Name: Co-immunoprecipitazione della proteina mouse Mx1 con il virus nucleoproteina Influenza A (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Scopri la co-immunoprecipitazione per studiare l'interazione tra la proteina antivirale Mx1 e la nucleoproteina del virus Influenza A. Questo metodo rivela i meccanismi di difesa immunitaria.

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Questo lavoro è stato sostenuto da FWO-Vlaanderen, il progetto IOF IOF10 / stARTT / 027 e Università di Gand Special Research Grant BOF12 / GOA / 014.

Nota: La seguente protocollo trasfezione e co-immunoprecipitazione è stabilito per un formato piatto 9 centimetri Petri. Altri formati sono possibili anche dopo il ridimensionamento del protocollo. 1. Semina del rene embrionale umano (HEK) Cellule 293T <ol><li> Seme della cellule HEK293T un giorno prima trasfezione in 1,2 x 10 6 cellule per 9 centimetri piatto Petri in 12 ml di mezzo modificato Eagle di Dulbecco (DMEM) supplementato con siero fetale di vitello al 10%, 2 mM L-glutammina, 0,4 mM Na-piruvato, 0,1 mM aminoacidi non essenziali, 100 U / ml di penicillina e 0,1 mg / ml di streptomicina. </li><li> Crescere le cellule 16 ore a 37 ° C e 5% CO 2. </li><li> Ispezionare visivamente la morfologia e la vitalità delle cellule con un microscopio ottico invertito prima trasfezione. Le cellule devono essere sub-confluenti per una ottimale efficienza trasfezione. </li></ol> 2. calcio-fosfato Trasfezione delle cellule HEK293T Note: Uso 0.5-1 mg di pCAXL-NP o vuoto plasmide pCAXL in combinazione con 1-3 mg di pCAXL-MX1 per 9 centimetri piatto. Utilizzare una pari quantità di DNA plasmidico totale in tutti i campioni; regolare con vuoto plasmide, se necessario. <ol><li> Preparare i seguenti buffer di trasfezione: <ol><li> Preparare Tris-EDTA (TE) con concentrazioni di 1,0 mm Tris-HCl pH 8,0 e 0,1 mM EDTA pH 8.0. </li><li> Preparare BS / HEPES con concentrazioni di 25 mM HEPES (5,96 g / L, 4- (2-idrossietil) -1-acido piperazineethanesulfonic), 274 mM NaCl (16 g / L), KCl 10 mM (0,74 g / L), 1.5 mM NaHPO 4 · 12H 2 O (0,5 g / L) e destrosio mM 11,1 (2 g / L). Regolare il pH a 7,05. </li><li> Preparare CaCl 2 / HEPES con concentrazioni di 1,25 M CaCl 2 · 2H 2 O (183,8 g / L) e 125 mM HEPES (29.79 g / L). Regolare il pH a 7,05 con NaOH. </li></ol></li><li> Riscaldare i buffer di transfezione a 37 ° C prima dell&#39;uso. </li><li> Preparare i campioni plasmide diluendo il DNA plasmide in 600 ml di TE.Preparare queste miscele in pozzetti di una piastra da 6 pozzetti. </li><li> Aggiungere 150 ml di CaCl 2 / HEPES in modo saggio goccia ai campioni plasmide e mescolare pipettando 3 volte su e giù. </li><li> Preparare la soluzione trasfezione goccia saggio aggiungendo la soluzione plasmide (TE + DNA + CaCl 2 / HEPES; 750 ml) a 750 ml di buffer di BS / HEPES forniti in un 6-pozzetti fresco. Distribuire la soluzione plasmide uniformemente sul BS buffer di completo benessere contenente / HEPES. </li><li> Agitare la soluzione trasfezione su un agitatore per 90 secondi a 1.000 RPM. </li><li> Incubare la miscela per 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Aggiungere la soluzione trasfezione (1,5 ml) gocciolamento alle cellule. Utilizzare una micropipetta P1000 a gocciolare la soluzione trasfezione sulle cellule. Disperdere il composto sulla completa 9 centimetri piastra di Petri e scuotere la piastra molto delicatamente. </li><li> Incubare le cellule a 37 ° C e 5% CO 2 per 6 ore. Quindi rimuovere il supporto per aspirazione e sostituire immediatamente with 12 ml fresco medio, pre-riscaldata. Aggiungere delicatamente il mezzo fresco alle cellule per evitare il distacco delle cellule. Per questo, tenere la punta della pipetta contro il lato del pozzo e delicatamente spingere fuori il mezzo. </li><li> Incubare le cellule per un ulteriore 16 ore a 37 ° C e 5% CO 2. </li></ol> 3. Co-immunoprecipitazione Nota: Eseguire la co-immunoprecipitazione 24 ore dopo la trasfezione. <ol><li> Preparazione del tampone di lisi basso sale e tampone di lavaggio di sale. <ol><li> Preparare una soluzione madre di 2 M N-etilmaleimmide (NEM), pesando la quantità di NEM e sciogliere in etanolo