Name: Istituzione e caratterizzazione di UTI e CAUTI in un modello murino (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: Scopri un metodo affidabile per stabilire infezioni delle vie urinarie e CAUTI in un modello murino. Questa tecnica consente di valutare la colonizzazione batterica e lo sviluppo di comunità batteriche intracellulari per studiare la patogenesi e sviluppare nuove terapie.

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Il finanziamento per questo lavoro è stato fornito da ORWH SCOR P50 DK064540, RO1 DK 051.406, RO1 AI 108749-01, F32 DK 101.171, e F32 DK 104516-01.

Affermazione Etica: Il Comitato Washington University Animal Studies approvato tutte le infezioni del mouse e procedure nell&#39;ambito del numero di protocollo 20120216, che è stato approvato 2013/01/11 e 2016/01/11 scade. Cura generale degli animali era in linea con la guida per la cura e l&#39;uso di animali da laboratorio da parte del Consiglio Nazionale delle Ricerche e la cura Resource Guide USDA animale. Eutanasia procedure sono in linea con le &quot;linee guida AVMA per l&#39;eutanasia degli animali edizione 2013&quot;. 1. UPEC UTI protocollo, inoculazione Ago Preparazione (Figura S1) <ol><li> Togliere il tappo del G 30 ago. Infilare circa 1 pollice di tubo PE10 sull&#39;albero dell&#39;ago. UV sterilizzare i gruppi di aghi durante la notte. Aghi cateterizzati possono essere conservati a tempo indeterminato in piastre Petri sterili. </li></ol> 2. UPEC batterica Inoculum Preparazione <ol><li> Preparare UTI89 inoculo (inizio 72 ore prima della inoculizione giorno) <ol><li> Streak UTI89 su un LB (Luria-Bertani) piastra di agar da uno stock congelato. Incubare per una notte a 37 ° C. Scegliere una colonia e inoculare in 10 ml di LB in un pallone da 125 ml. Incubare a 37 ° C per 24 ore, in modo statico. </li><li> Seminare 10 ml di coltura durante la notte in 10 ml di LB in un pallone nuovo 125 ml per altre 24 ore a 37 ° C, in modo statico. </li><li> Trasferimento 3 ml (variano in base alla tensione e alle dimensioni inoculo desiderato) per sterili provette da 1,5 ml e centrifugare a 7.000 xg per 3 min e risospendere il pellet in 1x PBS e centrifugare una seconda volta. Risospendere il pellet batterico in 1 ml di PBS 1x. </li></ol></li><li> Misurare la densità ottica batterica e regolare la concentrazione alla densità inoculo desiderato. La concentrazione standard dell&#39;inoculo utilizzato è 10 7 batteri; Tuttavia, questo può variare a causa del disegno dello studio. </li></ol> 3. batterica Inoculazione <ol><li> Pulire la stazione di lavoro con il 70% di etanolo e csu area con carta assorbente (o usare cappa a flusso sterile). </li><li> Disegna fino a 0,9 ml di inoculo batterico preparato in un 1 ml (TB) siringa (rimuovere le bolle d&#39;aria). Collegare un ago sterile inoculazione preparata con tubi PE10, sulla siringa contenente l&#39;inoculo, quindi sterilmente tagliare il tubo in polietilene. NOTA: Lasciare 1 mm tubo sopra la punta dell&#39;ago per evitare la puntura della vescica. </li><li> Tagliare un pezzo quadrato 1 pollice di parafilm e mettere una piccola quantità di lubrificante chirurgica (circa le dimensioni di una monetina) sulla parte superiore. </li><li> Anestetizzare femminile topi C3H / nubilato mettendoli in un vaso di vetro 32 once contenente una sfera di tè-infusore con batuffoli di cotone imbevuti di 3 ml di isoflurano o camera vaporizzatore (segue produce protocollo) fino incosciente ma ancora respirando normalmente (1 respiro / sec) . NOTA: Alcuni comitati IACUC non approvano l&#39;uso di un vaso o vaporizzatore. Si prega di seguire le indicazioni del comitato IACUC della vostra istituzione. NOTA: Se vaso di vetrocon tè-ball e / o di cono con batuffoli di cotone vengono utilizzate isoflurano-soakd, l&#39;animale deve essere osservato con attenzione per evitare overdose di anestetico e la morte. Il vantaggio di utilizzare una camera di vaporizzatore e anestesia è che fornisce somministrazione isoflurano controllato che evita overdose accidentale. ATTENZIONE: Isoflurano è un anestetico per inalazione. Utilizzare in un ambiente ben ventilato e ridurre al minimo l&#39;inalazione. </li><li> Rimuovere il mouse dal vaso / vaporizzatore e posizionarlo sul dorso su un tovagliolo di carta e diffondere le gambe. </li><li> Coprire il naso del mouse con un cono (un tubo collegato al vaporizzatore che fornisce una dose controllata isoflurance che è dotato su alcune unità vaporizzatore) o 50 ml tubo conico con un batuffolo di cotone contenente una piccola quantità (circa 1-2 ml ) di isoflurano. </li><li> Palpitate delicatamente la vescica per indurre la minzione e garantire una vescica annullata. Pulire la zona periuretrale con il 100% di etanolo pulire. Tamponare l&#39;inoculazione ago / siringa, primo punto, nelLubrificante chirurgico. </li><li> Inoculare ciascuna mouse con 50 microlitri della soluzione batteri inserendo l&#39;ago inoculazione transurethrally, di circa 12 mm, e premendo sullo stantuffo della siringa delicatamente per dispensare l&#39;inoculo in vescica delicatamente (10 ml / sec). Rimuovere l&#39;ago inoculazione dal mouse. NOTA: il ritorno immediato di inoculo in apertura uretrale quando si inizia per inoculare indica l&#39;inserimento improprio o incompleta dell&#39;ago. </li><li> Rimuovere il mouse dal cono e tornare alla sua gabbia. Ripetere i passaggi 3,3-3,8 per ogni mouse. Quando / se il passaggio di inoculo condizioni / ceppi, gettare la siringa e l&#39;ago inoculazione in un apposito contenitore approvato e ricominciare punto 3.2. NOTA: inoculazione di organismi uropatogeni generalmente non causa gravi sintomi di dolore. Tuttavia, in rari casi, la somministrazione di forti dosi di agenti patogeni può causare febbre, riduzione di cibo e acqua e l&#39;assunzione di un comportamento anomalo. LaNimal salute deve essere monitorato durante tutto l&#39;esperimento. Se i sintomi di dolore sono evidenti preavviso, un analgesico, come la buprenorfina (0,05-0,1 mg / kg per via sottocutanea), può essere applicato. Le procedure