Name: In vitro e in vivo modello per studiare ladesione batterica alla parete del serbatoio in condizioni di flusso (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Scopri un modello in vitro e in vivo per studiare l'adesione batterica alla parete vascolare sotto stress di taglio usando Staphylococcus aureus. Questo metodo consente la visualizzazione in tempo reale e approfondisce la patogenesi delle infezioni endovascolari.

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Questo lavoro è stato supportato dal Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek (FWO) Vlaanderen G0466.10, 11I0113N; &quot;Eddy Merckx Research Grant&quot; e la &quot;Sporta Research Grant&quot; per Cardiologia Pediatrica, UZ Leuven, Belgio (JC); il Centro per Molecolare e Biologia Vascolare è supportato dal Programmafinanciering KU Leuven (PF / 10/014), dal &quot;Geconcentreerde Onderzoeksacties&quot; (GOA 2009/13) presso l&#39;Università di Lovanio e un assegno di ricerca da Boehringer-Ingelheim.

Gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal Comitato Etico della KU Leuven. 1. I batteri Preparazione in vitro perfusione e in vivo <ol><li> Abbiamo usato S. aureus ceppo Newman per tutti gli esperimenti descritti in questo manoscritto. S. aureus Newman è stato memorizzato in Brain Heart Infusion (BHI) con il 10% di glicerolo a -80 ° C. </li><li> Utilizzare un&#39;ansa sterile per raschiare i batteri congelati off e inoculare in 5 ml Tryptic Soy Broth (TSB) O / N a 37 ° C (OD 600&gt; 3). </li><li> Lavare i batteri mediante centrifugazione (2.600 g, RT, 5 min) e risospendere il pellet batterico in 5 ml di PBS (tampone fosfato salino). </li><li> Preparare una soluzione di 1 mg / ml di 5 (6) estere -carboxy-fluoresceina N-hydroxysuccinimidyl (carbossi-fluoresceina) in etanolo. Diluire il / soluzione 1 mg ml di carbossi-fluoresceina a 150 mg / ml in acqua grado di laboratorio (ad esempio, acqua MilliQ). Proteggere i tubi di lucecon un foglio di alluminio e conservare a -20 ° C. </li><li> Centrifugare i batteri (2.600 xg, RT, 5 min). Risospendere il pellet batterico in 800 l di PBS e aggiungere 200 ml (concentrazione finale di 30 mg / ml per gli esperimenti di perfusione) o 400 ml (concentrazione finale 50 mg / ml per gli esperimenti in vivo) della / ml soluzione carbossi-fluoresceina 150 mcg. Proteggere i tubi dalla luce con un foglio di alluminio e incubare per 30 minuti a RT su un agitatore. </li><li> Dopo etichettatura, blocco con soluzione al 6% albumina di siero bovino (BSA) in PBS. </li><li> Diluire batteri utilizzando densitometria ottica (OD), un OD 600 di 0,65 per esperimenti in vitro (corrispondenti a circa 3 x 10 8 unità formanti colonie (CFU) / ml di S. aureus) e un diametro esterno di 600 1.8 per esperimenti in vivo ( corrispondente a circa 1 x 10 9 CFU / ml per S. aureus) in PBS. Proteggere i tubi dalla luce con un foglio di alluminio e lasciare sul ghiaccio. </li></ol> 2. Gli esperimenti in vitro perfusione <ol><li> Rivestimento di vetrini di vetro <ol><li> Diluire fattore di von Willebrand (VWF) (Haemate P, concentrazione della 2.400 mg / ml) in acqua grado di laboratorio (deionizzata distillata) ad una concentrazione finale di 50 mg / ml. </li><li> Diluire collagene in soluzione isotonica di glucosio (soluzione SKF, pH 2,7-2,9, come fornito dal produttore) ad una concentrazione finale di 160 mg / ml. </li><li> Coprioggetto di vetro Coat (24 × 50 mm) con VWF o collagene facendo cadere 200 ml di rivestimento sul parafilm e posizionare il vetrino in cima della goccia. La goccia si diffonderà lungo la superficie del vetrino. </li><li> Incubare il vetrino in un contenitore umidificato per 4 ore a temperatura ambiente. Sollevare con cautela i coprioggetti dal parafilm con un ago smussato. Montare il vetrino nella parte inferiore della camera di flusso. </li></ol></li><li> Rivestimento di plastica scivola con le cellule endoteliali <ol><li> Scivola Coat plastica(1-well camera di coltura cellulare PCA, Sarstedt, Germania) con 1 ml di una soluzione di gelatina 1% in PBS e incubare per 30 min a 37 ° C. Cellule umane Seed vena ombelicale endoteliali (HUVEC) sui gelatina rivestito scivola di plastica e di farle crescere al 70-80% di confluenza. Montare lo scorrimento in plastica nella parte inferiore della camera di flusso. </li></ol></li><li> Perfusion Experiment NOTA: Una panoramica schematica del modello di perfusione in vitro è rappresentata in figura 1. <ol><li> Eseguire in vitro studi adesione batterica in una camera di flusso lamiera microforata parallelo ad un carico laminare taglio tra 2,5 dyne / cm 2 e 20 dyne / cm 2 per simulare diverse condizioni di flusso fisiologiche. </li><li> Il (progettazione interno) camera di flusso è costituito da un telaio metallico e una camera di perfusione fatto di plexiglas (poli (metil) metacrilato (PMMA)). Collegando ad una pompa per infusione ad alta precisione (PHD 2000 Infusion, Harvard Apparatus, Stati Uniti d&#39;America), siamo in grado di generare flussi di raTES tra 0,0001 ml / min e 220,82 ml / min. </li><li> Collegare il tubo per la parte superiore della camera di flusso e iniettare fluido nel tubo. Posizionare delicatamente la parte superiore della camera di flusso sopra la parte inferiore e montare la camera di flusso. Fare attenzione a evitare bolle d&#39;aria. Iniettare 1 ml di terreno attraverso la camera per assicurarsi che la camera non perde e per rimuovere la soluzione di rivestimento in eccesso. Evitare bolle d&#39;aria. </li><li> Posizionare il mouse su una piastra elettrica termo-controllata a 37 ° C su un vassoio microscopio. Poiché questo è un procedimento terminale, non vi è alcuna necessità