Name: Lectura granel simple de Digital ácidos nucleicos Cuantificación ensayos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 55 s
Description: Aprende a simplificar la lectura de ensayos digitales de gotas mediante fluorescencia masiva con termocicladores qPCR estándar. Este método permite cuantificar ácidos nucleicos sin equipos especializados.

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Los autores reconocen a Liyi Xu por proporcionar reactivos y protocolos de MDA. También agradecemos a David Feldman y Navpreet Ranu por las discusiones relacionadas con este trabajo. Este trabajo fue apoyado en parte por un premio Burroughs Wellcome Career Award en la Scientific Interface to PCB.

Nota: fabricar el dispositivo de microfluidos no es necesario para este ensayo, en forma de gotas para este protocolo se pueden formar con los responsables de gotitas comerciales existentes 23,29. 1. Hacer que el dispositivo de microfluidos Gotita de formación <ol><li> Preparar molde maestro para los canales con el protocolo Fabrication Maestro SU-8 esbozó previamente 31, pero con un patrón de máscara generador de gotas 32. </li><li> Fabricar dispositivos en PDMS utilizando las técnicas de litografía blanda 32,33. </li></ol> 2. Prepare la mezcla de reacción para granel Gotita Lectura Nota: El protocolo se puede utilizar para cuantificar ácidos nucleicos utilizando muchos tipos de reacciones de amplificación. Como ejemplo, se dan los reactivos necesarios para MDA de varias concentraciones de ADN Lambda. Detalles de reactivos se enumeran en la Tabla de reactivos específicos. La distribución de plantilla dentro de las gotitas depende de suficient de mezcla de la muestra. <ol><li> Obtener o ADN polimerasa Phi29 Purify. <ol><li> Purificar Phi29 lo descrito previamente 7, o la compra de un proveedor. El Phi29 utilizado para los experimentos mostrados se purificó. </li></ol></li><li> Preparar 10 ml de desnaturalización tampón consistente en 65 mM de KOH, EDTA 1,65 mM, y DTT 14 mM. </li><li> Preparar 10 ml de tampón de neutralización que consisten en HCl 65 mM, 0,21 M Tris-Cl pH 7,0, y 9 Tris-Cl mM, pH 8,0. </li><li> Preparar dos estándares, uno no tiene control plantilla (NTC), como el agua libre de nucleasa, y una alta concentración de la plantilla (en torno a 4 pg de ADN Lambda / l). Desnaturalizar 3.3 l de cada estándar con 3,3 l de desnaturalización de búfer en un tubo de qPCR. Incubar a temperatura ambiente durante 3 min. Saciar cada uno con 3,3 l de tampón de neutralización. </li><li> Desnaturalizar 3.3 l de la plantilla de interés con 3,3 l de desnaturalización de búfer en un tubo de qPCR. Incubar a temperatura ambiente durante 3 min. Saciar con 3,3 lde tampón de neutralización. </li><li> Preparar 11 l de mezcla maestra por muestra en hielo. La mezcla maestra de reacción 2x ​​MDA consiste en ADN de doble cadena 2x (dsDNA) tinte vinculante, tinte referencia 2x qPCR, 50 M oligo aleatorizado, 2 mg / ml de BSA, ADN Phi29 2x Polimerasa tampón de reacción, 4,8 mM dNTPs, agua libre de nucleasa y 40 mg / ml de ADN polimerasa Phi29. Añadir ADN polimerasa Phi29 última para garantizar la polimerasa no encontrarse con niveles de pH mucho más alto o más bajo que 7.5.Mix bien. </li><li> Opcional: Para un menor número de falsos positivos, exponer mezcla maestra con luz UV antes de formar gotitas 34. <ol><li> Preparar 10 l de pre-mezcla por muestra en un tubo transparente de 0,5 ml o 1,5 ml en hielo. La premezcla se compone de 55 M oligo aleatorizado, 2,2 mg / ml de BSA, ADN polimerasa Phi29 1.1x tampón de reacción, 5,3 mM dNTPs, y el agua libre de nucleasa. </li><li> Se coloca el tubo en el agua en hielo como se describe 34 y exponer a la luz UV (254 nm) a un accuacu- dosis de 5,7 J / cm 2. </li><li> Añadir colorante