Name: Generazione di ricombinante umano IgG anticorpi monoclonali da immortalizzate cellule ordinati B (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: Scopri come generare anticorpi monoclonali umani IgG da cellule B immortalizzate con virus Epstein-Barr. Questo metodo consente di studiare risposte immunitarie e autoanticorpi patogenici per ricerca immunologica.

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Contratto di ricerca Miguel Servet (ISCIII CD14 / 00032) a (GN-G.). Fellowship dalla Organizzazione olandese per la ricerca scientifica &quot;Graduate School of Translational Neuroscience Programma&quot; (022005019) a (CH). Le sovvenzioni da parte Prinses Beatrix Fonds (Progetto WAR08-12) e dell&#39;Association Française contre les Myopathies a (PM-M.); nonché da un Veni Fellowship dell&#39;Organizzazione olandese per la ricerca scientifica (916.10.148) una borsa di studio della Fondazione cervello dei Paesi Bassi (FS2008 (1) -28) e il Prinses Beatrix Fonds (Progetto WAR08-12) (a ML ). Ringraziamo Jozien Jaspers per il suo aiuto nel B-cell sorting mediante citometria di flusso.

<ol><li>Vrolix, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+heterogeneity+of+thymic+B+cells+from+early-onset+myasthenia+gravis+patients+with+antibodies+against+the+acetylcholine+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Autoimmun%22%5BJournal%5D)">Clonal heterogeneity of thymic B cells from early-onset myasthenia gravis patients with antibodies against the acetylcholine receptor.</a> J Autoimmun. 52, 101-112 (2014).</li>
<li>Yamashita, M., Katakura, Y., Shirahata, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+the+generation+of+human+monoclonal+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Recent advances in the generation of human monoclonal antibody.</a> Cytotechnology. 55 (2-3), 55-60 (2007).</li>
<li>Pereira, K. M., Dellavance, A., Andrade, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+challenge+of+identification+of+autoantibodies+specific+to+systemic+autoimmune+rheumatic+diseases+in+high+throughput+operation%3A+Proposal+of+reliable+and+feasible+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chim+Acta%22%5BJournal%5D)">The challenge of identification of autoantibodies specific to systemic autoimmune rheumatic diseases in high throughput operation: Proposal of reliable and feasible strategies.</a> Clin Chim Acta. 437, 403-410 (2014).</li>
<li>Losen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+myasthenia+gravis+by+preventing+acetylcholine+receptor+modulation%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Treatment of myasthenia gravis by preventing acetylcholine receptor modulation.</a> Ann N Y Acad Sci. 1132, 174-179 (2008).</li>
<li>Smith, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+generation+of+fully+human+monoclonal+antibodies+specific+to+a+vaccinating+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Rapid generation of fully human monoclonal antibodies specific to a vaccinating antigen.</a> Nat Protoc. 4 (3), 372-384 (2009).</li>
<li>Fraussen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+making+human+monoclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Autoimmun%22%5BJournal%5D)">A novel method for making human monoclonal antibodies.</a> J Autoimmun. 35 (2), 130-134 (2010).</li>
<li>Traggiai, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+method+to+make+human+monoclonal+antibodies+from+memory+B+cells%3A+potent+neutralization+of+SARS+coronavirus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">An efficient method to make human monoclonal antibodies from memory B cells: potent neutralization of SARS coronavirus.</a> Nat Med. 10 (8), 871-875 (2004).</li>
<li>Fraussen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoantigen+induced+clonal+expansion+in+immortalized+B+cells+from+the+peripheral+blood+of+multiple+sclerosis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Autoantigen induced clonal expansion in immortalized B cells from the peripheral blood of multiple sclerosis patients.</a> J Neuroimmunol. 261 (1-2), 98-107 (2013).</li>
<li>Yamashita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+individual+immune+responses+elicited+by+in+vitro+immunization%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Different individual immune responses elicited by in vitro immunization.</a> Cytotechnology. 40 (1-3), 161-165 (2002).</li>
<li>Hui-Yuen, J., Koganti, S., Bhaduri-McIntosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+B+cell+immortalization+for+monoclonal+antibody+production%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Human B cell immortalization for monoclonal antibody production.</a> Methods Mol Biol. 1131, 183-189 (2014).</li>
<li>Tiller, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+monoclonal+antibodies+from+single+human+B+cells+by+single+cell+RT-PCR+and+expression+vector+cloning%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of monoclonal antibodies from single human B cells by single cell RT-PCR and expression vector cloning.</a> J Immunol Methods. 329 (1-2), 112-124 (2008).</li>
<li>Lanzavecchia, A., Corti, D., Sallusto, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+monoclonal+antibodies+by+immortalization+of+memory+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Human monoclonal antibodies by immortalization of memory B cells.</a> Curr Opin Biotechnol. 18 (6), 523-528 (2007).</li>
<li>Traggiai, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalization+of+human+B+cells%3A+analysis+of+B+cell+repertoire+and+production+of+human+monoclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Immortalization of human B cells: analysis of B cell repertoire and production of human monoclonal antibodies.</a> Methods Mol Biol. 901, 161-170 (2012).</li>
<li>Strober, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+cell+growth.+Curr+Protoc+Immunol+%2F+edited+by%5BTitle%5D)+AND+%22John+E.+Coligan+...+%5Bet+al.%5D%22%5BJournal%5D)">Monitoring cell growth. Curr Protoc Immunol / edited by.</a> John E. Coligan ... [et al.]. Appendix 3, Appendix 3A(2001).</li>
<li>Ibrahim, S. F., van den Engh, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+and+cell+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Biochem+Eng+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry and cell sorting.</a> Adv Biochem Eng Biotechnol. 106, 19-39 (2007).</li>
<li>Leith, J. T., Padfield, G., Faulkner, L. E., Quinn, P., Michelson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+feeder+cells+on+the+X-ray+sensitivity+of+human+colon+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Radiother+Oncol%22%5BJournal%5D)">Effects of feeder cells on the X-ray sensitivity of human colon cancer cells.</a> Radiother Oncol. 21 (1), 53-59 (1991).</li>
<li>Hui-Yuen, J., McAllister, S., Koganti, S., Hill, E., Bhaduri-McIntosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+Epstein-Barr+virus+growth-transformed+lymphoblastoid+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Establishment of Epstein-Barr virus growth-transformed lymphoblastoid cell lines.</a> J Vis Exp. (57), 3321(2011).</li>
<li>Smith, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+detection+in+automated+DNA+sequence+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fluorescence detection in automated DNA sequence analysis.</a> Nature. 321 (6071), 674-679 (1986).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

