Name: Fenomica fagi: Approcci fisiologici per caratterizzare Novel virali Proteine (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Scopri approcci fenotipici per caratterizzare geni fagi con funzioni sconosciute utilizzando E. coli e analisi metabolomica. Questo metodo collega genotipi a fenotipi nello studio delle interazioni batterio-fago.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ringraziamo Benjamin Knowles, Yan Wei Lim, Andreas Haas e i membri del consorzio Viral Dark Matter per il loro aiuto e il loro contributo costruttivo su questo manoscritto. Questa ricerca è finanziata dalla National Science Foundation (DEB-1046413) e fa parte del progetto Dimensions: Shedding Light on Viral Dark Matter.

<ol><li>Wommack, K. E., Colwell, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virioplankton%3A+Viruses+in+Aquatic+Ecosystems%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+Molecular+Biology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Virioplankton: Viruses in Aquatic Ecosystems.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 64 (1), 69-114 (2000).</li>
<li>Hendrix, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recoding+in+Bacteriophages%5BTitle%5D)+AND+%22Recoding%3A+Expansion+of+decoding+rules+enriches+gene+expression%22%5BJournal%5D)">Recoding in Bacteriophages.</a> Recoding: Expansion of decoding rules enriches gene expression. 24, 249-258 (2010).</li>
<li>Breitbart, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+analysis+of+uncultured+marine+viral+communities%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Genomic analysis of uncultured marine viral communities.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (22), 14250-14255 (2002).</li>
<li>Breitbart, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+and+population+structure+of+a+near-shore+marine-sediment+viral+community%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings.+Biological+sciences+%2F+The+Royal+Society%22%5BJournal%5D)">Diversity and population structure of a near-shore marine-sediment viral community.</a> Proceedings. Biological sciences / The Royal Society. 271 (1539), 565-574 (2004).</li>
<li>Dinsdale, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+metagenomic+profiling+of+nine+biomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional metagenomic profiling of nine biomes.</a> Nature. 452 (7187), 629-632 (2008).</li>
<li>Vega Thurber, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metagenomic+analysis+indicates+that+stressors+induce+production+of+herpes-like+viruses+in+the+coral+Porites+compressa%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Metagenomic analysis indicates that stressors induce production of herpes-like viruses in the coral Porites compressa.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (47), 18413-18418 (2008).</li>
<li>Pedulla, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origins+of+highly+mosaic+mycobacteriophage+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Origins of highly mosaic mycobacteriophage genomes.</a> Cell. 113 (2), 171-182 (2003).</li>
<li>Calendar, R., Abedon, S. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCalendar%2C+R+%22The+bacteriophages%22">The bacteriophages</a>. , Oxford Univeresity Press. (2006).</li>
<li>Breitbart, M., Miyake, J. H., Rohwer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+distribution+of+nearly+identical+phage-encoded+DNA+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+microbiology+letters%22%5BJournal%5D)">Global distribution of nearly identical phage-encoded DNA sequences.</a> FEMS microbiology letters. 236 (2), 249-256 (2004).</li>
<li>Klenk, H. -P., Palm, P., Zillig, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-Dependent+RNA+Polymerases+as+Phylogenetic+Marker+Molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Systematic+and+Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">DNA-Dependent RNA Polymerases as Phylogenetic Marker Molecules.</a> Systematic and Applied Microbiology. 16 (4), 638-647 (1993).</li>
<li>Breitbart, M., Thompson, L., Suttle, C., Sullivan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+Vast+Diversity+of+Marine+Viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Oceanography%22%5BJournal%5D)">Exploring the Vast Diversity of Marine Viruses.</a> Oceanography. 20 (2), 135-139 (2007).</li>
<li>Mann, N. H., Cook, A., Millard, A., Bailey, S., Clokie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marine+ecosystems%3A+bacterial+photosynthesis+genes+in+a+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Marine ecosystems: bacterial photosynthesis genes in a virus.</a> Nature. 424 (6950), 741(2003).</li>
<li>Mann, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genome+of+S-PM2%2C+a+%E2%80%9Cphotosynthetic%E2%80%9D+T4-type+bacteriophage+that+infects+marine+Synechococcus+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+bacteriology%22%5BJournal%5D)">The genome of S-PM2, a “photosynthetic” T4-type bacteriophage that infects marine Synechococcus strains.</a> Journal of bacteriology. 187 (9), 3188-3200 (2005).</li>
<li>Lindell, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+of+photosynthesis+genes+to+and+from+Prochlorococcus+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Transfer of photosynthesis genes to and from Prochlorococcus viruses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (30), 11013-11018 (2004).</li>
<li>Millard, A., Clokie, M. R. J., Shub, D. A., Mann, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+organization+of+the+psbAD+region+in+phages+infecting+marine+Synechococcus+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Genetic organization of the psbAD region in phages infecting marine Synechococcus strains.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (30), 11007-11012 (2004).</li>
<li>Sullivan, M. B., Coleman, M. L., Weigele, P., Rohwer, F., Chisholm, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+Prochlorococcus+cyanophage+genomes%3A+signature+features+and+ecological+interpretations%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+biology%22%5BJournal%5D)">Three Prochlorococcus cyanophage genomes: signature features and ecological interpretations.</a> PLoS biology. 3 (5), e144(2005).</li>
<li>Rohwer, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complete+genomic+sequence+of+the+marine+phage+Roseophage+SIOI+shares+homology+with+nonmarine+phages%5BTitle%5D)+AND+%22Limnology+and+Oceanography%22%5BJournal%5D)">The complete genomic sequence of the marine phage Roseophage SIOI shares homology with nonmarine phages.</a> Limnology and Oceanography. 45 (2), 408-418 (2000).</li>
<li>Miller, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+genome+sequence+of+the+broad-host-range+vibriophage+KVP40%3A+comparative+genomics+of+a+T4-related+bacteriophage%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+bacteriology%22%5BJournal%5D)">Complete genome sequence of the broad-host-range vibriophage KVP40: comparative genomics of a T4-related bacteriophage.</a> Journal of bacteriology. 185 (17), 5220-5233 (2003).</li>
<li>Thompson, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phage+auxiliary+metabolic+genes+and+the+redirection+of+cyanobacterial+host+carbon+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Phage auxiliary metabolic genes and the redirection of cyanobacterial host carbon metabolism.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (39), E757-E764 (2011).</li>
<li>Paterson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antagonistic+coevolution+accelerates+molecular+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Antagonistic coevolution accelerates molecular evolution.</a> Nature. 464 (7286), 275-278 (2010).</li>
<li>Seguritan, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+neural+networks+trained+to+detect+viral+and+phage+structural+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+computational+biology%22%5BJournal%5D)">Artificial neural networks trained to detect viral and phage structural proteins.</a> PLoS computational biology. 8 (8), e1002657(2012).</li>
<li>Neidhardt, F. C., Bloch, P. L., Smith, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+Medium+for+Enterobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Culture Medium for Enterobacteria.</a> Journal of Bacteriology. 119 (3), 736-747 (1974).</li>
<li>Khlebnikov, A., Datsenko, K. A., Skaug, T., Wanner, B. L., Keasling, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homogeneous+expression+of+the+P%28BAD%29+promoter+in+Escherichia+coli+by+constitutive+expression+of+the+low-affinity+high-capacity+AraE+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+%28Reading%2C+England%29%22%5BJournal%5D)">Homogeneous expression of the P(BAD) promoter in Escherichia coli by constitutive expression of the low-affinity high-capacity AraE transporter.</a> Microbiology (Reading, England). 147 (Pt 2), 3241-3247 (2001).</li>
<li>Cuevas, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elucidating+genomic+gaps+using+phenotypic+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Research%22%5BJournal%5D)">Elucidating genomic gaps using phenotypic profiles.</a> F1000Research. , (2014).</li>
<li>Zwietering, M. H., Jongenburger, I., Rombouts, F. M., van’t Riet, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+of+the+bacterial+growth+curve%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+environmental+microbiology%22%5BJournal%5D)">Modeling of the bacterial growth curve.</a> Applied and environmental microbiology. 56 (6), 1875-1881 (1990).</li>