dsDNA vinculante a 1x, tinte referencia a 1X, y Phi29 a 40 mg / ml en la pre-mezcla. Mezclar bien. </li></ol></li><li> Combine 10 l de plantilla desnaturalizado o estándar y 10 l de mezcla maestra. Mezclar bien. </li></ol> 3. Gotita Formación Nota: Las gotitas pueden ser muy sensibles a la electricidad estática y el esfuerzo cortante. Quitar las ropas que pueden causar electricidad estática, y la tierra antes de la formación de gotas. Manejar tubos de emulsión desde la parte superior del tubo, en la medida de la emulsión como sea posible. Emulsiones pipeta muy lentamente, de preferencia con una gran punta de la pipeta ánima. Cuando la dispensación de una punta de pipeta, ver la emulsión en el lado de la punta para determinar la velocidad de pipeteado. <ol><li> Gotas de formulario. Para los experimentos mostrados, el dispositivo de microfluidos tiene una entrada de aceite y dos entradas acuosas con un cruce de enfoque de flujo para la generación de gotitas. Utilice dos syriESN bombas para controlar las velocidades de flujo de 55 l de aceite con tensioactivo y un 20 l de mezcla de reacción a través del chip de microfluidos para generar 20.000 1 gotitas nl. </li><li> Nota: Es posible producir gotitas con muchos tipos de aceite con tensioactivo, pero la composición afectará en gran medida la estabilidad de gota a altas temperaturas y el tiempo. Una combinación posible es HFE aceite fluorado 7500 con un tensioactivo aniónico 19,35. </li><li> Producir gotitas en cualquier tamaño, con cualquier método de 13,36, pero la variabilidad del tamaño de la población de gotitas afectará la fluorescencia a granel, y por lo tanto la exactitud del ensayo. Para los experimentos mostrados, las gotitas eran monodispersas con un volumen de 1 nl. </li><li> Recoge todas las gotas y el aceite en tubos de PCR. Para cada muestra, alícuota de 30 l de aceite en tubos de PCR frescas con tapones ópticos y transferir 20 l de gotas en la parte superior del aceite. Los volúmenes consistentes garantizan el ensayo es como accomisariar posible. </li><li> Cerrar tubo de tapas con fuerza, como tapas flojas permitirán que el aceite se evapore. </li></ol> 4. La amplificación isotérmica <ol><li> El uso de un termociclador de PCR, qPCR termociclador o placa caliente, incubar las muestras a 30 ° C durante 7 horas, e inactivar durante 1 min a 75 ° C. Los tubos de las gotitas se pueden dejar en una nevera revestido con una lámina por un par de horas en este punto. </li></ol> 5. Adquisición de Datos y Análisis <ol><li> Inmediatamente después de la inactivación de reacción, medir los niveles de fluorescencia de colorante para todas las muestras utilizando el termociclador qPCR. Configuración del filtro óptima dependerá de excitación del colorante y espectros de emisión. Para este ejemplo, utilice el filtro de 516 nm-492 nm fijado para el tinte dsDNA vinculante, y el filtro 585 nm nm-610 fijado para el tinte de referencia. Otras técnicas de medición fluorescentes se pueden utilizar para cuantificar la fluorescencia. </li><li> Para cada muestra, dividir la intensidad de fluorescencia del colorante dsDNA vinculante porla intensidad de fluorescencia del colorante de referencia. Restar la fluorescencia de fondo, o la fluorescencia normalizada del control sin plantilla, de todas las muestras. </li><li> Crear una curva patrón lineal utilizando las medidas de fluorescencia corregidos de las normas. La norma NTC representa la fluorescencia para una muestra con 0% gotitas fluorescentes (&quot;todos negativos&quot;), y la medición de fluorescencia alta concentración de plantilla es la fluorescencia esperado para una muestra con 100% gotitas fluorescentes (&quot;todo es positivo&quot;). Utilizando la curva estándar correspondiente, predecir las