Name: Cloruro ferrico-indotta Trombosi modello murino sulla carotide e Mesentere Vessel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: Scopri il modello di trombosi indotta da cloruro ferrico su carotide e vaso mesenterico murino. Questo metodo utilizza microscopia intravivente e misurazione del flusso ematico per studiare la formazione del trombo in tempo reale.

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Gli autori vorrebbero riconoscere il supporto tecnico da Joy Yao e il Dr. Karen Alt, così come i finanziamenti del NHMRC e NHF.

Tutti gli esperimenti su animali sono stati approvati dalla Alfred Medical Research and Education Precinct comitato etico degli animali (E / 1534/2015 / B). Tutte le operazioni chirurgiche sono stati eseguiti in anestesia totale e gli animali non hanno esperienza del dolore in qualsiasi momento. Tutti gli esperimenti descritti sono mancato recupero. 1. Preparazione <ol><li> Tagliare bande sottili di carta filtro (1 mm x 2 mm). </li><li> Appena preparare 2 soluzioni di cloruro ferrico del 4% (w / v) e il 6% (w / v) diluito in acqua deionizzata. Preparare una soluzione rodamina 6G 0,3% in PBS, filtrata attraverso 0,22 micron. </li><li> Tagliare un piccolo pezzo (5 mm x 1 cm) dalla plastica bianca della siringa involucro. </li></ol> 2. Mesentere Arteriola trombo Formazione Osservato da intravitale Microscopia <ol><li> Pesano 10-12 settimane maschio C57BL / 6 wild type mouse e anestetizzare conseguenza con una miscela di ketamina (100 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg) se iniezione intraperitoneale. Monitorare la profondità dell&#39;anestesia dalla risposta ai piedi, coda e / o pizzico pelle, reattività da presa cornea e della palpebra, e l&#39;assenza di movimento baffi. Se necessario, iniettare una seconda dose di ketamina (50 mg / kg) per mantenere l&#39;anestesia dell&#39;animale. Applicare veterinario pomata sugli occhi per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia. Posizionare il mouse in una piccola scatola di Petri posto su una piastra elettrica regolata a 37 ° C. NOTA: Sebbene iniezione IP può provocare dolore per gli animali, la durata di questo disagio sarà minimo (meno di 3 sec). Il dolore e il disagio associato con iniezioni saranno ridotti al minimo attraverso l&#39;utilizzo di personale esperto e competente e la dimensione ago appropriato (25 G). A seguito di tutte le procedure, eutanasia tutti gli animali con una overdose di ketamina e xilazina seguita da dislocazione cervicale. </li><li> Effettuare una incisione mediana addominale di circa 3 cm nella pelle e tagliare con attenzione il peritoneo. </li><li> Posizionare il mouse sul lato del petpiatto ri, esteriorizzare delicatamente suoi intestini e diffondere accuratamente il mesentere con 2 bastoncini cotonati portare un recipiente adatto alla superficie della piastra di Petri. Asciugare bene con un delicato tergicristallo. NOTA: Per limitare il movimento dei vasi mesenterici, papaverina può essere utilizzato per inibire la peristalsi intestinale. </li><li> Immergere la coda del topo in acqua calda per dilatare i vasi e iniettare 30 ml di rodamina 6G (0,3%) nella vena della coda del topo con una siringa 29 G etichettare leucociti e piastrine. </li><li> Porre la capsula di Petri con un microscopio invertito e concentrarsi sul arteriole scelta utilizzando il canale in campo chiaro. </li><li> Immergere una striscia di carta filtro con 6% (w / v) di ferro (III) cloruro e applicare la carta da filtro in arteriole con due pinze; il primo a tenere la carta da filtro, la seconda per premere delicatamente sulla zona di interesse. Osservare formazione di trombi nel primo 10 sec dopo la deposizione della carta da filtro. NOTA: E &#39;abbastanza commsulla ferire microcircolo circondato e la precisione della deposizione della carta da filtro e la pressione delicatamente è quindi importante limitare questo problema. </li><li> Osservare formazione di trombi mediante microscopia a fluorescenza (canale TRITC: picco di eccitazione 557 nm, picco di emissione 576 nm), attraverso la carta da filtro. Osservare le leucociti circolanti e piastrine che hanno raccolto la rodamina 6G e la loro aggregazione in trombo è quindi facile da identificare. </li><li> Prendere