di severe procedure asettiche. Fare un&#39;incisione vicino alla vena giugulare, rimuovere delicatamente il lato destro del muscolo cervicale e isolare la vena giugulare dal tessuto circostante. </li><li> Impostare la pompa di infusione e microscopio a fluorescenza. Impostazioni della pompa di infusione dipendono dal diametro siringa e la portata desiderata (vedere paragrafo 2.4). D&#39;ora in poi, lavorare in una stanza buia. </li><li> VWF Rivestimento: <ol><li> Riempire una siringa con batteri fluorescente e collegarlo al tubo di ingresso. Evitare bolle d&#39;aria. Avviare la pompa di infusione per 10 minuti. Il tempo di infusione dipende dalla velocità di deformazione e il rivestimento, batteri e mezzo utilizzato e dovrebbe rappresentare lo stato stazionario di aderenza. </li><li> Dopo 10 min, lavare via i batteri non legato collegando una siringa con PBS al tubo di ingresso e di avviare la pompa per infusione. </li><li> Prendere almeno 15 immagini o filmati in diversi punti dopo il processo di lavaggio. I batteri sono piccoli e potenzialmente difficile mettere a fuoco. Prima dell&#39;esperimento flusso in vitro, il piano focale appropriata può essere recuperato mettendo una goccia di batteri fluorescente su un vetrino e posizionare il vetrino nella camera di flusso. Quindi, cercare il piano focale appropriata e salvare le impostazioni. NOTA: Durante l&#39;esperimento flusso in vitro, catturando le immagini durante la fase di lavaggio (± 5 min dopo l&#39;avvio) assicura che solo lasegnale per i batteri aderenti viene catturato. </li></ol></li><li> Collagene Rivestimento: <ol><li> Aggiungere 60 mg / ml VWF ai batteri fluorescente appena prima di iniziare la perfusione. Riempire una siringa con batteri fluorescente o batteri fluorescente integrata con 60 mg / ml VWF e collegarlo al tubo di ingresso. Evitare bolle d&#39;aria. Ripetere i passaggi da 2.3.5.2 a 2.3.5.3 </li></ol></li><li> Cellule endoteliali: <ol><li> Attivare le cellule endoteliali mediante perfusione con una soluzione 0,1 mM di Ca 2+ -ionophore A23187 (soluzione stock 10 mM disciolto in dimetilsolfossido (DMSO)) in DMEM alla stessa velocità di taglio come la perfusione batterico per 10 min in perfusione con 0,1 mm. Ripetere i passaggi da 2.3.5.2 a 2.3.5.3. </li></ol></li></ol></li><li> Calcola gradiente di velocità e sforzo di taglio come segue. Tasso Shear = 6Q / wh 2 Dove: Q: portata in ml / min, w: larghezza in cm, h: altezza in cm Lo stress Shear (τ) = taglio rattoex viscosità (μ) Dove μ: media: 0.01 dynes x sec / cm 2, sangue intero: 0.04 dine x sec / cm 2 </li><li> L&#39;analisi delle immagini <ol><li> Ottenere le immagini dal vivo utilizzando un microscopio a fluorescenza invertito con una macchina fotografica in bianco e nero e sviluppare mediante software di imaging. Utilizzare il tempo di esposizione di 1,5 sec. Prendere istantanee multiple (almeno 15) distribuite casualmente sulla superficie rivestita della camera di flusso e salvarli nel formato di file appropriato. </li><li> Eseguire l&#39;analisi delle immagini con ImageJ. Sottrarre il fondo per rimuovere continui sfondi lisci dall&#39;immagine (Process - Contesto Sottrarre) e definire la soglia per impostare i valori di soglia inferiore e superiore, segmentando le immagini in scala di grigi in caratteristiche di interesse. Misurare l&#39;area limitata alla soglia. </li><li> Confronta adesione batterica, espresso in zona fluorescenti, ad esempio, utilizzando il software di analisi statistica. Confronta i gruppi utilizzando ANOVA unidirezionale o two-coda t-test di Student. Segnala tutti i valori medi errore ± standard della media (SEM). Si consideri un valore p- &lt;0,05 significative (* p &lt;0,05; ** p &lt;0.01; *** p &lt;0.001). </li></ol></li></ol> 3. In Vivo mesenterica Perfusion Modello <ol><li> Preparazione / chirurgia del mouse <ol><li> Digiunare il mouse la notte prima dell&#39;esperimento per limitare il movimento intestinale. </li><li> Dare un 6-8 settimane vecchio mouse (C57Bl / 6) l&#39;analgesia pre-operatoria per una iniezione sottocutanea di buprenorfina (0,1 mg / kg di peso corporeo (BW)) 20-30 minuti prima dell&#39;intervento. </li><li> Anestetizzare il topo mediante iniezione intraperitoneale di ketamina (125 mg / kg di peso corporeo) e xilazina (12,5 mg / kg di peso corporeo). Controllare a pedale reflex. Applicare veterinario pomata per prevenire la secchezza. </li><li> Posizionare il mouse su una piastra elettrica termo-controllata a 37 ° C su un vassoio microscopio. Poiché questo è un procedimento terminale, non vi è alcuna necessità di una rigorosa asceptiProcedure c. Fare un&#39;incisione vicino alla vena giugulare, rimuovere delicatamente il lato destro del muscolo cervicale e isolare la vena giugulare dal tessuto circostante. </li><li> Inserire un catetere endovenoso francese 2 nella vena giugulare destra per l&#39;infusione di batteri fluorescente o altre soluzioni. Aprire la cavità peritoneale attraverso un incisione addominale mediana e utilizzare tamponi di cotone per diffondere il mesentere e di visualizzare il arteriolare mesenterica e la circolazione venulare. </li><li> Posizionare il mouse sul lato destro su una lastra trasparente e fissare la cannula con nastro. Utilizzare un impacco caldo per prevenire l&#39;ipotermia. Per evitare la disidratazione del tessuto, goccia 500 ml 0,9% NaCl l&#39;intestino. </li></ol></li><li> Microscopia a fluorescenza di adesione batterica alla circolazione mesenterica <ol><li> Lavorare in una stanza buia. Usare tamponi di cotone per immobilizzare i vasi e li visualizza sotto un microscopio invertito. </li><li> Topicamente applicare 5 ml di una soluzione 10 