proporciones intermedias de gotitas positivos y negativos sobre la base de su fluorescencia a granel. </li></ol> 6. producir gotas de Medidas de prueba de Principio <ol><li> Hacer fluorescentes gotitas (positivos): Preparar una mezcla de reacción PCR que consta de 0,1 ng de ADN Lambda, tinte 1x dsDNA vinculante, tinte de referencia 1x, 1,5 unidades de Taq ADN polimerasa, 10 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM dNTP, y 0,5 mM cebadores. Termociclo la mezcla de 30 veces (95 ° C durante 20 seg, 55 ° C durante 20 seg, 72 ° C durante 1 min), a continuación, formar gotitas como se describe anteriormente. </li><li> Hacer no fluorescentes gotitas (negativos): Preparar una mezcla de reacción de PCR que consiste en colorante 1x dsDNA vinculante, tinte de referencia 1x, 1,5 unidades de Taq ADN polimerasa, 10 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, 1,5 mM de MgCl 2, mM dNTP 0,2, y 0,5 mM cebadores. Termociclo las mezcla de 30 veces (95 ° C durante 20 s, 55 ° C durante 20 s, 72 ° C durante 1 min), entonces se forman gotitas. </li><li> La formación de relaciones de gotas premezclados <ol><li> Distribuir 20 l de aceite fluorado en tubos qPCR, cubrir con una tapa óptica para evitar la evaporación. </li><li> Pipetear suavemente 10 l de gotitas bien mezclados en proporciones de positivos deseados: negativos en la parte superior del aceite. En los resultados mostrados, positivos: relaciones de gotitas negativos fueron 1 (todas positivas), 0,8, 0,5, 0,2, 0,1, 0,01, 0,001, 0,0001 y 0 (todo el negativa). </li></ol></li><li> Medir los niveles de colorante de fluorescencia para todas las muestras utilizando el termociclador qPCR. Para este protocolo, utilice el filtro de 516 nm-492 nm fijado para el tinte dsDNA vinculante, y el filtro 585 nm nm-610 fijado para el tinte de referencia. <ol><li> Normalizar dsDNA vinculante tinte de fluorescencia utilizando colorante de referencia de fluorescencia. Normalizar aún más por la fluorescencia de la &quot;todos positivos&quot; de la muestra. </li></ol></li><li> Crear una curva patrón lineal utilizando las medidas de fluorescencia normalizados de los &quot;todos positivos&quot; y &quot;negativos&quot; todas las muestras. Utilizando la curva estándar correspondiente, predecir las proporciones intermedias de gotitas positivos y negativos sobre la base de su fluorescencia a granel. </li><li> Repite el experimento para cada relación (n = 3) con la formación de gotas independiente y de mezcla para cada réplica. </li></ol> Experimento 7. La prueba de principio MDA <ol><li> Medir la concentración de solución madre de ADN Lambda con una especificaciónfotómetro. <ol><li> Calcular la concentración de plantilla necesario medias moléculas 10 de la plantilla por las gotitas. Para este protocolo, asumen volúmenes de gota son 1 nl y 1 ng de ADN Lambda contiene aproximadamente 1,9 x 10 7 copias. Por lo tanto, 10 plantillas por gotita será de 10 copias por nl o 526 fg de ADN Lambda por l. La plantilla se diluyó ~ 6x cuando se forman las gotitas, por lo tanto, la concentración inicial más alta plantilla será 3,2 pg / l. </li></ol></li><li> En serie diluir el ADN Lambda de 3.2 pg / l con desnaturalización Buffer e igual volumen de tampón de neutralización. Para un factor de dilución de 0,1, combinar muestra de 10 l con 45 l de tampón de desnaturalización e incubar a temperatura ambiente durante 3 min. Añadir 45 lL de tampón de neutralización para saciar. </li><li> Además diluir la muestra como se describe en el paso 7.2 para hacer que el resto de las muestras para el experimento. Las concentraciones iniciales de plantilla en las reacciones que se muestran fueron 3,2 pg, 320 fg,160 fg, 32 fg, 16 fg, 3,2 fg, y 1,6 fg por microlitro. Nota: Las concentraciones plantilla finales después de la adición de mezcla maestra eran 526 fg, 52,6 fg, 26,3 fg, 5,26 fg, 2,63 fg, 526 ag y 263 ag por microlitro. 