<li>Venables, W. N., Smith, D. M. An introduction to R. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://cran.r-project.org/doc/manuals/R-intro.pdf">http://cran.r-project.org/doc/manuals/R-intro.pdf</a> (2014).</li>
<li>Schmieder, R., Lim, Y. W., Rohwer, F., Edwards, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TagCleaner%3A+Identification+and+removal+of+tag+sequences+from+genomic+and+metagenomic+datasets%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+bioinformatics%22%5BJournal%5D)">TagCleaner: Identification and removal of tag sequences from genomic and metagenomic datasets.</a> BMC bioinformatics. 11, 341(2010).</li>
<li>Schmieder, R., Edwards, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quality+control+and+preprocessing+of+metagenomic+datasets%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics+%28Oxford%2C+England%29%22%5BJournal%5D)">Quality control and preprocessing of metagenomic datasets.</a> Bioinformatics (Oxford, England). 27 (6), 863-864 (2011).</li>
<li>Schmieder, R., Edwards, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+identification+and+removal+of+sequence+contamination+from+genomic+and+metagenomic+datasets%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Fast identification and removal of sequence contamination from genomic and metagenomic datasets.</a> PloS One. 6 (3), e17288(2011).</li>
<li>Welch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+parameters+to+control+synthetic+gene+expression+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Design parameters to control synthetic gene expression in Escherichia coli.</a> PloS One. 4 (9), e7002(2009).</li>
<li>Fiehn, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quality+control+for+plant+metabolomics%3A+reporting+MSI-compliant+studies%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+journal%3A+for+cell+and+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Quality control for plant metabolomics: reporting MSI-compliant studies.</a> The Plant journal: for cell and molecular biology. 53 (4), 691-704 (2008).</li>
<li>Zeng, Q., Chisholm, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marine+viruses+exploit+their+host%E2%80%99s+two-component+regulatory+system+in+response+to+resource+limitation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+biology%3A+CB%22%5BJournal%5D)">Marine viruses exploit their host’s two-component regulatory system in response to resource limitation.</a> Current biology: CB. 22 (2), 124-128 (2012).</li>
<li>Shindy, W. W., Smith, O. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+plant+hormones+from+cotton+ovules%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+physiology%22%5BJournal%5D)">Identification of plant hormones from cotton ovules.</a> Plant physiology. 55 (3), 550-554 (1975).</li>
<li>Lee, H. I., Leon, J., Raskin, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosynthesis+and+metabolism+of+salicylic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Biosynthesis and metabolism of salicylic acid.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (10), 4076-4079 (1995).</li>
<li>Chappell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Biochemistry+and+Molecular+Biology+of+Isoprenoid+Metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">The Biochemistry and Molecular Biology of Isoprenoid Metabolism.</a> Plant Physiology. 107 (1), 1-6 (1995).</li>
<li>Kitagawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+set+of+ORF+clones+of+Escherichia+coli+ASKA+library+%28a+complete+set+of+E.+coli+K-12+ORF+archive%29%3A+unique+resources+for+biological+research%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+research%3A+an+international+journal+for+rapid+publication+of+reports+on+genes+and+genomes%22%5BJournal%5D)">Complete set of ORF clones of Escherichia coli ASKA library (a complete set of E. coli K-12 ORF archive): unique resources for biological research.</a> DNA research: an international journal for rapid publication of reports on genes and genomes. 12 (5), 291-299 (2005).</li>
<li>Baran, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+footprinting+of+mutant+libraries+to+map+metabolite+utilization+to+genotype%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">Metabolic footprinting of mutant libraries to map metabolite utilization to genotype.</a> ACS chemical biology. 8 (1), 189-199 (2013).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Qui vi presentiamo approcci Phenomic per la caratterizzazione funzionale dei geni dei fagi putativi. Le tecniche includono un saggio sviluppato capace di metabolismo anabolico monitoraggio host, le piastre Multi-fenotipo Assay (MAP), oltre al metodo stabilito di metabolomica, capace di effetti al metabolismo catabolico misurazione. Abbiamo fornito ulteriori strumenti per la gestione dei grandi insiemi di dati derivanti da queste tecnologie, consentendo l&#39;elaborazione ad alta produttività e analisi 24. Infine, attraverso il confronto di una proteina annotato fago capside, fagi tioredoxina, due geni del metabolismo dei fagi putativi, e la risposta media sperimentale ci proponiamo diverse strategie per interpretare entrambe le serie di dati e le classi di geni, con particolare attenzione alla identificazione delle tendenze fenotipici e l&#39;identificazione dei valori anomali. Come detto, entrambi gli approcci quantitativamente misurano solo la metà del metabolismo dell&#39;ospite. Per interpretare la relativa funzione di una qualsiasi dellenuove proteine ​​in esame, i dati di entrambi i metodi è tenuto a fornire la prova della funzione. Anche se questo non è un punto focale della nostra manoscritto corrente, uscite dati di ogni metodo Phenomic è messo attraverso analisi combinatorie che si concentrano su tecniche di clustering come la foresta casuale e analisi delle componenti principali. Inoltre, le ipotesi emerse dall&#39;analisi combinata devono essere convalidati da metodologie genetiche tradizionali. Infine, i metodi presentati sono fortemente influenzate dalla fisiologia batterica e quindi seguire le stesse norme. Nell&#39;avviare entrambi i metodi, le considerazioni devono essere fatte per garantire indipendenti, gruppi clonali sono sperimentato; è impedito contaminazione; una sola variabile è in fase di sperimentazione; e controlli adeguati sono corse contemporaneamente. La mancata per tenere conto di questi punti si tradurrà in risultati non chiari, simile a qualsiasi dosaggio fisiologico. Multi-fenotipo Piastre Assay(MAP) Lo sviluppo di MAP fornisce un elevato throughput e dosaggio adattabile rispetto alle tecnologie attualmente disponibili (Figura 5A e Tabelle 1,2). Il test utilizza forniture, attrezzature e le tecniche fondamentali disponibili in tutti i laboratori di microbiologia. L&#39;incorporazione di una pipeline di calcolo, PMAnalyzer 24, per la successiva elaborazione e analisi dei dati assicura una rapida interpretazione dei dati. Inoltre, entrambi gli aspetti sperimentali e analitiche del metodo possono essere facilmente regolati o sintonizzati per scopi personalizzati. Ad esempio, se una gran parte dei dati non riesce a passare filtraggio descritto nella sezione 4, si può vagliare manualmente attraverso le curve di crescita per identificare problemi. Se il problema è legato ai parametri di filtro stringenti, adeguamenti lo script può essere fatto. In alternativa, se i problemi sono associati con il processo sperimentale (cioè, condensazione prolungata; impropria trasferimento di cel battericals, ecc) quindi replicati supplementari possono essere facilmente ripetuti. Come descritto in Cuevas et al. 24, il PMAnalyzer è un unico programma bash scritto come uno script wrapper che esegue l&#39;analisi e analisi script come una coesa, conduttura automatizzata. Tutti gli script sono liberamente accessibili da un repository Git a 25, prendendo il valore mediano per ogni punto di tempo attraverso i dati triplice copia, e successivamente parametrizza la curva logistica per ottenere il tempo di ritardo, il tasso di crescita massima, asintoto, e un termine romanzo, Livello Crescita. Il valore mediano è stato scelto il media nel nostro studio per ridurre l&#39;effetto di grandi valori anomali, tuttavia, lo script può essere facilmente adattato per calcolare la media dei dati replicati. Grazie alla ridotta variazione (SE) visto attraverso dati replicati (Figura 2A) abbiamo mantenuto l&#39;uso della mediana nel PMAnalyzer per montare una curva logistica. Inoltre, il limite per la crescita in questo studio (GL ≥ 0,4) era determined confrontando come i dati separati attraverso livello di crescita e tasso di crescita massimo (Figura 1A, B). A seconda del modello di sistema strumenti e ha usato questo termine può variare, richiedendo ridefinizione di questo valore di soglia. Uno dei principali vantaggi della nostra analisi è la possibilità di confrontare fenotipi utilizzando un unico parametro che caratterizza la crescita microbica complessiva, che definiamo come livello di crescita (GL). GL è una media armonica, e mitiga quindi gli effetti di grandi valori anomali nei dati. L&#39;utilizzo di un media armonica con i valori logistici-misura spostati per fornire una sintesi di crescita è arrivato a attraverso tentativi ed errori. Altri metodi hanno cercato di differenziare la crescita incluso: tempo impiegato