Name: Immagini dal vivo del ependimale Cilia nei ventricoli laterali del cervello di topo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 58 s
Description: Scopri l'osservazione ex vivo delle ciglia ependimali battenti nei ventricoli laterali del cervello di topo. Questa tecnica di microscopia DIC ad alta risoluzione permette di classificare le cellule ependimali in tre gruppi distinti.

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Gli autori desiderano ringraziare Charisse Montgomery per il suo servizio di editing. Il lavoro di A. Alomran soddisfa parzialmente i requisiti per un master in Farmacologia.Questo lavoro è finanziato dal fondo di avvio intramurale dell'Università di Toledo per W.A.A e dalla sovvenzione NIH (DK080640) per S.M.N.

Le procedure per l&#39;uso degli animali sono stati approvati dalla cura e l&#39;uso degli animali Comitato Istituzionale (IACUC) della University of Toledo in conformità con le linee guida della cura e l&#39;uso degli animali Comitato Istituzionale presso il National Institutes of Health e della Guida per la cura e l&#39;uso di animali da laboratorio. 1. Estrazione del cervello, Sezioni e Preparazione del tessuto <ol><li> Sacrifica ceppo selvatico topo C57BL / 6 da profondamente eutanasia con CO 2 asfissia per 5 min. Assicurare la morte per dislocazione cervicale. </li><li> Pulire la testina del mouse con il 70% di etanolo. </li><li> Eseguire craniectomy con le forbici sterili e pinze tirando prima la pelle di dosso, a partire dalla parte superiore della testa per esporre il cranio. </li><li> Poi, quando il cranio è esposto, rimuovere il cranio mediante pelatura pezzo per pezzo di osso, partendo dal lato posteriore e lo spostamento verso il lato anteriore. Fare attenzione a non distruggere i ventricoli del cervello. </li><li>Raccogliere tutto il cervello. </li><li> Mettere il cervello in un piatto da 100 millimetri di Petri contenente DMEM / High-glucosio addizionato con siero fetale bovino 10% (FBS) e 1% di soluzione di penicillina / streptomicina contenente 10.000 unità / ml di penicillina e 10.000 ug / ml di streptomicina e pre-riscaldato a 37 ° C. </li><li> Tagliare il cervello sul piano sagittale mediana a mano con una lama affilata, e di ottenere la prima sezione 100-200 mm da ciascuna metà con un vibratome. </li><li> Sciacquare il tessuto cerebrale con una soluzione pre-riscaldato a 37 ° C tampone fosfato (PBS 1x). </li><li> Porre immediatamente la sezione cervello in DMEM / media-alta glucosio pre-riscaldato a 37 ° C. </li></ol> 2. Immagini dal vivo Configurazione e impostazione <ol><li> Posizionare le sezioni di tessuto cerebrale in 30 millimetri con fondo di vetro piatti della cultura contenenti 1 ml di DMEM / supporti ad alta glucosio. Regolare ambiente camera chiusa del microscopio a 37 ° C, 95% / 5% O 2 / CO 2 contenuto (Figura 1 </strong&gt;). </li><li> Utilizzando un obiettivo 60X immersione in olio obiettivo, raccogliere le cellule ependimali / immagini ciglia dapprima mettendo un goccia di olio sulla lente dell&#39;obiettivo 60X e concentrandosi sulle cellule con regolare DIC trasmessa luce. </li><li> Quindi, seguire la direzione del movimento bolla DMEM come guida per la posizione delle ciglia ependimali motilità come percosse ciliari creano una sorta di movimento bolla nella zona. Scegli una zona che contiene le cellule sane con cilia motile nel ventricolo laterale del cervello utilizzando il filtro DIC. Una volta che le ciglia ependimali si trovano, regolare la luce e messa a fuoco per ottenere un&#39;immagine soddisfacente. </li><li> Impostare i parametri di imaging dal vivo secondo uno scopo specifico utilizzando software di imaging Metamorph. Nel presente manifestazione, acquisire venti immagini a quattro bit con il set di binning fotocamera a 1 x 1 combinato con 60X obiettivo e 5-10 il tempo di esposizione msec. </li><li> Raccogliere le immagini DIC aprendo il diaframma microscopio ad un livello ottimale per avere un exp minimatempo osure. Osservare le immagini in diretta streaming per la fotocamera per fornire l&#39;acquisizione delle immagini veloce e immediato senza indugio. Calcolare la velocità delle ciglia battere sulla base dei requisiti dei tempi di esposizione minima per ottenere il contrasto dell&#39;immagine sufficiente. </li></ol> 3. Visualizzazione e analisi dei dati <ol><li> Calcolare il numero di percosse ciglia contando il numero di pestaggi in 1 min. A tale scopo, diminuendo la velocità del video e contando il numero di battute utilizzando un contatore di cellule o un attrezzo simile. </li><li> Per calcolare la frequenza di percosse, moltiplicare il tempo di esposizione in cui il video viene registrato dal numero di fotogrammi o time-lapse immagini acquisite per ottenere il numero di sec. (Esempio: tempo di esposizione 5 msec 200 fotogrammi = 1.000 msec o 1 sec). </li><li> Calcolare il numero di percosse in un secondo per ottenere la frequenza che viene espresso come numero di battere per un secondo. A tale scopo, dividendo