dovrebbero essere in accordo con IACUC di ciascuna istituzione. </li></ol> 4. Determinazione degli oneri batteriche <ol><li> Preparare separati 5 ml provette per ogni coppia vescica e reni per essere raccolto. Aggiungere 1 ml di PBS 1x / tubo / mouse vescica per essere raccolte. Aggiungere 0,8 ml di PBS 1x / tubo / coppia di reni del mouse per essere raccolto. Etichettare ogni provetta corrispondere ad un determinato mouse. Preparare una piastra a 96 pozzetti contenenti 180 ml di PBS 1x in ogni pozzetto per 01:10 diluizioni seriali. </li><li> Pulire l&#39;area di lavoro con il 70% di etanolo e coprire l&#39;area con una copertura o tovagliolo di carta assorbente. </li><li> Anestetizzare il mouse con isoflurano (vedi punto 3.4) fino a quando il mouse smette di respirare per circa 1 minuto, poi posizionarlo sul coperchio o tovagliolo di carta assorbente. Altri metodi di euthanaSia sono accettati anche da comitati IACUC, come l&#39;anidride carbonica, e può essere sostituito in caso di sovradosaggio isoflurano. </li><li> Sacrificare il mouse rapida dislocazione cervicale che consiste di immobilizzare la collo alla base della testa e tirando la coda distanza orizzontale dal corpo finché non si verifica dislocazione. NOTA: La maggior parte dei comitati IACUC richiedono un mezzo secondario di eutanasia e dislocazione cervicale è un metodo comune. Tuttavia, altri metodi possono essere utilizzati, se approvato dal comitato IACUC. </li><li> Posizionare il mouse guasto sul dorso e spruzzare 70% di etanolo sull&#39;addome. Sezionare il mouse, raccogliere la vescica e reni, in questo ordine per minimizzare la contaminazione potenziale dal sangue dopo la dissezione rene. Posizionare gli organi in modo indipendente nei preparati da 5 ml provette contenenti 1x PBS (vedi punto 4.1). NOTA: utilizzare forbici diverse per la dissezione esterna e per il prelievo di organi per ridurre al minimo la contaminazione. </li><li> Toccare il tubo per assicurare gli organi sono in tegli 1x PBS. Ripetere il passaggio 4,3-4,5 per ogni mouse. Forbici pulite e pinze in etanolo al 70% dopo ogni mouse. </li></ol> 5. batterica Recovery <ol><li> Omogeneizzare vescica raccolti e reni nelle provette da 5 ml con un omogeneizzatore tessuto, 15 sec per rene e 30 sec per la vescica. Sciacquare omogeneizzatore sequenzialmente in 1x PBS, il 70% di etanolo e 1x PBS tra i campioni. </li><li> Fai seriali diluizioni 1:10 out a 10 -8 e piastra ogni diluizione per UFC (unità formanti colonie) su piastre di agar LB. Incubare le piastre a 37 ° C durante la notte e contare le colonie il giorno successivo. </li></ol> 6. IBC Enumeration <ol><li> Asetticamente rimuovere la vescica e posizionarlo in 1x PBS in una piastra da 6 pozzetti con fondo silicone. Le piastre possono essere preparati utilizzando un kit di elastomero di silicone e versando circa 1 cm di silicone in ogni pozzetto, vedere produce istruzioni. Tagliare la vescica a metà con le forbici. </li><li> Utilizzando piccoli perni metallici splay delicatamente la fogliader modo che il lume della vescica è rivolto verso l&#39;alto. Assicurarsi di posizionare i perni sui bordi più esterni delle sezioni vescica per garantire la quantità massima di dell&#39;urotelio è esposto. </li><li> Dopo strombatura, lavare delicatamente la vescica una volta con PBS 1x. Rimuovere la PBS 1x per pipetta. Fissare la vescica aggiungendo abbastanza 3% paraformaldeide per coprire l&#39;intera vescica strombato. ATTENZIONE: Paraformaldeide è cancerogeno. Attrezzatura protettiva adatta, compresi i guanti, deve essere indossato in ogni momento. I rifiuti devono seguire le linee guida istituzionali. </li><li> Incubare a temperatura ambiente per 1 ora. Rimuovere la soluzione paraformaldeide. Lavare una volta con PBS 1x. </li><li> Lavare con soluzione di lavaggio LacZ (2 mM MgCl 2, 0,01% sodio desossicolato e 0,02% Nonidet-p40in 1x PBS) tre volte per 5 minuti a lavaggio. </li><li> Rimuovere la soluzione di lavaggio e aggiungere abbastanza macchia LacZ (9,5 ml di soluzione di lavaggio LacZ, 0,4 ml di 25 mg / ml di X-gal e 0,1 ml di 100 mM K-ferrocianuro / K-ferricianuro) per coprire le vesciche. Incubare a 30 ° C overniGHT al riparo dalla luce. </li><li> Rimuovere vesciche strombate da incubatore e osservare IBC, che appaiono come blu puncta come visualizzato con un ambito dissezione, 40-60X ingrandimento. NOTA: A volte un mouse può urinare prima del posizionamento del tubo sotto l&#39;uretra. In questo caso, attendere 15-20 minuti prima di tentare di raccogliere di nuovo le urine. </li></ol> 7. raccolta di urine per batteriuria CFU Enumeration (non applicabile per CAUTI) <ol><li> Per la raccolta delle urine pre o post infezione frenare dolcemente il mouse tenendo la coda e collocata su una superficie elevata piatta (parte superiore della gabbia del mouse). </li><li> Tenere una provetta sterile da 1,5 ml sotto l&#39;uretra mouse. Premere delicatamente verso il basso sul retro del mouse vicino alla coda per esercitare una pressione alla vescica. Cattura l&#39;urina nella provetta da 1,5 ml. </li><li> Fai seriali diluizioni 1:10 out a 10 -7 e piastra ogni diluizione adeguati LB. Incubare le piastre a 37 ° C durante la notte e contare le colonie il giorno successivo. </li></ol> 8. CAUTI modello di protocollo, catetere Ago Preparazione per CAUTI Model (figura S2) <ol><li> Togliere il tappo del G 30 ago. Tagliare un pezzo 7 millimetri di tubo PE10 e 5 mm pezzo di tubo in silicone come RenaSIL. Infilare l&#39;ago con tubi PE10 finché il tubo tocca la base dell&#39;ago. </li><li> Poi alimentare il pezzo 5 millimetri sul ago-PE10 contenenti. UV sterilizzare i aghi assemblee durante la notte. NOTA: Quando si carica il tubo di silicone, lasciare circa 1 millimetro del tubo che si estende oltre la punta dell&#39;ago. </li></ol> 9. E. faecalis OG1RF batterica Inoculum Preparazione <ol><li> Preparare OG1RF inoculo di partenza 48 ore prima del giorno inoculazione. Streak OG1RF su un BHI (Brain Heart Infusion) piatto da uno stock congelato. </li><li> Scegli una colonia e inoculare in 10 ml di BHI