Name: Generazione di pluripotenti indotte cellule staminali da congelata Buffy cappotti con non-integrazione episomiale Plasmidi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 52 s
Description: Impara a generare cellule staminali pluripotenti indotte da buffy coat congelati utilizzando plasmidi episomiali non integranti. Questo metodo virus-free e conveniente permette la riprogrammazione di cellule mononucleate del sangue periferico umano.

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Lo studio è stato sostenuto dal Ministero della Salute e dal Dipartimento dell'Assistenza Educativa, Università e Ricerca della Provincia Autonoma di Bolzano e dalla Fondazione Sparkasse dell'Alto Adige.

Cellule mononucleari del sangue periferico (PBMNCs) sono stati isolati da campioni di sangue periferico di donatori sani, dopo firmato il consenso informato e l&#39;approvazione del Comitato Etico della Provincia di Bolzano. Gli esperimenti sono stati condotti in conformità con i principi espressi nella Dichiarazione di Helsinki. Tutti i dati sono stati raccolti e analizzati in modo anonimo. 1. Isolamento di cellule mononucleate del sangue periferico (PBMNCs) <ol><li> PBMNCs ottenuti da buffy coats dopo centrifugazione del sangue intero, senza separazione gradiente di densità. <ol><li> Raccogliere 8 mL di sangue periferico venoso in un citrato di sodio tamponata tubo di plastica, e conservare a RT (25 ° C). Sangue di processo entro 12 ore dal prelievo. </li><li> Centrifugare la provetta a 2.000 xg per 15 min a 4 ° C in un rotore secchio oscillante, i freni centrifuga spegnimento. </li><li> Raccogliere nuvoloso buffy coat (strato tra la fase di plasma superiore e quella inferioreFase contenente la maggior parte degli eritrociti), contenente la frazione PBMNC arricchito (500 microlitri) in una provetta esageratamente. </li><li> Risospendere 500 ml di buffy coat con 500 pl di mezzo 2x congelamento contenente 90% FBS e 20% DMSO, in modo da ottenere un volume totale di 1 ml con concentrazione DMSO 10%. </li><li> Blocca il flacone in un contenitore di congelamento a velocità controllata a -80 ° C. Cellule Conservare in azoto liquido per periodi più lunghi. </li></ol></li><li> PBMNCs ottenuti dopo la separazione gradiente di densità <ol><li> Raccogliere 12 ml di sangue periferico venoso in citrato di sodio tamponata tubo di plastica, e conservare a temperatura ambiente. Sangue di processo entro 12 ore dal prelievo. </li><li> Diluire il sangue con PBS sterile fino ad un volume finale di 35 ml. </li><li> Cautela e lentamente, strato 35 ml di sangue diluito su 15 ml di soluzione di polysucrose (utilizzata per la separazione gradiente di densità) (p = 1.077) in una provetta conica da 50 ml (rapporto 3: 1). </li><li> Centrifugare la provetta a 800 xg per 30 min a RTun rotore bucket oscillante, i freni centrifuga spegnimento. </li><li> Aspirare la parte superiore, la fase gialla contenente plasma ed eliminarla. Cautela, trasferire lo strato interfase bianco opaco contenente PBMNCs in una nuova provetta conica da 50 ml. </li><li> Portare il volume totale di 30 ml con PBS sterile e centrifugare a 300 xg per 10 min a RT. </li><li> Eliminare il surnatante e risospendere le cellule con 30 ml di PBS. Contare il numero di cellule vitali, sulla base di trypan esclusione blu 25. </li><li> PBMNCs centrifuga a 300 xg per 10 minuti a temperatura ambiente, aspirare il surnatante e gettarlo. </li><li> Risospendere il pellet di cellule in una quantità appropriata di medie congelamento contenente 90% FBS e 10% DMSO, in modo da ottenere una concentrazione di 5 x 10 6 cellule / ml. </li><li> Aliquotare 1 ml per flacone (circa 5 x 10 6 cellule / ml) e congelare la fiala in un tasso controllato congelamento contenitore a - 80 ° C. Cellule Conservare in azoto liquido per periodi più lunghi. </li></ol&gt; </li></ol> 2. di scongelare e placcatura di PBMNCs (DAY 0) <ol><li> PBMNCs ottenuti da buffy coats dopo centrifugazione del sangue intero, senza separazione gradiente di densità. <ol><li> Per avviare il protocollo utilizzando PBMNCs di buffy coat congelati, scongelare 1 fiala di cellule in un bagno d&#39;acqua a 37 ° C e diluire il buffy coat con PBS sterile fino ad un volume finale di 2 ml. </li><li> Trasferire il buffy coat diluito in una provetta da 50 ml, aggiungere 10 ml di tampone di lisi dei globuli rossi e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Per preparare 500 ml di tampone di lisi dei globuli rossi, aggiungere 0,5 g di bicarbonato di potassio, 4.145 g di cloruro di ammonio, 100 ml di soluzione 0,5 M EDTA a 500 ml di acqua ultrapura, pH 7,2-7,4. </li><li> Portare il volume totale di 50 ml con PBS sterile e centrifugare a 300 xg per 10 min a RT. </li><li> Eliminare il supernatante e lavare il pellet con 50 ml di PBS sterile, centrifugare il buffy coat a 300 xg per 10 min a RT. </li><li> Risospendere le cellule in1 ml di PBMNC media, come precedentemente descritto 22, composto da: IMDM e di