per raggiungere i parametri specifici della curva (la metà μ max, μ max, e la capacità di carico), il coefficiente di determinazione (R 2), e combinazioni di R 2 moltiplicato per specifici parametri della curva. Utilizzando un media armonica con spostatavalori logistico-fit per il GL fornito la più grande gamma nella valutazione della crescita, quindi è diventato il metodo di scelta. Una considerazione da notare è che i modelli curva di crescita dinamici hanno il potenziale di perdersi quando si utilizza un singolo parametro o di un modello adattato. Per esempio, i singoli parametri della curva della curva logistica e GL sono incapaci di rappresentare crescita bifasico. In un unico ambiente di carbonio, questo effetto sulla crescita implica mediazione della proteina virale su entrambi conversione del substrato o cambiamento di utilizzazione del substrato. Ulteriori effetti potenzialmente persi quando non considerando parametri di crescita più comprendono: ritardo prolungato, proponendo un aumento del carico di macchinari o prodotti virale; rapida accelerazione fase esponenziale, suggerendo proteine ​​virali accoppiati ad ospitare percorsi di produzione di energia; livelli o più alti di formazione della biomassa, che implica il supporto virale in assorbimento dei nutrienti ospite e anabolismo (dati non riportati). Così, tracciare curve di crescita nascenti ( <strong&gt; Figura 2A, B) fornisce informazioni per quanto riguarda le tendenze nel corso del tempo, mentre la GL tiene conto delle principali variabili del modello logistico, fornendo un unico numero quantitativa per rappresentare il successo globale di un clone. Se si considerano le diverse risposte fornite da geni strutturali e metabolici nelle mappe, si osserva che le diverse classi di substrato in questione forniscono la prova più funzione della proteina. Per esempio, le proteine ​​metaboliche sono spesso associati con l&#39;acquisizione di nutrienti limitanti, che sono non specifico per ospitare centrale metabolismo 16,32. MAP preliminari esperimenti rivelano che i cloni che ospitano putativi geni metabolici dei fagi hanno una maggiore fase di latenza quando coltivate su fonti di carbonio metabolismo centrali (Figura 2A). Al contrario, i cloni che portano geni strutturali putativi, che richiedono grandi proporzioni, di piscine energia ospite e dNTP, provocano una risposta falsi positivi sulla crescita per centosubstrati ral e aminoacidi carbonio metabolismo. Ciò è probabilmente dovuto all&#39;accumulo di proteine ​​insolubili conseguente filamentazione ospitante e / o corpi inclusi, come osservato mediante microscopia (Figura 2A e dati non mostrati). Mentre ulteriori analisi è necessaria per convalidare questi risultati preliminari, le mappe sono in grado di recuperare le risposte fenotipiche che correlano alle ipotizzato funzioni specifiche classi di geni fagi. Oltre alla spiegazione delle proteine ​​virali sconosciuti, le mappe sono un romanzo risorsa per indagare la diversità funzionale e metabolico di un individuo batterio o una comunità di batteri. I componenti del MAP sono progettati per una facile modifica per sostenere la crescita di una gamma di batteri; compresi marino, auxotrophic e microbi anaerobici. Per facilitare questi sforzi il basale e pre-sviluppo dei media definito richiedono ulteriori o regolate specie chimiche prima di un genere di batteri diverso può essere sostenuto nelle mappe.Una nota in questo uso delle mappe è quello di mantenere i media definiti, che vieta l&#39;uso di ingredienti come triptone, estratto di lievito e peptone. Metabolomica Il campo della metabolomica dipende database metaboliti, che comprendono metaboliti isolati identificati mediante spettrometria di massa. La struttura di base scelto qui ha uno dei più grandi database metabolomica. È interessante notare che più della metà dei metaboliti derivanti dalle nostre sperimentazioni erano identificabili (~ 65%), mentre gli altri non erano mai stati registrati nel nostro ospite, Escherichia coli (esempi includono: Indole 3 acido acetico 33, acido salicilico 34, e l&#39;acido dihydroabietic 35). Questo fatto potrebbe essere attribuita a una forte inclinazione del database verso metaboliti di piante, o le proteine ​​specifiche in esame. Indipendentemente, il risultato è un numero limitato di metaboliti noti disponibili per la rappresentazione e l&#39;analisi dei dati. Nella future, diversi metodi di metabolomica con varie banche dati consentirebbe una maggiore copertura metabolita. Attualmente, sia conosciuto e metaboliti sconosciuti vengono utilizzati quando comparare e confrontare le nostre proteine ​​virali romanzo. Usando questo approccio, ipotizziamo che i cloni che ospitano le proteine ​​funzionalmente simili condivideranno una maggiore somiglianza nel loro profilo metabolomica completo. Analisi metabolomica preliminari hanno rivelato che mentre geni strutturali e metaboliche non si separano chiaramente uno dall&#39;altro, quei geni esibendo effetti simili sul host quando overexpressed non correlare (Figura 6). Ad esempio, i Capside cluster di geni annotati da vicino con i geni metabolici putativi evidenziati in questo studio, EDT2440 e EDT2441. Le indagini che utilizzano una topologia transmembrana e peptide segnale programma predittore a disposizione del pubblico hanno mostrato evidenza che entrambi i geni metabolici putativi porto un singolo dominio transmembrana. Interessante 5 su the 9 cloni del primo gruppo di cluster (più a sinistra parte del dendrogramma) hanno previsto domini transmembrana che utilizzano lo stesso programma topologia. Sono necessari ulteriori studi, tuttavia, è probabile che i metaboliti presenti durante la sovraespressione di questi cloni sono associati a risposta allo stress cellulare risultante dalla membrana o fardelli strutturali. Queste prove sostengono che mentre i dati metabolomics possiede una maggiore quantità di rumore, il metodo è in grado di segnali che differenziano effetti generali di geni, sia all&#39;interno e attraverso una classe gene evidenziando. Per determinare se il metodo è in grado di estrarre le informazioni specifiche della funzione del gene, i metaboliti sono stati raggruppati in specifiche vie metaboliche. L&#39;essere ipotesi, se un clone colpisce metaboliti specifici di un unico percorso, allora il gene overexpressed è attivo in quel percorso. Prima della costituzione della nostra pipeline di garanzia della qualità metabolomica, dati preliminari hanno rivelato che più did metaboliti sottorappresentati erano tipicamente &quot;sconosciuto&quot;, che fornisce poche informazioni sui percorsi a cui sono associati (dati non riportati). Dati metabolomica pre-elaborati, tuttavia, rivela che la maggior parte dei profili dei metaboliti sono simili e solo un numero selezionato di sconosciute e conosciute abbondanze metaboliti variano tra i cloni, per esempio putrescina e uracile (Figura 6). Per offrire una maggiore risoluzione degli sforzi di funzione della proteina sono stati fatti per confrontare sperimentalmente i geni dei fagi nuovi contro geni fago noti, che possono essere utilizzati per riempire i &quot;buchi&quot; del metabolita basate caratterizzazione funzionale. Usando questa tecnica, la funzione assegnata di geni virali conosciuti fornisce un riferimento per la funzione dei geni ignoti. Tuttavia, il fattore limitante di analisi metabolomica è la dimensione e la rilevanza del database. Per correggere queste limitazioni, i database metabolomica facilmente riconoscibili per questa ricerca da sviluppare; comecome un database di metaboliti e loro abbondanze specifico alla raccolta ASKA di E. cloni coli in cui un singolo ORF è sovraespresso 36. Le prove per la necessità di tali banche dati è stato fornito nel 2013 quando i ricercatori del Berkeley National Laboratory Lawerence compilato il primo database completo di metaboliti specifici per intere biblioteche mutanti di batteri modello 37. Questa ricerca ha fornito romanzo spaccato geni necessari per l&#39;utilizzo di specifici metaboliti, rivelando la chiara connessione tra fenotipo e genotipo. Quando si considera metabolomica come strumento, è importante definire il regime di trasformazione seguita al core facility. Un artefatto della maggior parte delle procedure sperimentali è la varianza giorno per giorno associati con gli strumenti di utilizzo. Fino ad oggi tutte le analisi GC-MS implementa l&#39;uso di standard interni che sono inclusi in ogni seduta analitica; tuttavia, l&#39;aggiunta di progetti specifici campioni interni &lt;/ Em&gt; corse ogni giorno di sperimentazione rimuove varianza aggiuntivo. Queste considerazioni devono essere indirizzate presto per evitare problemi di normalizzazione e pregiudizi. Un&#39;altra soluzione è di elaborare tutti i campioni in una struttura nucleo sulla stessa macchina e come singolo lotto, un&#39;opzione disponibile presso qualsiasi struttura di base. I vari strumenti sia introdotto e ri-esplorati in questo manoscritto fornire nuovi mezzi per lo screening e caratterizzare geni fagi funzionalmente sconosciuti. La semplicità e adattabilità delle tecniche sperimentali con l&#39;uso Streamline di condotte computazionali assicura questi metodi sono applicabili ad una vasta gamma di sforzi e campi di ricerca. Il nostro obiettivo è che gli approcci Phenomic qui presentati saranno di aiuto ulteriori indagini di proteine ​​fagi romanzo, oltre a sistemi che sono ugualmente funzionalmente indefinito.