e coltivarla staticamente per 18 ore a 37 ° C. Centrifugare la cultura e lavare il pellet (3 volte) in 1 ml di volume di PBS sterile 1x. </li><li> Risospendere il pellet batterico in 1x PBS. Misurare la densità ottica batterica e regolare la concentrazione alla dimensione inoculo desiderato. La concentrazione standard dell&#39;inoculo utilizzato è 10 7; tuttavia, questo può variare a causa del disegno dello studio </li></ol> 10. Catetere impianto <ol><li> Pulire la stazione di lavoro con il 70% di etanolo e coprire l&#39;area con una copertura assorbente (o usare cappa a flusso sterile). </li><li> Fissare il catetere-ago a un vuoto 1 ml (TB) siringa. Tagliare un pezzo quadrato 1 pollice di parafilm e mettere una piccola quantità di lubrificante chirurgica (circa le dimensioni di una monetina) sulla parte superiore. NOTA: Due aghi differenti sono utilizzati per la deposizione del catetere e per l&#39;inoculo di minimizzato inoculazione accidentale dovuto alla manipolazione meccanica necessaria per l&#39;impianto del catetere. Questo permette anche per la comodità di preparare un minor numero di aghi di inoculazione. </li><li> Anestetizzare C57BL / 6 topi mettendoli in un vaso di vetro contenente 32 once un tèpalla -infuser con batuffoli di cotone imbevuti di 3 ml di isoflurano o camera vaporizzatore (segue produce protocollo) fino incosciente ma ancora respirando normalmente (1 respiro / sec). </li><li> Poi mettere il mouse sul dorso su un tovagliolo di carta e diffondere le gambe. Coprire il naso del mouse con un cono di naso o tubo da 50 ml con batuffoli di cotone contenente una piccola quantità (circa 1-2 ml) di isoflurano. ATTENZIONE: Isoflurano è un anestetico per inalazione. Utilizzare in un ambiente ben ventilato e ridurre al minimo l&#39;inalazione dal ricercatore. </li><li> Palpitate delicatamente la vescica per indurre la minzione e garantire una vescica annullata. Pulire zona periuretrale con etanolo al 100% pulire. </li><li> Disinfettare la zona periuretrale con soluzione di iodio-povidone al 10% con un applicatore di cotone-punta. Tamponare l&#39;inoculazione ago / siringa, primo punto, nel lubrificante chirurgico. NOTA: povidone-iodio viene utilizzato per l&#39;impianto del catetere, che è una soluzione asettica forte di alcol. Catetere impianto richiedepiù manipolazione meccanica per inserire il catetere e quindi un maggiore potenziale di contaminazione. </li><li> Inserire il catetere nell&#39;apertura uretrale. Una volta in, utilizzare pinzette per spingere la (7 millimetri PE10) lungo pezzo verso la vescica, quindi spingendo la (5 mm silicone) piccolo catetere e depositarlo nella vescica. Rimuovere l&#39;ago, con il tubo 7 millimetri ancora attaccato, immediatamente. </li></ol> 11. batterica Inoculazione <ol><li> Seguire il protocollo di inoculazione batterica nella sezione 3, utilizzando l&#39;inoculo preparato dalla sezione 9. Rimuovere il mouse dal cono naso e tornare alla sua gabbia </li></ol> 12. A ciascun intervallo di Sacrifice <ol><li> Preparare provette da 5 ml per la vescica e del rene (per organi seguire passo 4.1) e 1,5 ml provetta Eppendorf per cateteri. Aggiungere 1 ml di PBS 1x in 1,5 ml provetta Eppendorf per i campioni catetere </li><li> Seguire i passaggi 4,3-4,5. Sezionare il mouse, la raccolta della vescica, reni e del catetere, placing i tessuti in modo indipendente in 5 provette ml contenenti 1x PBS e il catetere nel 1,5 ml Eppendorf (vedi punto 12.1). NOTA: utilizzare forbici diverse per la dissezione esterna e per la raccolta di organi e il recupero del catetere per minimizzare la contaminazione </li><li> Poi seguire passo 4.6. </li></ol> 13. batterica Recovery <ol><li> Per gli organi, seguire i passi 5.1 e 5.2. Per il recupero batterica da cateteri, vortex alla velocità massima per 30 sec, sonicare campioni catetere per 5 minuti utilizzando un bagno sonicatore, e poi vortex alla velocità massima per altri 30 sec. </li><li> Fai seriali diluizioni 1:10 out a 10 -8 e piastra ogni diluizione per CFU enumerazione su piastre BHI. Incubare le piastre a 37 ° C durante la notte e contare le colonie il giorno successivo. </li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Comunità Semplice acquisito UTI è un&#39;infezione comune e costosa contabilità per diversi milioni di visite di assistenza primaria ogni anno 46. Inoltre, Cautis sono un sanitario comune infezione acquisita che è diventato estremamente oneroso per gli operatori sanitari, come i Centri di Medicare e Medicaid Services non rimborsa i fornitori per il costo aggiunto di trattamento risultante dall&#39;ospedale acquisito CAUTI 45. I modelli murini di UTI, sia cistite non complicata e CAUTI, descritti in...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/52892/establishment-and-characterization-of-uti-and-cauti-in-a-mouse-model">Establishment and Characterization of UTI and CAUTI in a Mouse Model</a>. The Protocol section has been updated.
The ethics statement has been updated from:
Ethics statement: The Washington University Animal Studies Committee approved all mouse infections and procedures as part of protocol number 20120216, which was approved 01/11/2013 and expires 01/11/2016. Overall care of the animals was consistent with The guide for the Care and Use of Laboratory Animals from the National Research Council and the USDA Animal Care Resource Guide. Euthanasia procedures are consistent with the &#8220;AVMA guidelines for the Euthanasia of Animals 2013 edition.&#8221;
to:
Ethics statement: The Washington University Animal Studies Committee approved all mouse infections and procedures as part of protocol number 20150226, which expires 12/10/2018. Overall care of the animals was consistent with The Guide for the Care and Use of Laboratory Animals from the National Research Council and the USDA Animal Care Resource Guide. Euthanasia procedures are consistent with the &#8220;AVMA guidelines for the Euthanasia of Animals 2013 edition.&#8221;
Step 3 has been updated from:
3. Bacterial Inoculation
<ol>