Ham F-12 (rapporto 1: 1), 1% di insulino-transferrina-selenio-Etanolammina (ITS-X), l&#39;1% di chimica definita Concentrato Lipid (CDL), 1% penicillina / streptomicina, 0,005% di acido L-ascorbico, lo 0,5% di albumina sierica bovina (BSA), 1-thioglycerol (concentrazione finale 200 micron), Stem Cell Factor SCF (100 ng / ml), interleuchina -3 IL-3 (10 ng / ml), eritropoietina EPO (2 U / ml), Insulin-like Growth Factor IGF-1 (40 ng / ml), desametasone (1 pM) e holo-transferrina (100 ug / ml ). </li><li> Trasferirli in un pozzetto di una piastra 12 pozzetti con superficie trattata coltura tissutale standard senza rivestimento, ad una densità di 2 x 10 6 cellule / ml. Incubare le cellule a 37 ° C, 5% CO 2 in un incubatore umidificato per 48 ore, fino a quando il cambiamento passo medio (vedere Sezione 3). </li></ol></li><li> PBMNCs ottenuti dopo la separazione gradiente di densità <ol><li> Per avviare il protocollo utilizzando PBMNCs congelati dopoDensità separazione in gradiente, disgelo 1 fiala di cellule in un bagno d&#39;acqua a 37 ° C, trasferire le cellule in 5 ml di PBMNC media. Centrifugare a 300 xg per 10 min a RT. </li><li> Risospendere le cellule in 1 ml di PBMNC medio e trasferirli in un pozzetto di una piastra 12 pozzetti, ad una densità di 2 x 10 6 cellule / ml. Incubare le cellule a 37 ° C, 5% CO 2 in un incubatore umidificato per 48 ore, fino a quando il cambiamento passo medio (vedere Sezione 3). </li></ol></li></ol> 3. Cultura ed espansione di PBMNCs (DAY 2-13) <ol><li> Raccogliere PBMNCs in coltura in sospensione, con una pipetta con una punta 1 ml, in un tubo da 15 ml e centrifugare a 300 xg per 10 min a RT. </li><li> Eliminare il surnatante e risospendere le cellule in 1 ml di terreno PBMNC fresco. </li><li> Trasferire le cellule in 1 pozzetto della piastra 12 pozzetti con superficie trattata coltura tissutale standard senza rivestimento, e incubare a 37 ° C, 5% CO 2 in un incubatore umidificato. </li><li&gt; Ripetere la procedura ogni due giorni, e dividere le celle in un rapporto di 1: 2 quando raggiungono la confluenza appropriata (circa l&#39;80%). </li></ol> 4. La trasfezione di PBMNCs con episomiale plasmidi (DAY 14) Nota: Eseguire l&#39;isolamento dei quattro plasmidi episomiale senza intergation commerciali, portando i geni pluripotenziali utilizzando un kit commerciale di purificazione plasmide e valutare la qualità dei plasmidi purificati utilizzando un&#39;analisi gel di agarosio, secondo le istruzioni del produttore. <ol><li> Raccogliere PBMNCs in tubo da 15 ml e contare il numero di cellule vitali (sulla base del trypan blue) 25. </li><li> Centrifuga 2 x 10 6 cellule a 300 xg per 10 min a RT. </li><li> Risospendere 2 x 10 6 cellule in mix trasfezione contenente 100 ml di Resuspension Buffer T e 1 mg di ciascun DNA plasmide (una plasmide portando Oct3 / 4 e shRNA contro p53, un plasmide portando SOX2 e Klf4, unoplasmide portando L-MYC e LIN28, e un plasmide portando EGFP, per verificare l&#39;efficienza di trasfezione). </li><li> Aspirare il mix trasfezione contenente le cellule in una punta microlitri 100 e inserire la pipetta con il campione verticalmente nel tubo, riempito con 3 ml di tampone elettrolitica E2, nella stazione pipetta di macchina elettroporazione, secondo le istruzioni del produttore. </li><li> Le cellule in modo efficiente l&#39;elettroporazione utilizzando il seguente programma: 1.650 V, 10 msec, 3 impulsi. </li><li> Risospendere le cellule elettroporate (2 x 10 6 cellule) in 2 ml di pre-riscaldato medio PBMNC, aggiungendo 0,25 mM sodio butirrato (NaB) e contare il numero di cellule vitali dopo protocollo elettroporazione (sulla base del trypan blue) 25. </li><li> Trasferire le cellule in un pozzetto di una piastra da 6 pozzetti senza rivestimento, agitare delicatamente la piastra e incubare le cellule a 37 ° C, 5% CO 2 in un incubatore umidificato. </li><li> Il giorno dopo elettroporazione, Count il numero di cellule GFP-positive al microscopio a fluorescenza 8-10 campi casuali, al fine di valutare l&#39;efficienza di trasfezione. </li><li> Mantenere le cellule transfettate senza suddivisione per 3 giorni, fino a quando li placcatura sul MEF (vedi Sezione 6). </li><li> Sostituire 2 ml di PBMNCs fresco medio, più 0,25 NAB mM ogni due giorni. </li></ol> 5. Preparare Piatti con Feeder cellule per la co-coltura (DAY 16) <ol><li> Coat i pozzetti di una piastra da 6 pozzetti con 1 ml di matrice membrana basale per 15 min a 37 ° C e la piastra di fibroblasti embrionali di topo (MEF) ad una densità di 2 x 10 5 cellule / pozzetto con 2 ml di 10% FBS conteneva DMEM (MEF medio) un giorno prima passaging le PBMNCs elettroporate sul feeder cellule MEF. </li></ol> 6. placcatura trasfezionati PBMNCs sul MEF (DAY 17-19) <ol><li> Raccogliere PBMNCs in coltura in sospensione, con una pipetta con 1 ml punta, in tubo da 15 ml e centrifugare transfettate PBMNCs a 300 xg per 10 mina RT. </li><li> Eliminare il surnatante e risospendere il pellet in 