10, 1, 0,5, 0,1, 0,05, 0,01, y 0,005 esperados copias Lambda por gotita, respectivamente. </li><li> Generar y analizar las gotitas de cada muestra como se describe en los pasos 2.5-5.3. </li><li> Adquirir las imágenes de fluorescencia se muestra (Figura 2,3) utilizando una cámara digital montado en un microscopio de epi-fluorescencia con un objetivo 10x a TA. Adquirir doce campos de visión para cada muestra. Imágenes de fluorescencia Corregir una imagen de fondo obtenido con un tobogán fluorescente por. </li><li> Utilice una cámara contenida para imágenes 37 como el aceite de la emulsión se evaporará rápidamente. </li><li> Analizar intensidades de gotas individuales utilizando una macro ImageJ (archivo de código suplementario). <ol><li> Elija una intensidad de fluorescencia umbral que mejor separa gotitas no fluorescentes en el NImágenes de TC de las gotas fluorescentes en las imágenes de alta concentración de la plantilla. Para cada muestra desconocida, calcular la fracción de gotitas con una intensidad de fluorescencia por encima del umbral. </li></ol></li></ol> 8. reacciones de PCR a granel y MDA <ol><li> Preparar reacción de PCR. <ol><li> Diluir en serie de ADN plantilla con un factor de dilución de 0,1. Para cada dilución, se combinan 10 l de plantilla con 45 l de desnaturalización Buffer e incubar a temperatura ambiente durante 3 min. Combine la dilución con 45 l de tampón de neutralización. </li><li> Preparar 20 l de mezcla maestra de PCR por muestra. La mezcla maestra de reacción 1.1x PCR consta de 60 unidades / l de ADN polimerasa Taq, 11 mM Tris-HCl, KCl 55 mm, 1,65 mM MgCl2, 0,22 mM dNTP, tinte, tinte referencia 1,1x y 1,1x 550 nM dsDNA vinculante cada cebador. </li><li> Combinar 2 l de plantilla diluida y 20 l de mezcla maestra. Nota: Las concentraciones plantilla finales en tél PCR reacciones mostradas fueron 50 pg, 5 pg, 500 fg, 50 fg, 5 fg, 500 ag, y 0 g de ADN Lambda por microlitro, y se realizaron por triplicado. </li><li> Termociclo reacción PCR en la máquina qPCR con el siguiente programa. Ejecutar 40 ciclos de 95 ° C durante 30 seg, 57 ° C durante 20 seg, 72 ° C durante 30 seg antes de 2 min a 72 ° C durante 2 min y mantenimiento a 4 ° C. </li><li> Normalizar dsDNA vinculante tinte de fluorescencia utilizando referencia colorante fluorescente antes de su posterior análisis. </li></ol></li><li> Preparar reacción MDA. <ol><li> Diluir las muestras como se describe en el paso 8.1.1. </li><li> Preparar 11 l de mezcla maestra por muestra en hielo. La mezcla maestra de reacción 2x ​​MDA consiste tinte 2x dsDNA vinculante, tinte referencia 2x, 50 M oligo aleatorizado, 2 mg / ml de BSA, ADN phi29 2x Polimerasa tampón de reacción, 4,8 mM dNTPs, agua libre de nucleasa, y 40 mg / ml ADN polimerasa Phi29. </li><li> Añadir la ADN polimerasa Phi29 a 40 g / ml durar para asegurar la polimerasa does no encontrarse con niveles de pH mucho mayor o menor que 7,5. Mezclar bien. </li><li> Desnaturalizar 3,3 l de plantilla se diluye con 3,3 l de desnaturalización de búfer en un tubo de qPCR. Incubar a temperatura ambiente durante 3 min. Añadir 3,3 l de tampón de neutralización. </li><li> Combine 10 l de plantilla desnaturalizado y 10 l de mezcla maestra. Mezclar bien. </li><li> Ejecutar reacción MDA en máquina qPCR con el siguiente programa. </li><li> Mantenga a 30 ° C durante 4 horas, medir la fluorescencia cada 7,5 minutos. </li><li> Inactivar a 75 ° C durante 1 min. </li><li> Normalizar dsDNA vinculante tinte de fluorescencia utilizando colorante de referencia de fluorescencia. Normalizar aún más por la fluorescencia máxima para cada muestra. </li></ol></li></ol>