la carta da filtro dopo 1 minuti di esposizione al ferro (III) cloruro e continuare a monitorare la formazione del trombo. Lavare il recipiente con PBS. </li><li> Osservare e registrare la formazione dinamica del trombo evidenziata con l&#39;etichettatura di piastrine e leucociti con rodamina 6G. Catturare le immagini e misurare le dimensioni del trombo. Le immagini qui presentati sono stati ottenuti con un microscopio intravitale invertito, anche se un obiettivo 4x, nel canale di fluorescenza TRITC. </li><li> Fopo tutte le procedure, eutanasia dell&#39;animale utilizzando un&#39;overdose di ketamina e xilazina seguita da dislocazione cervicale. </li></ol> 3. carotide trombo Formazione valutata dal Sangue di velocità del flusso di misura <ol><li> Pesano 10-12 settimane vecchio maschio C57BL / 6 del mouse e anestetizzare conseguenza con una miscela di ketamina (100 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg) se iniezione intraperitoneale. Applicare veterinario pomata sugli occhi per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia. </li><li> Fissare il mouse sotto un microscopio operatorio utilizzando nastro adesivo su gambe, su una piastra elettrica regolata a 37 ° C. </li><li> Fare un piccolo cuscino di un tergicristallo e il nastro sotto la testa del mouse per elevare la testa leggermente. Utilizzare un anello di filo con le pinze per tirare il muso verso il basso (utilizzare denti superiori). Questo esporrà la regione della carotide per un facile accesso. </li><li> Eseguire Small 5 mm di profondità di incisione della pelle direttamente sotto la mascella, fino allo sterno. </li><li> Sezionare la fascia e isolare un frammento di una carotide comune sinistra o destra sopra della biforcazione. </li><li> Introdurre con cautela una pinzetta in-tra l&#39;arteria e il nervo per separarli. Non disturbare il coraggio correndo vicino all&#39;arteria ed evitare di toccare troppo della carotide come può provoca danni alla nave. Isolare una sezione di un almeno 5 mm dell&#39;arteria. </li><li> Essiccare l&#39;area dell&#39;arteria correttamente tergicristalli per evitare che qualsiasi liquido interferisce con il FeCl 3. </li><li> Mettere il piccolo pezzo di plastica bianca sotto la parte isolata del carotide comune in modo che il FeCl 3 non immergere nei tessuti circostanti. A questo scopo, utilizzare una seconda pinza per portare il pezzo al primo poi lentamente scorrere la carta plastica sotto l&#39;arteria. </li><li> Immergere un pezzo di carta da filtro con il 4% (w / v) o 6% (w / v) di cloruro ferrico e posizionarlo tutto intorno all&#39;arteria. </li><li> Dopo 3 minuti di esposizione, togliere la carta da filtro, risciacquare con PBS e asciugare la zona wtergicristalli esima. </li><li> Posizionare la sonda Doppler intorno alla nave al zona lesa e iniziare a registrare i cambiamenti nel flusso. Nella carotide comune di topi adulti sani, il flusso è generalmente circa 1 ml / min. Attenzione! contatto della sonda con cloruro ferrico danneggerà la sonda in modo che qualsiasi contatto deve essere evitato. I dati qui presentati sono stati ottenuti con un metro Transonic System Inc. Flow, modulo perivascolare TS420 dotato di una sonda di mandata Nano Doppler 0,5 PBS. NOTA: La concentrazione di cloruro ferrico può modificare la cinetica di formazione di trombi conseguente diversi tempi di occlusione. Così, un&#39;esposizione al 6% (w / v) di cloruro ferrico dà un&#39;occlusione veloce di esposizione al 4% (w / v) di cloruro ferrico. </li><li> A seguito di tutte le procedure, eutanasia tutti gli animali con una overdose di ketamina e xilazina seguita da dislocazione cervicale e pulire accuratamente la sonda Doppler. </li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il cloruro ferrico trombosi indotta modello è uno strumento di ricerca eccellente. Come mostrato in questo studio, è estremamente facile da implementare e quando usato in combinazione con la microscopia intravitale o Doppler flussimetro, fornisce un buon controllo in tempo reale di formazione di trombi. Regolazione del tempo di esposizione e la concentrazione di FeCl 3, offre anche la possibilità di produrre trombi o non-occlusive o occlusive. Tuttavia, questo metodo ha anche alcu...