il numero di pestaggi ciglia sopra una sola seconda volta traval (Esempio: cilia batte 50 volte in un video 200 fotogrammi registrati al tempo di esposizione di 5 msec cioè 5 msec x 200 frames = 1 sec; ora dividere 50 battiti da 1 sec = 50 Hz). </li><li> Calcolare l&#39;angolo ciliare pestaggio valutando il percorso intrapreso dalle ciglia ependimale durante entrambe le corse di potenza e di recupero. Eseguire questa secondo un metodo precedentemente descritto, con lievi modifiche 11. Il movimento preciso delle ciglia individuale si osserva durante il ciclo di battito completo. </li><li> Su un foglio di acetato posto sopra il monitor, disegnare una linea orizzontale lungo il bordo ependimali e una linea verticale attraverso la posizione mediana delle ciglia all&#39;inizio della corsa di lavoro. </li><li> Tracciare la posizione precisa del telaio cilium per fotogramma mentre si muove in avanti durante la corsa di alimentazione. In modo simile, tracciare il movimento delle ciglia durante la corsa di recupero. </li><li> Calcolare l&#39;angolo ciliare pestaggio dalla deviazione massima del cilium dalla linea mediana durante tegli corsa di potenza nonché la corsa di recupero. </li></ol> 4. Calcio di registrazione del segnale <ol><li> Dopo il taglio del cervello, sciacquare brevemente la fetta cervello con 1x PBS o Dulbecco PBS (pH 7,0). Preparare fresco Fluo-2 per evitare estinzione della fluorescenza e avere buon rapporto segnale-rumore. </li><li> Preparare 1 soluzione madre mM di Fluo-2 soluzione in dimetilsolfossido (DMSO), mescolare e agitare la soluzione per almeno 5 minuti per garantire che Fluo-2 è omogeneamente disciolto in DMSO. </li><li> Diluire la soluzione Fluo-2 stock in 500 ml di DMEM / High-glucosio addizionato con 2% B27 preriscaldata a 37 ° C ad una concentrazione finale di 20 mg / ml. NOTA: B-27 è un integratore senza siero ottimizzato contenenti vitamina A, cocktail antiossidante e insulina utilizzato per sostenere la redditività a breve oa lungo termine di ippocampo e altri neuroni del sistema nervoso centrale. </li><li> Incubare Immediatamente la fetta cervello con 20 mg / ml Fluo-2 per 30 minuti a 37 ° C in una piastra di fondo di vetro. </li><li> Per determinare la concentrazione di carico ottimale di calcio fluoroforo Fluo-2 e per evitare la tossicità delle cellule tintura di calcio, le cellule sfida con l&#39;ATP, e verificare la vitalità cellulare determinando il decorso e punta grandezza dei segnali di calcio in risposta a ATP. </li><li> Registra il video per l&#39;oscillazione di calcio a una velocità di acquisizione di 5 msec per un minimo di 1 secondo (200 fotogrammi al secondo), con eccitazione e di emissione lunghezze d&#39;onda di 488 nm e 515 nm, rispettivamente (Movie 2). </li><li> Per distinguere il segnale Fluo-2 di calcio da autofluorescenza o movimenti artefatti, accertarsi che le intensità emessi a 515 nm è monitorata separatamente. NOTA: Fluo-2 non è il fluoremetric calcio adatto per quantificare calcio intracellulare. Tuttavia, è un ottimo colorante calcio dinamica per rilevare i cambiamenti rapidi di calcio, come oscillazioni calcio. Per la quantificazione di calcio più accurata, è consigliabile Fura-2. Tuttavia, le variazioni dinamiche di Fura-2 sono limitati dal suo raziometricola natura del colorante. </li><li> Seguire le formule fornite dal produttore per calcolare l&#39;esatto valore di calcio intracellulare libero. Esempio [Ca 2+] = K d × (R - R min) / (R max - R). Dove K d è la costante di dissociazione del colorante dal calcio rilasciato, R è la fluorescenza misurata a 488, e R e R min max sono i rapporti di fluorescenza alla minima e massima concentrazione di ioni 12. </li></ol> 5. immunofluorescenza Microscopia <ol><li> Fissare le sezioni di cervello con fosfato soluzione salina tamponata contenente 4% paraformaldeide (PFA) e 2% di saccarosio per 10 min. In alternativa, fissare tutto il cervello con il 4% PFA e poi la sezione in 50 sezioni mm utilizzando un criostato. </li><li> Lavare il tessuto tre volte con PBS 1x per 5 minuti ogni volta. </li><li> Incubare la fetta cervello con un solutisu 0,1% Triton-X in 1x PBS per 5 minuti, quindi risciacquare tre volte con PBS 1x per 5 minuti ogni volta. </li><li> Incubare la fetta cervello con anticorpo di topo primaria, antiacetylated a-tubulina, utilizzato ad una diluizione di 1: 5000 in 10% FBS in 1x PBS per un&#39;ora a temperatura ambiente (RT) o per una notte a 4 ° C. </li><li> Lavare il tessuto tre volte con PBS 1x per 5 minuti ogni volta. </li><li> Incubare la fetta cervello anticorpo secondario, fluoresceina anti-topo IgG ad una diluizione di 1: 500 in 10% FBS in soluzione PBS 1x per 1 ora a RT. </li><li> Prima osservazione al microscopio a fluorescenza, controcolorazione la sezione con 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) per 5 minuti per macchiare il nucleo (o DNA) 13. Per ridurre al minimo photobleaching, immagine delle sezioni subito con il tempo di esposizione minima possibile. </li></ol>