In questo manoscritto, tutti i passaggi per la generazione di anticorpi IgG da PBMC umane sono presentati in dettaglio. Questo protocollo comprende alcuni vantaggi rispetto alle tecniche precedentemente pubblicati. Uno dei vantaggi è che gli anticorpi prodotti mantiene le catene pesanti e leggere corrispondenti alla coppia originale nel clone cellulare B. L&#39;identificazione di anticorpi IgG può essere fatto in qualsiasi tipo di donatore umano, e non vi è alcuna necessità di esacerbazione della risposta immunitaria gr...

L&#39;obiettivo di questo articolo è quello di descrivere in dettaglio una metodologia per generare e caratterizzare gli anticorpi monoclonali IgG umane ottenute da cellule umane mononucleate del sangue periferico (PBMC). L&#39;interesse per lo studio anticorpi umani si è sviluppata in diversi campi di ricerca. In particolare, molti gruppi di ricerca sono interessati alla patologia causata da autoanticorpi 1-3. Abbiamo clonato e caratterizzato patogeni auto-anticorpi 1. Lo studio di auto-anticorpi può aiutare a identificare i loro obiettivi e per lo sviluppo di strategie terapeutiche, ad esempio, l&#39;uso di anticorpi concorrenti 4. Inoltre, lo studio di anticorpi umani può anche essere di interesse in altri campi di ricerca, cioè, per valutare la risposta immunitaria dopo la vaccinazione 5, per caratterizzare il profilo di anticorpi di individui che sono stati esposti e che sono diventate resistenti a patogeni specifici 6 o per studiare quale anticorpi sono inil repertorio naturali 7,12. Numerose tecniche sono state sviluppate per generare anticorpi monoclonali umani ricombinanti 8-12; la maggior parte di questi utilizzano phage display e immortalizzazione cellule B. L&#39;uso di phage display è stato ampiamente applicato per la scoperta di nuovi anticorpi 13. Tuttavia ha un grande svantaggio, vale a dire che le coppie di catena pesante e leggera della immunoglobulina umana diventare dissociato nel processo. La produzione di ibridomi con cellule B umane o trasformazione EBV supera questo inconveniente. Usiamo l&#39;infezione delle cellule B del timo con EBV in combinazione con la stimolazione delle cellule B policlonale via Toll-like receptor 9 (TLR-9) 6,12. In questo articolo, descriviamo in dettaglio la tecnologia che usiamo per lo sviluppo di anticorpi umani IgG, con una panoramica completa di tutte le fasi di isolamento PBMC alla vitro generazione di anticorpi in. Questoprotocollo può essere utilizzato per l&#39;analisi di qualsiasi tipo di profilo IgG umana. Nel nostro laboratorio, le cellule B che producono anticorpi IgG sono stati separati con successo dal resto del PBMC dopo la cernita. Cinquanta ordinati cellule B 8 possono essere placcati in piastre multi-pozzetti e immortalati da EBV e TLR-9 di attivazione, per l&#39;espansione clonale di singole cellule B. Come cellule feeder, sono stati utilizzati fibroblasti di tessuto polmonare embrionali, linea cellulare wi38, che facilita la visualizzazione delle cellule B immortalizzate. Da queste cellule B, le sequenze delle catene pesanti e leggere di immunoglobulina possono essere ottenuti mediante PCR, e geni gli anticorpi &#39;clonati in vettori di espressione immunoglobulina G e prodotti in vitro. Usando questa tecnica, singoli anticorpi con esattamente la stessa sequenza anticorpo trovato nel donatore possono essere studiate.