mM of Ca 2+ -ionophore A23187 disciolto in DMSO. Dopo 10 secondi, iniettare 100 pl batteri etichettati (vedi punto 1) attraverso il catetere giugulare. Prendere immagini time-lapse. Dopo l&#39;esperimento è finito, eutanasia il mouse secondo le linee guida istituzionali approvate. </li></ol></li><li> Image Analysis <ol><li> Ottenere le immagini dal vivo usando un microscopio a fluorescenza invertito, catturata con una macchina fotografica in bianco e nero e sviluppato utilizzando qualsiasi software di imaging. Applicare tempo di esposizione automatizzato e ottimizzazione contrasto specifici per l&#39;apparecchiatura utilizzata. </li><li> Acquisire time-lapse immagini utilizzando lo strumento &#39;acquisizione&#39; nella barra degli strumenti (Acquisizioni multidimensionale - Time) con 40 cicli di 1.000 immagini / sec. Salvare le immagini in un formato di file immagine appropriato. </li><li> Le immagini del processo utilizzando il software di analisi ImageJ per misurare l&#39;area del segnale fluorescente per immagine. Definire la soglia per impostare i valori di soglia inferiore e superiore, segmentando le immagini in scala di grigi in features di interesse. Identificare la regione di interesse (vaso sanguigno) e misurare l&#39;area limitata alla soglia e la regione di interesse. Confronta adesione batterica, espresso in zona fluorescenti utilizzando qualsiasi software statistico o grafica. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Lo stress Shear è un fattore cruciale per l&#39;adesione batterica presto alla parete del vaso e per la successiva generazione di endovascolare o vegetazioni endocardial e infezioni metastatiche 4,5. Abbiamo descritto complementari in vitro e in vivo per studiare la patogenesi delle infezioni endovascolari sotto sforzo di taglio fisiologico. Questi modelli hanno permesso di individuare von Willebrand factor-binding protein (vWbp) come la principale S. proteine ​​aureus di interagire in corrente con una parete vascolare lesa esporre VWF 4. Infezioni endovascolari e endocardite infettiva in particolare, sono fonte di preoccupazione non solo per insufficienza d&#39;organo indotta dalla sepsi e la morte, ma anche a causa della (&quot;metastatico&quot;) complicanze locali e distanti. Per causare endocardite infettiva e infezioni metastatiche, i batteri devono aderire alla parete del vaso e resistere alla sollecitazione di taglio del sangue che scorre così. Piùstudi sui batteri fattori di virulenza sono stati eseguiti in condizioni statiche. Tuttavia, queste interazioni stabiliti non potrebbero sopportare le forze di taglio e gli studi in condizioni di flusso può rivelare nuovi fattori precedentemente non riconosciute in gioco batteri-ospite. Utilizzando la camera di flusso micro-parallelo, noi e altri hanno mostrato l&#39;importanza di VWF per l&#39;adesione vascolare. Sotto sforzo di taglio, VWF progressivamente dispiega dalla sua struttura globulare di riposo, ed espone il dominio A1 che interagisce con le piastrine attraverso il suo recettore GPIb 6. Camere di flusso sono stati ampiamente utilizzati per studiare la funzione piastrinica 7. Sorprendentemente, anche S. aureus adesione sotto flusso richiede VWF, in particolare dominio A1 che è esposto sul taglio. Abbiamo identificato vWbp per mediare VWF vincolante. vWbp è un coagulasi che contribuisce ad S. aureus fisiopatologia attivando protrombina del padrone di casa. Staphylothrombin, la resulting complesso di un coagulasi batterica e protrombina, converte il fibrinogeno in fibrina insolubile 8,9. I nostri studi hanno dimostrato che vWbp non solo attiva protrombina, ma innesca la formazione di aggregati batteri fibrina-piastrine, che esaltano l&#39;adesione di vasi sanguigni sotto flusso 4,10,11. Il flusso modello di camera in vitro permette di studiare i diversi attori in adesione batterica di componenti cellulari e della matrice. Fattori di virulenza batterici possono essere studiati utilizzando mutanti o batteri innocui che esprimono proteine ​​di superficie specifici. In alternativa, inibitori farmacologici o anticorpi bloccanti possono essere aggiunti al mezzo nella camera di flusso. Il ruolo dei fattori dell&#39;ospite, come diversi elementi costitutivi del matrice extracellulare può essere studiato utilizzando coprioggetto con diversi rivestimenti. I vetrini possono essere coperti con le cellule endoteliali, di cui lo stato di attivazione può essere modulata con l&#39;aggiunta di stimolatori specifici. Apart dalla parete vascolare, il contributo delle cellule del sangue dell&#39;ospite e proteine ​​del plasma può essere studiata aggiungendo questi fattori per mezzo fluente. Così, differenti condizioni di crescente complessità possono essere studiati in condizioni standardizzate di flusso laminare per svelare le interazioni che permettono ai batteri di aderire alla parete del vaso in vivo. Interazioni individuate nel modello in vitro sono poi studiati in un modello animale per testare la loro rilevanza in un organismo complesso. Altri modelli in vivo per studiare interazioni dinamiche sotto flusso sono stati descritti, ad esempio la camera di criceto dorsale plica 12 e il modello cremastere 13. In confronto, il modello perfusione mesenterica qui descritto presenta diversi vantaggi per la sua facilità di utilizzo, la possibilità di variare ospitare background genetico dei topi e per valutare interventi farmacologici. In conclusione, i modelli descrittioffrire la possibilità di studiare proteine ​​di superficie, non solo di S. aureus, ma di molti altri microrganismi in diversi ambiti di accoglienza, per comprendere meglio la patogenesi delle infezioni vascolari.

