Name: Generazione di ricombinante umano IgG anticorpi monoclonali da immortalizzate cellule ordinati B (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: Scopri come generare anticorpi monoclonali umani IgG da cellule B immortalizzate con virus Epstein-Barr. Questo metodo consente di studiare risposte immunitarie e autoanticorpi patogenici per ricerca immunologica.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Contratto di ricerca Miguel Servet (ISCIII CD14 / 00032) a (GN-G.). Fellowship dalla Organizzazione olandese per la ricerca scientifica &quot;Graduate School of Translational Neuroscience Programma&quot; (022005019) a (CH). Le sovvenzioni da parte Prinses Beatrix Fonds (Progetto WAR08-12) e dell&#39;Association Française contre les Myopathies a (PM-M.); nonché da un Veni Fellowship dell&#39;Organizzazione olandese per la ricerca scientifica (916.10.148) una borsa di studio della Fondazione cervello dei Paesi Bassi (FS2008 (1) -28) e il Prinses Beatrix Fonds (Progetto WAR08-12) (a ML ). Ringraziamo Jozien Jaspers per il suo aiuto nel B-cell sorting mediante citometria di flusso.

<ol><li>Vrolix, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+heterogeneity+of+thymic+B+cells+from+early-onset+myasthenia+gravis+patients+with+antibodies+against+the+acetylcholine+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Autoimmun%22%5BJournal%5D)">Clonal heterogeneity of thymic B cells from early-onset myasthenia gravis patients with antibodies against the acetylcholine receptor.</a> J Autoimmun. 52, 101-112 (2014).</li>
<li>Yamashita, M., Katakura, Y., Shirahata, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+the+generation+of+human+monoclonal+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Recent advances in the generation of human monoclonal antibody.</a> Cytotechnology. 55 (2-3), 55-60 (2007).</li>
<li>Pereira, K. M., Dellavance, A., Andrade, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+challenge+of+identification+of+autoantibodies+specific+to+systemic+autoimmune+rheumatic+diseases+in+high+throughput+operation%3A+Proposal+of+reliable+and+feasible+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chim+Acta%22%5BJournal%5D)">The challenge of identification of autoantibodies specific to systemic autoimmune rheumatic diseases in high throughput operation: Proposal of reliable and feasible strategies.</a> Clin Chim Acta. 437, 403-410 (2014).</li>
<li>Losen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+myasthenia+gravis+by+preventing+acetylcholine+receptor+modulation%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Treatment of myasthenia gravis by preventing acetylcholine receptor modulation.</a> Ann N Y Acad Sci. 1132, 174-179 (2008).</li>
<li>Smith, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+generation+of+fully+human+monoclonal+antibodies+specific+to+a+vaccinating+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Rapid generation of fully human monoclonal antibodies specific to a vaccinating antigen.</a> Nat Protoc. 4 (3), 372-384 (2009).</li>
<li>Fraussen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+making+human+monoclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Autoimmun%22%5BJournal%5D)">A novel method for making human monoclonal antibodies.</a> J Autoimmun. 35 (2), 130-134 (2010).</li>
<li>Traggiai, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+method+to+make+human+monoclonal+antibodies+from+memory+B+cells%3A+potent+neutralization+of+SARS+coronavirus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">An efficient method to make human monoclonal antibodies from memory B cells: potent neutralization of SARS coronavirus.</a> Nat Med. 10 (8), 871-875 (2004).</li>
<li>Fraussen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoantigen+induced+clonal+expansion+in+immortalized+B+cells+from+the+peripheral+blood+of+multiple+sclerosis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Autoantigen induced clonal expansion in immortalized B cells from the peripheral blood of multiple sclerosis patients.</a> J Neuroimmunol. 261 (1-2), 98-107 (2013).</li>
<li>Yamashita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+individual+immune+responses+elicited+by+in+vitro+immunization%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Different individual immune responses elicited by in vitro immunization.</a> Cytotechnology. 40 (1-3), 161-165 (2002).</li>
<li>Hui-Yuen, J., Koganti, S., Bhaduri-McIntosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+B+cell+immortalization+for+monoclonal+antibody+production%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Human B cell immortalization for monoclonal antibody production.</a> Methods Mol Biol. 1131, 183-189 (2014).</li>
<li>Tiller, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+monoclonal+antibodies+from+single+human+B+cells+by+single+cell+RT-PCR+and+expression+vector+cloning%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of monoclonal antibodies from single human B cells by single cell RT-PCR and expression vector cloning.</a> J Immunol Methods. 329 (1-2), 112-124 (2008).</li>
<li>Lanzavecchia, A., Corti, D., Sallusto, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+monoclonal+antibodies+by+immortalization+of+memory+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Human monoclonal antibodies by immortalization of memory B cells.</a> Curr Opin Biotechnol. 18 (6), 523-528 (2007).</li>
<li>Traggiai, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalization+of+human+B+cells%3A+analysis+of+B+cell+repertoire+and+production+of+human+monoclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Immortalization of human B cells: analysis of B cell repertoire and production of human monoclonal antibodies.</a> Methods Mol Biol. 901, 161-170 (2012).</li>
<li>Strober, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+cell+growth.+Curr+Protoc+Immunol+%2F+edited+by%5BTitle%5D)+AND+%22John+E.+Coligan+...+%5Bet+al.%5D%22%5BJournal%5D)">Monitoring cell growth. Curr Protoc Immunol / edited by.</a> John E. Coligan ... [et al.]. Appendix 3, Appendix 3A(2001).</li>
<li>Ibrahim, S. F., van den Engh, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+and+cell+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Biochem+Eng+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry and cell sorting.</a> Adv Biochem Eng Biotechnol. 106, 19-39 (2007).</li>
<li>Leith, J. T., Padfield, G., Faulkner, L. E., Quinn, P., Michelson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+feeder+cells+on+the+X-ray+sensitivity+of+human+colon+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Radiother+Oncol%22%5BJournal%5D)">Effects of feeder cells on the X-ray sensitivity of human colon cancer cells.</a> Radiother Oncol. 21 (1), 53-59 (1991).</li>
<li>Hui-Yuen, J., McAllister, S., Koganti, S., Hill, E., Bhaduri-McIntosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+Epstein-Barr+virus+growth-transformed+lymphoblastoid+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Establishment of Epstein-Barr virus growth-transformed lymphoblastoid cell lines.</a> J Vis Exp. (57), 3321(2011).</li>
<li>Smith, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+detection+in+automated+DNA+sequence+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fluorescence detection in automated DNA sequence analysis.</a> Nature. 321 (6071), 674-679 (1986).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