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<li>Romanowsky, M. B., Abate, A. R., Rotem, A., Holtze, C., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+production+of+single+core+double+emulsions+in+a+parallelized+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">High throughput production of single core double emulsions in a parallelized microfluidic device.</a> Lab Chip. 12 (4), 802-807 (2012).</li>
</ol>

El Instituto Broad puede presentar una solicitud de patente que incluya aspectos de este trabajo.

Ensayos digitales son poderosos métodos que permiten la detección de células raras y contando de individual de moléculas de ácido nucleico. Sin embargo, los ensayos digitales aún no se aplican de forma rutinaria en los laboratorios de análisis, debido en parte al coste de equipo especializado asociados con los métodos disponibles comercialmente. Aquí se describe un ensayo digital de punto final para la cuantificación de ácidos nucleicos con una lectura analógica simplificada usando una cuantitativa en tiempo real máquin...

Ensayos digitales para la cuantificación de ácidos nucleicos (PCR digital) 1.4 y la base de la orden (secuencia) están impactando fuertemente las ciencias de la vida y la medicina. Digitales proporcionan ensayos de cuantificación de los recuentos moleculares en una escala absoluta (no respecto a un control), proporcionando una alta sensibilidad, lo que permite comparaciones fáciles a través de experimentos, y crucial, lo que permite la construcción de grandes bases de datos que contienen datos comparables 5 (Tabla 1). En los últimos 15 años, la amplificación del genoma (WGA) surgió junto PCR como una herramienta general para la amplificación de ácidos nucleicos. Al igual que la PCR, WGA es útil para aplicaciones analíticas y preparativas por amplificación de elementos de la muestra minuto hasta un nivel que puede ser fácilmente detectado o utilizado para los análisis posteriores, como la secuenciación de base. A diferencia de PCR, WGA no es específico de un locus particular de ADN, en lugar permitiendo la amplificación de todas las secuencias en la muestra, incluyendo secuencias desconocidas.Esta diferencia fundamental entre la PCR y WGA hace que los métodos complementarios entre sí y da lugar a diferentes desafíos en su aplicación. El alto rendimiento de las reacciones de WGA 6 permite la amplificación rutinaria de ADN genómico a partir de moléculas individuales 7, células individuales 8 y otras muestras de baja biomasa 9 para la cuantificación o análisis adicional. Los principales desafíos relacionados con la química WGA son su extrema sensibilidad a los contaminantes y la amplificación desigual entre moléculas plantilla individuales 6. Sin embargo, WGA está ganando popularidad como la secuenciación de una sola célula se ha convertido en la &quot;aplicación asesina&quot; de la tecnología WGA 10, y la plantilla de la cuantificación de Ventajas de Windows Original es importante en muchos campos de aplicación 7. Instrumentación para la cuantificación de ácido nucleico digital ha sido descrita previamente en una variedad de válvula y sin válvula forma de microfluidosts 11-14, incluyendo ensayos basados ​​en gotitas 15,16 (Tabla 2). Sin embargo, los sistemas de microfluidos comerciales para análisis digital requieren equipo especializado para la configuración de la reacción y la detección del producto 17. Microfluidos con válvula de encargo son flexibles, pero requieren de microfabricación de precisión y sistemas de control neumático 18. Si bien es relativamente sencillo de hacer monodispersas micro-gotas para los ensayos digitales basados ​​en emulsión 19,20, lectura digital es técnicamente onerosa, que requiere de formación de imágenes de campo amplio a gran escala (similar a las tecnologías de secuenciación populares de próxima generación) o 21,22 de alta velocidad de flujo basados ​​en la detección de gotas 23-25. Idealmente, un ensayo digitales sería simple a partir de la configuración de lectura de salida, reduciendo la necesidad de instrumentación compleja y permitiendo que un gran número de muestras para ser leído rápidamente. Aquí se describe un método simplificado para la lectura de los ensayos de gotitas digital que utiliza un tiempo real PCR convencional iNSTRUMENTO para medir la fluorescencia mayor parte de los ensayos digitales basados ​​en gotas. Mientras que el nuevo enfoque puede aplicarse a los ensayos de PCR digitales, es particularmente ventajoso para los ensayos de WGA digitales para el cual analógica ensayos de amplificación en tiempo real (que dan excelentes resultados para la PCR) son problemáticos. Ventajas de Windows Original se aplica comúnmente a las muestras con las moléculas de plantilla que son heterogéneos en secuencia, longitud y contenido de la base. Estas diferentes moléculas de molde se amplifican a diferentes velocidades 6, lo que exige el uso de una referencia (&quot;estándar&quot;) muestra con características coincidentes. A menudo, no hay tal estándar está disponible, o las características de las muestras entrantes son desconocidos. La heterogeneidad del material de entrada y la propiedad dependiente de la longitud de químicas de WGA 26 también complicar la interpretación de los resultados mediante la creación de ambigüedad en lo que se está cuantificado - la masa de entrada, el número de moléculas de entrada, una combinación de los dos, o ninguno. Finalmente, la secuencia de no especificidad de amplificación del desplazamiento hace que múltiple cuantitativa (MDA) más sensibles a la contaminación que la PCR cuantitativa ya que las moléculas contaminantes de cualquier secuencia tienen un potencial de interferir. Ensayos digitales microfluidos abordar la contaminación por segregar moléculas plantilla y la reducción de los volúmenes de reacción tales que menos contaminantes se muestrean. Aquí se utiliza un método WGA isotérmica popular, MDA 27. Es de destacar que varias otras químicas WGA incluyendo PicoPlex y MALBAC 28 dependen crucialmente de pasos iniciales de desplazamiento de hebra isotérmica. Pasos isotérmicos exacerban el reto de aplicar ensayos en tiempo real analógicos para WGA cuantitativo. WGA no puede ser ni impidió completamente durante la instalación, lo que lleva a no deseado de pre-amplificación variables, ni discretiza (&quot;ciclado&quot;) de una manera donde la replicación de moléculas heterogéneas puede ser conducido a la terminación y se detuvo antes de la siguiente ciclo de PCR como 11 </sup&gt; (Figura 1). Un formato de ensayo digital para WGA acoge procedimientos de configuración reacción típica debido a la segregación de cada molécula para la enumeración en el punto final de ensayo (de modo pre-amplificación no afecta a los resultados) de lectura original significa exactitud sería en gran medida independiente de la variación en la eficiencia de amplificación. El ensayo depende de las gotitas producidas en aceite con volúmenes uniformes, ya que el nivel de la señal por la gotita en el punto final del ensayo dependerá del volumen de gota, y no queremos que la consistencia de los resultados que dependen de un promedio a través de una distribución de tamaños de gota. Hacer gotitas monodispersas es ahora un procedimiento estándar (alrededor de 3.500 documentos de gotitas monodispersas se han publicado desde 2013), sino que requiere la instrumentación de microfluidos 25. De hecho, más de seis empresas han desarrollado productos comerciales independientes que dependen de la producción de este tipo de gotas, y los chips de microfluidos gotitas de decisiones sondisponible comercialmente 23,29. Para este estudio, se utilizaron dispositivos de microfluidos encargo de fabricación propia (véase el Protocolo). Las bombas de jeringa para conducir el flujo a través de los dispositivos también están disponibles comercialmente, pero, alternativamente, puede estar sustituido con un solo jeringa desechable para el flujo impulsado por vacío para reducir los costos 30.