Per stabilire le infezioni endovascolari, i patogeni richiedono un meccanismo per aderire all'endotelio, che riveste la parete del vaso e la superficie interna del cuore, e per persistere e stabilire un'infezione nonostante siano esposti allo stress di taglio del sangue che scorre rapidamente. L'agente patogeno più frequente che causa infezioni endovascolari potenzialmente letali ed endocardite infettiva è lo Staphylococcus aureus (S. aureus)1. 
Varie molecole adesive batteriche legate alla superficie mediano l'adesione al tessuto ospite interagendo con i componenti della matrice extracellulare. Questi MSCRAMM (componenti della superficie microbica che riconoscono le molecole della matrice adesiva) riconoscono molecole come la fibronectina, il fibrinogeno, il collagene e il fattore di von Willebrand (VWF). Gli MSCRAMM sono importanti fattori di virulenza di S. aureus e sono implicati nella colonizzazione e nell'invasione dell'ospite2. La maggior parte degli studi su questi fattori di virulenza sono stati condotti in condizioni statiche e quindi potrebbero non essere rappresentativi per le infezioni umane in cui l'adesione iniziale dei batteri si verifica nel sangue che scorre. 
Nel caso di infezioni del flusso sanguigno, i batteri devono superare le forze di taglio del sangue che scorre per attaccarsi alla parete del vaso. Di particolare interesse sono quindi i modelli che studiano l'interazione tra batteri ed endotelio o subendotelio in condizioni di flusso. 
Uno studio recente ha dimostrato che l'adesione di S. aureus ai vasi sanguigni sotto stress di taglio è mediata dal VWF3. Il VWF, una proteina operativa per lo stress di taglio, viene rilasciata dalle cellule endoteliali al momento dell'attivazione. Il VWF circolante si lega alle fibre di collagene della matrice subendoteliale esposta. Il nostro gruppo ha riportato che la proteina legante il fattore di von Willebrand (vWbp) di S. aureus è cruciale per l'adesione mediata dal taglio al VWF4. 
In questo articolo, presentiamo un modello di camera di flusso in vitro in cui è possibile valutare l'adesione batterica a diversi componenti della matrice extracellulare o alle cellule endoteliali. Per convalidare i risultati dei dati in vitro, abbiamo sviluppato un modello in vivo che visualizza e quantifica l'interazione diretta dei batteri con la parete del vaso e la formazione di trombi batteri-piastrini nella circolazione mesenterica dei topi, utilizzando la microscopia vascolare intravitale in tempo reale.