Lo studio dei meccanismi coinvolti nello sviluppo della trombosi e la valutazione dell&#39;efficacia di farmaci anti-trombotici richiede ben consolidata modelli animali sperimentali. Grandi modelli animali sono stati i primi ad essere usati in quanto forniscono grandi vasi più simile agli esseri umani dei roditori 1. Tuttavia, costo elevato, le strutture più grandi richieste e la difficoltà nel manipolare geneticamente sono i principali svantaggi del loro utilizzo e grandi animali ora sono solo gli studi preclinici in ritardo una volta test preliminari sui roditori hanno dato risultati conclusivi 2. Con la vasta disponibilità di transgenici e knockout ceppi e le loro piccole dimensioni che riduce al minimo la quantità di farmaci antitrombotici necessarie per il test in vivo, i topi sono utilizzati principalmente per la ricerca trombosi. Pertanto, diversi modelli di disturbi trombotici sono stati sviluppati in topi 3. Molti modelli trombosi stabiliti rompono gli intimuno strato della parete del vaso, seguita dall&#39;esposizione del sub matrice extracellulare endoteliale al flusso sanguigno indurre la formazione di coaguli di sangue 4. Il trombi può derivare dall&#39;esposizione di collagene, che provoca l&#39;attivazione delle piastrine e / o dall&#39;esposizione del fattore tissutale che attiva la cascata coagulativa 5. Diverse tecniche sono poi utilizzati per raggiungere il danno vascolare iniziale. Pierangeli et al. Sviluppato un modello rottura meccanica con un utensile microchirurgia sulla vena femorale 6. Kikushi et al. Descrissero un modello che consiste nella somministrazione di una foto composto reattivo (Rosa Bengala) che si accumula nel doppio strato lipidico delle cellule endoteliali seguita dall&#39;eccitazione specifica della parete del vaso di interesse con luce verde (540 nm) 7. La lesione può anche essere indotta da una breve ad alta intensità di illuminazione laser a impulsi 8. Un&#39;altra tecnica dapprima stabilito sulla carotide di ratticonsiste nella applicazione topica di cloruro ferrico (FeCl 3) 9. In questo caso, i risultati nave denudazione dai radicali liberi generati da FeCl 3 che provoca la perossidazione lipidica e la distruzione delle cellule endoteliali 10. L&#39;infortunio induce l&#39;espressione di diverse molecole di adesione scatenanti adesione piastrinica e l&#39;aggregazione, così come leucociti reclutamento. È stato dimostrato che, in particolare leucociti neutrofili, giocano un ruolo cruciale nella attivazione della cascata della coagulazione del sangue che porta alla trombosi 11. Questo metodo è adatto per riprodurre la cascata della coagulazione; gli investigatori devono tenere presente che, in questo modello di topo, la trombosi è tipicamente indotta in vasi sani, mentre la trombosi nell&#39;uomo si verifica principalmente nei es malato. vasi aterosclerotici. Poiché questo modello è molto semplice da implementare ed è anche efficace nei topi, è ora il modo più utilizzato trombosil per piccoli animali in vivo. Inoltre, questa tecnica offre la possibilità di indurre la formazione di trombi in una varietà di navi. Vasi di destinazione possono essere arterie o le vene di grande diametro (carotidea, femorale, vena cava) o di piccolo diametro (mesenterio, Cremaster) 12-14. Più di recente, è stato utilizzato anche in prossimale dell&#39;arteria cerebrale media di sviluppare un modello di ictus 15. La formazione trombosi può essere direttamente osservata tramite microscopia intravitale dopo marcatura fluorescente di piastrine e leucociti o monitorato misurando la diminuzione del flusso di sangue con una sonda di temperatura o una sonda Doppler 12,16,17. Diversi parametri come il tempo di occlusione, ora la formazione di trombi o dimensione del trombo possono quindi essere esaminati. Le differenze fisiologiche tra i vasi risultato indagati in significative variazioni nel trombi ottenuto. Pertanto, gli investigatori di solito scegliere il vaso target in base ai parametri che vogliono misuri e / o l&#39;impostazione vogliono studiare la malattia. In genere, il modello sul carotide è più rilevante per la ricerca su aterotrombosi relativa a infarto miocardico o ictus, mentre studi sulla vena cava sono più rilevanti per la ricerca sulla trombosi venosa profonda. L&#39;accessibilità dei vasi differenti determina anche il metodo utilizzato per misurare la crescita trombo. Per esempio, i vasi mesenterici sono facilmente accessibili, che questo modello adatto per l&#39;osservazione al microscopio intravitale e lo studio della dinamica di formazione di trombi. L&#39;arteria carotidea è meno accessibile ma più grande che consentano di flusso misurazioni sangue e fornire un modello eccellente per studiare la trombosi occlusiva. Il cloruro ferrico modello trombosi indotta ha fornito enormi progressi nella comprensione di questa patologia. E &#39;stato utilizzato in molti studi incentrati sul ruolo del fattore di von Willebrand nella formazione di trombosi 18,19. In combinazione con modi geneticatecniche ficazione, essa ha permesso l&#39;individuazione di molti geni specifici coinvolti in disordini trombotici. Lamrani et al. per esempio hanno mostrato che un knock-in del gene JAK2 V617F è associata con una formazione accelerazione di coagulo instabile 20. Zhang et al. Hanno studiato le implicazioni fisiologica del recettore P2Y12 piastrine e dimostrato che i topi transgenici specificamente questo recettore nelle piastrine solo, visualizzate una più rapida e stabile formazione di trombi nelle arterie mesenterica ferito con FeCl 3 21. Il ruolo cruciale di Tissue-tipo attivatore del plasminogeno (tPA) e urochinasi tipo plasminogeno (uPA) nel processo di degradazione della fibrina è stato studiato in questo metodo 22. Inoltre questo modello fornisce anche un modo semplice ed accurato di testare le capacità fibrinolitica di molti nuovi farmaci in vivo. Ad esempio, Wang et al. Hanno utilizzato questo modello per the validazione preclinica di un romanzo attivatore del plasminogeno ricombinante mirata contro piastrine attivate 23. Questo metodo ha consentito inoltre la convalida di proteine ​​terapeutiche isolate dal salivare di zecche, pipistrelli vampiri, e zanzare o dal veleno dei serpenti con specifico l&#39;identificazione del target 24-27. Questi esempi dimostrano la versatilità del modello di cloruro ferrico. In questo articolo, ci concentriamo su due metodi e studiamo cloruro ferrico trombosi indotta su due diversi tipo di nave; nave mesenterica e carotide.