In questo manoscritto, tutti i passaggi per la generazione di anticorpi IgG da PBMC umane sono presentati in dettaglio. Questo protocollo comprende alcuni vantaggi rispetto alle tecniche precedentemente pubblicati. Uno dei vantaggi è che gli anticorpi prodotti mantiene le catene pesanti e leggere corrispondenti alla coppia originale nel clone cellulare B. L&#39;identificazione di anticorpi IgG può essere fatto in qualsiasi tipo di donatore umano, e non vi è alcuna necessità di esacerbazione della risposta immunitaria gr...

L&#39;obiettivo di questo articolo è quello di descrivere in dettaglio una metodologia per generare e caratterizzare gli anticorpi monoclonali IgG umane ottenute da cellule umane mononucleate del sangue periferico (PBMC). L&#39;interesse per lo studio anticorpi umani si è sviluppata in diversi campi di ricerca. In particolare, molti gruppi di ricerca sono interessati alla patologia causata da autoanticorpi 1-3. Abbiamo clonato e caratterizzato patogeni auto-anticorpi 1. Lo studio di auto-anticorpi può aiutare a identificare i loro obiettivi e per lo sviluppo di strategie terapeutiche, ad esempio, l&#39;uso di anticorpi concorrenti 4. Inoltre, lo studio di anticorpi umani può anche essere di interesse in altri campi di ricerca, cioè, per valutare la risposta immunitaria dopo la vaccinazione 5, per caratterizzare il profilo di anticorpi di individui che sono stati esposti e che sono diventate resistenti a patogeni specifici 6 o per studiare quale anticorpi sono inil repertorio naturali 7,12. Numerose tecniche sono state sviluppate per generare anticorpi monoclonali umani ricombinanti 8-12; la maggior parte di questi utilizzano phage display e immortalizzazione cellule B. L&#39;uso di phage display è stato ampiamente applicato per la scoperta di nuovi anticorpi 13. Tuttavia ha un grande svantaggio, vale a dire che le coppie di catena pesante e leggera della immunoglobulina umana diventare dissociato nel processo. La produzione di ibridomi con cellule B umane o trasformazione EBV supera questo inconveniente. Usiamo l&#39;infezione delle cellule B del timo con EBV in combinazione con la stimolazione delle cellule B policlonale via Toll-like receptor 9 (TLR-9) 6,12. In questo articolo, descriviamo in dettaglio la tecnologia che usiamo per lo sviluppo di anticorpi umani IgG, con una panoramica completa di tutte le fasi di isolamento PBMC alla vitro generazione di anticorpi in. Questoprotocollo può essere utilizzato per l&#39;analisi di qualsiasi tipo di profilo IgG umana. Nel nostro laboratorio, le cellule B che producono anticorpi IgG sono stati separati con successo dal resto del PBMC dopo la cernita. Cinquanta ordinati cellule B 8 possono essere placcati in piastre multi-pozzetti e immortalati da EBV e TLR-9 di attivazione, per l&#39;espansione clonale di singole cellule B. Come cellule feeder, sono stati utilizzati fibroblasti di tessuto polmonare embrionali, linea cellulare wi38, che facilita la visualizzazione delle cellule B immortalizzate. Da queste cellule B, le sequenze delle catene pesanti e leggere di immunoglobulina possono essere ottenuti mediante PCR, e geni gli anticorpi &#39;clonati in vettori di espressione immunoglobulina G e prodotti in vitro. Usando questa tecnica, singoli anticorpi con esattamente la stessa sequenza anticorpo trovato nel donatore possono essere studiate.