<table><tbody><tr><td>Infusione di cuore cerebrale (BHI)</td><td>BD Plastipak&nbsp;</td><td>237500</td><td></td></tr><tr><td>Brodo di soia triptico (TSB)</td><td>Oxoid</td><td>CM0129</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)</td><td>Invitrogen</td><td>14190-169</td><td>D-PBS</td></tr><tr><td>5(6)-carbossi-fluoresceina N-idrossisuccinimidil estere&nbsp;</td>Etichettatura fluorescente <td>Sigma-Aldrich</td><td>21878-25MG-F</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Frazione di albumina sierica bovina V (BSA)</td><td>Roch</td><td>10 735 086 001</td><td></td></tr><tr><td>Emate-P</td><td>CSL Behring</td><td>PL 15036/0010</td><td>VWF</td></tr><tr><td>Collagene Horm</td><td>Takeda</td><td>10500</td><td>collagene</td></tr><tr><td>1 pozzetto Camere di coltura cellulare</td><td>PCA Sarstedt</td><td>94.6140.102</td><td>barbottine di plastica</td></tr><tr><td>Temgesic</td><td>Reckitt Benckiser</td><td>283716</td><td>bruprenorfina</td></tr><tr><td>Anesketina (Ketamin cloridrato 115 mg/ml (100 mg/ml chetamino))</td><td>Eurovet</td><td>BE-V136516</td><td>ketamina</td></tr><tr><td>XYL-M 2% (xilazina cloridrato 23,32 mg/ml (20 mg/ml xilazina))</td><td>VMD Arendonk</td><td>BE-V170581</td><td>xilazina</td></tr><tr><td>2 catetere endovenoso francese verde</td><td>Portex</td><td>200/300/010</td><td></td></tr><tr><td>0,9% cloruro di sodio (NaCl)</td><td>Baxter Healthcare</td><td>W7124</td><td></td></tr><tr><td>cotone tamponi</td><td>International Medical Product</td><td>300230</td><td></td></tr><tr><td>Ca2+-ionoforo soluzione A23187</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7522-10 MG</td><td></td></tr><tr><td>26 calibro 1 ml siringa&nbsp; &nbsp;</td><td>BD Plastipak&nbsp;</td><td></td><td></td>300013</tr><tr><td>siringa da 1 ml calibro 26 con ago</td><td>BD Plastipak</td><td>300015</td><td>iniezione intraperitoneale</td></tr><tr><td>Centrifuga 5810-R</td><td>Eppendorf</td><td>5811 000.320</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini coprioggetto (24x50)</td><td>VWR</td><td>BB02405A11</td><td>Spessore No, 1</td></tr><tr><td>PHD 2000 Infusione</td><td>Harvard Apparatus</td><td>702100</td><td>Pompa di infusione Harvard ad alta precisione</td></tr><tr><td>Axio-observer DI</td><td>Carl-Zeiss</td><td>Microscopio</td><td></td></tr> <tr><td>a fluorescenza invertitaImageJ</td><td>National Institute of Health</td><td>Software</td><td></td>di analisi</tr><tr><td>Graphpad Prism 5,0</td><td>Graphpad Software</td><td>di</td><td></td>analisi</tr><tr><td>AxioCam MRm</td><td>Carl-Zeiss&nbsp;</td>Fotocamera <td></td><td>in bianco e nero</td></tr></tbody></table>

in vitro e in vivo modello per studiare l&#39;adesione batterica alla parete del serbatoio in condizioni di flusso