I virus che infettano i batteri (aka batteriofago o fago) sono stimate a esistere da più di 10 31 particelle simili al virus (VLP) a livello globale e più numerosi di tutti gli altri organismi in un ambiente 1,2. Il primo studio metagenomica indagando le comunità virali associati agli ambienti marini incentrata sulla quantificazione della diversità visto all&#39;interno della frazione virale 3. Inoltre, Breitbart e colleghi hanno scoperto che oltre il 65% delle sequenze virali di comunità condivisa omologia di eventuali sequenze disponibili nelle banche dati pubbliche. Studi successivi hanno trovato prove metagenomiche simile: metagenomi da sedimenti marini a San Diego, California contengono il 75% sconosciuti sequenze virali 4; metagenomi dai laghi ipersalini del Salton Sea contengono il 98% sconosciuti sequenze virali 5; e metagenomi corallo associata contengono 95-98% sequenze virali sconosciuti 6. Questo accumulo di informazioni non annotate ha portatomateriale genetico Fago essere &quot;la materia oscura dell&#39;universo biologico&quot; 7. Caratterizzazione genomica del fago si basa sull&#39;identificazione di similarità di sequenza attraverso il confronto contro banche dati esistenti degli acidi nucleici e proteine. Poiché le informazioni genetiche fago codifica è prevalentemente ignota, metodi basati omologia-sono inefficaci. All&#39;interno del loro genoma, fagi tipicamente codificano tre principali tipi di geni: trascrizione e replicazione dei geni, i geni del metabolismo, e geni strutturali. I geni di trascrizione e replicazione (classe I / II geni 8) includono polimerasi, primases, endo / eso-nucleasi e chinasi. Questi geni sono altamente conservati per la loro importanza in infezione fagi, trascrivendo e replicare materiale genetico fago. Polimerasi dei fagi sono facilmente identificabili con metodi sequenza omologia tradizionali a causa della loro conservazione globale 9 e hanno dimostrato di servire come efficace marcatori filogenetici 10.Al contrario, fago metabolico e geni strutturali (classe II / III geni 8) sono sempre più divergenti e spesso annotato come geni ipotetiche. Fagi geni metabolici influenzano la capacità metabolica del paese ospitante e non sono necessariamente necessari per la replicazione virale. Questi geni, spesso denominate geni metabolici come ausiliari 11 (AMG), sembrano modulare il metabolismo di accoglienza e consentire la progressione ottimale di infezione e il successo del virione di maturazione. AMG sono stati associati con l&#39;utilizzo e la diffusione delle sostanze nutritive che limitano o in percorsi di produzione di energia. Alcuni esempi includono geni fotosistema presenti nei genomi di varie cyanophage 12-16, geni connesse e regolati da metabolismo del fosfato 17,18, e l&#39;utilizzo della via dei pentoso fosfati per fago dNTP biosintesi 18,19. In confronto, i geni strutturali sono tra la metà e la fine degli anni geni prodotte durante l&#39;infezione e variano tra i diversi fago-hoSistemi di st. La produzione delle proteine ​​strutturali sono subordinati alla disponibilità di dNTP virale, e piscine energia per la loro trascrizione, traduzione e assemblaggio 8. Le proteine ​​del capside e fibra di coda strutturali sono considerati come il più divergente di tutti i geni codificanti proteine ​​virali e sono necessari per la produzione di virion successo. La loro divergenza è tipicamente attribuita al ruolo attivo che ricoprono nella definizione dei virus-ospite coevoluzione 20. Proteine ​​divergenti, indipendentemente dalla classe gene, vengono facilmente trascurati quando utilizzando tecniche di omologia e allineamento di sequenze tradizionali. Uno sforzo per correggere le limitazioni osservati con sequenza comparazioni severe ha comportato strumenti bioinformatici capaci di utilizzare caratteristiche di sequenza per determinare associazione, come le reti neurali artificiali 21. Reti neurali artificiali (ANN) consentono la previsione di geni strutturali e metabolici, tuttavia, richiedono validazione sperimentale a valle di caratterizzare direttamentela funzione del gene. L&#39;obiettivo di questo manoscritto è quello di fornire i protocolli Phenomic in grado di monitorare sia il metabolismo catabolico e anabolico di un batterio ospite durante l&#39;espressione di un nuovo gene fago, funzionalmente previsto attraverso RNA. Il campo di fenomica, biologia associata a fenotipi cellulari, è ben consolidata in biologia dei sistemi per aiutare nelle indagini di proteine ​​con funzione sconosciuta o pleiotropico. Strumenti Phenomic vengono utilizzati per collegare le informazioni fenotipiche all&#39;informazione genotipica. Ipotizziamo per i geni dei fagi putativi che la loro funzione (s) può essere determinato attraverso l&#39;osservazione di accoglienza effetti fisiologici durante l&#39;espressione del gene fago. Per studiare questa ipotesi, sono stati scelti due metodi quantitativi. Piastre Multi-fenotipo Assay (MAP) sono stati usati per monitorare l&#39;utilizzo del substrato di accoglienza e la conseguente formazione di biomassa, mentre la metabolomica misurate diversità metabolita ospite e relativa abbondanza durante la crescita in ambienti specificicondizioni mentali. Proteine ​​strutturali e metaboliche putativi sono stati overexpressed in Escherichia coli e risultati rappresentativi di entrambi gli esperimenti vengono confrontati. Numerose tecniche visive e condotte di elaborazione high throughput vengono presentati per facilitare la replicazione sperimentale. Infine, la riproducibilità e la precisione dei metodi presentati sono discussi nel contesto degli effetti fisiologici attesi per una proteina capside annotato e fago proteine ​​metabolica, tioredossina, più due AMGs putativi.