<table><tbody><tr><td>Histopaque-1077&nbsp;</td><td>Soluzione Sigma-Aldrich</td><td>10771</td><td>contenente polisaccarosio e diatrizoato di sodio</td></tr><tr><td>FACSAria II cell sorter&nbsp;</td><td>BD Bioscienze&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 piastre per micro pozzetti con fondo a U&nbsp;</td><td>Costar</td><td>3799</td><td></td></tr><tr><td>Advanced Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medio</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>12633-020</td><td></td></tr><tr><td>surnatante contenente EBV al 30% v/v della linea cellulare B95-8. &nbsp;</td><td>ATCC</td><td>CRL-1612</td><td>3,4 x 108 copie/ml</td></tr><tr><td>CpG2006&nbsp;</td><td>Celle Invivogen</td><td>ODN 7909</td><td></td></tr><tr><td>Wi38</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>90020107</td><td></td></tr><tr><td>Interleuchina-2</td><td>Roche</td><td></td><td></td>10799068001</tr><tr><td>piastre ELISA</td><td>Greiner Bio-One, Microlon</td><td>655092</td><td></td></tr><tr><td>AffiniPure F(ab')2 Frammento di capra Anti-Human IgG, Fc&gamma; Frammento specifico (non coniugato)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>109-006-008</td><td></td></tr><tr><td>4% latte in polvere scremato (Blotting Grade Blocker)&nbsp;</td><td>Biorad</td><td>170-6404</td><td></td></tr><tr><td>IgG umane</td><td>Sigma</td><td>I 2511</td><td>IgG UMANE purificate Immunoglobulina, 5,6 mg/ml</td></tr><tr><td>F(ab)2 IgG antiumane Fc&gamma; [coniugato con perossidasi (PO)]</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>109-036-008</td><td></td></tr><tr><td>Lettore ELISA (Perkin Elmer 2030)&nbsp;</td><td>Perkin Elmer&nbsp;</td><td>2030-0050</td><td></td></tr><tr><td>AffiniPuro IgM anti-umano di coniglio coniugato con perossidasi, Fc5&micro; &nbsp; </td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>309-035-095</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di sintesi diretta del cDNA delle cellule SuperScript III&nbsp;</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>18080-200</td><td></td></tr><tr><td>Applied Biosystems (ABI) GeneAm PCR System 2700</td><td>Applied Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit di isolamento dell'RNA ad alta purezza&nbsp;</td><td>Kit</td> per il sistema di trascrizione inversa <td>Roche 11828665001</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Promega</td><td>A3500</td><td></td></tr><tr><td>Ricombinante Taq DNA Polimerasi</td><td>TAKARA</td><td>R001A</td><td></td></tr><tr><td>Primer (2 &mu; l)</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarosio Ultrapuro&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>16500-500</td><td></td></tr><tr><td>100 bp ladder</td><td>Invitrogen</td><td>15628-019</td><td></td></tr><tr><td>Quantità Uno 4.5.2 (Gel Doc 2000)</td><td>Biorad</td><td>170-8100</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR kit di purificazione</td><td>QIAGEN</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>BigDye Terminator v3.1 kit di sequenziamento del ciclo&nbsp;</td><td>Applied