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<li>Nonaka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Randomization+of+left-right+asymmetry+due+to+loss+of+nodal+cilia+generating+leftward+flow+of+extraembryonic+fluid+in+mice+lacking+kif3b+motor+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Randomization of left-right asymmetry due to loss of nodal cilia generating leftward flow of extraembryonic fluid in mice lacking kif3b motor protein.</a> Cell. 95 (6), 829-837 (1998).</li>
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<li>Nauli, S. M., Jin, X., AbouAlaiwi, W. A., El-Jouni, W., Su, X., Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-motile+primary+cilia+as+fluid+shear+stress+mechanosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">Non-motile primary cilia as fluid shear stress mechanosensors.</a> Methods in enzymology. 525, 1-20 (2013).</li>
<li>AbouAlaiwi, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survivin-induced+abnormal+ploidy+contributes+to+cystic+kidney+and+aneurysm+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Survivin-induced abnormal ploidy contributes to cystic kidney and aneurysm formation.</a> Circulation. 129 (6), 660-672 (2014).</li>
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<li>Jin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cilioplasm+is+a+cellular+compartment+for+calcium+signaling+in+response+to+mechanical+and+chemical+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Cilioplasm is a cellular compartment for calcium signaling in response to mechanical and chemical stimuli.</a> Cell Mol Life Sci. 71 (11), 2165-2178 (2014).</li>
<li>Praetorius, H. A., Spring, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bending+the+mdck+cell+primary+cilium+increases+intracellular+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+membrane+biology%22%5BJournal%5D)">Bending the mdck cell primary cilium increases intracellular calcium.</a> The Journal of membrane biology. 184 (1), 71-79 (2001).</li>
<li>Smith, C. M., Radhakrishnan, P., Sikand, K., O'Callaghan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+ethanol+and+acetaldehyde+on+brain+ependymal+and+respiratory+ciliary+beat+frequency%5BTitle%5D)+AND+%22Cilia%22%5BJournal%5D)">The effect of ethanol and acetaldehyde on brain ependymal and respiratory ciliary beat frequency.</a> Cilia. 2 (1), 5(2013).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Qui descritto è un protocollo per la preparazione di tessuto cerebrale topo sia per live-imaging e microscopia a fluorescenza che fornisce un rapido e sensibile osservazione delle ciglia ependimali nei ventricoli cerebrali. Questa tecnica non è limitato solo al ventricolo laterale; potrebbe essere utilizzata per osservare le ciglia in altre ventricoli cerebrali. Questa tecnica di imaging fornisce un flusso dal vivo che assomiglia al movimento del CSF battito ciliare in un ambiente ex vivo. Inoltre, essa consent...