2 ml di terreno PBMNC fresco, più lo 0,25 NaB mm. </li><li> Piastra le cellule su MEF rivestite 6 pozzetti e incubare le cellule a 37 ° C, 5% CO 2 in un incubatore umidificato. </li><li> Dopo due giorni, aspirare il terreno e sostituirlo con 2 ml di IPSC medio composto da knockout DMEM (KO-DMEM), il 20% KO-siero sostituzione (KOSR), 1 NEAAs mm, 1% penicillina / streptomicina, 20 mm L- glutammina, 0,1 mm β-mercaptoetanolo, 10 ng FGF / ml (bFGF base) e 0,25 NaB mm. </li><li> Sostituire 2 ml di fresco medio iPSC ogni giorno e controllare le celle al giorno. Nota: A circa 22-25 giorni, le prime colonie di iPSCs dovrebbero essere visibili. </li></ol> 7. Raccolta e l&#39;espansione delle cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) Clones (DAY 30-35) Nota: A circa 30-35 giorni dopo la trasfezione, le colonie IPSC dovrebbero essere pronti per la raccolta e replating. L&#39;efficienza riprogrammazione dovrebbe essere estiaccoppiato come la percentuale del numero di colonie IPSC / numero totale di cellule elettroporate, come riportato in precedenza 26. <ol><li> Il giorno prima passaging colonie IPSC, preparare l&#39;alimentatore MEF in un 12-pozzetti (1,25 x 10 5 cellule / pozzetto). </li><li> Aspirare il mezzo di MEF e cambiare con 1 ml di IPSC media con 10 ng / ml bFGF e 10 micron Y-27632. Sezionare manualmente con un ago una colonia in ogni volta sotto il microscopio da dissezione alla raccolta-cappa per ottenere una griglia, raccogliere piccoli grumi pipettando e trasferire singolarmente ciascuna in un pozzetto della piastra 12 pozzetti rivestiti con MEF. </li><li> Passaggio ed espandere ciascuna piastra 12 pozzetti ad una piastra da 6 pozzetti in un rapporto 1: 2, allora ogni 6 pozzetti in un rapporto 1: 4 per ulteriore moltiplicazione. Sezionare e ampliare iPSCs manualmente per i primi 2-3 passaggi (come ben descritto nella fase 7.2), quindi utilizzare una procedura enzimatica dissociazione (iniziare dal punto 7.4). </li><li> Per un protocollo enzima dissociazione, pulito iPSC colonies aspirando porzioni differenziati, al microscopio da dissezione alla raccolta cofano. </li><li> Incubare iPSCs con 1 ml di collagenasi IV (1 mg / ml) per 10 minuti a 37 ° C. </li><li> Aspirare la soluzione enzimatica, lavare le cellule con 1 ml di KO-DMEM e raccogliere le colonie in una provetta conica da 15 ml. Centrifugare a 100 xg per 2 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Aspirare il surnatante, risospendere le colonie in 2 ml di COPSI media con 10 ng / ml bFGF e 10 pM Y-27632 e piatto su MEF rivestite 6 pozzetti (rapporto 1: 4). </li></ol> 8. Caratterizzazione di iPSCs (tra 5-15 Passages) <ol><li> Fosfatasi alcalina Colorazione <ol><li> Cultura colonie IPSC per 3-5 giorni in IPSC medio con 10 ng / ml bFGF. </li><li> Per iniziare un protocollo di fosfatasi alcalina di colorazione, sciacquare iPSCs una volta con PBS e poi fissarli con 1 ml di 4% PFA per 20 minuti a RT. </li><li> Lavare le cellule tre volte con PBS per rimuovere residui di PFA. </li><li> Macchia fisso celle usandoun kit commerciale alcalina fosfatasi colorazione in base alle istruzioni del produttore. </li></ol></li><li> Immunofluorescenza <ol><li> Cultura colonie IPSC per 3-5 giorni in IPSC medio con 10 ng / ml bFGF. </li><li> Per avviare un test di immunofluorescenza, lavare iPSCs una volta con PBS e poi fissarli con 1 ml di PFA 4% per 20 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Lavare le cellule tre volte con PBS per rimuovere residui di PFA. </li><li> Trattare iPSCs fissate con 1 ml di permeabilizzazione / blocco soluzione contenente siero di capra 4%, 0,1% BSA, 0,1% Triton X-100 e 0,05% di sodio azide (NaN 3) per 1 ora a RT. </li><li> Aspirare la soluzione di saturazione e incubare le cellule fissate con anticorpi primari a 3% di BSA e 0.05% NaN 3 soluzione O / N a 4 ° C (controllare la tabella materiale per la lista anticorpo primario e ha suggerito di anticorpi fattore di diluizione). </li><li> Il giorno dopo, lavare iPSCs tre volte con PBS, poi incubare le cellule con Alexa Fluor 488 capra anti-topo e Alexa Flanticorpi anti-coniglio di capra UOR 555, diluito 1: 1000 in 3% BSA e 0,05% NaN soluzione 3, per 1 ora a 37 ° C. </li><li> Macchiare i nuclei con DAPI (1 ug / ml) per 10 minuti a RT in scuro, seguito da tre lavaggi con PBS tempo. </li></ol></li><li> Differenziazione dei iPSCs a corpi embrionali (EBS) <ol><li> Cultura colonie IPSC per 5-6 giorni in IPSC medio con 10 ng / ml bFGF. </li><li> Rimuovere parti differenziate da colonie IPSC aspirando, sotto il microscopio da dissezione alla raccolta-cappuccio. </li><li> Incubare iPSCs con 1 ml di collagenasi IV (1 mg / ml) per 10 minuti a 37 ° C. </li><li> Aspirare la soluzione enzimatica, lavare le cellule con 1 ml di KO-DMEM e raccogliere le colonie in una provetta conica da 15 ml. Centrifugare a 100 xg per 2 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Aspirare il surnatante e risospendere le colonie in 2 ml di EB mezzo