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

Per causare infezioni endovascolari, endocardite infettiva, batteri devono essere in grado di aderire alla parete del vaso mentre viene esposta alla sollecitazione di taglio del flusso sanguigno. Per identificare i fattori batterici e di accoglienza che contribuiscono alla adesione vascolare di microrganismi, sono necessari modelli appropriati che studiano queste interazioni in condizioni fisiologiche di taglio. Qui, descriviamo un modello vitro camera di flusso che permette di indagare adesione batterica alle diverse componenti della matrice extracellulare o alle cellule endoteliali, e un modello di microscopia intravitale che è stato sviluppato di visualizzare direttamente l&#39;adesione iniziale dei batteri alla circolazione splancnica in vivo . Questi metodi possono essere utilizzati per identificare i fattori batterici e host richiesto per l&#39;adesione dei batteri sotto flusso. Illustriamo la rilevanza di sforzo di taglio e il ruolo del fattore di von Willebrand per l&#39;adesione di Staphylococcus aureus utilizzando sia in vitro e in modelli in vivo.

S. aureus adesione alla VWF, matrice subendoteliale e cellule endoteliali è un fenomeno dipendente sforzo di taglio Per sottolineare il ruolo dello stress di taglio nell&#39;interazione tra S. aureus e VWF, abbiamo eseguito perfusioni oltre VWF vetrini rivestiti a differenti velocità di taglio (una visione schematica del modello di perfusione in vitro è dato in Figura 1. Adesione di S. aureus per VWF aumentato con l&#39;aumento dei tassi di taglio da 250 sec -1 a 2.000 sec -1 (Figura 2), indicando che elevate forze di taglio non inibiscono ma rinforzano l&#39;adesione dei batteri alle VWF. Per investigare il contributo di VWF per adesione batterica al collagene, il componente principale della matrice subendoteliale, abbiamo perfuso fluorescente S. aureus sopra collagene in presenza o assenza di VWF. In assenza di VWF, adesione di S. unureo al collagene è diminuita con l&#39;aumentare i tassi di taglio. Tuttavia, quando VWF era presente nel mezzo, l&#39;adesione di S. aureus aumentava con l&#39;aumentare shear rate (Figura 3). Il modello di flusso in vitro ci permette anche di valutare l&#39;adesione dei batteri alle cellule endoteliali sotto flusso. Abbiamo perfuso HUVECs con fluorescente S. aureus a velocità di taglio da 500 a 2.000 sec -1. Dove indicato, HUVECs sono stati attivati ​​con un Ca 2+ -ionophore, a causare il rilascio di VWF. Attivazione delle cellule endoteliali e del successivo rilascio VWF, maggiore adesione di S. aureus (Figura 4A), che costituiva schemi tipici &quot;stringa-like&quot; di fluorescente cluster batteriche allineati nella direzione della forza di taglio (Figura 4B), suggerendo il legame di batteri lungo una VWF molecola lineare allungata. Iniziale in vivoadesione batterica nelle vene splancnico è mediato da VWF Da S. aureus è in grado di aderire a VWF, abbiamo utilizzato topi di tipo selvatico (VWF + / +) e VWF topi con deficit (VWF - / -) per indagare adesione batterica alla parete del vaso attivata in vivo. In tempo reale videomicroscopia delle vene splancnici permesso la visualizzazione in vivo di far circolare fluorescente S. aureus (Schema del modello in vivo perfusione è rappresentato in figura 5). Dopo l&#39;attivazione farmacologica dell&#39;endotelio dal Ca 2+ -ionophore, abbiamo osservato rapido accumulo locale dei singoli batteri e aggregati di batteri alla parete del vaso di topi WT (supplementare Video 1 e 2). Quasi nessuna adesione dei batteri è stato osservato sulla parete del vaso attivato di vWF -deficient topi (supplementare Video 3) rispetto ad adesione in topi WT (Figura 6). L&#39;assenza di VWF diminuisce la capacità di S. aureus di aderire alla parete del vaso attivato. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52862/52862fig1.jpg" /> Figura 1. Una rappresentazione schematica del modello di flusso in vitro. Il modello di flusso in vitro è un modello multifunzionale, che consente lo studio di diversi meccanismi dipendenti taglio come adesione batterica alla matrice sottoendoteliale ma anche la formazione di trombi. La camera di flusso micro-parallelo è posto su un vetrino (plastica o vetro) con differenti rivestimenti di proteine ​​e cellule endoteliali. L&#39;adesione dei batteri diversi (arancione e punti grigi) possono essere analizzati, e l&#39;impatto della presenza di proteine ​​plasmatiche, piastrine e sangue intero può essere valutato. Marcatori fluorescenti per piastrine (ovali blu) o fibrinogit (stringhe blu) può essere utilizzato in combinazione con diversi inibitori (ovali neri) di distinguere fattori batterici e di accoglienza. Immagini rappresentative della adesione batterica di S. aureus a rivestimento di collagene in presenza (in basso) o assenza (superiore) del VWF sono mostrati (barra della scala è di 100 micron). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52862/52862fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52862/52862fig2.jpg" /> Figura 2. Adesione di S. aureus di VWF aumenta con l&#39;aumentare i tassi di taglio. Micro-parallelo perfusione camera di flusso su patinata VWF (50 mg / ml) con fluorescente S. aureus Newman a velocità di taglio di 250 a 2000 sec -1 (sec -1) a medio (n&gt; 5). Tutti i risultati sono espressi come media ± SEM. * P &lt;0.05, ** p &lt;0,01. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52862/52862fig3.jpg" /> Figura 3. Adesione di S. aureus a subendothelium è taglio e VWF dipendente. Micro-parallelo perfusione camera di flusso su collagene rivestito (160 mg / ml) con fluorescente S. aureus Newman a velocità di taglio di 250 a 2000 sec -1 in media (n&gt; 5). VWF (60 ug / ml) era presente nel mezzo di dove indicato. Tutti i risultati sono espressi come media ± SEM. ** P &lt;0.01. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52862/52862fig4.jpg" /> Figura 4. Adesione di S. aureus alle cellule endoteliali attivate è taglio dipendente. Micro-parallelo perfusione camera di flusso su cellule endoteliali. (A) cellule endoteliali umane della vena ombelicale sono state attivate con l&#39;Università Ca 2+ -ionophore A23187 (0.1 mM) seguito da 10 minuti di perfusione fluorescente S. aureus Newman a velocità di taglio di 500 a 2000 sec -1 in media (n&gt; 5). Tutti i risultati sono espressi come media ± SEM. * P &lt;0,05. (B) L&#39;immagine di micro-parallelo perfusione camera di flusso su HUVECs attivati ​​con S. aureus ad una velocità di taglio di 1.000 sec -2. S. aureus forma stringhe di ± 200 micron di lunghezza, il che suggerisce l&#39;adesione di multimeri VWF (barra della scala è di 100 micron). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52862/52862fig4large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52862/52862fig5.jpg" /> Figura 5. Una panoramica schematica del modello di perfusione mesenterica in vivo. Un catetere giugulare destra (linea gialla) è inserito per la somministrazione di fluorobatteri escently etichettati (punti arancione), anestetici aggiuntivi o di altri componenti come gli inibitori farmaceutiche e gli anticorpi. La cavità peritoneale è aperta e il mesentere si sviluppa per visualizzare i vasi sanguigni (arteriosi e venosi) sotto un microscopio a fluorescenza. Dopo l&#39;attivazione farmacologica dell&#39;endotelio da Ca 2+ -ionophore, che induce il rilascio di VWF, batteri possono essere iniettati attraverso il catetere vena giugulare. In tempo reale video microscopia intravascolare permette di visualizzare in vivo di circolante batteri fluorescente e la conseguente formazione di batteri-piastrinici trombi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52862/52862fig5large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/52862/52862fig6.jpg" /> Figura 6. L&#39;adesione iniziale di S. aureusdi endotelio attivato in vivo è mediata da VWF In vivo venosa mesenterica modello perfusione con C57BL / 6- VWF + / + e C57BL / 6- FvW -. / - mice. Adesione di fluorescente S. aureus alla parete del vaso localmente attivato è significativamente più bassa in VWF - / - mice. Tutti i risultati sono espressi come media ± SEM. *** P &lt;0,001, n&gt; 7. <img alt="Video Figura 1" src="/files/ftp_upload/52862/52862figV1.jpg" /> Video 1: in tempo reale adesione di S. aureus a parete dei vasi attivato al VWF + / + topo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52862/Video1JorienClaes.mov" target="_blank">Cliccate qui per vedere il video.</a> Video 2: la formazione di aggregati in tempo reale e embolizzazione di S. aureus in VWF + / + topo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52862/Video2JorienClaes.mov" target="_blank">Clicca qui per vedere il video.</a> <img alt="Video Figura 3" src="/files/ftp_upload/52862/52862figV3.jpg" /> Video 3: tempo reale adesione di S. aureus a parete dei vasi attivato al VWF - / -. topi in vivo modello perfusione mesenterica con VWF + / + e VWF - / - mice. Cinque microlitri di Ca 2+ -ionophore (10 mM) è stato applied alla regione del letto vascolare visualizzato. Una sospensione di carbossi-fluoresceina S. aureus è stato iniettato attraverso il catetere giugulare. La circolazione mesenterica è stato visualizzato sotto un microscopio invertito. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52862/Video3JorienClaes.mov" target="_blank">Clicca qui per vedere il video.</a>

Per studiare l'interazione dei batteri con i vasi sanguigni sottoposti a stress di taglio, vengono descritti una camera di flusso e un modello di microscopia intravitale mesenterica in vivo che consentono di sezionare i fattori batterici e dell'ospite che contribuiscono all'adesione vascolare.

In vitro e in vivo modello per studiare l&#39;adesione batterica alla parete del serbatoio in condizioni di flusso