<table><tbody><tr><td>Evagreen Dye</td><td>Biotium</td><td>31000</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>New England Biotechnologies</td><td>B9000S</td><td></td></tr><tr><td>Phi29 Tampón de reacción de ADN polimerasa</td><td>New England Biotechnologies</td><td>B0269S</td><td>Vórtice periódicamente hasta que el agregado se disuelve</td></tr><tr><td>ADN lambda</td><td>New England Biotechnologies</td><td>N3011S</td><td>Calentado a 50 oC y enfriado hielo antes de la dilución</td></tr><tr><td>Oligótidos aleatorios de MDA</td><td>Tecnologías de ADN integradas 5</td><td></td><td>'-NNNNN*N-3'Imprimaciones</td></tr> <tr><td>de PCR</td> Tecnologías <td></td> de <td>ADN integradas</td><td>5'-CGGCAAACGGGAATGAAACGCC-3' y 5'-TGCGGCAAAGACAGCAACGG-3'</td></tr><tr><td>Agua ultrapura sin nucleasas</td><td>Life Technologies</td><td>10977-015</td><td>Tratada con rayos UV durante 30 minutos en Stratalinker 2400 antes de su uso (opcional)</td></tr><tr><td>Colorante de referencia ROX</td><td>Life Technologies</td><td>12223-012</td><td></td></tr><tr><td>Tapones de tiras ópticas para PCR</td><td>Life Technologies</td><td>4323032</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de PCR</td><td>Agilent Technologies</td><td>401428</td><td></td></tr><tr><td>dNTP (25 micromolares cada uno)</td><td>Agilent Tecnologías</td><td>200415</td><td></td></tr><tr><td>Termociclador - Sistema qPCR Mx3000P</td><td>Agilent Technologies</td><td>401403</td><td></td></tr><tr><td>Puntas de pipeta de barrera</td><td>VWR</td><td>89003-046</td><td></td></tr><tr><td>Aceite Bio-rad para evagreen</td><td>Bio-rad</td><td>186-4005</td><td></td></tr><tr><td>JumpStart Taq ReadyMix</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2893-100RXN</td><td></td></tr></tbody></table>