<table><tbody><tr><td>Carta per cromatografia Whatman</td><td>GE Healthcare</td><td>3030917</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di ferro (III) 40% (p/v)</td><td>VWR</td><td>24212.298</td><td></td></tr><tr><td>Rodamina 6G</td><td>Sigma</td><td>R4127</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio invertito&nbsp;</td>Fotocamera digitale in bianco e nero <td>Olympus</td><td>IX81</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Olympus</td><td>XM10</td><td></td></tr><tr><td>Misuratore di portata Doppler</td><td>Transonic</td><td>TS420</td><td></td></tr><tr><td>Sonda di flusso nano-doppler</td><td>Transonic</td><td>0.5 PBS</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina</td><td>Hospira&nbsp;</td><td>0409-2051-05</td><td></td></tr><tr><td>Xilazina (Rampun)</td><td>Bayer</td><td>75313&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di Petri</td><td>Sarstedt</td><td>82.1472</td><td></td></tr><tr><td>Siringa da insulina (29 G)</td><td>BD Ultra-Fine</td><td>326103</td><td></td></tr><tr><td>Applicatori con punta in cotone</td><td>BSN medical</td><td>211827A</td><td></td></tr><tr><td>Suture dysilk Dynek Dynek Dysilk Dynek</td><td>Ltd</td><td>CS30100</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tampone fosfato di Dulbecco (PBS)</td><td>Gibco life technologies</td><td>21600-069</td><td></td></tr><tr><td>Termoforo</td><td>Kirchner</td><td>T60</td><td></td></tr></tbody></table>

cloruro ferrico-indotta trombosi modello murino sulla carotide e mesentere vessel