Biosystems</td><td>4337455</td><td></td></tr><tr><td>piastra di reazione da 0,1 ml (MicroAMP Optical 96-well)</td><td>Applied Biosystems</td><td>4346906</td><td></td></tr><tr><td>Analizzatore genetico ABI300&nbsp;</td><td>Applied Biosystems</td><td>4346906</td><td></td></tr><tr><td>DH5&alfa; cellule competenti (E. coli)</td><td>Invitrogen</td><td>18263-012</td><td></td></tr><tr><td>pFUSEss-CHIg-hG1 (4.493 bp)</td><td>Invivogen</td><td>pfusess-hchg1</td><td></td></tr><tr><td>pFUSEss-CHIg-hG4 (4.484 bp)&nbsp;</td><td>Invivogen</td><td>pfusess-hchg4</td><td></td></tr><tr><td>pFUSE2ss-CLIg-hk (3.875 bp)</td><td>Invivogen</td><td>pfuse2ss-hclk</td><td></td></tr><tr><td>pFUSE2ss-CLIg-hl2 (3.883 bp)&nbsp;</td><td>Invivogen</td><td>pfuse2ss-hcll2</td><td></td></tr> Terreno di coltura SOC Terreno di agar a base di <tr><td></td><td>Invitrogen</td><td>15544-034</td><td></td></tr><tr><td>LB integrato con Zeocin (Fast-Media Zeo Agar)</td>Terreno liquido a base di <td>Invivogen</td><td>fas-zn-s</td><td></td></tr><tr><td>Terrific Broth (TB) integrato con Zeocin (Fast-Media Zeo TB)</td>Kit di miniprep <td>Invivogen</td><td>fas-zn-l</td><td></td></tr><tr><td>DNA&nbsp;</td><td>Omega Bio Technology</td><td>D6942-02</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop (spettrofotometro ND1000)</td><td>Terreno</td> di agar a base di Nanodrop <td></td><td></td></tr><tr><td>LB integrato con Blasticidina (Fast-Media Blast Agar)</td>Terreno liquido a base di <td>Invivogen</td><td>fas-bl-s</td><td></td></tr><tr><td>Terrific Broth (TB) integrato con Blasticidina (Fast-Media Blast TB)</td><td>Invivogen</td><td>fas-bl-l</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0101S</td><td>20.000 U/ml, in 10x NEBuffer EcoRI</td></tr><tr><td>NheI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0131S</td><td>10.000 U/ml, in 10x NEBuffer 2.1</td></tr><tr><td>2-Log Scala DNA</td><td>New England Biolabs</td><td>N3200S</td><td>0.1-10.0 kb, 1.000 &mu; g/ml</td></tr><tr><td>XmaI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0180S</td><td>10.000 U/ml, in 10x CutSmart Buffer&nbsp;</td></tr><tr><td>BsiWI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0553S</td><td>10.000 U/ml, in 10x NEBuffer 3.1</td></tr><tr><td>AvrII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0174S</td><td>5.000 U/ml, in 10x CutSmart Buffer&nbsp;</td></tr><tr><td>FastAP Fosfatasi Alcalina Termosensibile</td><td>Thermo Scientific</td><td>EF0651</td><td>1 U/&micro; l, in 10x FastAP Buffer</td></tr><tr><td>DH5&alpha; cellule competenti&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>18263-012</td><td></td></tr><tr><td>PE Topo Anti-Human IgG</td><td>BD Pharmingen</td><td>555787</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD22, PerCP-Cy5.5, Clone: HIB22</td><td>Fisher scientific</td><td>BDB563942</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit&nbsp;</td><td>QIAGEN</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>BigDye Terminator v3.1</td><td>Applied Biosystems</td><td>4337455</td><td></td></tr></tbody></table>