Cilia sono organelli basato microtubuli sensoriali che si estendono dalla superficie cellulare per l&#39;ambiente extracellulare. A seconda della loro organizzazione dei microtubuli, ciglia possono essere classificati in due tipi - &quot;9 + 0&quot; o &quot;9 + 2&quot;. Funzionalmente, sulla base della loro motilità, questi possono essere classificati come motile o non mobili cilia 1. Cilia primaria è un termine comunemente usato per indicare &quot;9 + 0&quot; cilia non mobili. Questi hanno nove microtubuli doppietto parallele (indicati con &#39;9&#39;) e una coppia centrale di microtubuli è presenta all&#39;interno della guaina centrale (indicato con &#39;0&#39;). Tuttavia, alcuni &quot;9 + 0&quot; cilia, come cilia nodale, che regolano embrione lateralità sono mobili 2. D&#39;altra parte, cilia motile sono caratterizzati, oltre alle nove doppietti microtubuli parallele, da una coppia centrale supplementare di doppietti microtubuli e associata con proteine ​​motrici dynein per facilitare la motilità. Inoltre, alcuni &quot;9+2 &quot;Cilia come ciglia olfattive sono non mobili 3. Cellule ependimali rivestono i ventricoli cerebrali e il canale centrale del midollo spinale sono caratterizzati da cilia motile che spingono il liquido cerebrospinale (CSF) lungo i ventricoli cerebrali 4. L&#39;obiettivo generale di questo metodo è quello di facilitare lo studio della motilità dinamiche ciglia e anomalie strutturali. Salute e lo sviluppo del cervello dipendono fortemente efficiente circolazione del liquor nei ventricoli cerebrali. Ad esempio, il normale flusso di CSF e l&#39;equilibrio dei fluidi richiedono battito normale e funzionale delle ciglia ependimali 5,6, che a sua volta gioca un ruolo critico nella regolazione del movimento direzionale delle cellule neuronali e la migrazione delle cellule staminali 7. Come tale, anormale funzione cilia ependimali o la struttura può portare a flusso CSF ​​anormali, che è associato con idrocefalo, una condizione medica in cui vi è un accumulo anomalo di CSF nei ventricoli del bpioggia. Ciò può di conseguenza causare un aumento della pressione intracranica e progressivo ampliamento della testa, convulsioni, visione a tunnel, e disabilità mentale 8. I vantaggi di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti è che ha permesso per la prima volta a segnalare tre distinti tipi di cellule ependimali: I, II, e III, sulla base della loro frequenza battito ciliare unica e l&#39;angolo battendo. Queste cellule ependimali sono localizzati in alcune regioni nei ventricoli cerebrali. Inoltre, gli effetti dell&#39;età e agenti farmacologici come alcol e cilostazolo sulla modifica i tipi di cellule ependimali o loro localizzazioni possono essere dimostrati, che non era possibile prima questa classificazione delle cellule ependimali. Cilostazolo è un inibitore della fosfodiesterasi-3, un enzima che metabolizza cAMP di AMP e regola anche il calcio intracellulare 9. Usando l&#39;analisi di imaging di fluorescenza ad alta velocità permette l&#39;imaging e la quantificazione del intracellulare unicoproprietà di oscillazione di calcio delle cellule ependimali. Ad esempio, alcol e cilostazol alterato significativamente la frequenza ciliare pestaggio ependimale nonché le oscillazioni intracellulari di calcio proprietà, che a sua volta, potrebbe portare a un cambiamento del volume del liquido cerebrospinale di sostituzione da ciglia ependimali 10. In sintesi, questa tecnica è stato fondamentale per fornire la prima prova di tre diversi tipi di cellule ependimali con diverse proprietà di oscillazione calcio. Nella sezione seguente, una panoramica dettagliata passo-passo della procedura è prevista, prestando molta attenzione alla preparazione e la manipolazione dei tessuti.

