Immagini dal vivo del ependimale Cilia nei ventricoli laterali del cervello di topo

L'obiettivo generale di questa procedura è fornire un'osservazione ex vivo del battito degli appendici Motr CLIA situati all'interno dei ventricoli cerebrali del topo. Questo risultato si ottiene innanzitutto prelevando l'intero cervello e successivamente ottenendo sezioni sottili attraverso i ventricoli laterali. Successivamente, le fette vengono incubate in una piastra personalizzata con fondo in vetro contenente un mezzo ricco di glucosio, mantenuto alla temperatura corporea, per mantenere il tessuto vitale durante l'esperimento.

Infine, il battito delle ciglia viene registrato utilizzando un microscopio a contrasto di interferenza differenziale ad alta risoluzione. In ultima analisi, la struttura e la localizzazione delle proteine nelle ciglia possono essere visualizzate mediante imaging a immunofluorescenza. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto al nostro metodo esistente è che si tratta della prima tecnica in grado di consentire la classificazione delle cellule epidermiche in tre gruppi distinti in base alle loro specifiche frequenze e angoli di ripetizione ciliari.

È positivo. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia dell'idrocefalo. Poiché un'anomala funzione epidermica del CLIA porta all'accumulo di liquido cerebrospinale nel cervello.

Ventricoli. A dimostrare la procedura saranno la signora Zaha Alam e la signorina Hannah, studentesse molto brave del nostro laboratorio. Iniziare pulendo la testa di un topo adulto con etanolo al 70%. Poi, a partire dalla sommità della testa, utilizzare forbici e pinzette sterili per rimuovere la pelle ed esporre il cranio.

Successivamente, procedere al recupero del tessuto osseo pezzo per pezzo, partendo dal lato posteriore e spostandosi verso il lato anteriore. Per rimuovere il cranio, isolare l'intero cervello e collocarlo in una piastra di Petri da 100 millimetri contenente mezzo ad alto contenuto di glucosio a 37 gradi Celsius. Utilizzando una lama affilata, sezionare il cervello lungo il piano sagittale mediano per ottenere la prima sezione di 100-200 micron da ciascuna metà.

Quindi risciacquare le sezioni con PBS a 37 gradi Celsius e posizionare immediatamente il tessuto a 37 gradi Celsius. Per acquisire immagini delle sezioni, collocare le fette di cervello in piatti per colture con fondo in vetro da 30 millimetri contenenti un millilitro di mezzo con alto contenuto di glucosio e regolare l'ambiente della camera microscopica a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica utilizzando un obiettivo ad immersione in olio da 60x. Successivamente, mettere a fuoco le cellule con luce trasmessa DIC normale.

Quindi, seguendo la direzione del movimento della bolla di DMEM come guida per individuare la posizione dei clii mobili. Utilizzare il filtro DIC per selezionare un'area contenente cellule sane con clii mobili nel ventricolo laterale del cervello. Dopo aver identificato i clii, regolare la luce e il fuoco per ottenere un'immagine soddisfacente.

Successivamente, impostare i parametri di acquisizione in tempo reale nel software di imaging. Ad esempio, in questo caso, si acquisiscono immagini a 24 bit con il binning della fotocamera impostato su uno per uno, in combinazione con un obiettivo 60x e un tempo di esposizione compreso tra cinque e 10 millisecondi. Aprire il diaframma del microscopio al livello ottimale per un tempo di esposizione minimo e acquisire le immagini DIC.

Osservare le immagini in diretta trasmesse alla telecamera per un'acquisizione rapida e immediata senza ritardi. La velocità dei battiti cardiaci può quindi essere calcolata in base al requisito dei tempi minimi di esposizione necessari per ottenere un contrasto d'immagine sufficiente per registrare il segnale del calcio. Dopo aver sezionato il cervello, sciacquare brevemente il tessuto in PBS e incubare immediatamente le sezioni in 20 microgrammi per millilitro di lu O2 appena preparato in una piastra con fondo in vetro.

Dopo 30 minuti a 37 gradi Celsius, registrare l'oscillazione del calcio con una frequenza di acquisizione di cinque millisecondi per un minimo di un secondo. Prima a una lunghezza d'onda di eccitazione di 488 nanometri, poi a una lunghezza d'onda di emissione di 515 nanometri. Per visualizzare i marcatori cellulari di interesse mediante microscopia a immunofluorescenza, fissare i campioni in paraformaldeide al 4% e saccarosio al 2% in PBS per 10 minuti.

Lavare il tessuto tre volte in PBS per cinque minuti ogni lavaggio. Successivamente, incubare le sezioni cerebrali in Triton X 0,1% per cinque minuti. Dopo aver risciacquato i campioni come appena dimostrato, incubarli con anticorpo murino anti alfa tubulina acetilata.

Dopo un ulteriore lavaggio con PBS, incubare i campioni con IgG anti-US marcati con fluoresceina per un'ora a temperatura ambiente. Infine, controcolorare le sezioni con DPI per cinque minuti e acquisire immediatamente le immagini delle cellule con il tempo di esposizione minimo possibile. La presenza di un CLIA penale è confermata mediante un marcatore ciliare, l'alfa-tubulina acetilata, con controcolorazione con DPI. Per identificare i nuclei, l'analisi del flusso della motilità di un CLIA penale viene effettuata contando la frequenza di battito e il modello angolare delle cellule in movimento.

Il CLIA può quindi essere suddiviso in uno dei tre gruppi in base a questi dati. È importante notare che l'esposizione del CLIA all'etanolo 0,25% reprime significativamente la frequenza di battito del CLIA, indipendentemente dal loro tipo. La flessione ulteriore del CLIA induce un segnale intracellulare di calcio dipendente dai cigli, che consente la misurazione del segnale intracellulare di calcio all'interno dei ventricoli cerebrali. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in un'ora se eseguita correttamente.

Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di manipolare il tessuto cerebrale con delicatezza ed efficienza, al fine di non distruggere i ventricoli cerebrali dopo il loro sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo delle neuroscienze per esplorare la funzione di append CLIA e del tessuto cerebrale vivo nei topi.