composto KO-DMEM, 20% definito di siero fetale bovino (FBS), 1 NEAAs mM, 1% di penicillina / streptomicina, 20 mM L-glutammina, 0,1 mM46; -mercaptoetanolo. </li><li> Piatto colonie IPSC in sospensione per 6 giorni su fissaggio 6 pozzetti ultra-bassa, in modo da consentire la formazione di sferoidali corpi embrionali tridimensionali (EBS). Cambia 2 ml di fresco medio EB ogni due giorni. </li><li> Il giorno 7, raccogliere EBs e piastra sul 0,1% di gelatina rivestito 6 pozzetti in 2 ml di EB medio e mantenere EBs nella differenziazione per 20 giorni. </li><li> Cambia 2 ml di fresco medio EB ogni due giorni. </li></ol></li><li> qRT-PCR per l&#39;espressione genica di analisi <ol><li> Cultura colonie IPSC per 5-6 giorni in IPSC medio con 10 ng / ml bFGF. </li><li> Estratto RNA totale da PBMNCs, iPSCs o EBs utilizzando 1 ml di reattivo commerciale in conformità con le istruzioni del produttore. </li><li> Valutare la concentrazione di RNA e la purezza con metodi adatti come l&#39;uso di uno spettrofotometro (RNA di alta qualità con A 260 / A 280 e A 260 / A 230 rapporti&gt; 1.8) 27. </li><li> ControllareIntegrità dell&#39;RNA utilizzando un kit commerciale secondo il protocollo del produttore (di alta qualità RNA RQI&gt; 9.5) 28. </li><li> Eseguire una reazione di trascrizione inversa in 1 mg di RNA totale utilizzando un kit trascrittasi inversa commerciale secondo le istruzioni del produttore. </li><li> Preparare le miscele contenenti qPCR 5 ng di cDNA, 7,5 ml SYBR GREEN Supermix, 2 ml di 5 micron primer (forward: 1 ml e reverse: 1 ml) e 6 ml di / acqua priva di DNasi RNasi per ogni reazione 29. </li><li> Eseguire la qRT-PCR utilizzando il seguente programma: una denaturazione iniziale a 95 ° C per 10 minuti, seguito da 40 cicli suddivisi in una fase di denaturazione a 95 ° C per 15 sec e di primer ricottura ed estensione fase a 60 ° C per 45 sec 29. </li><li> Normalizzare l&#39;espressione di altri geni che utilizzano GAPDH come le pulizie gene 28 (vedi i primer elencati nella tabella 1). </li></ol></li><li> qPCRper Transgene Esclusione <ol><li> Estrarre il DNA da PBMNCs o iPSCs utilizzando 1 ml di buffer di lisi contenente 50 mM Tris, EDTA 100 mm, NaCl 100 mm, 1% sodio dodecilsolfato (SDS) e 20 mg / ml proteinasi K. </li><li> Aggiungere un volume uguale (1 ml) di 100% isopropanolo, miscelare capovolgendolo tre volte al fine di consentire la precipitazione del DNA e centrifugare a 10.000 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Eliminare il supernatante, lavare il pellet di DNA con 1 ml di etanolo al 70% e centrifugare a 10.000 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. Aspirare e scartare il surnatante e risospendere in / acqua priva di DNasi RNasi. </li><li> Valutare la concentrazione del DNA e la purezza con metodi adatti come l&#39;uso di uno spettrofotometro (RNA di alta qualità con A 260 / A 280 e A 260 / A 230 rapporti&gt; 1.8) 27. </li><li> Preparare le miscele contenenti qPCR 5 ng di DNA stampo, 7,5 microlitri SYBR GREEN Supermix, 2 ml di 5 micron primer (forward: 1 ml e reverse: 1 ml) e 6 &amp;# 181; l di / acqua priva di DNasi RNasi per ogni reazione 29. </li><li> Normalizzare l&#39;espressione di specifici plasmide episomiale EBNA-1 gene utilizzando FBX-15 come le pulizie gene 29 (vedere i primer elencati nella tabella 1). </li></ol></li><li> Analisi del cariotipo <ol><li> Cultura colonie IPSC per 5-6 giorni sulla piastra rivestita seminterrato matrice membrana senza alimentatore con uno spot definito, terreno di mantenimento senza alimentatore per iPSCs, seguendo le istruzioni del produttore. </li><li> Per avviare il protocollo di analisi cariotipo, staccare colonie IPSC con 1 ml di soluzione di distacco cellulare per 5 min a 37 ° C, fino ad ottenere la dissociazione singola cellula. </li><li> Raccogliere cellule e centrifugare a 400 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Risospendere iPSCs in 2 ml di un mezzo appositamente sviluppato per coltura di cellule per le tecniche di diagnosi prenatale. IPSCs Piatto monocellulari sulla membrana basale matrici rivestite piatti di vetro e incubare a 37 ° C, 5% CO 2 &lt;/ Sub&gt; incubatrice. </li><li> Dopo 2-4 giorni, aggiungere 10 microlitri / ml colchicina direttamente alle culture e incubare per 3 ore a 37 ° C, 5% CO 2 in un incubatore umidificato. </li><li> Aspirare il mezzo e incubare iPSCs in 1 ml di una soluzione ipotonica (0,6% di citrato di sodio e cloruro di potassio 0,13%) per 10 minuti a RT. </li><li> Risciacquare le cellule con 1 ml di soluzione di acido acetico al 5% e fissare con iPSCs / soluzione metanolica di acido acetico (rapporto 3: 1) in una macchina con temperatura controllata e umidità (28 ° C, 42% UR). </li><li> Immergere e le cellule macchia fissa con la soluzione Quinacrine per 15-20 minuti a temperatura ambiente al buio (per ottenere Q-banding) 30. </li><li> Acquisire metafasi di cellule al microscopio a fluorescenza ad ingrandimento 100X 29. </li></ol></li></ol>