<table><tbody><tr><td>DMEM/ALTO GLUCOSIO</td><td>Cellgro Mediatech Inc.</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>Clone</td><td>SH30088-03</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina/Streptomicina</td><td>Thermo Scientific</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30256-01</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide&nbsp;</td><td>Scienze della microscopia elettronica</td><td>15710-SP</td><td></td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-2395</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-2&nbsp;</td><td>TEF Labs</td><td>#0200</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD HardSet Terreno di montaggio con DAPI</td><td>Vector Labs</td><td>H-1500</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo a-tubulina acetilata</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7451&nbsp;</td><td>clone 6-11B1</td></tr><tr><td>FITC Anticorpo anti-topo</td><td>Vector Labs</td><td>FI-2000</td><td></td></tr><tr><td>Piastra per colture cellulari</td><td>VWR Vista Vision</td><td>30-2041</td><td></td></tr><tr><td>Vetrino coprioggetti (18 x 18)</td><td>VWR Vista Vision</td><td>16004.326</td><td></td></tr><tr><td>Vibratomo</td><td>Leica Biosystems</td><td>Leica VT1200S</td><td></td></tr><tr><td>criostato</td><td>Leica Biosystems Leica</td><td>CM1860</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio a fluorescenza invertita</td><td>Nikon&nbsp;</td><td>Olio Nikon TE2000</td><td>60X&nbsp;</td></tr><tr><td>Vetro di copertura del microscopio 24 x 60 mm2</td><td>VWR Vista Vision</td><td>16004-312</td><td></td></tr><tr><td>Mezzo di montaggio con DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1500</td><td></td></tr><tr><td>Cubo filtrante DAPI</td><td>Tecnologia</td><td></td><td></td> Chroma</tr></tbody></table>

immagini dal vivo del ependimale cilia nei ventricoli laterali del cervello di topo

Live Imaging of the Ependymal Cilia in the Lateral Ventricles of the Mouse Brain

Cellule ependimali Multiciliated linea i ventricoli del cervello adulto. Funzione o la struttura di ciglia ependimali anormale è associata con vari deficit neurologici. L&#39;attuale ex vivo imaging dal vivo di motilità tecnica cilia ependimale consente per uno studio dettagliato delle dinamiche ciliari dopo diversi passaggi. Questi passaggi sono: topi eutanasia con anidride carbonica secondo i protocolli della University of Institutional cura di Toledo degli animali e del Comitato uso (IACUC); craniectomy seguita dalla rimozione del cervello e sagittale dissezione del cervello con un vibratomo o lama affilata di ottenere sezioni molto sottili attraverso i ventricoli laterali del cervello, dove le ciglia ependimale possono essere visualizzati. L&#39;incubazione delle fette del cervello in una lastra di vetro-bottom personalizzata contenente Modified Eagle Medium (DMEM) / High-Glucosio Dulbecco a 37 ° C in presenza di 95% / 5% O 2 / CO miscela 2 è essenziale per mantenere vivo il tessuto durantel&#39;esperimento. Un video del pestaggio cilia viene registrato utilizzando un microscopio a contrasto di interferenza differenziale ad alta risoluzione. Il video viene poi analizzato fotogramma per fotogramma per calcolare la frequenza ciliare pestaggio. Questo permette la classificazione distinta delle cellule ependimali in tre categorie o tipi in base alla loro frequenza di battito ciliare e l&#39;angolo. Inoltre, questa tecnica permette l&#39;uso dell&#39;analisi fluorescenza ad alta velocità per caratterizzare le proprietà uniche intracellulari oscillazione calcio di cellule ependimali, nonché l&#39;effetto di agenti farmacologici sulle oscillazioni di calcio e la frequenza di battito ciliare. Inoltre, questa tecnica è adatto per immunofluorescenza di imaging per studi di struttura ciliare e localizzazione della proteina ciliare. Ciò è particolarmente importante in studi diagnosi della malattia e fenotipo. Il limite principale di questa tecnica è attribuita alla diminuzione in vivo movimento cilia motilità come il tessuto cerebrale inizia a morire.