assoluto. Preparare la soluzione di riserva NEM fresco prima dell&#39;uso. ATTENZIONE: NEM è molto tossico, preparare e utilizzare questa soluzione madre in una cappa aspirante. </li><li> Preparare basso tampone di lisi sale a concentrazioni di 50 mm Tris-HCl pH 8, 150 mM NaCl, 5 mM acido etilendiamminotetraacetico (EDTA), 1% NP40 e un cocktail inibitore della proteasi (sciogliere 1 tavolot in tampone di lisi 50 ml). Aggiungere NEM ad una concentrazione finale di 25 mM (cioè, diluire 1:80). Tenere sul ghiaccio dopo aver aggiunto gli inibitori della proteasi e NEM. Nota: aggiungere sempre gli inibitori della proteasi e NEM momento, poco prima dell&#39;uso. </li><li> Preparare un sale tampone di elevata lavaggio a concentrazioni di 50 mm Tris-HCl pH 8, NaCl 500 mm, 5 EDTA mm e 1% NP40. Si noti che il tampone di lavaggio di sale non contiene NEM. </li></ol></li><li> Preparazione dei lisati cellulari. <ol><li> Rimuovere il supporto e lavare le cellule con 2 ml di ghiaccio freddo fosfato salina tamponata (PBS). Aggiungere molto delicatamente il tampone di lavaggio, come cellule HEK293T staccano facilmente. </li><li> Rimuovere la PBS e aggiungere 600 ml di ghiaccio freddo tampone di bassa lisi sale per 9 centimetri piastra di Petri. </li><li> Incubare le piastre per 20 minuti in ghiaccio. Assicurarsi che le piastre sono tenuti orizzontali, per assicurare una copertura completa della superficie della piastra con tampone di lisi. Agitare delicatamente le piastre ogni 5 min. </li><li> Raccogliere il lisato cellulare in una microcentrifuga da 1,5 mlprovetta e centrifugare per 3 min a 4 ° C e 16.000 xg a pellet frazione insolubile. </li><li> Trasferire la frazione solubile, cioè il lisato cellulare ad un nuovo 1,5 ml provetta e tenere in ghiaccio. Continuare immediatamente con il protocollo di co-immunoprecipitazione, per impedire la dissociazione delle proteine ​​interagenti. Eseguire le seguenti operazioni per quanto possibile su ghiaccio oppure a 4 ° C per limitare l&#39;attività proteolitica nei lisati. </li></ol></li><li> Generazione di immuno-complessi. Nota: In questo passaggio, la proteina di interesse è vincolata dalla anticorpi appropriati. Per studiare l&#39;interazione NP-MX1, utilizzare un anti-NP anticorpo monoclonale mouse. <ol><li> Per ogni campione, miscelare 135 ml di lisato con 2 ml di anticorpo monoclonale anti-NP e 113 ml di tampone di lisi sale basso (volume totale di 250 microlitri). Conservare il lisato rimasto a -20 ° C per ulteriori analisi, come western blotting, per documentare i livelli di espressione del Intera ipotizzatopartner ction nelle cellule transfettate. Nota: In alternativa, misurare la concentrazione di proteine ​​del lisato (ad esempio con reagente di Bradford) e usare una quantità fissa di proteine ​​totali, per esempio, 400 mg, per ciascun lisato. </li><li> Incubare la miscela anticorpi lisato per 3 ore su una ruota che gira a 4 ° C. Questo passaggio può essere esteso ad una notte di incubazione. </li></ol></li><li> Preparazione della proteina G perline. Nota: Le perle di proteine ​​G sono spediti e conservati in etanolo al 20% per la conservazione. Il tallone-slurry normalmente consiste di 50% perle e perline questi devono essere lavati prima di essere utilizzati per immunoprecipitare i complessi immuni. <ol><li> Usare 50 ml di perline, cioè 100 ml di bead-liquami, per ogni campione. Lavare la quantità di perline necessari per tutti i campioni del test co-immunoprecipitazione in un tubo. Tagliare la punta di una punta di pipetta 1 ml per facilitare pipettato la bead-sospensione. </li><li> Centrifugare la proteina G bead-liquami a 8.000 xge 4 ° C per 30 sec. Rimuovere la soluzione di etanolo ed aggiungere un volume uguale di tampone di lisi basso sale. Centrifugare la proteina G tallone-slurry a 8.000 xg e 4 ° C per 30 sec e rimuovere il surnatante delicatamente. Ripetere questa operazione di lavaggio per 3 volte. Nota: Il buffer bassa lisi sale usato per lavare le perline non deve contenere inibitori della proteasi o NEM. </li><li> Stimare il volume di proteine ​​G perline e aggiungere un uguale volume di tampone bassa lisi di sale per fare un nuovo 