<table><tbody><tr><td>Histopaque-1077&nbsp;</td><td>Soluzione Sigma-Aldrich</td><td>10771</td><td>contenente polisaccarosio e diatrizoato di sodio</td></tr><tr><td>FACSAria II cell sorter&nbsp;</td><td>BD Bioscienze&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 piastre per micro pozzetti con fondo a U&nbsp;</td><td>Costar</td><td>3799</td><td></td></tr><tr><td>Advanced Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medio</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>12633-020</td><td></td></tr><tr><td>surnatante contenente EBV al 30% v/v della linea cellulare B95-8. &nbsp;</td><td>ATCC</td><td>CRL-1612</td><td>3,4 x 108 copie/ml</td></tr><tr><td>CpG2006&nbsp;</td><td>Celle Invivogen</td><td>ODN 7909</td><td></td></tr><tr><td>Wi38</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>90020107</td><td></td></tr><tr><td>Interleuchina-2</td><td>Roche</td><td></td><td></td>10799068001</tr><tr><td>piastre ELISA</td><td>Greiner Bio-One, Microlon</td><td>655092</td><td></td></tr><tr><td>AffiniPure F(ab')2 Frammento di capra Anti-Human IgG, Fc&gamma; Frammento specifico (non coniugato)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>109-006-008</td><td></td></tr><tr><td>4% latte in polvere scremato (Blotting Grade Blocker)&nbsp;</td><td>Biorad</td><td>170-6404</td><td></td></tr><tr><td>IgG umane</td><td>Sigma</td><td>I 2511</td><td>IgG UMANE purificate Immunoglobulina, 5,6 mg/ml</td></tr><tr><td>F(ab)2 IgG antiumane Fc&gamma; [coniugato con perossidasi (PO)]</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>109-036-008</td><td></td></tr><tr><td>Lettore ELISA (Perkin Elmer 2030)&nbsp;</td><td>Perkin Elmer&nbsp;</td><td>2030-0050</td><td></td></tr><tr><td>AffiniPuro IgM anti-umano di coniglio coniugato con perossidasi, Fc5&micro; &nbsp; </td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>309-035-095</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di sintesi diretta del cDNA delle cellule SuperScript III&nbsp;</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>18080-200</td><td></td></tr><tr><td>Applied Biosystems (ABI) GeneAm PCR System 2700</td><td>Applied Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit di isolamento dell'RNA ad alta purezza&nbsp;</td><td>Kit</td> per il sistema di trascrizione inversa <td>Roche 11828665001</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Promega</td><td>A3500</td><td></td></tr><tr><td>Ricombinante Taq DNA Polimerasi</td><td>TAKARA</td><td>R001A</td><td></td></tr><tr><td>Primer (2 &mu; l)</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarosio Ultrapuro&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>16500-500</td><td></td></tr><tr><td>100 bp ladder</td><td>Invitrogen</td><td>15628-019</td><td></td></tr><tr><td>Quantità Uno 4.5.2 (Gel Doc 2000)</td><td>Biorad</td><td>170-8100</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR kit di purificazione</td><td>QIAGEN</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>BigDye Terminator v3.1 kit di sequenziamento del ciclo&nbsp;</td><td>Applied Biosystems</td><td>4337455</td><td></td></tr><tr><td>piastra