Name: Visualizzazione di condrociti intercalazione e direzionale proliferazione via Zebrabow Analisi cellulare clonale nella cartilagine del Embryonic Meckel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 40 s
Description: Scopri la visualizzazione dell'intercalazione dei condrociti nella cartilagine craniofaciale di Danio rerio mediante analisi clonale Zebrabow. Questo metodo consente l'osservazione dinamica del comportamento cellulare durante la formazione dell'organo.

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Gli autori ringraziano Alex Schier per gentilmente condividere la linea transgenica Zebrabow-M, Geoffrey Burns per il vettore pDEST e Renee Ethier-Daigle per un&#39;eccellente cura della struttura pesce e le linee. FINANZIAMENTO: Siamo grati per il generoso sostegno finanziamento NIDCR RO3DE024490 e Shriners Hospitals for Children (ECL) e borse di formazione post-dottorato da Shriners Hospitals for Children (LR e YK).

Massachusetts General Hospital Istituzionale Cura e Comitato uso degli animali (IACUC) ha approvato tutte le operazioni in numero di protocollo # 2010N000106. Ciò è in accordo con l&#39;Associazione per la valutazione e l&#39;accreditamento di laboratorio Animal Care International (AAALAC) le linee guida. 1. Reagenti e materiali di preparazione <ol><li> Preparare 1 L di 50X medio E3 embrione (Vedi Tabella 1) e preparare 1 l di 1X E3 medio embrione (vedi tabella 2). </li><li> Preparare E3 medio embrione con N-feniltiourea (PTU) con l&#39;aggiunta di 30 mg di PTU a 1 L di 1X E3. Mescolare O / N per garantire che il PTU completa dissoluzione. Conservare a temperatura ambiente. </li><li> Per preparare la soluzione pronasi, diluire 150 ml di pronasi (0,5 mg / ml) con 15 ml di 1X E3. Tale importo è sufficiente per il piatto 1 Petri. Utilizzare immediatamente. </li><li> Preparare la soluzione metilcellulosa. <ol><li> Preparare la soluzione E3-tricaine mescolando 75 ml di 0,2% tricaine con 25 mldi 1X E3. Far bollire 3 g di metilcellulosa in 75 ml di soluzione di E3-tricaine. </li><li> Portare il volume finale a 100 ml con la soluzione E3-tricaine. La soluzione metilcellulosa finale è viscoso e opaco con una tinta giallastra. Conservazione: RT al riparo dalla luce. </li></ol></li><li> Tamoxifene magazzino e la soluzione ad induzione <ol><li> Preparare 5 mM tamoxifene soluzione madre sciogliendo 4 hydroxytamoxifen in 100% di etanolo. Conservare magazzino a -80 ° C. </li><li> Preparare la diluizione fresco di tamoxifene alla concentrazione desiderio 1X E3 per ottenere la soluzione di induzione. ATTENZIONE! Si prega di consultare Scheda di Sicurezza prima dell&#39;uso. </li></ol></li><li> Preparare 1 L di 0,2% tricaine come da Tabella 3. </li><li> Ottenere diapositive confocale. Colla quattro coprioggetti (18 x 18) per formare un blocco poi posto 2 blocchi su un 24 x 60 cm di distanza coprioggetti 2 per consentire il montaggio di un embrione nel mezzo. </li></ol> 2. Preparazione Embrione <ol><li> Linee transgeniche. <br/&gt; Nota: Zebrabow-M è stato un dono generoso da laboratorio di Alex Schier. </li><li> SOX10: ERT2-Cre NOTA: Genera il vettore targeting pDestTol2- SOX10: ERT2-Cre utilizzando metodi di