50% bead-sospensione in tampone di lisi basso sale. </li><li> Per ciascun campione, trasferire 100 ul di tallone-slurry in una nuova provetta da 1,5 ml e memorizzare in ghiaccio fino al momento dell&#39;uso. Attenzione per risospendere il tallone-slurry prima di dividere, come queste perle sedimentano rapidamente al fondo della provetta. </li></ol></li><li> Immunoprecipitazione dei complessi immuni da proteine ​​G perline e la loro eluizione. <ol><li> Prima di utilizzare le proteine ​​G perline per immunoprecipitazione, centrifuga tutte le provette 30 sec a 8000 xg e 4 ° C everificare mediante ispezione visiva che c&#39;è una quantità uguale di perline presente in tutti i campioni. Se necessario regolare la quantità di perline in alcuni dei campioni e centrifugare di nuovo. Scartare il surnatante. Fare attenzione a non disturbare le proteine ​​G perline pellet. </li><li> Centrifugare brevemente i complessi immuni (es., Lisati con anticorpi, 250 microlitri) per 30 secondi a 8000 xg e 4 ° C per raccogliere il campione completa sul fondo della provetta. Trasferire i complessi immuni alla proteina G perline (50 microlitri). </li><li> Incubare 60 min su una ruota che gira a 4 ° C. Non incubare questi complessi immunitari più di 75 minuti con le perline per ridurre legame aspecifico di proteine ​​alle proteine ​​G perline. </li><li> Centrifugare le proteine ​​G (con perle legate complessi immuni) per 30 sec a 8000 xg e 4 ° C e rimuovere il surnatante. Fare attenzione a non disturbare le proteine ​​G perline pellet. Opzionale: memorizzare questo supernatanti a 4 ° C o -20 ° C per una successiva analisi,ad esempio, per stimare la quantità di proteina non legata. </li><li> Lavare le proteine ​​G perline per circa 5 minuti con 900 ml di tampone di lisi di sale. Assicurarsi che le perle sono completamente risospese nel tampone di lavaggio per il lavaggio ottimale. Centrifugare le proteine ​​G perline per 30 sec a 8000 xg e 4 ° C e scartare il surnatante. Ripetere questa operazione di lavaggio 4 volte. Fare attenzione a non disturbare le perline proteine ​​G pellet per evitare la perdita di materiale immunoprecipitato. </li><li> Dopo l&#39;ultima fase di lavaggio, aggiungere 50 ml di tampone campione 2x Laemmli ai talloni, riscaldare la sospensione per 10 min a 95 ° C per eluire i (co) proteine ​​immunoprecipitate. <ol><li> Preparare 10 ml di tampone Laemmli 6x con 1 g di sodio dodecil solfato, 3,5 ml di glicerolo, 3,5 ml di 1 M Tris-HCl pH 6,8 e 420 ml di β-mercaptoetanolo. Regolare ad un volume totale di 10 ml aggiungendo acqua distillata. Diluire 3 volte in acqua distillata per ottenere tampone 2x Laemmli. ATTENZIONE: &amp;# 946; -mercaptoethanol è tossico, preparare e usare tampone Laemmli in una cappa aspirante. </li></ol></li><li> Dopo il riscaldamento, centrifugare le proteine ​​G perline per 30 sec a 8000 xg e conservare i campioni a 4 ° C (a breve termine) o -20 ° C (a lungo termine). </li></ol></li></ol> 4. Analizzare il (co) immunoprecipitati Proteine <ol><li> Visualizzare le proteine ​​presenti nel lisato cellulare e eluato della co-immunoprecipitazione mediante SDS-PAGE e Western blotting 20 21,22. Caricare Tipicamente metà eluato Laemmli su gel. Fare attenzione a non disturbare le perline G proteine ​​pellet quando il prelievo di campioni per il gel di carico. MX1 ed espressione NP sono stati rivelati con un anti-MX1 e anticorpi-NP contro, rispettivamente, 14. Le bande sono state rilevate con chemiluminescenza a base di HRP ed uno sviluppatore pellicola X-ray. </li></ol>

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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Studiare l&#39;interazione tra le proteine ​​antivirali e ai loro obiettivi virale è molto importante per comprendere i dettagli del meccanismo antivirale di queste proteine. Questo può dare nuove intuizioni come i virus ei loro ospiti co-evoluti e sarà la base per lo sviluppo di nuove strategie antivirali. Il protocollo di co-immunoprecipitazione ottimizzata qui descritto consente di studiare l&#39;interazione tra la proteina del mouse MX1 suo bersaglio virale, la proteina influenza NP. L&#39;aspetto più importante di ...