di reazione da 0,1 ml (MicroAMP Optical 96-well)</td><td>Applied Biosystems</td><td>4346906</td><td></td></tr><tr><td>Analizzatore genetico ABI300&nbsp;</td><td>Applied Biosystems</td><td>4346906</td><td></td></tr><tr><td>DH5&alfa; cellule competenti (E. coli)</td><td>Invitrogen</td><td>18263-012</td><td></td></tr><tr><td>pFUSEss-CHIg-hG1 (4.493 bp)</td><td>Invivogen</td><td>pfusess-hchg1</td><td></td></tr><tr><td>pFUSEss-CHIg-hG4 (4.484 bp)&nbsp;</td><td>Invivogen</td><td>pfusess-hchg4</td><td></td></tr><tr><td>pFUSE2ss-CLIg-hk (3.875 bp)</td><td>Invivogen</td><td>pfuse2ss-hclk</td><td></td></tr><tr><td>pFUSE2ss-CLIg-hl2 (3.883 bp)&nbsp;</td><td>Invivogen</td><td>pfuse2ss-hcll2</td><td></td></tr> Terreno di coltura SOC Terreno di agar a base di <tr><td></td><td>Invitrogen</td><td>15544-034</td><td></td></tr><tr><td>LB integrato con Zeocin (Fast-Media Zeo Agar)</td>Terreno liquido a base di <td>Invivogen</td><td>fas-zn-s</td><td></td></tr><tr><td>Terrific Broth (TB) integrato con Zeocin (Fast-Media Zeo TB)</td>Kit di miniprep <td>Invivogen</td><td>fas-zn-l</td><td></td></tr><tr><td>DNA&nbsp;</td><td>Omega Bio Technology</td><td>D6942-02</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop (spettrofotometro ND1000)</td><td>Terreno</td> di agar a base di Nanodrop <td></td><td></td></tr><tr><td>LB integrato con Blasticidina (Fast-Media Blast Agar)</td>Terreno liquido a base di <td>Invivogen</td><td>fas-bl-s</td><td></td></tr><tr><td>Terrific Broth (TB) integrato con Blasticidina (Fast-Media Blast TB)</td><td>Invivogen</td><td>fas-bl-l</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0101S</td><td>20.000 U/ml, in 10x NEBuffer EcoRI</td></tr><tr><td>NheI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0131S</td><td>10.000 U/ml, in 10x NEBuffer 2.1</td></tr><tr><td>2-Log Scala DNA</td><td>New England Biolabs</td><td>N3200S</td><td>0.1-10.0 kb, 1.000 &mu; g/ml</td></tr><tr><td>XmaI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0180S</td><td>10.000 U/ml, in 10x CutSmart Buffer&nbsp;</td></tr><tr><td>BsiWI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0553S</td><td>10.000 U/ml, in 10x NEBuffer 3.1</td></tr><tr><td>AvrII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0174S</td><td>5.000 U/ml, in 10x CutSmart Buffer&nbsp;</td></tr><tr><td>FastAP Fosfatasi Alcalina Termosensibile</td><td>Thermo Scientific</td><td>EF0651</td><td>1 U/&micro; l, in 10x FastAP Buffer</td></tr><tr><td>DH5&alpha; cellule competenti&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>18263-012</td><td></td></tr><tr><td>PE Topo Anti-Human IgG</td><td>BD Pharmingen</td><td>555787</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD22, PerCP-Cy5.5, Clone: HIB22</td><td>Fisher scientific</td><td>BDB563942</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit&nbsp;</td><td>QIAGEN</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>BigDye Terminator v3.1</td><td>Applied Biosystems</td><td>4337455</td><td></td></tr></tbody></table>

generazione di ricombinante umano igg anticorpi monoclonali da immortalizzate cellule ordinati b

Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells

Trovare nuovi metodi per generare anticorpi monoclonali umani è un campo di ricerca attivo che è importante sia per le scienze di base che per quelle applicate, compreso lo sviluppo di immunoterapie. Tuttavia, le tecniche per identificare e produrre tali anticorpi tendono ad essere difficili e talvolta la coppia di anticorpi a catena pesante e leggera è dissociata. Qui, descriviamo un protocollo relativamente semplice e diretto per produrre anticorpi monoclonali ricombinanti umani da cellule mononucleate del sangue periferico umano utilizzando l'immortalizzazione con il virus di Epstein-Barr (EBV) e l'attivazione del recettore Toll-like 9. Con un'adeguata colorazione, le cellule B che producono anticorpi possono essere isolate per la successiva immortalizzazione ed espansione clonale. I trascritti anticorpali prodotti dai cloni di cellule B immortalizzate possono essere amplificati mediante PCR, sequenziati come corrispondenti coppie di catene pesanti e leggere e clonati in vettori di espressione di immunoglobuline. Gli anticorpi ottenuti con questa tecnica possono essere strumenti potenti per studiare le risposte immunitarie umane rilevanti, inclusa l'autoimmunità, e creare le basi per nuove terapie.

Il gating ordinamento dopo colorazione cellule CD22 positive e IgG è mostrato in Figura 1 In questa immagine la zona delle cellule doppio positive -. È selezionata per ordinare tutte queste cellule in un tubo separato - cellule B che producono anticorpi IgG. Nell&#39;analisi, circa l&#39;1% dei PBMC totali corrispondono a questa doppia popolazione positiva. Il numero di cellule filtrate ottenute dipenderà dal numero di cellule ottenute nella sezione 1. I diversi risultati do...

La sintesi di anticorpi monoclonali umani è il primo passo negli studi volti a svelare i meccanismi fisiopatologici delle risposte immunitarie mediate da auto-anticorpi. Abbiamo sviluppato un protocollo per generare anticorpi monoclonali ricombinanti di immunoglobuline G (IgG) umane da cellule B selezionate per sangue, tra cui l'isolamento delle cellule B, il clonaggio di anticorpi e la sintesi in vitro.

Generazione di ricombinante umano IgG anticorpi monoclonali da immortalizzate cellule ordinati B

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, ...

L'obiettivo generale di questa procedura è clonare ed esprimere anticorpi prodotti da cellule B. Questo viene raggiunto isolando innanzitutto le cellule B da un tessuto sorgente rilevante, come il sangue o il timo. Il secondo passaggio consiste nell'eseguire FACS e selezionare la popolazione di cellule B positiva per la produzione di IgG.Successivamente, le cellule vengono immortalizzate tramite infezione con il virus di Epstein-Barr insieme all'attivazione del recettore simile alla tolla nove da parte del C-P-G-O-D-N 2006 e mantenute in coltura. I passaggi finali consistono nell'isolare l'RNA da cloni risultati positivi alla produzione di IgG mediante ELISA e nel generare DNA copia sia dalle catene leggere che da quelle pesanti dell'IgG. Infine, le sequenze di IgG possono essere clonate in vettori di espressione mammiferi per produrre elevate quantità di IgG umana monoclonale.Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la tecnologia di visualizzazione mediante fagi, è che l'accoppiamento originale delle catene pesanti e leggere dell'IgG non viene perso. Questo metodo può fornire risposte a domande fondamentali nel campo dell'autoimmunità, come la s

generation-recombinant-human-igg-monoclonal-antibodies-from

Research

Ricerca

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Un elevato throughput, piattaforma automatizzata di sviluppo delle cellule linea di produzione per la produzione di proteine ​​terapeutiche è descritto. Implementazione di Cell BD FACS sorter Aria, CloneSelect Imager e TECAN Libertà sistema di movimentazione EVO liquido ha dimostrato capacità di elaborazione significativamente aumentata in linea con lo sviluppo delle cellule migliore qualità linea cellulare e alta riproducibilità.

