vettore per la catena leggera e 50 microlitri di soluzione di polietilene. Aggiungere delicatamente questa miscela a una piastra di cellule HX e agitare dolcemente la soluzione sulla piastra.

Incubare la piastra durante la notte e quindi iniziare a raccogliere i mezzi di coltura ogni giorno, sostituendoli con mezzo privo di siero. I mezzi contengono gli anticorpi e possono essere raccolti giornalmente per quattro giorni dopo che le pBMC positive per CD22 e IgG sono state separate mediante FACS.

L'area delle cellule doppio positive, ovvero le cellule B che producono anticorpi IgG, è stata raccolta separatamente per l'espansione. Circa l'1% dei PBMC apparteneva a questa popolazione doppio positiva. Dopo cinque settimane di stimolazione con immortalizzazione da EBV e CPG 2006, sono stati isolati cloni immortalati.

Le cellule feeder WI 30 presentano una forma fibroblastica più allungata, mentre le cellule clonali B appaiono come piccole cellule rotonde che crescono raggruppate al centro della piastra multi-pozzetto con fondo rotondo. Il sopranatante dei cloni in crescita è stato analizzato mediante ELIZA per IgG. Un clone positivo è stato valutato su un'eli, con un valore pari a tre deviazioni standard superiore al valore del bianco.

Almeno tre supernatanti da un clone positivo hanno dato esito positivo nel saggio ELISA. Gli anticorpi di un clone positivo sono stati sottoposti a sequenziamento dopo il clonaggio delle regioni variabili e costanti della catena pesante e della coppia di catene leggere lambda; in questo modo, le catene pesanti e leggere degli immunoglobulini sono state caratterizzate. Seguendo questa procedura.

Altri metodi, come il sequenziamento, possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande riguardanti l'uso di anticorpi e geni, la diversità genetica, ecc. Dopo questo sviluppo, la tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'autoimmunità per esplorare le malattie, la patologia e le strategie terapeutiche pertinenti per patologie autoimmuni come la miastenia grave. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla diagnosi e al trattamento di malattie come la miastenia grave, poiché l'individuazione di anticorpi patogeni può portare allo sviluppo di nuovi trattamenti, come anticorpi competitori privi di attività infiammatoria.