Resistenza Myxovirus (Mx) proteine ​​sono una parte importante della difesa immunitaria innata contro i patogeni virali. Queste proteine ​​sono grandi GTPases Dynamin simili che sono indotti da tipo I e tipo III interferoni. I corrispondenti geni Mx sono presenti in quasi tutti i vertebrati in una o più copie e loro prodotti genici inibiscono un&#39;ampia gamma di virus, compresi Orthomyxoviridae (ad es., Virus dell&#39;influenza), Rhabdoviridae (ad es., Virus della stomatite vescicolare), Bunyaviridae (es. , virus crosse la) e Retroviridae (ad esempio, il virus dell&#39;immunodeficienza umana-1) 1-4. Non è chiaro come queste proteine ​​riconoscono una così ampia gamma di virus, senza alcuna sequenza primaria apparente condiviso motivi in ​​questi virus. Analizzando l&#39;interazione delle proteine ​​Mx con i loro obiettivi virali, potenzialmente coinvolge complessi di ordine superiore con altri fattori della cellula ospite, aiuterà a comprendere i meccanismi molecolari tCappello si sono evoluti nella corsa agli armamenti tra virus e loro ospiti. L&#39;interazione tra le proteine ​​di mammiferi Mx e target virali è stato studiato più ampiamente per MxA umana. MxA umana può inibire la replicazione di molti virus, tra cui il ortomixovirus influenza A e virus Thogoto. MxA lega complessi ribonucleoproteici virus Thogoto (vRNPs), impedendo così il loro ingresso nucleare, che si traduce nel blocco di infezione 5. Questa interazione tra MxA e Thogoto vRNPs virus è stata dimostrata con il co-sedimentazione e co-immunoprecipitazione esperimenti 6-9. Come proteine ​​Mx ostacolano virus dell&#39;influenza A è meno chiaro. Uno dei problemi principali è che non è semplice dimostrare una interazione tra una proteina Mx e un prodotto genico influenza. Un rapporto ha dimostrato un&#39;interazione tra MxA umana e la proteina NP in influenza A virus cellule infettate 10. Questa interazione può essere visualizzato solo dal co-immunoprecipitation se le cellule erano stati trattati con le ditiobis reticolanti reagenti (succinimidil propionato) prima lisi, suggerendo che l&#39;interazione è transitorio e / o debole. Studi più recenti hanno dimostrato che la sensibilità Mx differenziale di diversi ceppi di influenza A è determinata dall&#39;origine della proteina NP 11,12. In linea con questo, i virus influenzali A possono sfuggire in parte dal controllo Mx mutando residui specifici nella proteina NP 13. Questo suggerisce che l&#39;obiettivo principale del virus dell&#39;influenza per host MX è la proteina NP, probabilmente NP assemblato in complessi vRNP. Tuttavia, nessuno di questi studi più recenti hanno dimostrato una interazione tra influenza NP o vRNPs e sia umana MxA o il mouse MX1. Recentemente abbiamo mostrato, per la prima volta, una interazione tra l&#39;influenza NP e la proteina Mx1 mouse con un protocollo ottimizzato co-immunoprecipitazione 14, che è qui descritto in dettaglio. In generale, i co-mmunoprecipitation è uno degli approcci biochimici più frequentemente utilizzati per indagare le interazioni proteina-proteina. Questa tecnica è spesso preferito su tecniche alternative, ad esempio, due ibridi di lievito, in quanto consente di studiare le interazioni proteina-proteina nel loro ambiente naturale. Co-immunoprecipitazione può essere eseguita su proteine ​​espresse endogenamente se sono disponibili anticorpi contro le proteine ​​di interesse. In alternativa, le proteine ​​di interesse possono essere espressi nella cellula attraverso trasfezione o infezione e un