Misurare funzione cilia ependimale nel cervello di topo vivo Il metodo descritto in questo protocollo viene utilizzato per monitorare la funzione cilia ependimali e struttura nel tessuto fresco sezionato dal cervello di topo e di monitorare e studiare cilia frequenza battito. La procedura seguita per realizzare un esperimento completo vengono rappresentati in un diagramma di flusso schematico (figura 1). Si consiglia vivamente che l&#39;esperimento è condotto entro un breve ...

Utilizzando ad alta risoluzione di contrasto di interferenza differenziale (DIC) microscopia, un ex vivo osservazione del battito di ciglia motile ependimale situato all&#39;interno il mouse ventricoli cerebrali è dimostrata dal live-imaging. La tecnica consente una registrazione della frequenza battito ciliare unico e battendo angolo come pure i loro calcio intracellulare proprietà oscillazione stimolazione.

Immagini dal vivo del ependimale Cilia nei ventricoli laterali del cervello di topo

Multiciliated ependymal cells line the ventricles in the adult brain. Abnormal function or structure of ependymal cilia is associated with various ...

L'obiettivo generale di questa procedura è fornire un'osservazione ex vivo del battito degli appendici Motr CLIA situati all'interno dei ventricoli cerebrali del topo. Questo risultato si ottiene innanzitutto prelevando l'intero cervello e successivamente ottenendo sezioni sottili attraverso i ventricoli laterali. Successivamente, le fette vengono incubate in una piastra personalizzata con fondo in vetro contenente un mezzo ricco di glucosio, mantenuto alla temperatura corporea, per mantenere il tessuto vitale durante l'esperimento.Infine, il battito delle ciglia viene registrato utilizzando un microscopio a contrasto di interferenza differenziale ad alta risoluzione. In ultima analisi, la struttura e la localizzazione delle proteine nelle ciglia possono essere visualizzate mediante imaging a immunofluorescenza. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto al nostro metodo esistente è che si tratta della prima tecnica in grado di consentire la classificazione delle cellule epidermiche in tre gruppi distinti in base alle loro specifiche frequenze e angoli di ripetizione ciliari.È positivo. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia dell'idrocefalo. Poiché un'a

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Ex vivo Imaging in diretta di divisioni cellulari singoli in mouse neuroepitelio

Fonte: Maruoka, H., et. al. Imaging simultaneo della dinamica microgliale e dell'attività neuronale in topi svegli. J. Vis. Exp. (2022) Questo video mostra una procedura di microscopia a due fotoni per l'imaging dell'attività neuronale e della dinamica microgliale in un topo sveglio durante la stimolazione visiva, evidenziando i transitori del calcio e le interazioni cellulari.

Imaging simultaneo della dinamica microgliale e dell'attività neuronale in un topo sveglio

Fonte: Bancroft, E. A., et al. Quantificare spontaneamente Ca2+ flussi e i loro effetti a valle nei neuroni primari del mesencefalo del topo. J. Vis. Exp. (2020) Questo video dimostra la visualizzazione in tempo reale dell'afflusso di calcio nei neuroni mesencefalici ventrali derivati da embrioni di topo. Utilizzando un vettore virale per esprimere un indicatore di calcio, i neuroni vengono ripresi al microscopio confocale per tracciare i cambiamenti nell'intensità della fluorescenza durante...