lectura granel simple de digital ácidos nucleicos cuantificación ensayos

Simple Bulk Readout of Digital Nucleic Acid Quantification Assays

Ensayos digitales son poderosos métodos que permiten la detección de células raras y recuento de moléculas de ácido nucleico individuales. Sin embargo, los ensayos digitales son todavía no se aplican de forma rutinaria, debido al coste y equipos específicos asociados con los métodos disponibles comercialmente. Aquí presentamos un método simplificado para la lectura de las pruebas de gota digitales utilizando un instrumento convencional PCR en tiempo real para medir la fluorescencia mayor parte de los ensayos digitales basados ​​en gotas. Caracterizamos el rendimiento del ensayo de lectura mayor usando mezclas de gotitas sintético y un digital de amplificación por desplazamiento múltiple (MDA) de ensayo de gotas. Cuantitativa MDA en particular se beneficia de un formato digital de la reacción, pero nuestro nuevo método se aplica a cualquier ensayo digital. Para protocolos de ensayo digitales establecidos, tales como PCR digital, este método sirve para acelerar y simplificar la lectura del ensayo. Nuestra metodología de lectura mayor aporta las ventajas de partitioned ensayos sin la necesidad de la instrumentación de lectura especializada. Las principales limitaciones de la metodología de lectura mayor se reducen rango dinámico en comparación con las plataformas de gotita de conteo y la necesidad de una muestra estándar, aunque los requisitos de esta norma son menos exigentes que para un experimento en tiempo real convencional. La amplificación del genoma completo cuantitativa (WGA) se utiliza para probar los contaminantes presentes en las reacciones de Ventajas de Windows Original y es la forma más sensible para detectar la presencia de fragmentos de ADN con secuencias desconocidas, dando el método de gran promesa en diversas áreas de aplicación incluyendo control de calidad farmacéutica y la astrobiología.

Mientras que las lecturas de mayor convencional / en tiempo real se pueden utilizar tanto para PCR cuantitativo y ensayos cuantitativos WGA (Figura 1), ensayos cuantitativos digitales proporcionan ventajas (Tabla 1). En el método descrito, leemos a cabo ensayos digitales en formato micro-gotita con una medición de punto final a granel sencilla (Figura 2). Si bien este método es ampliamente aplicable, nos centramos en WGA cuantitativa (MDA) ya que este método presenta de...

Describimos un ensayo digital de punto final para cuantificar ácidos nucleicos con una lectura simplificada (analógica). Medimos la fluorescencia masiva de ensayos digitales basados en gotas utilizando una máquina de qPCR estándar en lugar de instrumentación especializada y confirmamos nuestros resultados mediante microscopía.

Lectura granel simple de Digital ácidos nucleicos Cuantificación ensayos

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are ...