tag di affinità possono essere utilizzati. Oltre ai vantaggi sopra menzionati, il protocollo di co-immunoprecipitazione descritto consente il rilevamento di interazioni deboli e / o transitori proteine. Il componente principale di questo protocollo ottimizzato è l&#39;aggiunta di N-etilmaleimmide (NEM) nel tampone di lisi cellulare. NEM è un reagente alchilante che reagisce con i gruppi tiolici liberi come presente in cisteine, a pH 6,5-7,5, per formare una stabile tio-estere(Figura 1). Al più alto pH, NEM può anche reagire con gruppi amminici o subire l&#39;idrolisi 15. NEM è in genere utilizzato per bloccare gruppi tiolo gratuito, al fine di prevenire la formazione di legami disolfuro o inibire l&#39;attività enzimatica. Ad esempio, NEM è spesso usato per bloccare enzimi desumoylating, che sono cisteina proteasi. Nel protocollo co-immunoprecipitazione descritto, NEM è stato inizialmente incluso nel tampone di lisi perché era stato riferito che la sumoilazione delle proteine ​​influenza può influenzare l&#39;interazione tra proteine ​​virali 16. Inaspettatamente, l&#39;aggiunta di NEM rivelata chiave per documentare l&#39;interazione tra influenza NP e mouse Mx1 mediante co-immunoprecipitazione. Non è chiaro perché l&#39;aggiunta di NEM è cruciale per rilevare l&#39;interazione NP-MX1. Forse l&#39;interazione è troppo transitoria e / o debole. NEM potrebbe stabilizzare l&#39;interazione, ad esempio, conservando una specifica conformazione MX1 una proteina virale o anche un terzo compo sconosciutanente. Tale effetto stabilizzante di NEM è stato osservato in precedenza, ad esempio, per l&#39;interazione tra la ribonucleotide reduttasi M1 e la sua gemcitabina inibitore (F2dC) 17. MX1 e NP entrambi contengono più residui di cisteina che potrebbero essere modificati da NEM. Ad esempio, un recente studio condotto da Rennie et al. Hanno dimostrato che un stalkless MxA variante contiene tre residui di solventi cisteina esposti che possono essere modificate da iodoacetamide. Mutando questi residui di serine non ha influenzato l&#39;attività enzimatica di MxA, ma impedisce l&#39;aggregazione disolfuro-mediata 18. Poiché questi cisteine ​​sono conservati in MX1, questo suggerisce che le cisteine ​​analoghe in MX1 possono essere modificati da NEM e come tale influenza la sua conformazione e solubilità. Inoltre, NEM potrebbe anche influenzare l&#39;attività di GTPasi Mx1, che è essenziale per l&#39;attività anti-influenzale di MX1, stabilizzando così l&#39;interazione tra MX1 e NP. Tuttavia, un effetto diretto di NEM sul GTPase actività di Mx1 è improbabile, come NEM è necessario anche per rilevare l&#39;interazione tra l&#39;influenza NP e GTPase mutanti inattivi della proteina Mx1 14. Chiaramente, sono necessarie ulteriori ricerche per chiarire l&#39;effetto del NEM sull&#39;interazione NP-MX1. In sintesi, il protocollo di co-immunoprecipitazione descritto consente di studiare l&#39;interazione tra la proteina Mx1 antivirale e il suo bersaglio virale, la proteina influenza NP. Questo protocollo può essere utilizzato anche per studiare altre interazioni deboli o transitori che dipendono dalla stabilizzazione specifiche conformazioni proteiche. Interazione proteina-proteina che dipendono conformazioni specifiche sono state descritte in precedenza, ad esempio, per le proteine ​​leganti il calcio come calmodulina 19. Infine, il ruolo benefico di NEM potrebbe essere utilizzato anche in altri metodi che rilevano interazioni proteina-proteina, come saggi co-sedimentazione.