clonazione molecolare standard e commercialmente ottenuto ricombinazione tecnologia di clonazione. <ol><li> Combina 5 &#39;entrata clone (pENTR5&#39;- sox10p) contenente 7.2Kb del promotore SOX10, un clone di mezzo Gateway (PME-ERT2-Cre), ea 3&#39; entrata clone (pENTR3&#39;-polyA) in una reazione di LR con destinazione lente vettore pDestTol2- α-cristallina: YFP. </li><li> Purificare costrutto pDestTol2- SOX10: ERT2-Cre. Co-iniettare il costrutto purificato (100 ng / mL) con Tol2 trasposasi mRNA (50 ng / ml) in embrioni WT (F0) nella fase una cella. </li><li> Schermo fondatori F0 per adulti per la trasmissione germinale basate su una forte fluorescenza gialla in embrioni di F1. </li></ol></li><li> SOX10: ERT2-Cre, Zebrabow-M <ol><li> Outcross il Zebrabow-MLinea (2.1.1) con la SOX10: linea transgenica ERT2-Cre. </li><li> Selezionare gli embrioni che presentano una forte espressione RFP ubiquitaria e marcatore lente YFP e farle crescere fino adulti. </li></ol></li></ol> 3. embrioni Collection <ol><li> Impostare diverse paia di SOX10: ERT2-Cre, Zebrabow-M zebrafish transgenico 05:00-06:00 il giorno 1. </li><li> Il giorno seguente, tirare i divisori al mattino e raccogliere le uova intorno a mezzogiorno. </li><li> Trasferirli al di Petri e aggiungere 15 ml di soluzione di pronasi dechorionate gli embrioni. </li><li> Incubare gli embrioni per 1-5 minuti fino a circa il 60% degli embrioni sono stati dechorionated. Arrestare la reazione per decantazione la soluzione pronasi e lavare gli embrioni 3-4 volte con fresco medio E3. </li><li> Incubare gli embrioni dechorionated in E3 a RT O / N e far loro sviluppare per raggiungere la fase 10 somiti. Incubare 50-60 embrioni per la frizione per evitare la crescita di sviluppo diverso. </li></ol&gt; 4. Trattamento <ol><li> Controllare fase dello sviluppo degli embrioni al microscopio campo di luce per garantire che siano in fase di 10 somiti. </li><li> Utilizzando un microscopio a fluorescenza con una proteina fluorescente (RFP) filtro rosso, isolare gli embrioni di colore rosso vivo. </li><li> Procedere alla induzione della ricombinazione Cre-aggiungendo 10 mM di soluzione hydroxytamoxifen alla capsula di Petri e incubando gli embrioni isolati a 28,5 ° C per 3 ore. </li><li> Decantare la soluzione tamoxifene e lavare gli embrioni più volte con E3. ATTENZIONE! scartare la soluzione di tamoxifene in un apposito contenitore per rifiuti biologici. </li><li> Incubare gli embrioni a 28,5 ° CO / N. </li><li> Quando gli embrioni sono circa il 28-29 fase somiti (circa 24 ore dopo la fecondazione), incubare gli embrioni a 28,5 ° C a E3-PTU soluzione qui di seguito. NOTA: PTU è qui utilizzato per inibire la formazione di melanofori negli embrioni di sviluppo. Questo trattamento è necessarioevitare la distorsione del segnale di fluorescenza melanofori auto-fluorescente. </li><li> Incubare gli embrioni a 28,5 ° C </li></ol> Selezione 5. Embrione <ol><li> Per visualizzare le strutture craniofacciali completamente sviluppati, selezionare gli embrioni a 4 giorni dopo la fecondazione per l&#39;intensità del segnale rosso e Cre marcatore espressione positività (giallo nella retina). </li><li> Anestetizzare gli embrioni con