Visualizzazione dell'afflusso di calcio nei neuroni ventrali del mesencefalo derivati da embrioni di topo

Source: Wiegreffe, C., et. al.,  Time-lapse Imaging confocale di neuroni in migrazione in una coltura di fette organotipiche del cervello embrionale di topo utilizzando In Utero Elettroporazione. J. Vis. Exp. (2017) Questo video mostra la microscopia confocale time-lapse per osservare la migrazione radiale del neurone corticale dalla zona subventricolare alla placca corticale tramite scaffold gliali radiali in fette di cervello embrionale di topo trasdotte.

Imaging time-lapse della migrazione radiale dei neuroni corticali in fette di cervello embrionale di topo trasdotto

Fonte: Al Omran, A. J., et al. Imaging dal vivo delle ciglia ependimali nei ventricoli laterali del cervello del topo. J. Vis. Exp. (2015).  Questo video dimostra una tecnica di imaging dal vivo che utilizza la microscopia a contrasto interferenziale differenziale (DIC) per osservare il battito delle ciglia ependimali nelle sezioni del cervello sagittale del topo. Le ciglia ependimali spingono il liquido cerebrospinale (CSF) e la loro attività viene registrata in sezioni cerebrali mantenute in...

Imaging dal vivo dell'attività ciliare delle cellule ependimali in una sezione cerebrale di topo

Progenitrici neurali mitosi è un parametro critico della neurogenesi. Gran parte della nostra comprensione delle progenitrici neurali mitosi si basa sull'analisi del tessuto fisso. Vivo imaging in fettine cerebrali embrionali è una tecnica versatile per valutare mitosi con alta risoluzione temporale e spaziale in un ambiente controllato.

Immagini dal vivo della mitosi in via di sviluppo embrionali di topo Cortex

Utilizzando scansioni MRI (umane), software di imaging 3D e analisi immunoistologica, documentiamo i cambiamenti nei ventricoli laterali del cervello. La mappatura 3D longitudinale delle variazioni di volume del ventricolo laterale e la caratterizzazione dei cambiamenti cellulari periventricolari che si verificano nel cervello umano a causa dell'invecchiamento o della malattia vengono quindi modellati nei topi.

Modellazione 3D del laterale ventricoli e istologica Caratterizzazione del Tissue periventricolare di esseri umani e il mouse

Qui, forniamo un metodo affidabile e a basso costo per generare colture individulamente cervello organotipiche fetta da embrioni del mouse adatti per la microscopia confocale e tecniche di imaging live.

Ex Utero Elettroporazione e colture Organotypic fetta di cervelli embrionali del Mouse per vivere-Imaging di migrazione interneuroni GABAergici

Qui descriviamo una procedura per tessuto di compensazione, l'etichettatura fluorescente e su larga scala di formazione immagine del tessuto di cervello di topo che, quindi, permette la visualizzazione dell'organizzazione tridimensionale dei tipi delle cellule nella neocorteccia.

Formazione immagine tridimensionale su larga scala di organizzazione cellulare nella neocorteccia Mouse

Qui, descriviamo un protocollo che combina l'iniezione di virus adeno-associato con l'impianto di finestre craniche per l'imaging simultaneo delle dinamiche microgliali e dell'attività neuronale nei topi svegli.

Imaging simultaneo delle dinamiche microgliali e dell'attività neuronale in topi svegli

Durante lo sviluppo della corteccia cerebrale, i neuroni e le cellule gliali hanno origine nella zona ventricolare che riveste il ventricolo e migrano verso la superficie del cervello. Molti geni sono coinvolti in questo processo. Questo protocollo introduce la tecnica per l'imaging time-lapse di neuroni in migrazione e progenitori gliali.

Imaging time-lapse di neuroni in migrazione e progenitori gliali in fette di cervello embrionale di topo

Scopri l'osservazione ex vivo delle ciglia ependimali battenti nei ventricoli laterali del cervello di topo. Questa tecnica di microscopia DIC ad alta risoluzione permette di classificare le cellule ependimali in tre gruppi distinti.

Immagini dal vivo del ependimale Cilia nei ventricoli laterali del cervello di topo

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