	<li>Clean the workstation with 70% ethanol and cover area with absorbent paper (or use sterile flow hood).</li>
	<li>Draw up to 0.9 ml of the prepared bacterial inoculum into a 1 ml (TB) syringe (remove air bubbles). Attach a prepared sterile inoculation needle with PE10 tubing, onto the syringe containing the inoculum, then sterilely trim the polyethylene tubing. 
	NOTE: Leave 1 mm of tubing above the tip of the needle to avoid puncturing the bladder.</li>
	<li>Cut a 1 inch square piece of parafilm and put a dab of surgical lubricant (approximately the size of a dime) on top.</li>
	<li>Anesthetize female C3H/HeN mice by putting them in a 32 ounce glass jar containing a tea-infuser ball with cotton balls soaked with 3 ml of isoflurane or vaporizer chamber (following manufactures protocol) until unconscious but still breathing normally (1 breath/sec). 
	NOTE: Some IACUC committees do not approve the use of a jar or vaporizer. Please follow the indication of the IACUC committee of your institution. 
	NOTE: If glass jar with tea-ball and/or nose cone with isoflurane-soakd cotton balls are used, the animal must be carefully observed to avoid anesthetic overdose and death. The advantage of using a vaporizer and anesthesia chamber is that it provides controlled isoflurane administration that avoids accidental overdoses. CAUTION: Isoflurane is an inhalation anesthetic. Use in a well-ventilated area and minimize inhalation.</li>
	<li>Remove the mouse from the jar/vaporizer and place it on its back on a paper towel and spread the legs.</li>
	<li>Cover the nose of the mouse with a nose cone (a tube connected to the vaporizer that provides a controlled isoflurance dose that comes equipped on some vaporizer units) or 50 ml conical tube with a cotton ball containing a small amount (approximately 1-2 ml) of isoflurane.</li>
	<li>Gently palpitate the bladder to induce urination and ensure a voided bladder. Wipe the periurethral area with 100% ethanol wipe. Dab the inoculation needle/syringe, point first, into the surgical lubricant.</li>
	<li>Inoculate each mouse with 50 &#181;l of the bacteria solution by inserting the inoculation needle transurethrally, approximately 12 mm, and pressing down on the syringe plunger gently to dispense the inoculum into the bladder gently (10 &#181;l/sec). Remove the inoculation needle from the mouse. 
	NOTE: Immediate return of inoculum at the urethral opening when beginning to inoculate indicates improper or incomplete insertion of the needle.</li>
	<li>Remove the mouse from nose cone and return it to its cage. Repeat steps 3.3-3.8 for each mouse. When/if switching inoculum conditions/strains, dispose of the syringe and inoculation needle in an approved sharps container and start again step 3.2.&#160;&#160; 
	NOTE: Inoculation with uropathogenic organisms generally does not cause severe pain symptoms. However, in rare instances, administering large doses of pathogens may cause fever, reduction in food and water intake and abnormal behavior. Animal health should be monitored throughout the experiment. If overt pain symptoms are notice, an analgesic, such as Buprenorphine (0.05&#8722;0.1 mg/kg given subcutaneously), can be applied. Procedures should be in accordance with each institution&#8217;s IACUC.</li>
</ol>
to:
3. Bacterial Inoculation
<ol>
	<li>Clean the workstation with 70% ethanol and cover area with absorbent paper (or use sterile flow hood).</li>
	<li>Draw up to 0.9 ml of the prepared bacterial inoculum into a 1 ml (TB) syringe (remove air bubbles). Attach a prepared sterile inoculation needle with PE10 tubing, onto the syringe containing the inoculum, then sterilely trim the polyethylene tubing. 
	NOTE: Leave 1 mm of tubing above the tip of the needle to avoid puncturing the bladder.</li>
	<li>Cut a 1 inch square piece of parafilm and put a dab of surgical lubricant (approximately the size of a dime) on top.</li>
	<li>Anesthetize female C3H/HeN mice by putting them in a vaporizer chamber (following manufactures protocol) until unconscious but still breathing normally (1 breath/sec). 
	NOTE: Some IACUC committees do not approve the use of a vaporizer. Please follow the indication of the IACUC committee of your institution. 
	CAUTION: Isoflurane is an inhalation anesthetic. Use in a well-ventilated area and minimize inhalation.</li>
	<li>Remove the mouse from the vaporizer and place it on its back on a paper towel and spread the legs.</li>
	<li>Cover the nose of the mouse with a nose cone (a tube connected to the vaporizer that provides a controlled isoflurance dose that comes equipped on some vaporizer units) to maintain anesthetization.</li>
	<li>Gently palpitate the bladder to induce urination and ensure a voided bladder. Wipe the periurethral area with 100% ethanol wipe. Dab the inoculation needle/syringe, point first, into the surgical lubricant.</li>
	<li>Inoculate each mouse with 50 &#181;l of the bacteria solution by inserting the inoculation needle transurethrally, approximately 12 mm, and pressing down on the syringe plunger gently to dispense the inoculum into the bladder gently (10 &#181;l/sec). Remove the inoculation needle from the mouse. 
	NOTE: Immediate return of inoculum at the urethral opening when beginning to inoculate indicates improper or incomplete insertion of the needle.</li>
	<li>Remove the mouse from nose cone and return it to its cage. Repeat steps 3.3-3.8 for each mouse. When/if switching inoculum conditions/strains, dispose of the syringe and inoculation needle in an approved sharps container and start again step 3.2.&#160;&#160; 
	NOTE: Inoculation with uropathogenic organisms generally does not cause severe pain symptoms. However, in rare instances, administering large doses of pathogens may cause fever, reduction in food and water intake and abnormal behavior. Animal health should be monitored throughout the experiment. If overt pain symptoms are notice, an analgesic, such as Buprenorphine (0.05&#8722;0.1 mg/kg given subcutaneously), can be applied. Procedures should be in accordance with each institution&#8217;s IACUC.</li>
</ol>