generazione di ricombinante umano igg anticorpi monoclonali da immortalizzate cellule ordinati b

Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells

Trovare nuovi metodi per generare anticorpi monoclonali umani è un campo di ricerca attivo che è importante sia per le scienze di base che per quelle applicate, compreso lo sviluppo di immunoterapie. Tuttavia, le tecniche per identificare e produrre tali anticorpi tendono ad essere difficili e talvolta la coppia di anticorpi a catena pesante e leggera è dissociata. Qui, descriviamo un protocollo relativamente semplice e diretto per produrre anticorpi monoclonali ricombinanti umani da cellule mononucleate del sangue periferico umano utilizzando l'immortalizzazione con il virus di Epstein-Barr (EBV) e l'attivazione del recettore Toll-like 9. Con un'adeguata colorazione, le cellule B che producono anticorpi possono essere isolate per la successiva immortalizzazione ed espansione clonale. I trascritti anticorpali prodotti dai cloni di cellule B immortalizzate possono essere amplificati mediante PCR, sequenziati come corrispondenti coppie di catene pesanti e leggere e clonati in vettori di espressione di immunoglobuline. Gli anticorpi ottenuti con questa tecnica possono essere strumenti potenti per studiare le risposte immunitarie umane rilevanti, inclusa l'autoimmunità, e creare le basi per nuove terapie.

Il gating ordinamento dopo colorazione cellule CD22 positive e IgG è mostrato in Figura 1 In questa immagine la zona delle cellule doppio positive -. È selezionata per ordinare tutte queste cellule in un tubo separato - cellule B che producono anticorpi IgG. Nell&#39;analisi, circa l&#39;1% dei PBMC totali corrispondono a questa doppia popolazione positiva. Il numero di cellule filtrate ottenute dipenderà dal numero di cellule ottenute nella sezione 1. I diversi risultati do...

La sintesi di anticorpi monoclonali umani è il primo passo negli studi volti a svelare i meccanismi fisiopatologici delle risposte immunitarie mediate da auto-anticorpi. Abbiamo sviluppato un protocollo per generare anticorpi monoclonali ricombinanti di immunoglobuline G (IgG) umane da cellule B selezionate per sangue, tra cui l'isolamento delle cellule B, il clonaggio di anticorpi e la sintesi in vitro.

Generazione di ricombinante umano IgG anticorpi monoclonali da immortalizzate cellule ordinati B

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, ...