una soluzione di E3 / 0,015% tricaine. L&#39;anestesia è confermata quando non movimenti attivi o attività pinna si osserva quando incitando delicatamente l&#39;embrione. </li></ol> 6. Montaggio del Embryo in metilcellulosa <ol><li> Trasferire l&#39;embrione selezionato per l&#39;imaging in una capsula di Petri contenente una goccia di metilcellulosa e imbalsamare delicatamente l&#39;embrione con metilcellulosa. </li><li> Su un confocale vetrino pulito, una goccia di metilcellulosa fresca e montare la embrione all&#39;interno della goccia con una punta microloader. Posizione embrione dorsale prendere attenzione a non toccarel&#39;embrione direttamente. </li><li> Coprire l&#39;embrione montato con 25 x 25 coprioggetto e regolare la posizione dell&#39;embrione eventualmente manipolando il coprioggetto. </li><li> L&#39;embrione è ora pronto per l&#39;immagine. </li></ol> 7. Analisi per microscopia a fluorescenza <ol><li> Utilizzare l&#39;obiettivo 20x secca obiettivo (apertura numerica 0,75; dimensione pinhole 2.0 micron) per mettere a fuoco l&#39;embrione. </li><li> Premere il tasto L100 sul microscopio e selezionare i canali nel software. </li><li> Selezionare il pulsante di configurazione confocale e fare clic su &#39;auto&#39; e selezionare i seguenti canali prima di chiudere la finestra: Ch1: CFP, Ch2: GFP, Ch3: RFP o mCherry </li><li> Accendere Ch2 e Ch3 prima di fare clic sul pulsante &#39;rimuovere blocco&#39;. Fare clic su &#39;play&#39; per iniziare la scansione. </li><li> Focus sulla struttura di interesse, che è meglio farlo partendo da ½ telaio / sec e alta tensione (HV) 150 e quindi regolando le impostazioni di conseguenza fino a quando la qualità di immagine desiderata è achieved. La richiesta di offerta sarebbe più luminoso di altri colori, quindi regolare l&#39;alta tensione. Cambiare la posizione Z per trovare sia YFP e cellule positive RFP. </li><li> Una volta impostato con le impostazioni, acquisire l&#39;immagine della vostra dell&#39;embrione. Salvare l&#39;immagine nel formato confocale format software di imaging e TIFF per l&#39;elaborazione delle immagini in ogni canale di divisione. </li><li> Quindi, per l&#39;imaging CFP, spegnere Ch2 e Ch3 e accendere Ch1. Re-regolare le impostazioni come nel passaggio 5 senza modificare l&#39;area di messa a fuoco. NOTA: CFP può essere davvero difficili da individuare a causa di segnale di fondo in blu canale che può essere aggirato regolando la dimensione del foro stenopeico. Una dimensione più grande foro stenopeico permette una migliore rilevazione della fluorescenza, riducendo il rapporto segnale rumore / sfondo. Tuttavia, un più ampio foro stenopeico ridurranno effetto confocale, compromettere la qualità dell&#39;immagine. Pertanto, un&#39;attenta regolazione delle impostazioni è necessario per ottenere la qualità dell&#39;immagine desiderata e intensità. </li><li> Catturare l&#39;immagine e salvarla in formato sia (software confocale e TIFF) per l&#39;elaborazione delle immagini. Le immagini possono poi essere elaborati con software comune elaborazione delle immagini per unire i livelli e migliorare le impostazioni di colore, come descritto da Pan e colleghi 8. </li></ol>