Ferric Chloride-induced Thrombosis Mouse Model on Carotid Artery and Mesentery Vessel

La trombosi grave e le sue conseguenze ischemiche come l'infarto del miocardio, l'embolia polmonare e l'ictus sono i principali problemi di salute in tutto il mondo. La lesione da cloruro ferrico è ormai una tecnica ben consolidata per indurre in modo rapido e preciso la formazione di trombi in vene esposte o arterie di piccolo e grande diametro. Questo modello ha svolto un ruolo chiave nello studio della fisiopatologia della trombosi, nella scoperta e validazione di nuovi farmaci antitrombotici e nella comprensione del meccanismo d'azione di questi nuovi agenti. Qui viene presentata l'implementazione di questa tecnica su un vaso mesenterico e un'arteria carotide nei topi. Il metodo descrive come marcare i leucociti e le piastrine circolanti con un colorante fluorescente e osservare, mediante microscopia intravitale sul mesentere esposto, il loro accumulo sulla parete del vaso lesionato che porta alla formazione di un trombo. Sull'arteria carotide, l'occlusione causata dalla formazione del coagulo viene misurata monitorando il flusso sanguigno con una sonda Doppler.

La fluorescenza intravitale osservazione al microscopio del mesentere rivelerà l&#39;accumulo di rodamina 6G etichettato piastrine e dei leucociti lungo la parete del vaso feriti da FeCl 3. La formazione progressiva di un trombo parziale è monitorato in un recipiente mesentere 200 micron (Figura 1). Un trombo appare lentamente ed è chiaramente identificabile dopo il primo minuto di esposizione a FeCl 3 (figura 1, t = 60 sec). 40 secondi dopo la rimozione della cart...

Il modello di trombosi indotta da FeCl3 nei topi è descritto qui. Viene presentato un metodo per monitorare la crescita dei trombi mediante osservazione al microscopio intravitale su un vaso mesenterico e mediante misurazione del flusso sanguigno nell'arteria carotide.

Cloruro ferrico-indotta Trombosi modello murino sulla carotide e Mesentere Vessel

Severe thrombosis and its ischemic consequences such as myocardial infarction, pulmonary embolism and stroke are major worldwide health issues. The ferric ...

L'obiettivo generale di questa procedura è monitorare la formazione di una trombosi indotta in un vaso esposto di un topo. Questo viene ottenuto esponendo innanzitutto il vaso di interesse. Successivamente, un piccolo pezzo di carta da filtro imbevuto di cloruro ferrico viene posizionato sul vaso per indurre il trombo nel vaso mesenterico.L'aggregazione delle cellule che formano il trombo viene monitorata mediante microscopia in provetta sull'arteria carotidea. I cambiamenti nel flusso sanguigno indotti dal trombo vengono misurati con un flussimetro a effetto Doppler. L'uso del cloruro per indurre una trombosi nell'arteria CED dei pesci rossi è stato inizialmente introdotto nel 1990 dal Professor Coz e colleghi.Da allora, è stato adattato ai topi ed è stato utilizzato per studiare molti vasi diversi. Questo metodo è ora il modello di trombosi più comunemente usato nel nostro campo di ricerca, e ha contribuito a rispondere a domande fondamentali come la parete del fattore di vulnerabilità e l'applicazione del recettore piastrinico P due Y 12 nella tromboformazione. Prima di iniziare la procedura, tagliare strisce di carta da filtro di uno per due millimetri e un piccolo pezzo bianco

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Riportiamo una procedura raffinata del cloruro ferrico (FeCl 3) modelli trombosi -indotta sulla carotide e dell'arteria mesenterica così come la vena, caratterizzato in modo efficiente usando la microscopia intravitale per monitorare il tempo di occlusiva la formazione di trombi.