<table><tbody><tr><td>0,22 &micro; m Filtro Sterivex</td><td>Fisher Scientific</td><td>SVGP01050</td><td>Millipore</td></tr><tr><td>0,22 &micro; m Filtri Millex</td><td>Fisher Scientific</td><td>SLGV033RS</td><td>Millipore</td></tr><tr><td>0.22 &micro; m Filtro SteriCap</td><td>Fisher Scientific</td><td>SCGPS02RE</td><td>Millipore</td></tr><tr><td>0,22 & micro; m Filtri a membrana Omnipore</td><td>Millipore</td><td>JHWP02500</td><td>Millipore</td></tr><tr><td>Piastre per microtitolazione a 96 pozzetti</td><td>VWR</td><td>82050-764</td><td>Standard F-Bottom 96 pozzetti Micropiastre</td></tr><tr><td>2 ml Piastra a 96 pozzetti</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pellicola adesiva per piastra di tenuta</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z369667</td><td></td></tr><tr><td>2 L Flaconi quadrati Nalgene</td><td>Cole Parmer</td><td>T-06040-70</td><td></td></tr><tr><td>125 ml Bottiglie quadrate Nalgene</td><td>Cole Parmer</td><td>T-06040-50</td><td></td></tr><tr><td>1/4 in. Dado di bloccaggio per montaggio a pannello, nylon nero</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-45509-04</td><td></td></tr><tr><td>Filettatura Luer femmina per montaggio a pannello per barbiglio serie 200, 1/16 poll.</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-45500-30</td><td></td></tr><tr><td>Femmina Luer filettatura tipo montaggio a pannello su aletta serie 200, 1/8 in.</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-45500-34</td><td></td></tr><tr><td>Maschio Luer anello di bloccaggio integrato a barbiglio serie 500, 1/16 in. Tubo ID</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-45505-31</td><td></td></tr><tr><td>Luer maschio con anello di bloccaggio x accoppiatore Luer femmina</td><td>Cole Parmer</td><td>T-45508-80</td><td></td></tr><tr><td>Raccordi da paratia spinati, 1/4 in. OD</td><td>Fisher Scientific</td><td>6149-0002</td><td></td></tr><tr><td>Tubo Sanipure, 1/16 poll. ID x 1/8 poll. OD</td><td>SaniPure</td><td>AR400002</td><td></td></tr><tr><td>Sanipure tubo, 1/4 poll. OD x 1/8 poll. ID</td><td>SaniPure</td><td>AR400007</td><td></td></tr><tr><td>Mini pompa a portata variabile (pompa peristaltica)</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-876-1</td><td></td></tr><tr><td>Agitatore magnetico</td><td>Velp Scientifica</td><td>F203A0160</td><td></td></tr><tr><td>Pinze</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-512-141</td><td>Millipore* Pinza per filtri</td></tr><tr><td>Spettrofotometro multipiastra Lettore di piastre</td><td>Molecular Devices Analyst GT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Collettore di filtri</td><td>Fisher Scientific</td><td>XX10 025 02</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Software:</td></tr><tr><td>Python versione 2.7.5</td><td></td><td></td><td><a href="http://www.python.org/" target="_blank">http://www.python.org/</a></td></tr><tr><td>PyLab module</td><td></td><td></td><td><a href="http://wiki.scipy.org/PyLab" target="_blank">http://wiki.scipy.org/PyLab</a></td></tr><tr><td>R versione 3.0.1</td><td></td><td></td><td><a href="http://www.r-project.org/" target="_blank">http://www.r-project.org/</a></td></tr><tr><td>reshape2 library</td><td></td><td></td><td><a href="http://had.co.nz/reshape" target="_blank">http://had.co.nz/reshape</a></td></tr><tr><td>ggplot2 library</td><td></td><td></td><td><a href="http://ggplot2.org/" target="_blank">http://ggplot2.org/</a></td></tr><tr><td>Gene Composer</td><td>PSI Tech Portal</td><td></td><td><a href="http://www.genecomposer.net" target="_blank">http://www.genecomposer.net</a></td></tr><tr><td colspan="4">Services:</td></tr><tr><td>West Coast Metabolomics Center</td><td>UC Davis</td><td></td><td><a href="http://metabolomics.ucdavis.edu/" target="_blank">http://metabolomics.ucdavis.edu</a></td></tr><tr><td>DNA 2.0</td><td></td><td></td><td><a href="https://www.dna20.com" target="_blank">https://www.dna20.com</a></td></tr></tbody></table>