El objetivo general de este procedimiento es simplificar la lectura de ensayos en gotas digitales mediante el uso de un instrumento convencional de PCR en tiempo real para medir la fluorescencia total del ensayo. Esto se logra primero preparando reacciones de amplificación de las muestras de interés, dos estándares y formando gotas para particionar cada una en miles de reactores del tamaño de nanolitros. El segundo paso consiste en incubar las gotas para amplificar los ácidos nucleicos dentro de cada gota.A continuación, se mide la fluorescencia total de cada muestra o estándar mediante un QPC estándar o un termociclador. El paso final consiste en predecir la fracción de gotas fluorescentes en las muestras de interés utilizando una curva estándar generada a partir de las muestras estándar. Para verificar el desempeño de este método, se puede utilizar microscopía fluorescente para evaluar independientemente el rendimiento de cuantificación del ensayo de fluorescencia total.La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como el recuento de gotas es que no requiere instrumentación especializada antes de comenzar la reparación de este ensayo. Se necesitan todos los reactivos necesarios, tal como se describe en el texto del protocolo, y dos patrones. Uno, un control sin molde, como agua libre de nucleasas, y otro con alta concentración de molde, como ADN lambda. Desnaturalice 3,3 microlitros de cada patrón con 3,3 microlitros de tampón de desnaturalización en un tubo A-Q-P-C-R.Incubarlo a temperatura ambiente durante tres minutos. Detener cada reacción con 3,3 microlitros de tampón de neutralización. De manera similar, desnaturalizar 3,3 microlitros de la plantilla de interés con 3,3 microlitros de tampón de desnaturalización incubado a temperatura ambiente durante tres minutos.Detenga la reacción con 3,3 microlitros de tampón de neutralización. Prepare 11 microlitros de mezcla maestra por muestra para reducir los falsos positivos. Exponga la mezcla maestra a luz UV antes de formar las gotas.Primero, prepare 10 microlitros de mezcla premezclada por muestra en un tubo transparente de 0,5 mililitros o 1,5 mililitros sobre hielo. La mezcla premezclada consiste en oligonucleótido aleatorizado, tampón de reacción de la ADN polimerasa B-S-A, dn, NTPs y agua libre de nucleasas. Coloque el tubo en agua sobre hielo y expóngalo a luz UV después de la exposición a UV.Incube el colorante de unión A-D-S-D-N-A y la dieta de referencia con la mezcla de premezcla. Añada la ADN polimerasa PHI 29 al final para asegurar que la polimerasa no entre en contacto con niveles de pH mucho más altos o más bajos que 7,5. Mezcle bien y combine 10 microlitros de la plantilla desnaturalizada o estándar con 10 microlitros de la mezcla maestra; mezcle bien.Dado que las gotas pueden ser muy sensibles a la electricidad estática y al esfuerzo cortante, el experimentador debe quitarse la ropa que pueda generar electricidad estática y ponerse a tierra antes de formar las gotas. El dispositivo microfluídico utilizado para esta demostración fue fabricado en el laboratorio y cuenta con una entrada de aceite y dos entradas acuosas con una unión de enfoque de flujo para la generación de gotas. Utilice dos bombas de jeringa para controlar los caudales de 55 microlitros de aceite con surfactante y 20 microlitros de mezcla de reacción a través del chip microfluídico.Para generar 20 001 gotas de nanolitros, uno de los pasos más difíciles consiste en recolectar las gotas sin perturbar la emulsión. Es importante pipetear lentamente y, preferiblemente, utilizar una punta de gran apertura.Recolecte todas las gotas en tubos PCR para cada muestra. Aliquote 30 microlitros de aceite en tubos PCR nuevos con tapas ópticas utilizando una punta de gran orificio y pipeteando muy lentamente. Transfiera 20 microlitros de gotas encima del aceite.Los volúmenes constantes aseguran que el ensayo sea lo más preciso posible. Cierre las tapas de los tubos firmemente, ya que las tapas sueltas permitirán que el aceite se evapore; manipule los tubos de emulsión desde la parte superior del tubo, lo más alejado posible de la emulsión. Se puede utilizar un termociclador PCR, un termociclador A-Q-P-C-R o una placa calefactora para la amplificación isotérmica.Se utiliza un termociclador A-Q-P-C-R en esta demostración. Incube las muestras durante siete horas a 30 grados Celsius y desactive durante un minuto a 75 grados Celsius. Inmediatamente después de la reacción y la activación.Mida los niveles de fluorescencia para todas las muestras utilizando el termociclador QPCR. Para cada muestra, divida la intensidad de fluorescencia del colorante fluorescente para el ADN de doble cadena (D DS DNA) entre la intensidad de fluorescencia del colorante de referencia.Reste la fluorescencia de fondo o la fluorescencia normalizada del control sin molde de todas las muestras. Elabore una curva estándar lineal utilizando las mediciones correctivas de fluorescencia de los patrones. El patrón de control sin molde representa la fluorescencia de una muestra con 0 % de gotas fluorescentes y la concentración alta de molde.La medición de fluorescencia es la fluorescencia esperada para una muestra con 100 % de gotas fluorescentes utilizando la curva estándar correspondiente. Prediga las proporciones intermedias de gotas positivas y negativas basándose en su fluorescencia masiva. Este método utiliza un instrumento convencional de PCR en tiempo real para medir la fluorescencia masiva de ensayos digitales basados en gotas.Se mezclaron previamente gotas fluorescentes y no fluorescentes en diferentes proporciones y se realizó una comparación entre la fluorescencia en masa y la fracción de gotas positivas. Como era de esperar, la fluorescencia en masa y el recuento de gotas positivas aumentan linealmente con la fracción de entrada de gotas fluorescentes. Se compararon las proporciones predichas basadas en patrones con las fracciones de entrada fluorescente esperadas.La línea indica el valor esperado dada una relación lineal. Los resultados muestran un buen desempeño en la cuantificación de la relación de gotas a lo largo de dos órdenes de magnitud de rango dinámico. Para probar este método en un ensayo real de amplificación del genoma completo cuantitativo, se midieron los niveles de fluorescencia y las fracciones de gotas positivas de una gota digital.Se midió el ensayo de MDA con concentraciones crecientes de ADN molde Lambda. La línea indica la fracción fluorescente esperada utilizando la distribución de Poisson para modelar los datos del experimento. Se muestran imágenes fluorescentes representativas de las gotas, tanto la fluorescencia masiva como la fracción de gotas positivas de las muestras digitales de MDA, que escalan según lo esperado con el promedio de molde por gota, lo que indica que la lectura masiva puede capturar fielmente el resultado de un ensayo digital.Este método puede beneficiar a otros ensayos digitales, como la PCR digital, acelerando la paralelización y simplificando la lectura del ensayo.

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Research

Investigación

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