<table><tbody><tr><td>DMEM alto glucosio</td><td>Gibco</td><td>52100-047</td><td></td></tr><tr><td>N-etilmaleimmide</td><td>Sigma</td><td>E-3876</td><td>tossico</td></tr><tr><td>Igepal CA-630</td><td>Sigma</td><td>I-30212</td><td>noto anche come NP40</td></tr><tr><td>Cocktail di inibitori della proteasi</td><td>Roche</td><td>11 873 580 001</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo monoclonale anti-NP</td><td>NIH Biodifesa e infezioni emergenti Archivio</td> <td>delle risorse di ricercaNR-4282</td><td>ascite miscela di cloni A1 e A3</td></tr><tr><td>siero policlonale anti-RNP</td><td>NIH Biodefense and Emerging Infections Research Resources Repository</td><td>NR-3133</td><td>diretto contro A/Scotland/840/74 (H3N2)</td></tr><tr><td>Protein G Sepharose 4FF</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0618-01</td><td></td></tr><tr><td>Hyperfilm ECL 18 x 24 cm</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9068-36</td><td></td></tr><tr><td>ECL western blotting substrato</td><td>Pierce</td><td>Telefono 32106</td><td></td></tr></tbody></table>

co-immunoprecipitazione della proteina mouse mx1 con il virus nucleoproteina influenza a

Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein

Studiare l'interazione tra le proteine è fondamentale per comprendere le loro funzioni. Un metodo molto potente che viene spesso utilizzato per studiare le interazioni delle proteine con altre macromolecole in un campione complesso è chiamato co-immunoprecipitazione. Il protocollo di co-immunoprecipitazione descritto consente di dimostrare e approfondire l'interazione tra la proteina 1 di resistenza ai mixovirus antivirali (Mx1) e uno dei suoi bersagli virali, la nucleoproteina (NP) del virus dell'influenza A. Il protocollo inizia con cellule di mammifero trasfettate, ma è anche possibile utilizzare cellule infette dal virus dell'influenza A come materiale di partenza. Dopo la lisi cellulare, la proteina NP virale viene estratta con un anticorpo specifico e gli immunocomplessi risultanti vengono precipitati con perle di proteina G. Il successo del pull-down di NP e la co-immunoprecipitazione della proteina antivirale Mx1 sono successivamente rivelati dal western blotting. Un prerequisito per il successo della co-immunoprecipitazione di Mx1 con NP è la presenza di N-etilmaleimmide (NEM) nel tampone di lisi cellulare. NEM, gruppi tiolici liberi da alchilati. Presumibilmente questa reazione stabilizza l'interazione debole e/o transitoria NP-Mx1 preservando una specifica conformazione di Mx1, il suo bersaglio virale o un terzo componente sconosciuto. Un'importante limitazione degli esperimenti di co-immunoprecipitazione è il pull-down involontario di proteine contaminanti, causato dal legame non specifico di proteine alle perle di proteina G o agli anticorpi. Pertanto, è molto importante includere le impostazioni di controllo per escludere i risultati falsi positivi. Il protocollo di co-immunoprecipitazione descritto può essere utilizzato per studiare l'interazione delle proteine Mx di diverse specie di vertebrati con proteine virali, qualsiasi coppia di proteine o di una proteina con altre macromolecole. Il ruolo benefico della NEM nello stabilizzare le interazioni deboli e/o transitorie deve essere testato individualmente per ogni coppia di interazioni.

N-etilmaleimmide è un composto organico che può essere utilizzato per modificare irreversibilmente gruppi tiolici liberi, ad esempio per inibire proteasi cisteina (Figura 1). La proteina antivirale Mx1 inibisce la replicazione del virus influenzale A interagendo con la nucleoproteina virale. Il protocollo di co-immunoprecipitazione ottimizzato qui descritto permette di studiare questa interazione NP-MX1. HEK293T cellule sono state trasfettate con vettori di espressi...

Questo protocollo di co-immunoprecipitazione permette di studiare l'interazione tra la nucleoproteina del virus dell'influenza A e la proteina antivirale Mx1 nelle cellule umane. Il protocollo sottolinea l'importanza della N-etilmaleimmide per il successo della co-immunoprecipitazione della nucleoproteina del virus Mx1 e dell'influenza A.

Co-immunoprecipitazione della proteina mouse Mx1 con il virus nucleoproteina Influenza A

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions ...