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è studiare l'interazione tra batteri e endotelio e sottendotelio sotto stress di taglio. Questo viene ottenuto mediante etichettatura fluorescente dei batteri per visualizzarli in tempo reale utilizzando la microscopia video come secondo passaggio. Una camera di flusso in vitro viene utilizzata per analizzare i diversi fattori coinvolti nell'adesione dei batteri in movimento ai componenti cellulari o alla matrice.Successivamente, le interazioni identificate nel modello in vitro vengono studiate nel modello di perfusione mesenterica in vivo per verificarne la rilevanza in un organismo complesso; i risultati mostrano che Staphylococcus aureus è in grado di aderire alle cellule endoteliali attivate e alla sottostante matrice subendoteliale sotto stress di taglio. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti è che comprende sia un modello in vitro che uno in vivo, complementari per lo studio della patogenesi delle infezioni endovascolari sotto stress di taglio. Questi metodi possono contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo delle malattie infettive e della biologia vascolare, come ad esempio come si instaurano l'endocardite infettiva e le infezioni metastatiche sotto stress di taglio fisiologico, dimostrando una procedura attraverso Be Malin, una tecnica specializzata nel lavoro sugli animali del nostro laboratorio. Iniziare preparando il colorante fluorescente utilizzato per tracciare i batteri.Aggiungere 150 microlitri di una soluzione fluorescente di carbossi da stock in 850 microlitri di acqua di qualità per laboratorio e mescolare. Conservare la soluzione al riparo dalla luce a meno 20 gradi Celsius fino al momento dell'uso. Successivamente, centrifugare un coltura di 5 millilitri di S. reus.Batteri coltivati per tutta la notte in brodo di soia triptica, lavare una volta con PBS e quindi risospendere. Al nuovo pellet aggiungere 800 microlitri di PBS e poi 200 microlitri di soluzione colorante per esperimenti di perfusione in vitro, oppure 400 microlitri di soluzione colorante. Per esperimenti in vivo, coprire i tubi con carta d'alluminio per prevenire il fotoblecamento del colorante e incubare su agitatore per 30 minuti a temperatura ambiente.Successivamente, aggiungere alla miscela una soluzione di albumina sierica bovina al 6% in PBS per bloccare il legame non specifico. Verificare la concentrazione delle cellule mediante citometria ottica e diluire i batteri in PBS a diverse concentrazioni in base all'applicazione prevista. Dopo la diluizione, proteggere i tubi dalla luce e porli sul ghiaccio.Diluire il fattore von Willebrand in acqua di grado laboratorio fino a una concentrazione finale di 50 microgrammi per millilitro. Diluire inoltre il collagene in soluzione di glucosio isotonica fino a una concentrazione finale di 160 microgrammi per millilitro. Quindi aggiungere 200 microlitri di ciascun rivestimento su una striscia di paraform.Posizionare i vetrini sopra le gocce per ricoprirli con le proteine. Incubare il vetrino in un contenitore umidificato per quattro ore a temperatura ambiente. Successivamente, sollevare con attenzione i vetrini dal paraform con un ago smussato e montare il vetrino nella parte inferiore di una camera a flusso per esperimenti con cellule endoteliali; ricoprire i vetrini di plastica con un millilitro di soluzione di gelatina al 1% in PBS e incubarli per 30 minuti a 37 gradi Celsius.Quindi seminare cellule endoteliali di vena ombelicale umana su coprioggetti di plastica rivestiti con gelatina e coltivarle fino a una confluenza del 70-80%. Montare il coprioggetto rivestito di proteina o il coprioggetto di plastica rivestito con cellule endoteliali nella parte inferiore della camera a flusso. Successivamente, collegare i tubi di ingresso e di uscita alla parte superiore della camera a flusso e connettere il tubo di uscita a un contenitore di rifiuti.Posizionare delicatamente la parte superiore della camera di flusso sulla parte inferiore e assemblare la camera di flusso, evitando la formazione di bolle d'aria. Iniettare un millilitro di mezzo attraverso la camera per verificare che non ci siano perdite e per rimuovere la soluzione di rivestimento in eccesso.Successivamente, configurare la pompa per infusione per una siringa da un millilitro in modo che fluisca a 75 microlitri al minuto. Lavorando in una stanza buia, riempire una siringa da un millilitro con un millilitro di batteri marcati con fluorescenza e inserirla nella pompa per infusione. Collegare l'uscita della siringa all'ingresso della camera di flusso.Avendo cura di evitare bolle d'aria, avviare la pompa di infusione per 10 minuti a 75 microlitri al minuto. Dopo 10 minuti, rimuovere la prima siringa e collegare una siringa da un millilitro contenente PBS o DMEM al tubo di ingresso. Avviare l'infusione, pompare e risciacquare per 10 minuti per eliminare eventuali batteri non legati.Dopo il risciacquo, lasciare il pompa per infusione accesa ed acquisire almeno 15 immagini in bianco e nero con un tempo di esposizione di 1,5 secondi in posizioni casuali, distribuite su tutta la superficie rivestita della camera di flusso. Utilizzando un programma di analisi delle immagini come Image J, sottrarre il fondo per rimuovere i fondali continui e uniformi dall'immagine e definire la soglia, impostando i valori di soglia inferiore e superiore, in modo da suddividere le immagini in scala di grigi in elementi di interesse. Successivamente, misurare l'area limitata alla nuova soglia creata e salvare questo valore, noto come area fluorescente, per ciascun campione.Sottoporre i topi di otto settimane di età a digiuno notturno prima dell'esperimento per ridurre il movimento intestinale. Il giorno dell'esperimento, iniziare iniettando 0,1 milligrammi di buprenorfina per chilogrammo di peso corporeo come analgesico. Successivamente, anestetizzare il topo e applicare un unguento sugli occhi.Posizionare il mouse sul tappetino riscaldante a temperatura controllata sotto la lente stereoscopica e verificare che il mouse non presenti riflesso plantare. Eseguire un'incisione di un centimetro parallela alla vena giugulare. Rimuovere la muscolatura cervicale del lato destro, quindi isolare la vena giugulare dai tessuti circostanti.Inserire un catetere endovenoso di due French nella vena giugulare destra e fissarlo in posizione mediante punti di sutura. Successivamente, praticare un'incisione addominale mediana per aprire la cavità peritoneale. Posizionare il topo sul fianco destro su una piastra trasparente e fissare la cannula con del nastro adesivo.Estrarre delicatamente gli intestini utilizzando bastoncini di cotone e distendere il mesenterio. Per visualizzare la circolazione arteriolare e venulare mesenterica. Posizionare una borsa riscaldata sul topo per prevenire l'ipotermia e aggiungere ogni 30 minuti 500 microlitri di NaCl 0,9% sugli intestini per evitare la disidratazione del tessuto.Utilizzare tamponi di cotone per immobilizzare i vasi e visualizzarli al microscopio invertito. Successivamente, applicare in modo topico cinque microlitri di una soluzione 10 millimolare di ionoforo del calcio quattro disciolto in DMSO. Questo indurrà il rilascio del fattore di Von Willebrand dalle cellule endoteliali dei vasi.Dopo 10 secondi, iniettare 100 microlitri di batteri marcati con fluorescenza attraverso il catetere giugulare. In questo momento, iniziare ad acquisire immagini in time-lapse, utilizzando lo strumento di acquisizione nella barra degli strumenti con 40 cicli di 1000 immagini al secondo. Al termine dell'acquisizione delle immagini, eutanasia il topo seguendo le linee guida istituzionali.Salvare le immagini in un formato di file immagine appropriato, quindi elaborare le immagini utilizzando il software di analisi ImageJ come descritto in precedenza. Per evidenziare il ruolo dello sforzo di taglio sull'adesione batterica, sono state effettuate perfusioni di Staphylococcus aureus a diversi tassi di taglio su coprioggetti rivestiti con fattore Von Willebrand. All'aumentare dei tassi di taglio, aumenta anche l'adesione batterica, indicando che forze di taglio elevate non inibiscono, ma rafforzano l'adesione dei batteri alla proteina. In assenza del fattore Von Willebrand, l'adesione di Staphylococcus aureus al collagene diminuisce all'aumentare dei tassi di taglio.Tuttavia, quando il fattore di Von Vand era presente nel mezzo, l'adesione dei batteri aumentava all'aumentare delle velocità di taglio; le cellule endoteliali attivate con un ionoforo del calcio per rilasciare il fattore Vand mostravano un'adesione batterica significativamente maggiore rispetto alle cellule non attivate. Inoltre, i batteri formavano tipici pattern a filamento di aggregati batterici marcati con fluorescenza, allineati nella direzione della forza di taglio, suggerendo il legame dei batteri lungo una molecola di VWF linearmente estesa. Per verificare l'effetto del fattore di Von Vbr in vivo, le cellule endoteliali della circolazione mesenterica sono state attivate per indurre il rilascio del fattore di Von Vbr, quindi cellule batteriche marcate con fluorescenza sono state introdotte nel flusso sanguigno. I batteri si sono aderiti localmente alla parete vascolare attivata e hanno formato aggregati.Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una migliore comprensione su come studiare l'interazione tra batteri e parete vascolare sotto stress di taglio, etichettando i batteri con un marcatore fluorescente e visualizzandoli sia in un modello in vitro con camera di flusso che in un modello in vivo di perfusione mesenterica intravitale. Questa tecnica apre la strada ai ricercatori nel campo delle infezioni cardiovascolari per esplorare l'interazione tra patogeni e parete vascolare nelle infezioni endocarditiche e metastatiche.