<ol><li>Dougherty, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+requirements+for+wnt9a+and+irf6+in+extension+and+integration+mechanisms+during+zebrafish+palate+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Distinct requirements for wnt9a and irf6 in extension and integration mechanisms during zebrafish palate morphogenesis.</a> Development. 140, 76-81 (2013).</li>
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<li>McCarthy, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pdgfra+protects+against+ethanol-induced+craniofacial+defects+in+a+zebrafish+model+of+FASD%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Pdgfra protects against ethanol-induced craniofacial defects in a zebrafish model of FASD.</a> Development. 140, 3254-3265 (2013).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Alcian blue linee transgeniche e fotoconvertibile come descritto sopra complementi tra loro per definire il complesso processo di cartilagine e sviluppo osseo. Tuttavia, la migrazione cellulare dal vivo e organizzazione durante l&#39;organogenesi è stato a lungo ipotizzato e dimostrato indirettamente ma mai visualizzato. Linea transgenica Zebrabow-M accoppiata con una cartilagine specifica Cre permette simultaneamente l&#39;osservazione dal vivo di tutti questi eventi distinti coinvolti nella formazione delle ossa e del...

Sviluppo craniofacciale richiede, interazioni cellulari e tissutali complessi molecolari di guidare la proliferazione cellulare, la migrazione e la differenziazione 1,2, 3. Questo processo strettamente regolato e complesso è soggetto alle perturbazioni genetici e ambientali, in modo tale che deformità cranio facciali sono tra le malformazioni congenite più comuni 1-9. Mentre gli interventi chirurgici rimangono il cardine del trattamento per le anomalie cranio-facciali, la comprensione della base di sviluppo è essenziale per innovare terapie future. Pertanto, lo studio della morfogenesi e meccanismi nella convergenza ed estensione e integrazione cella fornisce nuove intuizioni nella formazione dello scheletro craniofacciale 1. Cranica migrazione cresta neurale e popolano il primo arco faringeo, poi formare coppie di processi mandibolare che si estendono a formare cartilagine di Meckel, che prefigura la mandibola. Morfogenesi of cartilagine di Meckel richiede organizzazione condrociti via proliferazione direzionale, la polarizzazione cellulare e la differenziazione 1,10. Tuttavia, la complessità di organizzazione condrociti nella crescita e l&#39;estensione della cartilagine del Meckel rimane poco chiaro. Capire il comportamento delle cellule dinamico è fondamentale per comprendere malformazioni congenite che colpiscono le dimensioni della mandibola, come ad esempio ipoplasia fenotipi mandibola 11. Embrioni di zebrafish offrono molti vantaggi evolutivi e genetici per lo studio dettagliato della cartilagine morfogenesi di Meckel. Il loro trattabilità genetica, la trasparenza, ex vivo e rapido sviluppo sono potenti vantaggi prestito bene per l&#39;osservazione del movimento e l&#39;organizzazione delle cellule per l&#39;imaging dal vivo 6. L&#39;utilizzo di strumenti di lineage tracing, come SOX10: Kaede linea transgenica, noi e altri abbiamo delineato le origini della cresta neurale dello scheletro cranio embrionale 1,5. Using il SOX10: ERT2-Cre con la ubi: linea transgenica Zebrabow-M, è ora possibile esplorare i dettagli dei movimenti cellulari durante lo sviluppo craniofacciale. Il Zebrabow-M, è una linea transgenica ingegnerizzata con il promotore ubiquitina guidare l&#39;espressione di diversi fluorofori, ogni fiancheggiato da siti Lox 8. Il Zebrabow-M predefinita fluoroforo è rosso, che esprime RFP. Dopo l&#39;induzione di espressione Cre, il Zebrabow-M costrutto ricombina e le cellule esprimono una combinazione di diversi fluorofori (RFP, CFP e YFP) creando espressione multispettrale nell&#39;embrione. Tutte le cellule figlie che dividono dalle cellule marcate dopo l&#39;evento di ricombinazione sono poi clonale etichettati, in modo che le popolazioni di cellule che derivano da diverse progenitori giustapposte sono clonale etichettati. Con questa marcatura cellulare clonazione, cellule proliferazione e migrazione con risoluzione clonale può essere seguito (figura 1 e 2).

<table><tbody><tr><td>Pronase</td><td>Roche Life Sciences</td><td>10165921001</td><td>Prepare 500 &mu; l. aliquote stock a 50 mg/ml</td></tr><tr><td>Metilcellulosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0262</td><td></td></tr><tr><td>PTU (N-Phenylthiourea)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7619</td><td></td></tr><tr><td>Tricaina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>4-HydoxyTamoxifen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T176</td><td></td></tr><tr><td>24 x 60 vetrini coprioggetti</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-548-5P</td><td></td></tr><tr><td>18 x 18 vetrini coprioggetti</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-540A</td><td></td></tr><tr><td>25 x 25 vetrini coprioggetti</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-540C</td><td></td></tr><tr><td>pENTR5'-TOPO TA Kit di clonazione Tecnologie per</td> la <td>vita&nbsp;</td><td>K591-20</td><td></td></tr><tr><td>Kit di clonazione pENTR/D-TOPO&NBSP;</td><td>Life Technologies</td><td>K2400-20</td><td></td></tr><tr><td>pENTR3'-pA</td><td>Tol2Kit</td><td>302</td><td></td></tr><tr><td>pDEST</td><td></td><td></td><td>Regalo dai laboratori Geoffrey Burns</td></tr><tr><td>Microscopio a campo chiaro&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio a fluorescenza&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio</td><td></td><td></td><td></td>confocale</tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td> di elaborazione delle immagini</tr></tbody></table>