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/52892/establishment-and-characterization-of-uti-and-cauti-in-a-mouse-model">Establishment and Characterization of UTI and CAUTI in a Mouse Model</a>. The Protocol section has been updated.

Erratum: Establishment and Characterization of UTI and CAUTI in a Mouse Model

Infezioni del tratto urinario (UTI) sono una delle più comuni infezioni batteriche e possono essere suddivisi in due categorie a seconda del meccanismo di acquisizione, comunità e nosocomiali acquisita UTI. IVU si verificano spesso nelle donne e negli studi altrimenti sane acquisita in comunità hanno dimostrato che circa il 50% delle donne avranno almeno un UTI nella vita 1. Inoltre, la recidiva è un grave problema. Una donna che ha una infezione acuta iniziale ha una probabilità del 25-40% di avere una seconda infezione entro sei mesi, nonostante adeguato trattamento antibiotico e molte donne continuano ad avere recidive frequenti 2. I batteri che causano queste infezioni stanno diventando resistenti ulteriori protocolli terapeutici sempre più confondenti antibiotico 3-6. UTI colpiscono milioni di persone ogni anno costano circa 2,5 miliardi di dollari di spese relative di assistenza sanitaria negli Stati Uniti, sottolineando l&#39;impatto e prevalenza della malattia1,7 .Nosocomial acquisito IVU sono associati principalmente con la presenza di corpi estranei, quali cateteri. Catetere-associate infezioni del tratto urinario (CAUTI) rimangono il nosocomiale più comune acquisito UTI, pari al ~ 70-80% di tali infezioni 8. Inoltre, CAUTI è associata ad un aumento della morbilità e della mortalità ed è la causa più comune delle infezioni del sangue secondarie 9. UPEC comunità associata acquisita IVU sono pensato per essere causato dall&#39;introduzione di batteri nella vescica da giacimenti nel tratto gastrointestinale attraverso la manipolazione meccanica durante il rapporto sessuale, scarsa igiene o di altri dinamica delle popolazioni microbiche tra host differenti nicchie 10. Una volta dentro la vescica, UPEC impiegano numerosi fattori di virulenza, tra cui capsule, sistemi di acquisizione di ferro, le tossine, un plasmide di virulenza, tRNA, isole di patogenicità e fattori di colonizzazione che hanno dimostrato di avere un ruolo nella patogenesi &lt;sup&gt; 11-14. Fondamentale per la creazione di colonizzazione UPEC, UPEC codificare anche più tipi di chaperone adesivo usciere pathway (CUP) pili che riconoscono i recettori con specificità stereochimica 15. Tipo 1 pili, rovesciato con l&#39;adesina FimH, sono espressi da UPEC e BIND uroplakins 16 e α-1, β-3 integrine 17, che si esprimono sulla superficie luminale di entrambe le vesciche umane e di topo 18 mannosylated. Queste interazioni FimH mediata facilitano la colonizzazione batterica e l&#39;invasione delle cellule epiteliali superficiali 19,20. Una volta all&#39;interno della cellula, UPEC può sfuggire nel citoplasma dove un singolo batterio può rapidamente dividere per formare una comunità batterica intracellulare (IBC), che A maturazione, può contenere circa 10 4 21 batteri. Formazione IBC è stata dimostrata in almeno sei diversi ceppi di topi, C3H / nubilato, C3H / HeJ, C57Bl / 6, CBA, FVB / NJ e BALB / c, e con una grande varietà di differenti UPECeppi C e altri enterobatteri 22-24. Tuttavia le differenze temporali e spaziali della formazione IBC può variare a seconda del fondo mouse e il ceppo infettante UPEC. In topi C3H / HeN infettati con il prototipo UPEC ceppi UTI89 o formazione CFT073, IBC possono essere visualizzati come piccoli biomasse di batteri già il 3 HPI (infezione post hr). Questa comunità continua ad espandersi e raggiunge un &quot;punto medio&quot; di sviluppo circa 6 hpi quando i batteri astiformi occupano una grande percentuale di spazio citoplasmatica di cellule superficiali ombrello terminalmente differenziate Questi prima forma GIR in maniera relativamente sincrono con la maggioranza visualizzazione dimensioni simili e morfologie. ~ 8 hpi i batteri nel cambiamento IBC da un bacilli a Cocci morfologia. IBC sono di natura transitoria. Così, IBC maturazione 12-18 risultati HPI in continua espansione della popolazione batterica, seguito dal loro filamentazione e dispersione dal wi cellulareth successiva diffusione di cellule vicine 23. Così, la nicchia IBC consente per la crescita batterica rapida in un ambiente protetto dalle risposta immunitaria e antibiotici 25. Le fasi distinte di infezione UPEC che si vedono nei topi si osservano anche negli esseri umani, come i GIR ei filamentazione, sostenendo il modello murino di UTI come uno strumento utile che può essere utilizzato per modellare UTI nell&#39;uomo 22,26-28. Mentre la maggioranza delle donne sperimenta un UTI nella vita, l&#39;esito di queste infezioni può variare da infezione autolimitante acuta senza recidiva, a frequentare cistiti ricorrenti. Inoltre, gli studi hanno dimostrato una forte presenza familiare di UTI, il che suggerisce una componente genetica contribuisce alla UTI suscettibilità 29. Abbiamo scoperto che i diversi risultati UTI visto in cliniche possano essere riprese dai risultati diversi di infezione sperimentale UPEC tra ceppi di topi inbred 30. Ad esempio, C3H / nubilato, CBA, Topi DBA e C3H / HeOuJ sono suscettibili, in maniera dose-dipendente infettiva, a lunga durata, cistite cronica caratterizzata da persistente, batteri alto titolo (&gt; 10 4 unità formanti colonie (CFU) / ml), alto titolo batteriche oneri vescica al sacrificio&gt; 4 settimane dopo l&#39;infezione (WPI), infiammazione cronica, e necrosi uroteliale. Questi topi mostrano anche elevati livelli sierici di IL-6, G-CSF, KC, e IL-5 entro il primo 24 HPI che servono come biomarcatori per lo sviluppo di cistite cronica. Questo può rappresentare accuratamente il corso naturale della UTI in alcune donne, come gli studi placebo hanno dimostrato che una grande percentuale di donne che subiscono UTI manterrà livelli elevati di batteri nelle urine per diverse settimane dopo i primi sintomi della cistite se non somministrato il trattamento antibiotico 31 , 32. Inoltre, utilizzando topi C3H / nubilato, abbiamo scoperto che una storia di cistite cronica è un fattore di rischio significativo per le successive gravi infezioni ricorrenti. Ricorrente UTI è la più significant manifestazione clinica della UTI e il topo C3H / nubilato è attualmente il modello studiato solo che riassume una maggiore predisposizione dopo l&#39;esposizione precedente. Un altro risultato UTI è ricapitolato in C57Bl / 6 topi in cui l&#39;infezione acuta UPEC è autolimitante, con una risoluzione di infiammazione della vescica e batteriuria entro circa una settimana. È interessante notare che, in questo modello, UPEC facilmente formare riserve intracellulari di riposo all&#39;interno del tessuto della vescica da cui UPEC sono capaci di emergere da uno stato inattivo a ricominciare una UTI attivo, potenzialmente spiegare uno dei meccanismi per lo stesso ceppo UTI ricorrente negli esseri umani 33, 34. Oltre alle influenze genetiche sulla UTI suscettibilità, introduzione di un catetere in vescica aumenta notevolmente la probabilità di avere un&#39;infezione nonché aumentare la gamma di batteri in grado di causare un&#39;infezione. È stato dimostrato che la cateterizzazione urinaria umana provoca istologico ecambiamenti immunologici nella vescica a causa di stress meccanico che si traduce in una risposta infiammatoria robusto, esfoliazione, edema della lamina propria e submucusa, assottigliamento uroteliale, e mucosa lesioni dell&#39;urotelio e rene 35,36. Inoltre, il catetere fornisce una superficie di attacco batterico creando così un ambiente utilizzato da diverse specie di causare CAUTI. Mentre UPEC sono ancora una delle principali cause, Enterococcus faecalis rappresenta il 15% di questi CAUTI 37. E. faecalis sta diventando sempre più resistenti agli antibiotici con vancomicina resistenza emersione, che presentano un grave problema per la salute 38. E. faecalis possiedono numerosi fattori di virulenza tra cui tossine e adesine necessari per il fissaggio sia per il catetere e epitelio 38. Durante cateterizzazione urinaria, l&#39;host è vulnerabile a microbica adesione, moltiplicazione e diffusione del 39,40 tratto urinario. E. faecalis forma un biofilm sul catetere come parte di un meccanismo a persistere nella vescica e diffondere ai reni, che viene riprodotto in un modello di topo CAUTI 41. Recentemente, è stato dimostrato durante cateterizzazione urinaria, fibrinogeno (Fg) viene rilasciato nella vescica come parte della risposta infiammatoria. Fg accumula nella vescica, ricopre il catetere ed è essenziale per E. faecalis formazione di biofilm, funzionando come un ponteggio allegato. In un modello C57BL / 6 del mouse di CAUTI, abbiamo scoperto che E. formazione di biofilm faecalis sul catetere, e quindi la persistenza nella vescica, era dipendente dalla pilus Ebp, in particolare la sua EBPA punta adesina. Abbiamo trovato che il dominio N-terminale di EBPA lega specificamente a FG rivestimento del catetere. Inoltre, si è riscontrato che E. faecalis utilizza Fg come fonte metabolita durante l&#39;infezione, rafforzando in tal modo la formazione di biofilm 42. Modelli murini hanno dimostrato fondamentale per underdagiato nonché prevedere manifestazioni cliniche di UTI e CAUTI 41. In questo articolo abbiamo dimostrato la preparazione inoculo della cistite UPEC isolare UTI89 e inoculazione transuretrale di topi C3H / celibato. Inoltre, dimostriamo un protocollo per l&#39;inserimento del catetere in topi C57BL / 6 e inoculazione del E. ceppo faecalis OG1RF. Entrambe queste tecniche portano a UTI coerente e affidabile o CAUTI nei topi. Mostriamo anche le tecniche utilizzate per osservare la formazione di IBC durante cistite acuta e raccolta delle urine per l&#39;analisi di cistite cronica o ricorrente. Topi C3H / nubilato sono stati utilizzati per studiare gli aspetti della UPEC patogenesi tra cui l&#39;invasione iniziale batterica, la formazione di IBC, filamentazione e lo sviluppo di cistite cronica 23,33,43. Questi parametri di virulenza sono stati studiati anche in una varietà di altri ambiti del mouse 22,33. Per CAUTI, il / 6 modello C57BL permette per l&#39;impianto di corpi estranei nella vescica con conseguente co battericalonization, che può essere mantenuta per 7 giorni dopo l&#39;infezione 41. Questi modelli sono stati utili per valutare i meccanismi di virulenza batterica, le risposte di accoglienza per UTI e meccanismi per sovvertire risposta dell&#39;ospite, gran parte del quale è stato successivamente ricapitolato o osservati nella popolazione umana clinici.