fenomica fagi: approcci fisiologici per caratterizzare novel virali proteine

Phage Phenomics: Physiological Approaches to Characterize Novel Viral Proteins

Le ricerche in corso in interazioni fago-ospite dipendono estrapolazione conoscenze da (meta) genomi. È interessante notare che, il 60 - 95% di tutte le sequenze dei fagi condividere alcuna omologia con le proteine ​​annotati attuali. Di conseguenza, gran parte dei geni fago annotati come ipotetico. Questa realtà incide pesantemente l&#39;annotazione di entrambi i geni metabolici strutturali e ausiliari. Qui vi presentiamo metodi Phenomic progettati per catturare la risposta fisiologica (s) di un host selezionato durante espressione di uno di questi geni fago sconosciuti. Multi-fenotipo del saggio Piastre (MAP) vengono utilizzati per monitorare la diversità di utilizzazione del substrato di accoglienza e successiva formazione della biomassa, mentre la metabolomica fornisce un&#39;analisi bi-prodotto attraverso il monitoraggio del metabolita abbondanza e la diversità. Entrambi gli strumenti sono utilizzati simultaneamente per fornire un profilo fenotipica associata con l&#39;espressione di un singolo fago putative open reading frame (ORF). Risultati rappresentativi per entrambi i metodi sono confrontati, highlighting le differenze fenotipiche profilo di un host che trasportano sia putativi geni fago strutturali o metaboliche. Inoltre, le tecniche di visualizzazione e ad alto rendimento condutture computazionali che hanno facilitato l&#39;analisi sperimentale sono presentati.

Qui, presentiamo approcci fenomici per la caratterizzazione funzionale di geni fagici putativi. Le tecniche includono un test sviluppato in grado di monitorare il metabolismo anabolico dell'ospite, le piastre per saggi multifenotipo (MAP), oltre al metodo consolidato della metabolomica, in grado di misurare gli effetti sul metabolismo catabolico.