A High-throughput piattaforma automatica per lo sviluppo di linee cellulari di produzione per Therapeutics Proteine

Questo video dimostra un metodo di generazione di anticorpi da cellule di mammifero introducendo vettori plasmidici con geni a catena pesante e leggera. Questi vettori interagiscono con la polietilenimmina ed entrano nelle cellule formando poliplessi; Successivamente, vengono tradotte in singole proteine e assemblate in anticorpi completi, che vengono secreti nel mezzo extracellulare.

Generazione di anticorpi monoclonali ricombinanti da colture cellulari di mammifero

Il video mostra una tecnica per generare anticorpi monoclonali da cellule B antigene-specifiche. I vettori di espressione eucariotici che codificano per le catene pesanti e leggere di anticorpi, clonati da cellule B isolate antigene-specifiche, vengono introdotti nelle cellule di mammifero utilizzando poliplex. Una volta all'interno delle cellule, questi vettori subiscono la traduzione e i peptidi a catena pesante e leggera risultanti si assemblano in anticorpi, che vengono successivamente...

Una tecnica per generare anticorpi monoclonali da cellule B antigene-specifiche

Viene presentato un protocollo ottimizzato per la generazione di anticorpi monoclonali basati sulla tecnologia degli ibridomi. I topi sono stati immunizzati con un immunoconiugato. Le cellule della milza sono state fuse mediante PEG e un impulso elettrico con cellule di mieloma immortale. Le cellule di ibridoma produttrici di anticorpi sono state selezionate mediante HAT e screening ELISA antigene-specifico.

Generazione di Murine anticorpi monoclonali da ibridomi Tecnologia

Descriviamo un metodo per la produzione di anticorpi umani specifici per un antigene di interesse, a partire da rari linfociti B circolanti nel sangue umano. Generazione di questi anticorpi naturali è efficiente e rapido, e gli anticorpi ottenuti in grado di discriminare tra antigeni altamente correlati.

Generazione di anticorpi monoclonali umani discriminante da rari B antigene-specifiche cellule circolanti nel sangue

Il metodo BSelex per identificare e recuperare singoli anticorpi specifici dell'antigene dalle cellule mononucleari del sangue periferico umano combina citometria di flusso con PCR a cella singola e clonazione.

Metodo di screening a singola cellula per la selezione e il recupero di anticorpi con specifiche desiderate da popolazioni di cellule di memoria umana b arricchite

Descriviamo qui una semplice analisi dell'eterogeneità del compartimento delle cellule B immunitarie murine nel peritoneo, nella milza e nei tessuti del midollo osseo mediante citometria a flusso. Il protocollo può essere adattato ed esteso ad altri tessuti di topo.

Caratterizzazione citometrica a flusso dello sviluppo delle cellule B murine

Salvataggio di virus dell'influenza A dal DNA plasmide è una tecnica di base ed essenziale sperimentale che consente ai ricercatori di generare virus influenzali ricombinanti per studiare i molteplici aspetti della biologia del virus dell'influenza, e da utilizzare come potenziali vettori o vaccini.

Generazione di influenza da virus ricombinante del DNA plasmidi

Un efficiente sistema di struttura e analisi funzionale di un gene in...

Produzione ricombinante retrovirali e infezione delle cellule B

Topi C57BL / 6 sono stati utilizzati per studiare la patogenesi Hc e fornire il modello migliore. Stiamo esplorando i potenziali benefici dell'immunità umorale contro questo fungo e ha generato anticorpi monoclonali diversi [di istone H2B e 60kDa Heat Shock Protein] che abbiamo testato per la loro efficacia protettiva dopo la somministrazione intraperitoneale.

Amministrazione passivo di anticorpi monoclonali contro H. capsulatum E altri patogeni fungini

Scopri come generare anticorpi monoclonali umani IgG da cellule B immortalizzate con virus Epstein-Barr. Questo metodo consente di studiare risposte immunitarie e autoanticorpi patogenici per ricerca immunologica.

Generazione di ricombinante umano IgG anticorpi monoclonali da immortalizzate cellule ordinati B

Esplora altri video