L'obiettivo generale di questa procedura è clonare ed esprimere anticorpi prodotti da cellule B. Questo viene raggiunto isolando innanzitutto le cellule B da un tessuto sorgente rilevante, come il sangue o il timo. Il secondo passaggio consiste nell'eseguire FACS e selezionare la popolazione di cellule B positiva per la produzione di IgG.Successivamente, le cellule vengono immortalizzate tramite infezione con il virus di Epstein-Barr insieme all'attivazione del recettore simile alla tolla nove da parte del C-P-G-O-D-N 2006 e mantenute in coltura. I passaggi finali consistono nell'isolare l'RNA da cloni risultati positivi alla produzione di IgG mediante ELISA e nel generare DNA copia sia dalle catene leggere che da quelle pesanti dell'IgG. Infine, le sequenze di IgG possono essere clonate in vettori di espressione mammiferi per produrre elevate quantità di IgG umana monoclonale.Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la tecnologia di visualizzazione mediante fagi, è che l'accoppiamento originale delle catene pesanti e leggere dell'IgG non viene perso. Questo metodo può fornire risposte a domande fondamentali nel campo dell'autoimmunità, come la scoperta e la caratterizzazione funzionale di autoanticorpi patogeni. Non dimenticare che lavorare con materiale proveniente da pazienti e con il virus EBV può comportare dei rischi.Il virus EB è un agente patogeno per l'uomo e si devono sempre adottare precauzioni come il livello di sicurezza virale due e l'uso di dispositivi di protezione adeguati durante l'esecuzione di questi passaggi. Prima di colorare i PBMC, seminarli in un'ampolla da 25 centimetri con sei millilitri di mezzo RPMI 1640 completo e lasciarli ripristinare durante la notte. Dopo il bloccaggio e il lavaggio delle cellule, raccogliere i PBMC in un tubo con mezzo millilitro di mezzo e centrifugarli. Quindi risospendere le cellule nel buffer di marcatura e contarle.Successivamente, preparare due provette da centrifuga con 5 milioni di cellule in 200 microlitri di tampone aggiunti a queste provette. Aggiungere 10 microlitri di anti-CD22 P-E-R-C-P oppure 40 microlitri di anti-IgG PE e lasciare incubare per 30 minuti sul ghiaccio e al buio, quindi lavare, filtrare e separare le cellule. L'obiettivo è contare le cellule doppio positive.Iniziare diluendo i BMC P ordinati a una cellula per microlitro in mezzo completo RPMI 1640, con aggiunta di CPG 2006 e EBV. Successivamente, in una cappa, seminare 110 microlitri della diluizione cellulare con EBV e CPG 2006 in due pozzetti di una piastra a 96 pozzetti con fondo rotondo, precedentemente rivestita con cellule WI-38 irradiate. L'infezione con 50 cellule per pozzetto è ottimizzata e aumenta la probabilità di ottenere un anticorpo monoclonale.Tuttavia, raccomandiamo di confermare questo risultato mediante una PCR. Dopo una settimana di incubazione, esaminare le cellule al microscopio per verificare la crescita delle cellule B. Dopo due settimane, sostituire il mezzo: aspirare lentamente 90 microlitri di mezzo da ogni pozzetto e trasferirli in una nuova piastra.Per verificare la produzione di IgG mediante ELISA. Quindi aggiungere nuovamente 100 microlitri di mezzo fresco supplementato, inclusa l'IL-2, in ciascun pozzetto. Continuare il monitoraggio della crescita delle linee cellulari durante la terza e la quarta settimana di crescita.Ripetere il cambio del mezzo ogni settimana. Consultare il protocollo scritto per i metodi di espansione clonale. Verificare il surnatante prelevato dai cambi di mezzo per la produzione di IgG mediante saggio immunoenzimatico (ELISA).Per prima cosa, preparare le piastre ELIZA dispensando in ciascun pozzetto 50 microlitri di anticorpi caprini anti-Fc umano, diluiti uno a 200 in tampone di rivestimento. Dopo l'incubazione e il lavaggio della piastra, bloccare i pozzetti aggiungendo 100 microlitri di tampone di bloccaggio per pozzetto e incubare nuovamente la piastra. Al termine dell'incubazione di blocco, rimuovere il liquido dalla piastra battendola su un foglio di carta assorbente.Con la piastra pronta, diluire i soprannatanti con quattro volumi di RPMI. Successivamente, per i controlli standard, eseguire una diluizione seriale di soluzione di IgG umana in RPMI da 1000 nanogrammi per millilitro a 15,6 nanogrammi per millilitro.Includere anche un bianco. Applicare 50 microlitri di supernatante o del campione standard in ogni pozzetto e incubare la piastra ELISA per un'ora a 37 gradi Celsius