Fenomica fagi: Approcci fisiologici per caratterizzare Novel virali Proteine

Current investigations into phage-host interactions are dependent on extrapolating knowledge from (meta)genomes. Interestingly, 60 - 95% of all phage ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è identificare e caratterizzare geni fagici con funzioni sconosciute. Innanzitutto, vengono espressi in e coli frame di lettura aperti virali, chiamati ORF, di fagi putativi.Cloni del fago. E. coli esprimenti Orff sono inoculati in piastre per saggio fenotipico multiplo o MAPS, che contengono mezzo di crescita e vari substrati. La crescita batterica viene quindi monitorata nel tempo mediante spettrometria. Come secondo metodo di analisi, E. coli esprimenti geni fagici sono coltivati in coltura continua oppure mediante colture ripetute in serie.I metaboliti della crescita risultanti vengono quindi raccolti ed inviati per l'analisi metabolomica mediante cromatografia gassosa e spettrometria di massa con tempo di volo. I dati ottenuti forniscono un profilo fenotipico associato all'espressione di un singolo frame di lettura aperto fagico putativo. Questo metodo è stato inizialmente sviluppato per chiarire la funzione di proteine virali sconosciute.È inoltre applicabile a studi volti a indagare il legame tra genotipi e fenotipi, e nell'esaminare le interazioni tra fagi batterici e ospiti attraverso diversi biomi. Iniziare questa procedura etichettando piastre microtitolatrici sterili a 96 pozzetti con il numero di identificazione della clone di e coli e il tipo di schema della mappa, che indica i substrati sottoposti a test nel saggio. Trasferire in modo asettico acqua sterile in un serbatoio liquido.Quindi, utilizzando una pipetta multicanale, trasferire 60 microlitri di acqua in ogni pozzetto della piastra microtitolatrice. Successivamente, trasferire in modo asettico tre X di mezzo basale in un serbatoio liquido. Quindi, utilizzando una pipetta multicanale, trasferire 50 microlitri in ogni pozzetto della piastra microtitolatrice.Utilizzando la stessa tecnica, pipettare 50 microlitri di ciascun mezzo basale utilizzato nello schema della mappa. Successivamente, trasferire 30 microlitri di ciascun substrato nel pozzetto appropriato. Quindi, utilizzando una pipetta multicanale, trasferire 10 microlitri di cellule batteriche in ciascun pozzetto.Assicurarsi di cambiare i puntali prima di reinserire la pipetta nel ceppo di coltura. Coprire ogni piastra con una pellicola adesiva per piastre. Premere fermamente la pellicola sopra le pozzette della piastra e lungo i bordi per creare un sigillo uniforme e ben aderente.Utilizzando una lametta sterile, rimuovere qualsiasi eccesso di pellicola dai bordi della piastra microtitolata. Posizionare la piastra preparata nella fessura di ingresso di uno spettrofotometro multiplo. Aprire il software del lettore di piastre e creare un protocollo per misurare l'assorbanza ogni 30 minuti per un totale di 32 ore.Con 60 secondi di agitazione tra una lettura e l'altra, impostare la temperatura dell'apparato a 37 gradi Celsius. Una volta che la mappa ha raggiunto l'equilibrio alla temperatura impostata, avviare il protocollo dopo 32 ore, rimuovendo la mappa dalla fessura di uscita del lettore di piastre. Etichettare ogni file di dati con il numero di identificazione di e coone, la data e il tipo di schema della mappa.Analizzare i dati come descritto nel documento allegato per valutare la crescita e la crescita biologicamente rilevante. A partire dall'analisi dei metaboliti, le cellule possono essere coltivate mediante passaggio continuo o batch in serie. Per mantenere uno stato stazionario.Di seguito illustreremo una coltura continua. Sterilizzare i componenti di un reattore per coltura continua da 75 millilitri e una bottiglia di alimentazione da due litri come descritto nel documento allegato. Dopo la sterilizzazione, posizionare tutti i materiali autoclavati all'interno di una cappa a sicurezza biologica e accendere la luce ultravioletta mentre il mezzo si raffredda. Una volta che il mezzo si è raffreddato, aggiungere arabinosio allo 0,1% e 100 microgrammi per millilitro.Ampicillina fino a 75 millilitri di brodo 0,5 XLB e trasferirla nel reattore continuo. Rimuovere l'involucro dal tappo del reattore per coltura continua e avvitarlo al reattore. Evitare di toccare il tubo di campionamento, rimuovere l'involucro dal tappo della bottiglia di alimentazione e avvitarlo sulla bottiglia di alimentazione.Evitare di toccare il tubo di campionamento, mantenendo sterile il tubo da 18 pollici collegato alla porta epsilon. Rimuovere l'involucro dal tubo da 18 pollici e dal tubo della pompa peristaltica. Collegare un'estremità del tubo da 18 pollici a un'estremità dell'adattatore del tubo della pompa peristaltica; inserire l'altra estremità dell'adattatore del tubo della pompa peristaltica nel tubo da 18 pollici.Collegare il porto epsilon del tappo della bottiglia di alimentazione a unità filtranti da 0,22 micron sui porti beta e delta del reattore per coltura continua. Collegare un'unità filtrante da 0,22 micron all'adattatore del porto alpha. A questa, collegare il tubo da 18 pollici all'interno della cappa a sicurezza biologica.Inoculare il reattore a coltura continua con 100 microlitri di una coltura notturna di e coli preparata come descritto nel documento allegato. Chiudere bene i tappi del reattore e della bottiglia di alimentazione, quindi posizionare il sistema in un incubatore a 37 gradi Celsius. Dotato di una piastra magnetica agitatrice e di una mini pompa peristaltica, inserire l'adattatore per tubo della pompa peristaltica nella pompa peristaltica.Il tubo della bottiglia di alimentazione entra nella pompa e prosegue fino al reattore. Impostare la pompa su veloce, quindi avviarla. Passare alla verifica in avanti per assicurarsi che il mezzo inizi a fluire attraverso il tubo.Posizionare il reattore sulla piastra agitatrice magnetica e iniziare a mescolare. Lasciare equilibrare il reattore per coltura continua per 24 ore prima di prelevare il campione il giorno successivo. Per prelevare il campione dalla coltura continua, avvitare una siringa con bloccaggio a baionetta da cinque millilitri sul portagamma e aspirare 4,5 millilitri di coltura.Utilizzare 500 microlitri della coltura per misurare la densità ottica a 600 nanometri. Successivamente, utilizzare il resto dell’aliquota per preparare quattro colture da un millilitro con un OD a 600 di 0,35 e tubi microcentrifuga da 1,7 millilitri per preparare i campioni per la cromatografia gassosa accoppiata a spettrometria di massa con tempo di volo o GC-TOF MS. Centrifugare le cellule a 16.900 ×g per due minuti per ottenere il pellet.Dopo la centrifugazione, decantare il soprannatante e quindi lavare con 500 microlitri di PBS. Eseguire questo lavaggio un secondo passaggio, decantare il soprannatante definitivamente e poi immergere le provette microcentrifuga contenenti le cellule pellettizzate in azoto liquido.Fino a quando cessa l'effervescenza, conservare i campioni in un congelatore a meno 80 gradi Celsius. Ripetere il prelievo ogni 12 ore per quattro giorni dopo che tutti i campioni sono stati raccolti. Spedire tre campioni per clone su ghiaccio secco a una struttura centrale di metabolomica per l'analisi della lavorazione dei campioni e la normalizzazione della GC rispetto a f ms per ottenere i frame di lettura aperti virali.L'acqua di mare è stata prelevata dall'isola di Starbuck e dalla Caroline AOL delle isole Line Meridionali al di sotto del limite del layer corallino. La crescita batterica in 72 condizioni specifiche di carbonio è stata valutata per 47 cloni utilizzando mappe. I dati ottenuti sono stati quindi utilizzati per classificare i cloni in fenotipi di crescita prevista, acquisizione di funzione, perdita di funzione e assenza di crescita.Per verificare l'ipotesi secondo cui i cloni che ospitano proteine funzionalmente simili presentano profili metabolomici analoghi, sono state determinate le abbondanze mediane dei metaboliti per 84 cloni coltivati in coltura continua mediante GC TOF ms. I dati ottenuti sono stati quindi utilizzati per raggruppare gerarchicamente i cloni in base alle loro abbondanze relative di metaboliti, indicate mediante colori.I metaboliti più abbondanti sono mostrati in rosso, mentre quelli meno abbondanti sono mostrati in blu scuro. Un'analisi preliminare di metabolomica ha rivelato che, sebbene i geni strutturali e metabolici non si distinguano chiaramente l'uno dall'altro, i geni che mostrano effetti simili sull'ospite risultano correlati. Ad esempio, il gene della capsidica annotato si raggruppa strettamente con i geni metabolici putativi evidenziati in questo studio EDT 24 40 e EDT 24 41; indagini utilizzando un programma pubblicamente disponibile di previsione della topologia transmembrana e dei peptidi segnale hanno mostrato evidenze che entrambi i geni metabolici putativi ospitano un singolo dominio transmembrana.Interessantemente, cinque dei nove cloni nel primo gruppo di cluster presentano domini transmembrana predetti con la stessa topologia. Nel complesso, questi dati indicano che questo metodo è in grado di fornire informazioni sui profili metabolitici dei cloni, sui potenziali cloni con funzioni correlate e sugli outlier metabolitici dei cloni. È importante ricordare, nel tentativo di applicare questa procedura, che i metodi presentati sono fortemente influenzati dalla fisiologia batterica.È necessario prendere in considerazione diversi aspetti per garantire che i gruppi clonali indipendenti vengano sperimentati prevenendo contaminazioni e che venga testata una singola variabile utilizzando i controlli appropriati.