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<li>Hanna, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+cell+reprogramming+is+a+stochastic+process+amenable+to+acceleration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Direct cell reprogramming is a stochastic process amenable to acceleration.</a> Nature. 462 (72-73), 595-601 (2009).</li>
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<li>Lindner, S. E., Sugden, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+plasmid+replicon+of+Epstein-Barr+virus%3A+mechanistic+insights+into+efficient%2C+licensed%2C+extrachromosomal+replication+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plasmid%22%5BJournal%5D)">The plasmid replicon of Epstein-Barr virus: mechanistic insights into efficient, licensed, extrachromosomal replication in human cells.</a> Plasmid. 58 (1), 1-12 (2007).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

In passato, l&#39;unico modo per ottenere cellule staminali pluripotenti umane che trasportano una particolare mutazione genetica è stato quello di reclutare genitori sottoposti a diagnosi genetica pre-impianto e generare cellule staminali embrionali da loro blastocisti scartate 31,32. Utilizzando un approccio riprogrammazione, i ricercatori possono ora generare iPSCs di pazienti portatori di praticamente qualsiasi genotipo. La possibilità di partire da una linea cellulare paziente-specifica ed una fonte faci...

Nel 2006, il gruppo di Shinya Yamanaka 1 ha dimostrato per la prima volta che le cellule somatiche di topi adulti e gli esseri umani possono essere convertiti in uno stato pluripotente dall&#39;espressione ectopica di quattro fattori di riprogrammazione (ottobre-4, Sox-2, KLF-4, e c-Myc), generando le cosiddette cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) 2. IPSCs paziente-specifiche sono molto simili a cellule staminali embrionali umane (hESC) in termini di morfologia, la proliferazione e la capacità di differenziarsi in tipi di cellule germinali (tre mesoderma, endoderma ed ectoderma), mentre mancano le preoccupazioni etiche legate all&#39;uso di hESC e bypass possibile rigetto immunitario 3. Così, iPSCs appaiono come una delle più importanti fonti di cellule paziente-specifiche per la ricerca di base, lo screening di stupefacenti, modelli di malattia, la valutazione della tossicità, e fini di medicina rigenerativa 4. Diversi approcci sono stati utilizzati per la generazione iPSC: vettori virali integrazione(Retrovirus 5, lentivirus 6), virale non integrando vettori (adenovirus 7), Sendai-virus 8, BAC trasposoni 9, vettori episomiale 10, proteine ​​11 o consegna RNA 12. Sebbene l&#39;uso di metodi di virus-mediata può portare ad alta efficienza riprogrammazione, vettori virali integrano nel genoma delle cellule ospiti e quindi potenziale casuale mutagenesi inserzionale, alterazione permanente di espressione genica, e la riattivazione di transgeni tacere durante la differenziazione non può essere esclusa 13. Per rendere più sicuro iPSCs per la medicina rigenerativa, sono stati compiuti sforzi per derivare iPSCs senza l&#39;integrazione di DNA esogeno in genomi cellulari. Sebbene siano stati sviluppati vettori virali soggetti ad accisa e trasposoni, è ancora chiaro se sequenze vettore brevi, che inevitabilmente rimangono nelle cellule trasdotte dopo escissione e transposase espressione, potrebbero indurre alterazioni nella cellalare funzionano 13. Nonostante la sua alta efficienza riprogrammazione, virus Sendai rappresenta un approccio costoso e raggiungere, attraverso problemi di licenza con la società che ha sviluppato questo sistema di avere il potenziale per limitarne l&#39;applicazione negli studi traslazionali. Inoltre, la necessità di introduzione diretta di proteine ​​e RNA richiede consegna multiplo di riprogrammazione molecole con le limitazioni tecniche insite questo introduce, e l&#39;efficienza complessiva riprogrammazione è molto bassa 14. Di nota, metodi virali libere e non integrare convenienti basate sull&#39;uso di plasmidi episomiale sono stati riportati con successo per la riprogrammazione dei fibroblasti cutanei 15. In particolare, in questo lavoro abbiamo deciso di utilizzare commerciali plasmidi episomiale senza integrazione disponibili, come riportato in precedenza 10,15. Fino ad oggi, fibroblasti cutanei rappresentano il più popolare tipo di cellula donatrice 5. Tuttavia, altre fonti di cellule sono stati successfully riprogrammato in iPSCs compresi cheratinociti 16, del midollo osseo cellule staminali mesenchimali 17, cellule stromali adipose 18, follicoli piliferi 19, e le cellule della polpa dentale 20. L&#39;isolamento di queste cellule richiede procedure chirurgiche, e diverse settimane sono necessari per l&#39;espansione delle cellule in vitro allo scopo di stabilire una coltura cellulare primaria. In questa luce, la selezione del tipo di cellula di partenza è critico ed è altrettanto importante essere in grado di produrre iPSCs dai tessuti facilmente accessibili e meno invasive come sangue. Entrambe le cellule mononucleate del sangue del cordone (CBMNCs) 21,22 e cellule mononucleari di sangue periferico (PBMNCs) 14,22-24 rappresentano idonee fonti di cellule per la derivazione di iPSCs. Sebbene l&#39;efficienza di adulti PBMNC riprogrammazione è 20-50 volte inferiore a quella del CBMNCs 22, rimangono il tipo di cella più conveniente per scopo campionamento. InInfatti, campionamento PBMNC ha il vantaggio di essere minimamente invasiva, e in aggiunta, queste cellule non richiedono vasta espansione in vitro prima degli esperimenti di riprogrammazione. Fino ad oggi, i protocolli differenti hanno riferito che PBMNCs dopo la separazione gradiente di densità possono essere congelati e scongelati giorni a diversi mesi dopo il congelamento e ampliato per alcuni giorni prima della riprogrammazione in iPSCs 22,23. Tuttavia, per quanto a nostra conoscenza segnalazioni hanno descritto una riprogrammazione della PBMNCs da buffy coats congelati. È importante sottolineare che, buffy coats congelati raccolti senza separazione gradiente di densità rappresentano i campioni di sangue più comuni memorizzati nella biobanche di grandi dimensioni provenienti da studi di popolazione, rappresentando così una piscina facilmente accessibile di materiale per la produzione di IPSC che evita ulteriormente la raccolta dei campioni. Qui riportiamo per la prima volta la generazione di iPSCs-virali privi di buffy coats congelati umani, sulla base di un protocollo precedentemente descritto 22. InInoltre, sono stati generati da iPSCs PBMNCs congelati ottenuti dopo la separazione gradiente di densità, come un protocollo di controllo per i risultati PBMNC gradiente di densità non depurati.