nello stesso modo; possono essere preparate ulteriori piastre ELISA per analizzare ulteriori diluizioni dei supernatanti al fine di verificare l'affinità dell'anticorpo. Al termine dell'incubazione, lavare la piastra.Quindi applicare a ciascun pozzetto 50 microlitri di buffer di incubazione contenente fab coniugato con perossidasi due. Dopo un ulteriore periodo di incubazione di un'ora e un altro lavaggio, aggiungere a ciascun pozzetto 100 microlitri di soluzione di substrato con TMB. Incubare quindi la piastra fino a 10 minuti, finché il colore blu che appare non si stabilizza.Quindi arrestare la reazione e misurare l'assorbanza. Tutti i supernatanti clonali con un'assorbanza misurata superiore di tre deviazioni standard rispetto al bianco sono considerati positivi.Per gli anticorpi IgG umani, la specificità antigenica può essere rilevata mediante ulteriori saggi. Per iniziare, seguire il protocollo scritto per sintetizzare il DNA copia dai cloni positivi. Successivamente, impostare le reazioni di PCR per le catene pesanti kappa e lambda dell'IgG.Nel risultato, individuare la catena pesante tra 400 e 550 paia di basi. Individuare la catena leggera tra 300 e 400 paia di basi. Se non sono presenti, utilizzare un microlitro dei prodotti come stampo per una successiva PCR.I nuovi prodotti dovrebbero trovarsi nell'intervallo appropriato. Procedere quindi con il clonaggio dei migliori prodotti: innanzitutto, sequenziarli. I loro elettroferogrammi dovrebbero essere puliti e corrispondere a una singola sequenza di immunoglobina.Seguire il protocollo indicato. Clonare il prodotto PCR purificato in un microgrammo di DNA plasmidico. Accertarsi di eseguire la ligazione per tutta la notte a 16 gradi Celsius.Utilizzando la DNA ligasi T4, preparare le cellule HX in DMEM integrato e coltivarle fino al raggiungimento di una confluenza del 75% in fiaschi da coltura di 75 centimetri quadrati. Per ogni trasfezione di catena pesante e leggera, preparare una miscela con 1,75 millilitri di DMEM senza siero contenente 4,5 microgrammi di vettore per la catena pesante, 3 microgrammi di vettore per la catena leggera e 50 microlitri di soluzione di polietilene. Aggiungere delicatamente questa miscela a una piastra di cellule HX e agitare dolcemente la soluzione sulla piastra.Incubare la piastra durante la notte e quindi iniziare a raccogliere i mezzi di coltura ogni giorno, sostituendoli con mezzo privo di siero. I mezzi contengono gli anticorpi e possono essere raccolti giornalmente per quattro giorni dopo che le pBMC positive per CD22 e IgG sono state separate mediante FACS.L'area delle cellule doppio positive, ovvero le cellule B che producono anticorpi IgG, è stata raccolta separatamente per l'espansione. Circa l'1% dei PBMC apparteneva a questa popolazione doppio positiva. Dopo cinque settimane di stimolazione con immortalizzazione da EBV e CPG 2006, sono stati isolati cloni immortalati.Le cellule feeder WI 30 presentano una forma fibroblastica più allungata, mentre le cellule clonali B appaiono come piccole cellule rotonde che crescono raggruppate al centro della piastra multi-pozzetto con fondo rotondo. Il sopranatante dei cloni in crescita è stato analizzato mediante ELIZA per IgG. Un clone positivo è stato valutato su un'eli, con un valore pari a tre deviazioni standard superiore al valore del bianco.Almeno tre supernatanti da un clone positivo hanno dato esito positivo nel saggio ELISA. Gli anticorpi di un clone positivo sono stati sottoposti a sequenziamento dopo il clonaggio delle regioni variabili e costanti della catena pesante e della coppia di catene leggere lambda; in questo modo, le catene pesanti e leggere degli immunoglobulini sono state caratterizzate. Seguendo questa procedura.Altri metodi, come il sequenziamento, possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande riguardanti l'uso di anticorpi e geni, la diversità genetica, ecc. Dopo questo sviluppo, la tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'autoimmunità per esplorare le malattie, la patologia e le strategie terapeutiche pertinenti per patologie autoimmuni come la miastenia grave. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla diagnosi e al trattamento di malattie come la miastenia grave, poiché l'individuazione di anticorpi patogeni può portare allo sviluppo di nuovi trattamenti, come anticorpi competitori privi di attività infiammatoria.

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