L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare l'interazione tra la proteina antivirale MX1 e il suo bersaglio virale, la nucleoproteina dell'influenza, mediante co-immunoprecipitazione. Questo viene ottenuto innanzitutto lisando cellule trasfettate contenenti entrambe le proteine in presenza di IDE. Il secondo passaggio consiste nell'aggiungere un anticorpo specifico per la nucleoproteina dell'influenza in grado di legare la nucleoproteina virale e la proteina MX1 interagente.Successivamente, i complessi immunitari ottenuti vengono precipitati mediante perle di proteina G e le proteine contaminanti vengono eliminate attraverso numerosi lavaggi. L'ultimo passaggio consiste nell'eluire la proteina nucleare dell'influenza e la proteina MX1 co-precipitata dalle perle di proteina G. Infine, viene utilizzato il western blotting per dimostrare l'interazione tra la proteina nucleare dell'influenza e la proteina antivirale MX1.Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come questi due ibridi è che le proteine interagenti si trovano nel loro ambiente naturale, ovvero la cellula umana. Questo metodo può fornire informazioni sull'interazione tra la proteina nucleare del virus dell'influenza e la proteina antivirale AMX1, ma può anche essere modificato per studiare altre interazioni proteina-proteina deboli o transitorie. La tecnica verrà dimostrata nella figura da un collega del mio laboratorio; preparare tutti i tamponi per la trasfezione come descritto nel protocollo testuale allegato.Diluire il DNA plasmatico in 600 microlitri di tampone tris EDTA. Quindi aggiungere 150 microlitri di cloruro di calcio tampone heaps in modo goccia a goccia ai campioni di plasmide, mescolando mediante pipettaggio su e giù per tre volte. Aggiungere il risultato in 750 microlitri di soluzione di plasmide, in modo goccia a goccia, a 750 microlitri di soluzione salina tampone heaps posti in una nuova piastra a sei pozzetti.Assicurarsi di distribuire uniformemente la soluzione plasmidica su tutta la superficie del pozzetto. Successivamente, posizionare la soluzione di trasfezione su un agitatore per piastre per 90 secondi a 1000 giri al minuto, quindi incubare il miscuglio a temperatura ambiente per cinque minuti. Prendere una piastra di Petri da nove centimetri rivestita per colture cellulari con cellule HEC 2 9 3 T, che risultino subconfluenti nel giorno della trasfezione.Utilizzando una micropipetta P 1000, aggiungere la soluzione di trasfezione goccia a goccia alle cellule, assicurandosi di distribuire uniformemente la miscela su tutta la piastra. Una volta aggiunti tutti i 1,5 millilitri di soluzione di trasfezione, agitare delicatamente la piastra e incubare le cellule a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per sei ore. Quindi aspirare il mezzo e sostituirlo immediatamente con 12 millilitri di mezzo fresco preriscaldato, aggiunto con delicatezza.Per evitare il distacco delle cellule. Preparare tutte le soluzioni stock di lisi come descritto nel protocollo testuale allegato. Una volta preparate, lavare le cellule con due millilitri di PBS freddo di ghiaccio. Eseguire il lavaggio delicatamente poiché le cellule HEC 2 9 3 T si staccano facilmente.Successivamente, rimuovere il PBS e aggiungere 600 microlitri di tampone di lisi a basso contenuto salino, freddo di ghiaccio, in ogni piastra. Posizionare le piastre sul ghiaccio per 20 minuti, agitando delicatamente ogni piastra ogni cinque minuti e assicurandosi che le piastre siano mantenute in posizione orizzontale. Raccogliere il lisato cellulare in una provetta microcentrifuga da 1,5 millilitro e centrifugare per tre minuti a quattro gradi Celsius e 16.000 ×g per ottenere il pellet della frazione insolubile. Trasferire la frazione solubile in una nuova provetta microcentrifuga da 1,5 millilitro e posizionarla sul ghiaccio.Eseguire i passaggi rimanenti il più possibile sul ghiaccio o a quattro gradi per limitare l'attività proteolitica nei lisati. Per preparare i complessi immunitari, mescolare 135 microlitri di lisato con due microlitri di anticorpo monoclonale anti NP e 113 microlitri di buffer di lisi a basso sale. Per un volume totale di 250 microlitri, conservare il lisato rimanente a meno 20 gradi Celsius.Per ulteriori analisi come il western blotting, incubare la miscela di lisato con l'anticorpo da tre ore a tutta la notte su un dispositivo rotante a