<table><tbody><tr><td>Citrato di sodio tamponato Venosafe Tubo di plastica</td><td>Terumo</td><td>VF-054SBCS07</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di ammodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9434</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato di potassio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60339</td><td></td></tr><tr><td>EDTA polvere disodica</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134</td><td>0,5 M soluzione</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque Premium&nbsp;</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-5442-02</td><td>Soluzione di polisaccarosio per centrifugazione</td></tr> in <tr><td>gradiente di densità Terreno di Dulbecco modificato di Iscove (IMDM)&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>21056-023</td><td>No fenolo rosso</td></tr><tr><td>prosciutto F-12</td><td>Mediatech</td><td>10-080-CV</td><td></td></tr><tr><td>insulina-transferrina-selenio-etanolammina (ITS -X)</td><td>Gibco</td><td>51500-056&nbsp;</td><td>1X (Stock: 100X)</td></tr><tr><td>Concentrato lipidico chimicamente definito</td><td>Gibco</td><td>11905031</td><td>1X (Stock: 100X)</td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>Acido L-ascorbico 2-fosfato sale di sesquimagnesio idrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8960</td><td></td></tr><tr><td>1-Tioglicerina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6145</td><td>Concentrazione finale a 200 &micro; </td></tr><tr><td>M Fattore di cellule staminali umane ricombinanti (SCF)</td><td>PeproTech</td><td>300-07</td><td>100 ng/ml (Stock:100 &micro; g/ml)&nbsp;</td></tr><tr><td>Interleuchina-3 umana ricombinante (IL-3)</td><td>PeproTech</td><td>200-03</td><td>10 ng/ml (Stock: 10 &micro; g/ml)</td></tr><tr><td>Fattore di crescita insulino-simile umano ricombinante (IGF-1)</td><td>PeproTech</td><td>100-11</td><td>40 ng/ml (Stock: 40 &micro; g/ml)</td></tr><tr><td>Eritropoietina umana ricombinante (EPO)</td><td>R& Sistemi D&nbsp;</td><td>287-TC-500</td><td>2 U/ml (Stock: 50 U/ml)</td></tr><tr><td>Desametasone&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2915</td><td>1 &mu; M (A magazzino: 1 mM)</td></tr><tr><td>Olotransferrina umana</td><td>R& Sistemi D&nbsp;</td><td>2914-HT</td><td>100 &mu; g/ml (Stock: 20 mg/ml)</td></tr><tr><td>Amniomax II</td><td>Gibco 11269016</td><td></td><td>Terreno per analisi citogenetiche</td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>StemCell Technologies</td><td>5850</td><td>Terreno per colture iPSC senza alimentatore</td></tr><tr><td>Knockout DMEM</td><td>Gibco</td><td>10829-018</td><td></td></tr><tr><td>Knockout Siero sostitutivo</td><td>Gibco</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina (10.000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>L-glutammina (200 mM)</td><td>Gibco</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>MEM Soluzione di aminoacidi non essenziali (100X)</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoetanolo&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>31350-010</td><td>0.1 mM (Stock: 50 mM)</td></tr><tr><td>Butirrato di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B5887</td><td>0.25 mM (Stock: 0.5 m)</td></tr><tr><td>FGF umano ricombinante basico, 145 aa&nbsp;</td><td>R& Sistemi D&nbsp;</td><td>4114-TC</td><td>10 ng/ml (Stock: 10 &micro; g/ml)</td></tr><tr><td>Y-27632 dicloridrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0503&nbsp;</td><td>10 &micro; M (Stock: 10 mM)</td></tr><tr><td>Siero bovino definito fetale</td><td>Hyclone</td><td>SH 30070.03</td><td></td></tr><tr><td>EmbryoMax 0,1% Soluzione di gelatina</td><td>Merck-Millipore</td><td>ES-006-B</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced BD</td><td>Biosciences</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase, Tipo IV</td><td>Gibco</td><td>17104-019</td><td>1 mg/ml (Stock: 10 mg/ml)</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>PAA Laboratories GmbH</td><td>L11-007</td><td>Soluzione di distacco cellulare</td></tr><tr><td>Fibroblasto embrionale di topo (CF1)</td><td>Global Stem</td><td>GSC-6201G</td><td>1*106 cells/6 pozzetti</td></tr><tr><td>piastra Plasmide pCXLE-hOCT3/4-shp53-F</td><td>Addgene&nbsp;</td><td>27077</td><td>1 &micro; g (Stock: 1 &micro; g/&micro; l)</td></tr><tr><td>Plasmide pCXLE-hSK</td><td>Addgene&nbsp;</td><td>27078</td><td>1 & micro; g (Stock: 1 &micro; g/&micro; l)</td></tr><tr><td>Plasmide pCXLE-hUL</td><td>Addgene&nbsp;</td><td>27080</td><td>1 & micro; g (Stock: 1 &micro; g/&micro; l)</td></tr><tr><td>Plasmide pCXLE-EGFP</td><td>Addgene&nbsp;</td><td>27082</td><td>1 & micro; g (Stock: 1 &micro; g/&micro; l)</td></tr><tr><td>Kit di colorazione della fosfatasi alcalina</td><td>Stemgent</td><td>00-0009</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-antigene embrionale specifico per stadio-4 (SSEA-4)</td><td></td><td>MAB4304</td><td>1/250</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-TRA-1-60</td><td>Merck-Millipore</td><td>MAB4360</td><td>1/250</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-TRA-1-81 Anticorpo</td><td>Merck-Millipore</td><td>MAB4381</td><td>1/250</td></tr><tr><td>Anticorpo Anti-Oct-3/4</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-9081</td><td>1/500</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-nanog</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-33759</td><td>1/500</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-troponina I</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-15368</td><td>1/500</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-alfa-actinina (sarcomerico)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7732</td><td>1/250</td></tr><tr><td>Classe neuronale III &szlig;-Tubulina (TUJ1)</td><td>Anticorpo Covance Prodotti di ricerca Inc&nbsp;</td><td>MMS-435P-100</td><td>1/500</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-tirosina idrossilasi (TH)</td><td>Calbiochem</td><td></td><td>657012 1/200</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Capra anti-topo&nbsp;</td><td>Sonde molecolari</td><td>A-11029</td><td>1/1000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 Sonde molecolari anti-coniglio di capra</td><td></td><td>A-21429</td><td>1/1000</td></tr><tr><td>Piastra per colture cellulari a bassissimo attaccamento</td><td>Corning</td><td>3471</td><td></td></tr><tr><td>Reagente Trizol</td><td>Ambion</td><td>15596-018&nbsp;</td><td>reagente per l'estrazione dell'RNA</td></tr><tr><td>Kit di sintesi del cDNA SuperScript VILO</td><td>Invitrogen</td><td>11754050</td><td>Kit di trascrittasi inversa</td></tr><tr><td>iTaq Universal SYBR Green Supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>172-5124</td><td></td></tr><tr><td>CFX96 Sistema di rilevamento PCR in tempo reale</td><td>Bio-Rad</td><td>185-5195</td><td></td></tr><tr><td>Experion Sistema di elettroforesi automatizzato</td><td>Bio-Rad</td><td>700-7000</td><td>Strumento per verificare l'integrità dell'RNA</td></tr><tr><td>Experion RNA Kit di analisi Highsense</td><td>Bio-Rad</td><td>7007105</td><td>Kit di reagenti per verificare l'integrità dell'RNA</td></tr><tr><td>Microscopio da dissezione (SteREO Discovery V12 )</td><td>Zeiss</td><td>495007</td><td></td></tr><tr><td>NeonSistema di trasfezione 100 &; l Kit</td><td>Invitrogen</td><td>MPK10025</td><td>Kit di reagenti per elettroporazione</td></tr><tr><td>Sistema di trasfezione al neon</td><td>Invitrogen</td> MPK5000 <td>Strumento utilizzato per l'elettroporazione</td><td></td></tr><tr><td>Spettrofotometro UV/Vis NanoDrop</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-2000</td><td>Strumento per la quantificazione di DNA/RNA</td></tr><tr><td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td><td>Qiagen</td><td>12362</td><td>Kit di purificazione dei plasmidi</td></tr></tbody></table>

generazione di pluripotenti indotte cellule staminali da congelata buffy cappotti con non-integrazione episomiale plasmidi

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Frozen Buffy Coats using Non-integrating Episomal Plasmids