<table><tbody><tr><td>Materiale per la preparazione del catetere e dell'ago:</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>aghi da 30 G</td> BD <td>Precision Glide</td><td>305106</td><td>30 G x &frac12; (0,3 mm x 13 mm)</td></tr><tr><td>Tubo in polietilene PE10</td><td>BD</td><td>427400</td><td>Diametro interno -0,011 pollici (0,28 mm); diametro esterno &ndash; 0,024 pollici (0,61 mm)</td></tr><tr><td>RenaSIL 025 tubo in silicone polimerizzato al platino</td><td>Braintree Scientific, Inc</td><td>SIL 025</td><td>diametro interno-0,012 x diametro esterno 0,025, bobina</td></tr><tr> da 25 piedi<td colspan="4">Materiale per infezioni:</td></tr><tr><td>Isoflourane &ndash; Isothesia</td><td>Butler Schein</td><td>29405</td><td></td></tr><tr><td>Barattolo dritto in vetro trasparente</td> da 250 ml <td>Kimble Chase</td><td>5413289V 21</td><td></td></tr><tr><td>Infusore per tè in acciaio inossidabile</td><td>Schefs-Amazon</td><td></td><td>Premium Infusore per tè sfuso di Schefs - Acciaio inossidabile - Grande capacità -</td></tr><tr><td>Batuffoli di cotone non sterili</td><td>Fisherbrand</td><td>22-456-880</td><td></td></tr><tr><td>Tubi Falcon da 50 ml</td><td>VWR</td><td>89039-660</td><td></td></tr><tr><td>Isotec 3 -vaporizzatore</td><td>Ohmeda</td><td>1224478</td><td></td></tr><tr><td>Ear punch</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-812-201</td> <td>(quando necessario)</td></tr><tr><td>Soluzione Betadine</td><td>Soluzione Betadine</td><td></td><td>10% Povidie-iodio soluzione topica</td></tr><tr><td>Q-tips</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-037-924</td><td></td></tr><tr><td>Pannolini 6 pollici per banco</td><td>Fisherbrand</td><td>14206 63</td><td>Sottocuscinetti assorbenti (20" X36" tappetini)</td></tr><tr><td>Lubrificante chirurgico</td><td>Surgilube</td><td>0281-0205-36</td><td></td></tr><tr><td>Forbice da dissezione</td><td>Strumenti per scienze fini, INC</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>Forcipe Micro-Adson</td><td>Strumenti per scienze fini, INC</td><td>11018-12</td><td></td></tr><tr><td>Siringa da 1 ml</td><td>BD</td><td>309659</td><td>Punta antiscivolo per tubercolina</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>PM996</td><td>4 pollici x 125 piedi</td></tr><tr><td>Eppendorf rack</td><td>Fisherbrand</td><td>05-541-1</td><td></td></tr><tr><td>Provette Eppendorf</td><td>MIDSCI</td><td>AVX-T-17-C</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Cateteri per prelievo, vesciche e reni:</td></tr><tr><td>Omogeneizzatore</td><td>PRO Scientific INC</td><td>Bio-Gen Pro 200</td><td></td></tr><tr><td>Tubo da 5 ml in polipropilene a fondo tondo</td><td>BD</td><td>352063</td><td>per omogeneizzazione di organi</td></tr><tr><td>Asciugamano di carta</td><td>Georgia-Pacific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>Pharmco-AAPER</td><td>11100020S</td><td>200 proof</td></tr><tr><td>Costar&trade; Piastre in polistirene trasparente a 96 pozzetti</td><td>Corning</td><td>3788</td><td></td></tr><tr><td>1x soluzione salina di sodio fosfato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3813</td><td></td></tr><tr><td>BRANSONIC Pulitore ad ultrasuoni 1210</td><td>Branson Ultrasonics Corporation</td><td>1210</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">IBC materiali:</td></tr> <tr><td>piastra di prova per coltura tissutale a 6 pozzetti</td><td>Techno Plastic Products</td><td>92006</td><td></td></tr><tr><td>Pins</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-20</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td>3097358-1004</td><td>Kit elastomero siliconico</td></tr><tr><td>X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-b-D-galattoside)</td><td>Invitrogen</td><td>15520-034</td><td>Ultrapuro</td></tr><tr><td>N, N-dimetilformammide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4551</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 (Cloruro di magnesio)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Desossicolato di sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D6750</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet-P40 Roche</td><td></td><td>11754599001</td><td>Ottilfenolopoli(etilenglicoletere)n</td></tr><tr><td>Esacianoferrato di potassio(II) triidrato (K-ferrOcianadro)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3289</td><td></td></tr><tr><td>Esacianoferrato di potassio(III) (K-ferrIcyanide)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>60299</td><td></td></tr></tbody></table>

istituzione e caratterizzazione di uti e cauti in un modello murino

Establishment and Characterization of UTI and CAUTI in a Mouse Model

Infezioni del tratto urinario (UTI) sono altamente prevalenti, una causa importante di morbilità e sono sempre più resistenti al trattamento con antibiotici. Le femmine sono sproporzionatamente afflitti da UTI: il 50% di tutte le donne avranno un UTI nella vita. Inoltre, il 20-40% di queste donne che hanno un primo UTI subirà una ricorrenza con qualche sofferenza recidive frequenti con un grave deterioramento della qualità della vita, il dolore e il disagio, interruzione delle attività quotidiane, l&#39;aumento dei costi sanitari, e poche opzioni di trattamento diverso di profilassi antibiotica a lungo termine. Uropatogeni Escherichia coli (UPEC) è l&#39;agente eziologico principale di acquisita in comunità UTI. Catetere-associata UTI (CAUTI) è la più comune infezione acquisita in ospedale pari a un milione di eventi negli Stati Uniti ogni anno e costi sanitari drammatici. Mentre UPEC è anche la causa primaria di CAUTI, altri agenti causali sono di maggiore importanza tra cui Enterococcusfaecalis. Qui utilizziamo due modelli murini consolidate che ricapitolano molte delle caratteristiche cliniche di queste malattie umane. Per UTI, un modello C3H / nubilato ricapitola molte delle caratteristiche di virulenza UPEC osservati negli esseri umani, tra cui le risposte di accoglienza, formazione e IBC filamentazione. Per CAUTI, un modello con topi C57BL / 6, che mantengono gli impianti vescica catetere, ha dimostrato di essere sensibili a E. faecalis infezione della vescica. Questi modelli rappresentativi vengono utilizzati per ottenere sorprendenti nuove informazioni sulla patogenesi della malattia UTI, che sta portando allo sviluppo di nuove terapie e strategie di gestione e di prevenzione.