phage-phenomics-physiological-approaches-to-characterize-novel-viral

Research

Ricerca

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Genomica singolo virus (SVG) è un metodo per isolare e amplificare il genoma di singoli virons. Sospensioni virali di un assemblaggio misto sono ordinati mediante citometria a flusso su un vetrino da microscopio con pozzi discrete contenenti agarosio, catturando così il virione e la riduzione del genoma taglio durante la lavorazione a valle. Intero genoma amplificazione viene ottenuta utilizzando multipla di amplificazione dello spostamento (MDA) risultante in materiale genomico che è adatto...

Isolamento e analisi del genoma di virioni singole utilizzando &quot;Genomica singolo virus &#39;

Una nuova generazione di piattaforme senza cellula trascrizione-traduzione è stata progettata per costruire sistemi biochimici in vitro mediante l'esecuzione di circuiti di gene. In questo articolo, descriviamo come batteriofagi, quali MS2, ΦΧ174 e T7, sono sintetizzati dal loro genoma utilizzando un sistema di TXTL senza cellula e. coli .

Sintesi dei batteriofagi infettive in un e. coli -basato sistema di espressione senza cellula

L'obiettivo del presente protocollo è specificamente tag e isolare selettivamente il DNA virale da cellule infettate per la caratterizzazione delle proteine del genoma virale associato.

Purificazione di DNA virale per l'identificazione delle proteine virali e cellulari associate

I protocolli descritti consentono la costruzione, la caratterizzazione e la selezione (contro il bersaglio di scelta) di una libreria di "domainome" fatta da qualsiasi fonte di DNA. Questo risultato è ottenuto da una pipeline di ricerca che combina diverse tecnologie: phage display, un reporter pieghevole e sequenziamento di nuova generazione con uno strumento web per l'analisi dei dati.

Interactoma-Seq: Un protocollo per la costruzione della libreria Domainome, la convalida e la selezione di Phage Display e sequenziamento di nuova generazione

Questo protocollo consente di rivelare l'impatto dei profagi sui loro ospiti. Le colture batteriche sono sincronizzate utilizzando le condizioni che meglio supportano lo stato lisogenico, limitando l'induzione spontanea. La RT-qPCR distingue inequivocabilmente i geni ristretti dai profagi e quelli disaccoppiati dal controllo fagico da quelli espressi durante il ciclo di replicazione litica.

Comprendere l'impatto dei batteriofagi temperati sui loro lisogeni attraverso la trascrittomica

Viene descritto un metodo di micropiastre basato sulla densità ottica per quantificare la crescita batterica a lungo termine in presenza di batteriofagi, adatto per actinomiceti e altri batteri a crescita lenta. Questo metodo include modifiche per ridurre l'evaporazione e la condensa del coperchio e il codice R per calcolare le metriche di infezione da virus, compresa l'area sotto la curva, il massimo di crescita e la virulenza relativa.

Un saggio su micropiastre adattato basato sulla densità ottica per caratterizzare l'infezione da actinobatteriofago

I batteriofagi (fagi), virus che infettano i batteri, sono parte integrante del microbioma intestinale. Sebbene questi abitanti simbiotici guidino la fitness batterica e le dinamiche di popolazione, si sa poco su come influiscono sull'omeostasi intestinale e sulle malattie. Questo protocollo studia i fagi T4 isolati all'interno di un modello murino, adattabile ad altre coppie fago-batterio.

Interazione tra batteriofago T4 ed E. coli nell'intestino murino: un modello prototipico per lo studio delle dinamiche ospite-batteriofago in vivo

Qui, descriviamo un test immunologico fluorescente multiplex di nuova concezione che utilizza un sistema citometrico a flusso dual-reporter per rilevare contemporaneamente due epitopi unici della proteina spike su particelle virali intatte di coronavirus 2 della sindrome respiratoria acuta grave (SARS-CoV-2) che erano state catturate da microsfere magnetiche accoppiate all'enzima di conversione dell'angiotensina-2.

Profilazione degli epitopi proteici di superficie su particelle virali mediante la strategia multiplex dual-reporter

Qui, descriviamo i metodi di campionamento dalle zone eufotiche degli ecosistemi marini e d'acqua dolce per isolare i cianofagi (e i loro ospiti) e i processi post-campionamento che arricchiscono i singoli genotipi e caratterizzano le dinamiche di interazione virus-ospite.

Campionamento ambientale di microbi fotosintetici e dei loro virus: dal campo al laboratorio

Il Virochip è un pan-virale microarray progettati per rilevare contemporaneamente tutti i virus conosciuti e nuovi virus sulla base di omologia di sequenza conservati. Qui mostriamo come eseguire un test Virochip per analizzare i campioni clinici per la presenza di virus noti e sconosciuti.

Utilizzando un pan-virale Assay Microarray (Virochip) allo schermo campioni clinici di patogeni virali

Scopri approcci fenotipici per caratterizzare geni fagi con funzioni sconosciute utilizzando E. coli e analisi metabolomica. Questo metodo collega genotipi a fenotipi nello studio delle interazioni batterio-fago.

Fenomica fagi: Approcci fisiologici per caratterizzare Novel virali Proteine

Esplora altri video