Cellule somatiche possono essere riprogrammate in cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) forzando l&#39;espressione di quattro fattori di trascrizione (ottobre-4, Sox-2, KLF-4, e c-Myc), tipicamente espressa da cellule staminali embrionali umane (hESC) . A causa della loro somiglianza con hESC, iPSCs sono diventati uno strumento importante per il potenziale di medicina rigenerativa paziente-specifici, evitando questioni etiche connesse con hESC. Al fine di ottenere cellule adatte per l&#39;applicazione clinica, iPSCs senza transgene devono essere generati per evitare transgene riattivazione, alterata espressione genica e differenziazione sbagliata. Inoltre, un metodo di riprogrammazione molto efficiente e conveniente è necessario ricavare iPSCs sufficienti a fini terapeutici. Tenuto conto di questa esigenza, un approccio efficiente non integrando episomiale plasmide è la scelta preferibile per IPSC derivazione. Attualmente il tipo di cella più comune utilizzato per scopi di riprogrammazione sono fibroblasti, l&#39;isolamento dei quali richiede biopsia tissutale, un iprocedura chirurgica nvasive per il paziente. Pertanto, sangue periferico umano rappresenta il tessuto più accessibile e meno invasivo per la generazione IPSC. In questo studio, un protocollo virale senza costo-efficacia e l&#39;utilizzo non integrano plasmidi episomiale è segnalato per la generazione di iPSCs dal periferico cellule umane mononucleate del sangue (PBMNCs) ottenute da buffy coats congelati dopo centrifugazione del sangue intero e senza la densità di separazione gradiente.

In questo studio un protocollo semplice ed efficace per la generazione di iPSCs-virali libero da riprogrammazione della PBMNCs isolati da buffy coat congelati dopo centrifugazione del sangue intero e confronto con riprogrammazione della PBMNCs ottenute dopo la separazione gradiente di densità è riportato. La figura 1A mostra una rappresentazione schematica di il protocollo dettagliato. Dopo lo scongelamento, i PBMNCs isolato, mostrando una tipica forma arrotondata, vengono espanse in specifico terreno d...

Cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) rappresentano una fonte di tessuti paziente-specifici per le applicazioni cliniche e di ricerca di base. Qui vi presentiamo un protocollo dettagliato per riprogrammare le cellule umane mononucleari di sangue periferico (PBMNCs) ottenute da buffy coats congelati in iPSCs-virali gratuito utilizzando non integrano plasmidi episomiale.

Generazione di pluripotenti indotte cellule staminali da congelata Buffy cappotti con non-integrazione episomiale Plasmidi

Somatic cells can be reprogrammed into induced pluripotent stem cells (iPSCs) by forcing the expression of four transcription factors (Oct-4, Sox-2, ...