quattro gradi Celsius. Successivamente, preparare le perle di proteina G aggiungendo 100 microlitri di sospensione di perle per ogni campione in un singolo tubo. Centrifugare la sospensione a 8.000 ×g e a quattro gradi Celsius per 30 secondi ed eliminare la soluzione di etanolo in cui sono conservate.Aggiungere un volume uguale di tampone di lisi a basso contenuto salino, freddo di ghiaccio, e mescolare delicatamente. Centrifugare nuovamente la sospensione di perle di proteina G a 8.000 ×g e 4 °C per 30 secondi, quindi rimuovere con attenzione il soprannatante. Stimare il volume di perle di proteina G rimanenti e aggiungere un volume uguale di tampone di lisi a basso contenuto salino, freddo di ghiaccio, per ottenere una nuova sospensione al 50% di perle nel tampone di lisi a basso contenuto salino.Sospendere la sospensione e trasferire 100 microlitri in un nuovo tubo da centrifuga da 1,5 millilitri. Conservare il tubo sul ghiaccio fino al momento dell'utilizzo. Prima di usare le perle di proteina G per l'immunoprecipitazione, centrifugare tutti i tubi per 30 secondi a 8.000 × g e a 4 °C. Successivamente, verificare mediante ispezione visiva che tutte le provette contengano quantità uguali di perle.Se necessario, regolare la quantità di perle in alcuni dei campioni e centrifugare nuovamente. Una volta che tutti i campioni risultano uguali a circa 50 microlitri, eliminare i soprannatanti avendo cura di non disturbare le perle di proteina G pellettizzate. Successivamente, centrifugare brevemente i complessi immunitari per 30 secondi a 8.000 ×g e a quattro gradi Celsius per raccogliere il campione sul fondo della provetta.Trasferire quindi l'intero complesso immunitario sulle perle di proteina G. Incubare per 60 minuti su un dispositivo rotante a quattro gradi Celsius. Non incubare i complessi immunitari con le perle di proteina G per più di 75 minuti. Un'incubazione più lunga aumenta il legame non specifico delle proteine alle perle di proteina G.Quindi centrifugare le perle di proteina G con i complessi immunitari ora legati. Rimuovere i soprannatanti, avendo cura di non disturbare le perle di proteina G sedimentate. Successivamente, lavare le perle di proteina G per circa cinque minuti con 900 microlitri di buffer di lisi ad alto sale.Assicurarsi che le perle siano completamente risospese nel buffer di lavaggio. Per un lavaggio ottimale, centrifugare le perle di proteina G per 30 secondi a 8.000 ×g e a quattro gradi Celsius, quindi scartare i soprannatanti. Fare attenzione a non disturbare le perle di proteina G sedimentate per evitare la perdita del materiale immuno-precipitato.Dopo l'ultimo passaggio di lavaggio, aggiungere 50 microlitri di buffer campione 2x a gel denaturato alle perline e riscaldare la sospensione per 10 minuti a 95 gradi Celsius per eluire le proteine precipitate. Dopo il riscaldamento, centrifugare le perline di proteina G per 30 secondi a 8.000 × g.Quindi conservare i campioni a quattro gradi Celsius se verranno utilizzati immediatamente oppure a meno 20 gradi Celsius per la conservazione a lungo termine. Qui è mostrato un immunoblotting di un esperimento di co-immunoprecipitazione in cui due campioni, uno contenente sia la proteina antivirale MX1 che le proteine nucleari del virus dell'influenza di tipo A, e un controllo in cui è presente soltanto la proteina MX1. Questo risultato dimostra che la proteina MX1 viene co-immunoprecipitata solo in presenza della proteina nucleare del virus dell'influenza di tipo A espressa in co-tempero.Qui si può osservare l'importanza dell'uso dell'agente alchilante N ide. Quando si preparano i lisati cellulari in presenza di N ylm, l'interazione NP MX one può essere rilevata, ma in assenza di questo composto, tale interazione non è rilevabile. Questo metodo è molto versatile e può essere utilizzato per valutare la co-immunoprecipitazione di MX one con la proteina nucleare dell'influenza, un virus, proveniente da lisati derivati da cellule trasfettate, cellule infette o da varians.Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come eseguire un esperimento di co-immunoprecipitazione. Inoltre, l'aggiunta di un mezzo alla lisi cellulare permette di studiare interazioni proteina-proteina deboli o transitorie, come l'interazione tra la proteina nucleare del virus dell'influenza A e la proteina antivirale Amex1.

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