I modelli intravescicali di semplice e catetere IVU associate forniscono piattaforme flessibili per chiarire i meccanismi molecolari della patogenesi batterica, l&#39;impatto di queste malattie sulla tessuto ospite, e lo sviluppo e la sperimentazione di nuovi approcci per gestire queste infezioni comuni e costosi. A seconda del ceppo di topi e patogeno, inoculazione intravesical può essere usato per studiare le interazioni ospite-patogeno per chiarire fattori necessari per avviare o modulante acuta (Figura 1</st...

La capacità di modellare le infezioni del tratto urinario (UTI) è fondamentale per essere in grado di comprendere la patogenesi batterica e generare lo sviluppo di nuove terapie. L'obiettivo di questo lavoro è dimostrare modelli murini di UTI sperimentali e UTI associate a catetere che ricapitolano e predicono i risultati osservati negli esseri umani.

Istituzione e caratterizzazione di UTI e CAUTI in un modello murino

Urinary tract infections (UTI) are highly prevalent, a significant cause of morbidity and are increasingly resistant to treatment with antibiotics. ...

L'obiettivo generale di questa procedura è illustrare un metodo affidabile per l'induzione di infezioni del tratto urinario o UTI e di UTI associate a catetere, o caUTI, in un modello murino, e per valutare tali infezioni. Questo risultato si ottiene innanzitutto preparando correttamente gli inoculari batterici, il catetere e l'ago. Successivamente, il tratto urinario del topo viene inoculato per via intravesicale e sottoposto a cateterizzazione.Successivamente, i tessuti del tratto urinario e i cateteri vengono prelevati per valutare l'infezione. Infine, l'infezione viene quantificata determinando il carico batterico nei tessuti, nell'urina e nei cateteri e/o la formazione di comunità batteriche intracellulari (IBC). In definitiva, il conteggio delle UFC e la colorazione laxy vengono utilizzati per dimostrare l'insediamento, la persistenza e la gravità della colonizzazione del tratto urinario in un modello murino.Il principale vantaggio di questa tecnica consiste nello sviluppare un modello affidabile per simulare le infezioni del tratto urinario umano, al fine di individuare i passaggi critici nella patogenesi delle infezioni da uropatogeni. Questo modello ha contribuito allo sviluppo di nuovi trattamenti e terapie per le infezioni del tratto urinario. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché l'inoculazione, l'internalizzazione e la valutazione delle comunità batteriche intracellulari sono difficili da apprendere, in quanto la manipolazione dell'uretra e del tessuto vescicale non risulta intuitiva.Per iniziare, infilare circa un pollice di tubo PE 10 sull'asta di un ago da 30 gauge. Sterilizzare con raggi UV durante la notte e preparare l'inoculo batterico. Secondo il protocollo descritto nel testo, su una postazione sterilizzata, aspirare fino a 0,9 millilitri dell'inoculo batterico preparato in una siringa da un millilitro.Collegare l'ago per inoculo sterile preparato con tubo in PE alla siringa e, utilizzando forbici sterili, tagliare il tubo in modo che la lunghezza sia di un millimetro. Dopo aver anestetizzato un topo femmina secondo il protocollo descritto nel testo, posizionarlo supino su un foglio di carta e divaricare le zampe. Applicare un cono nasale al topo ed erogare una quantità controllata di isoflurano.Palpare delicatamente la vescica per indurre la minzione ed evitare la vescica, quindi utilizzare un disinfettante al 100% di etanolo per pulire l'area periuretrale. Immergere la punta della siringa con ago di inoculazione nel lubrificante chirurgico. Inserire quindi l'ago di inoculazione nell'uretra per circa 12 millimetri e premere delicatamente lo stantuffo della siringa per somministrare 50 microlitri della soluzione batterica nella vescica.Per raccogliere l'urina, prima o dopo l'infezione, trattenere delicatamente il topo tenendone la coda e posizionandolo su una superficie piana rialzata, come il coperchio di una gabbia per topi. Tenere una provetta sterile da 1,5 millilitri sotto l'uretra del topo e premere delicatamente sulla schiena dell'animale in prossimità della coda per esercitare pressione sulla vescica. Raccogliere l'urina nella provetta.Dopo aver preparato delle diluizioni seriali dell'urina e aver effettuato la coltura per tutta la notte, conta le colonie per eseguire il protocollo C-A-U-T-I. Inizia tagliando un pezzo di tubo PE 10 lungo sette millimetri e un pezzo di tubo di silicone lungo cinque millimetri, ad esempio reil. Rimuovi il cappuccio da un ago da 30 gauge e utilizza il tubo PE 10 per infilare l'ago fino alla base.Quindi inserire il tubo di silicone nel PE 10. Per impiantare il catetere, fissare l'ago del catetere a una siringa da un millilitro vuota. Tagliare un quadrato di paraform da un pollice di lato e applicare una piccola quantità di lubrificante chirurgico sulla superficie.Dopo aver anestetizzato il topo, posizionarlo supino su un tovagliolo di carta e applicare un cono nasale per somministrare isoflurano. Palpare delicatamente la vescica per indurre la minzione ed assicurarsi che la vescica sia vuota. Quindi utilizzare un batuffolo imbevuto di etanolo al 100% per pulire la zona periuretrale.Successivamente, utilizzare una soluzione di iodopovidone al 10% e un applicatore di cotone per disinfettare l'area periuretrale; tamponare la punta dell'ago di inoculazione con il lubrificante chirurgico. Quindi inserire il catetere nell'orifizio uretrale. Una volta inserito, utilizzare una pinzetta per spingere il tubo in PE verso la vescica, in modo da posizionare il catetere in silicone più piccolo all'interno della vescica.Quindi rimuovere immediatamente l'ago con il tubicino di sette millimetri ancora attaccato. Dopo aver preparato l'inoculo batterico di EFAs, utilizzarlo per inoculare la vescica e riportare l'animale nella gabbia prima di determinare il carico batterico secondo la dimostrazione seguente. Una volta che l'animale è stato soppresso, posizionarlo supino e utilizzare etanolo al 70% per spruzzare l'addome, dissezionare il topo, prelevando prima la vescica e poi i reni in quest'ordine, e collocare gli organi in provette separate da cinque millilitri contenenti un XPBS.Se il mouse è canulato, rimuovere il catetere dalla vescica e collocarlo in un tubo separato. Dopo aver omogeneizzato gli organi, preparare diluizioni seriali e coltivare in modo notturno su LB aerato, quindi contare le colonie per l'enumerazione degli IBC. Dopo aver prelevato la vescica, collocarla in una pozzetta rivestita di silicone di una piastra a sei pozzette con PBS e utilizzare le forbici per tagliarla a metà.Utilizzando piccoli perni metallici posizionati lungo i margini esterni, aprire delicatamente la vescica in modo che la sua cavità sia rivolta verso l'alto e che sia esposta la massima quantità di urotelio. Dopo aver eseguito la colorazione XI come descritto nel protocollo testuale, osservare le IBC, che appaiono come puntini blu al microscopio stereoscopico. I dati qui mostrati rappresentano la colonizzazione acuta del tratto urinario da parte dell'isolato prototipico di cistite da uropatogeno UTI 89.In questa figura sono mostrate le UFC presenti quattro settimane dopo l'inoculazione di topi C3 HHEN con due volte 10 alla sette UFC di U UTI I 89. In queste condizioni sperimentali, dal 20 al 50% dei topi infettati sviluppa cistite cronica, mentre il restante 50-80% dei topi risolve l'infezione. La quantificazione dei IBC è una misura informativa del carico batterico durante la cistite acuta e livelli elevati di IBC si correlano con il rischio di sviluppare cistite cronica. Come si osserva qui mediante colorazione con LAE becyase, i IBC appaiono come puntini blu-violacei sull'urotelio, che possono essere contati sullo sfondo C3 HHEN. In media, si possono osservare circa 50 IBC per vescica.I dati mostrati qui provengono da un modello murino con impianto vescicale di infezione del tratto urinario causata da CA A e rappresentano infezioni di 24 ore con il ceppo di E. faecalis OG1 RF. Quando 1 × 10⁷ UFC di OG1 RF vengono inoculate per via intravescicale in una vescica non impiantata, l'infezione inizia a risolversi entro 24 ore post-infezione (HPI) ed è completamente risolta entro 3 giorni post-infezione (3D PI). Al contrario, l'inoculo di OG1 RF in una vescica impiantata determina la colonizzazione sia del catetere che della vescica, con livelli di colonizzazione dieci volte superiori a 24 HPI rispetto alle vesciche non impiantate. Dopo aver seguito questa procedura, altre tecniche come la microscopia confocale e la microscopia elettronica possono essere utilizzate per valutare ulteriormente la formazione di IBC e il localizzazione batterica.Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha suscitato un'ondata di interesse tra molti ricercatori nel campo delle infezioni del tratto urinario, spingendoli a esplorare i fattori di virulenza batterica e le risposte dell'ospite in modelli murini che riproducono la patogenesi umana.