L'obiettivo generale di questo procedimento è generare cellule staminali pluripotenti indotte a partire da cellule mononucleate del sangue periferico umano ottenute da buffy coat congelati, utilizzando un protocollo economico e privo di virus. Questo viene realizzato innanzitutto isolando le PB MNC dai buffy coat dopo la centrifugazione del sangue intero senza gradiente di densità, seguita dall'espansione in un specifico mezzo di coltura per sangue. Il secondo passaggio consiste nel trasfettare le PB MNC derivate dai buffy coat con plasmidi episomiali mediante elettroporazione.I PB MNC trasfettati vengono quindi seminati su cellule nutritizie di fibroblasti embrionali di topo freschi. L'ultimo passaggio consiste nel selezionare manualmente le cellule staminali pluripotenti indotte dalla coltura e trasferirle su nuove piastre con cellule nutritizie per l'espansione. Alla fine, la riprogrammazione efficiente dei PB MNC in cellule staminali pluripotenti indotte con una morfologia umana tipica può essere dimostrata mediante immunofluorescenza e misurazione dell'espressione genica.Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti consiste nel fatto che la degenerazione di IPC privi di virus da OT congelati riduce i costi, il tempo di lavoro e i passaggi manuali richiesti agli operatori durante l'elaborazione del campione. Un altro vantaggio di questa tecnica è che consente l'utilizzo di OT congelati conservati in Biobanche su larga scala, raccolti da studi su popolazioni, come materiale di partenza per la produzione di IPS. Iniziare prelevando otto millilitri di sangue periferico venoso in un tubo di plastica tamponato con citrato di sodio.Conservare il sangue a 25 gradi Celsius ed elaborarlo entro 12 ore. Il primo passaggio di elaborazione consiste nel centrifugare il sangue a 2000 G per 15 minuti a quattro gradi Celsius. Utilizzare un rotore con becchi oscillanti e non applicare i freni centrifughi durante la separazione.Prelevare il mantello schiumoso (buffy coat). Questo è lo strato interposto tra la fase superiore plasmatica e quella inferiore. Il mantello schiumoso rappresenta la frazione arricchita di P-B-M-N-C; trasferire circa 500 microlitri da ciascun campione di otto millilitri in una provetta criogenica.Ora sospendere il buffy coat aggiungendo un volume uguale di mezzo di congelamento 2x, quindi congelare la provetta in un contenitore a raffreddamento controllato a meno 80 gradi Celsius per un massimo di una settimana. Per una conservazione più lunga, le cellule possono essere conservate in azoto liquido. Per iniziare la scongelazione, utilizzare una sospensione congelata di un millilitro di PB MNC ottenuta da buffy coat congelati, scongelandola in un bagno a 37 gradi Celsius. Successivamente, diluire le cellule a due millilitri con PBS.Successivamente, trasferire la diluizione in un tubo da 50 millilitri e aggiungere 10 millilitri di tampone per la lisi dei globuli rossi. Lasciare incubare questa miscela a temperatura ambiente per circa 10 minuti. Dopo 10 minuti, portare il volume totale a 50 millilitri con PBS sterile.Quindi centrifugare le cellule a 300 G per 10 minuti a temperatura ambiente. Al termine della centrifugazione, eliminare il soprannatante e lavare il pellet con 50 millilitri di PBS. Centrifugare nuovamente le cellule e risospendere il pellet in un millilitro di mezzo PBM e C.Prelevare un'aliquote di cellule risospese e misurare la densità cellulare utilizzando una camera di conteggio. Successivamente, regolare la concentrazione a 2 milioni di cellule per millilitro. A questo punto, avviare una coltura in sospensione.Caricare le cellule in una pozzetta di una piastra standard da 12 pozzetti e incubarle per 48 ore. Cambiare il mezzo ogni due giorni, aspirare le cellule utilizzando una pipetta e trasferirle in un tubo conico da 15 millilitri. Centrifugare il tubo a 300 GS per 10 minuti a temperatura ambiente.Quindi eliminare il soprannatante e risospendere le cellule in un millilitro di mezzo fresco per P-B-M-N-C. Una contaminazione da globuli rossi è comune durante i primi giorni di coltura delle PB MNC. Prima di reinserire le cellule in una nuova piastra, controllarle al microscopio invertito quando raggiungono una confluenza di circa l'80% e suddividere la coltura durante il passaggio.Dopo due settimane dall'inizio della coltura di MNC del sangue periferico, le cellule dovrebbero essere pronte per la trasfezione. Preparare quattro plasmidi: uno contenente T tre quattro e S-H-R-N-A contro P 53, uno contenente SOX due e KLF quattro, uno contenente lmic e lin 28 e un plasmide contenente EGFP. Per iniziare, raccogliere gli MNC del sangue periferico in un tubo conico da 15 millilitri e contare il numero di cellule vitali utilizzando il triam blu.Quindi preparare 2 milioni di cellule vitali, centrifugare e risospendere le cellule in un mix di trasfezione contenente 100 microlitri di tampone di risospensione T e un microgrammo di ciascuno dei quattro plasmidi. Riempire ora il contenitore di trasfezione con tre millilitri di tampone elettrolitico. Con una pipetta da 100 microlitri, aspirare il mix di trasfezione ed espellere il campione verticalmente nel tubo di elettroporazione preparato.Quindi si sono consumate le cellule utilizzando tre impulsi. Dopo l'elettroporazione, risospendere le cellule in due millilitri di mezzo PBM e C preriscaldato con 0,25 millimoli di butirrato di sodio. Successivamente, contare il numero di cellule vitali come in precedenza e trasferire la sospensione in una pozzetta di una piastra a sei pozzette non rivestita. Incubare la piastra con agitazione delicata per 24 ore.Mantenere le cellule trasfettate senza suddividerle per tre giorni a partire dal giorno della trasfezione, effettuando il cambio a giorni alterni. Sostituire il mezzo con due millilitri di mezzo P-B-M-N-C appena preparato contenente butirrato di sodio 0,25 millimolare un giorno prima di stabilire la co-coltura; preparare innanzitutto il primo strato di MES, aggiungendo in ogni pozzetto di una piastra a sei pozzetti un millilitro di matrice della membrana basale e lasciare incubare le piastre a 37 gradi Celsius per 15 minuti. Quindi aspirare la matrice della membrana basale e seminare 200.000 MEF per ogni pozzetto con due millilitri di DMEM contenente il 10% di FBS; il giorno successivo, raccogliere i PB MNC in una punta da un millilitro.Trasferirli in un tubo conico da 15 millilitri e centrifugarli. Eliminare il soprannatante e risospendere il pellet in due millilitri di mezzo fresco. Quindi piastrare le cellule nei pozzetti rivestiti con metionina e incubare la piastra dopo due giorni.Sostituire il mezzo con due millilitri di mezzo IPSC contenente butirrato di sodio 0,25 millimolare e continuare a sostituire il mezzo IPSC ogni due giorni. Dopo circa 22-25 giorni, le prime colonie di IPSC dovrebbero essere visibili entro i 30-35 giorni. Le colonie dovrebbero essere pronte per essere selezionate e ripassate il giorno prima di allestire la piastra di colonie IPSC con cellule nutritizie su un 12.Piastri in una piastra a pozzetti a 125.000 cellule per pozzetto e incubarle per tutta la notte. Il giorno successivo, sostituire il mezzo sulle cellule meth con un millilitro di mezzo IPSC integrato. Quindi, sotto un microscopio stereoscopico, utilizzare un ago per isolare una colonia alla volta, a partire dalle colonie più grandi che formano piccoli agglomerati.Trasferirli singolarmente mediante pipetta, trasferendo una colonia in ciascun pozzetto della piastra rivestita con metionina e incubare la piastra per il passaggio. Le colonie di iPSC utilizzano inizialmente la stessa tecnica di isolamento manuale, ma dopo due o tre passaggi, si adotta la procedura enzimatica. I PB MNC isolati, che mostravano una tipica forma arrotondata, sono stati espansi in un mezzo di coltura ematica specifico per 14 giorni, quindi trasfettati con plasmidi episomiali. Circa da 10 a 15 giorni dopo la trasfezione, sono iniziate ad apparire piccole colonie arrotondate, brillanti, con margini ben definiti e morfologia simile a quella delle cellule staminali embrionali, circa da 20 a 30 giorni dopo la trasfezione.Compaiono colonie di IPSC altamente compatte con margini ben definiti, che aumentano di dimensione fino a diventare sufficientemente grandi da essere selezionate per i primi passaggi di confezionamento. Le colonie di IPSC mantengono il loro stato indifferenziato e mostrano una morfologia tipica delle cellule staminali embrionali umane. L'aumento dell'ingrandimento mostra le singole cellule all'interno delle colonie e l'elevato rapporto nucleo/citoplasma.Le linee IPSE selezionate sono state passate altre 10-15 volte. Circa 20 metafasi provenienti da diverse colture indipendenti sono state analizzate per valutare la stabilità genetica. Tutti i campioni hanno mostrato un cariotipo normale dopo 5-10 espansioni in vitro.Questi cloni sono stati caratterizzati per le loro proprietà di staminale e pluripotenza. I cloni hanno mostrato una colorazione positiva per la fosfatasi alcalina. La R-T-P-C-R quantitativa ha confermato che i cloni esprimevano geni pluripotenti endogeni a livelli molto più elevati rispetto ai MNC derivati da sangue periferico iniziali.Sebbene i livelli endogeni di cmic e KLA quattro siano rimasti più o meno costanti, l'espressione del transgene episomale esogeno non è stata rilevata nelle IPC, indicando così l'attivazione con successo dei geni pluripotenti endogeni. Infine, l'analisi di immunofluorescenza ha rivelato che le IPC esprimevano marcatori di pluripotenza come OC tre quattro, SSEA quattro, TRA 180 1, SOX due e TRA uno 60. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come generare IPC da ko, isolate dal sangue periferico umano in modo economicamente conveniente e utilizzando plasmidi episomiali non integranti.

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