Ferrico I modelli murini Trombosi indotta da cloruri

Qui, presentiamo le modifiche necessarie a un ben caratterizzato e comunemente usato piccolo indotta da cloruro ferrico (FeCl3) dell'arteria carotica ferita modello animale per l'uso in un modello di grande animale ferita vascolare. Il modello risultante può essere utilizzato per la valutazione pre-clinica prova degli interventi farmacologici e meccanici sia profilattici e trombolitici.

Trombosi dell'arteria carotica canini cloruro ferrico-indotta: Un grande modello animale di danno vascolare

Il presente protocollo descrive come utilizzare una lesione mediata da FeCl3 per indurre trombosi arteriosa e come raccogliere e preparare campioni di lesioni arteriose nelle varie fasi della trombosi per l'analisi al microscopio elettronico.

Trombosi arteriosa indotta da cloruro ferrico e raccolta di campioni per l'analisi al microscopio elettronico 3D

Questo descrive un intervento parziale legatura della carotide, che causa condizioni di flusso disturbato e lo sviluppo dell'aterosclerosi successivi (in due settimane) con intraplaque neo-vascolarizzazione (in quattro settimane) nel topo l'arteria carotide comune. Abbiamo anche descritto un nuovo metodo di isolamento di RNA dal dell'intima carotidea, fornendo RNA di elevata purezza endoteliali.

Un modello di Disturbed flusso indotta aterosclerosi carotidea in Arteria mouse da legatura parziale e un semplice metodo di isolamento dell&#39;RNA da Endotelio carotidea

L'intero modello murino stasi di trombosi della vena cava inferiore rendimenti quantificabile quantità di tessuto della parete venosa e trombosi. Si è dimostrato utile per valutare le interazioni tra la parete venosa e il trombo occlusivo e nel valutare la progressione da acuta a cronica.

Modello del mouse completa stasi della vena cava inferiore Trombosi

Dimostriamo nel video un metodo per produrre una occlusione dell'arteria cerebrale media in topi adulti utilizzando un monofilamento intraluminale. Mostriamo anche come valutare il grado di infarto cerebrale da 2,3,5-trifeniltetrazolio cloruro (TTC) colorazione.

Modello murino di Mezzo occlusione dell&#39;arteria cerebrale

Un modello di impianto dello stent nel topo carotidea è descritto. Rispetto ad altri metodi simili, questa procedura è molto rapida, semplice ed accessibile, che offre la possibilità di studiare in un modo conveniente la reazione parete vascolare a diversi stent medicati e dei meccanismi molecolari di restenosi.

Un modello murino di impianto di stent a livello dell&#39;arteria carotidea per lo Studio della restenosi

Noi descriviamo un metodo per creare un modello affidabile di ipertensione venosa cerebrale nel topo adulto. Questo modello è stato ampiamente descritto ed testati nel ratto. Questo nuovo omologo nei topi apre la possibilità di utilizzare animali geneticamente modificate e amplia così le applicazioni del modello.

Topo adulto venosa Ipertensione Modello: carotide comune di External Vena giugulare anastomosi.

Questo metodo è stato sviluppato con l'obiettivo di fornire una soluzione di droga costante attraverso l'arteria carotide, per valutare la farmacocinetica di nuovi farmaci in modelli murini.

Infusi carotide di farmacocinetica e di farmacodinamica Analisi dei taxani nei topi

Questo protocollo utilizza un catetere a palloncino per causare un danno endoluminale sull'arteria carotide di ratto e d'ora in poi suscitare iperplasia neointimale. Questo è un modello consolidato per lo studio dei meccanismi di rimodellamento vascolare in risposta al danno. È inoltre ampiamente utilizzato per determinare la validità dei potenziali approcci terapeutici.

Vascolare Balloon Lesioni e intraluminale Amministrazione in Rat carotide

Scopri il modello di trombosi indotta da cloruro ferrico su carotide e vaso mesenterico murino. Questo metodo utilizza microscopia intravivente e misurazione del flusso ematico per studiare la formazione del trombo in tempo reale.

Cloruro ferrico-indotta Trombosi modello murino sulla carotide e Mesentere Vessel

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