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Questo video dimostra metodi per indurre transurethrally infezioni del tratto urinario del mouse e quantificare l'entità delle infezioni che ne derivano.

Induzione transuretrale di infezioni del tratto urinario mouse

Fonte: Luyts, N., et al. Follow-up longitudinale delle infezioni delle vie urinarie e il loro trattamento nei topi tramite imaging bioluminescenze. J. Vis. Esp. (2021).Questo video dimostra l'induzione e il tracciamento dell'infezione delle vie urinarie in un modello murino utilizzando E. coli bioluminescente iniettate nella vescica, dove avvengono l'adesione, l'invasione e la replicazione intracellulare batterica. La luce emessa dall'operone bioluminescente funge da indicatore in tempo reale...

Visualizzazione dell'infezione delle vie urinarie in un modello murino utilizzando la bioluminescenza

Fonte: Conover, M. S., et al., J. Stabilimento e caratterizzazione di UTI e CAUTI in un modello murino. J. Vis. Esp. (2015)Questo video mostra la procedura per assemblare e impiantare un catetere transuretrale in una topolina, seguita da un'inoculazione batterica per stabilire infezioni urinarie associate al catetere e indagare le interazioni ospite-patogeno mediate dal biofilm.

Infezione delle vie urinarie associata al catetere in un modello murino

Questo video descrive la procedura per generare un modello murino sperimentale di xenotrapianto, che può essere utilizzato per studiare la progressione del carcinoma a cellule uroteliali.

Xenotrapianto tumorale derivato da paziente: una tecnica per generare un modello murino sperimentale per la valutazione del carcinoma a cellule uroteliali

In questo video, descriviamo la tecnica per la somministrazione intravescicale di batteri uropatogeni per generare un modello di infezione del tratto urinario nei topi. Questo modello può essere utilizzato per comprendere la diffusione dell'infezione batterica uropatogena all'interno del sistema urinario e i meccanismi che determinano la suscettibilità alle infezioni delle vie urinarie.

Generazione di un modello di infezione del tratto urinario: una tecnica per somministrare batteri uropatogeni nel topo per sviluppare un modello di infezione del tratto urinario

Questo video dimostra l'instaurazione di un'infezione uropatogena da Escherichia coli in una vescica di topo femmina attraverso l'instillazione di catetere transuretrale. I batteri iniettati stabiliscono con successo un'infezione del tratto urinario all'interno della vescica, fornendo una preziosa piattaforma per lo studio delle malattie associate all'assistenza sanitaria correlate al tratto urinario.

Cateterismo transuretrale e inoculazione batterica per generare un modello di infezione del tratto urinario nei topi maschi

Istituzione di un modello di infezione del tratto urinario nei topi femmina

L'infezione della prostata può essere un fattore che contribuisce a mediare dolore pelvico in prostatite cronica. Descriviamo la procedura per la preparazione di standard inoculo batterico, l'instillazione di batteri nell'uretra di topi maschi e la metodologia per la misurazione allodinia tattile nei topi nel corso del tempo.

Misurazione della tattile Allodinia in un modello murino di prostatite batterica

Il modello stabilito di cateterizzazione transuretrale dei topi permette lo studio delle patologie della vescica, compreso l'infezione delle vie urinarie, ma può essere eseguito solo nelle femmine. Un nuovo modello di maschio instillazione transuretrale, qui presentato, consentirà la ricerca in un'area segnata da forti differenze cliniche ed epidemiologiche tra i sessi.

Infezione di apparato urinario in un modello animale piccolo: cateterizzazione transuretrale di topi maschi e femmine

Viene dimostrato un modello murino di inoculazione transuretrale uropatogena di E. coli (UPEC) per stabilire serbatoi latenti della vescica intracellulare e la successiva esposizione della vescica a G. vaginalis per indurre UPEC UTI ricorrente. Sono inoltre dimostrati l'enumerazione dei batteri, la citologia delle urine e la fissazione e l'elaborazione della vescica in situ per la microscopia elettronica a scansione.

Infezione ricorrente del tratto urinario da Escherichia coli innescata dall'esposizione alla vescica di Gardnerella vaginalis nei topi

Questo manoscritto descrive la somministrazione intravescicale di batteri uropatogeni con un operone lux per indurre un'infezione del tratto urinario nei topi e la successiva analisi longitudinale in vivo della carica batterica utilizzando l'imaging a bioluminescenza.

Follow-up longitudinale delle infezioni del tratto urinario e loro trattamento nei topi utilizzando l'imaging a bioluminescenza

Scopri un metodo affidabile per stabilire infezioni delle vie urinarie e CAUTI in un modello murino. Questa tecnica consente di valutare la colonizzazione batterica e lo sviluppo di comunità batteriche intracellulari per studiare la patogenesi e sviluppare nuove terapie.

Istituzione e caratterizzazione di UTI e CAUTI in un modello murino

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