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Questo è un metodo per visualizzare l'adesione dei leucociti all'endotelio in raccolte serbatoi in pressione. La tecnica consente di studiare l'adesione vascolare in condizioni di flusso di taglio con differenti pressioni intraluminali fino a 200 mmHg così imitare-zione le condizioni fisiopatologiche di alta pressione sanguigna.

Imaging adesione dei leucociti all&#39;endotelio vascolare ad alta pressione intraluminale

Durante il processo di infezione, un passo fondamentale è l'adesione di patogeni con cellule ospiti. Nella maggior parte dei casi questo passo adesione avviene in presenza di sollecitazioni meccaniche generate dal flusso liquido. Descriviamo una tecnica che introduce sforzo di taglio come un parametro importante nello studio della adesione batterica.

L&#39;introduzione di shear stress nello studio di adesione batterica

Fonte: Ditkowski, B., et al. Un modello in vitro di un sistema di perfusione a placche parallele per studiare l'aderenza batterica ai tessuti dell'innesto. J. Vis. Esp. (2019).Questo video dimostra il metodo di utilizzo di una camera di flusso a piastre parallele per perfondere batteri marcati con fluorescenza su tessuti di innesto vascolare, consentendo un'analisi controllata dell'adesione batterica e della patogenesi precoce in condizioni di flusso di taglio.

Modello in vitro a flusso parallelo a placche per studiare l'adesione batterica in una biopsia tissutale

Fonte: Calatayud Arroyo, M., et al. Valutazione della vitalità di un consorzio batterico sintetico sull'interfaccia intestino-microbo ospite-microbo in vitro. J. Vis. Esp. (2018).Questo video dimostra un modello intestinale-microbio in vitro per studiare la vitalità batterica. Una co-coltura di cellule Caco-2 e HT29-MTX viene incubata con batteri pretrattati in condizioni digestive simulate. L'integrità della barriera epiteliale viene valutata utilizzando la resistenza elettrica...

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Micro-Parallel Plate Flow Chamber Model for Studying Bacterial Adhesion to Human Endothelial Cells

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An In Vivo Model to Study Shear-Dependent Bacterial Adhesion

Riportiamo un metodo in vitro che permette la quantificazione del numero effettivo di cellule adesive all'interno di un monostrato di cellule endoteliali.

La quantificazione di adesività delle cellule endoteliali<em&gt; In Vitro</em

Leucociti avidamente interagiscono con le cellule vascolari e le piastrine dopo lesione di parete del vaso o durante l'infiammazione. Qui, descriviamo un semplice test a flusso laminare per caratterizzare i meccanismi molecolari che sono alla base delle interazioni tra leucociti ed i loro partner cellulari.

Analisi di flusso laminare-based per indagare il reclutamento leucocitario su cellule vascolari coltivate e piastrine aderenti

Descriviamo un interno progettato in vitro camera modello di flusso, che permette l'indagine di aderenza batterica all'innesto di tessuti.

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