visualizzazione di condrociti intercalazione e direzionale proliferazione via zebrabow analisi cellulare clonale nella cartilagine del embryonic meckel

Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic Meckel&#8217;s Cartilage

Sviluppo delle strutture cranio-facciali vertebrati richiede coordinazione precisa di migrazione cellulare, la proliferazione, l&#39;adesione e la differenziazione. Patterning della cartilagine del Meckel, un primo arco faringeo derivata, prevede la migrazione di cranico cresta neurale (CNC), le cellule e il partizionamento progressivo, la proliferazione e l&#39;organizzazione dei condrociti differenziati. Diversi studi hanno descritto la migrazione CNC durante inferiore morfogenesi mascella, ma i dettagli di come i condrociti raggiungono organizzazione nella crescita e l&#39;estensione della cartilagine di Meckel rimane poco chiaro. Il SOX10 limitata e indotto chimicamente Cre ricombinasi mediata ricombinazione genera permutazioni di proteine ​​fluorescenti distinti (RFP, YFP e CFP), creando così un sistema di etichettatura multispettrale delle cellule progenitrici e la loro progenie, riflettendo popolazioni clonali distinte. Utilizzando confocale fotografia time-lapse, è possibile osservare i condrociti behavio durante lo sviluppo della cartilagine del pesce zebra di Meckel. Etichettatura cella multispettrali consente agli scienziati di dimostrare l&#39;estensione dei condrociti della Meckel. Durante la fase di estensione della cartilagine del Meckel, che prefigura la mandibola, condrociti intercalare di effettuare estensione come impilano in una cella singola fila stratificato organizzata. Fallimento di questo processo intercalante organizzato mediare estensione cella fornisce la spiegazione meccanicistica cellulare per mandibola ipoplasia che osserviamo in malformazioni mandibolari.

Visualizzazione cartilagine tradizionale da tutto il monte Alcian macchie blu è stato prezioso per osservare la sviluppo della cartilagine di Meckel e comunemente usato per visualizzare finale cellulare organizzazione 12 (Figura 1A). Per analizzare ulteriormente i condrociti in via di sviluppo straordinario, lignaggio tracciando con SOX10: linee transgeniche Kaede ci ha permesso di studiare la migrazione delle cellule, la convergenza e l&#39;estensione in embrioni vivi 2,12</sup...

Organizzazione delle cellule di ossa cranio-facciali è stato a lungo ipotizzato ma mai visualizzato direttamente. Marcatura delle cellule Multi-spettrale e in vivo vivo l&#39;imaging consente di visualizzare il comportamento delle cellule dinamica mandibola zebrafish. Qui, abbiamo dettaglio il protocollo di manipolare Zebrabow pesci transgenici e osservare direttamente intercalazione cellulare e cambiamenti morfologici di condrociti nella cartilagine di Meckel.

Visualizzazione di condrociti intercalazione e direzionale proliferazione via Zebrabow Analisi cellulare clonale nella cartilagine del Embryonic Meckel

Development of the vertebrate craniofacial structures requires precise coordination of cell migration, proliferation, adhesion and differentiation. ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è visualizzare l'intercollazione e l'estensione dei condrociti mediante analisi clonale di cellule zebra bow. Questo viene ottenuto generando una linea SOX10 ERT2 Cre zebra bow M per ottenere una ricombinazione specifica del tessuto nella cartilagine craniofacciale e negli embrioni ai fini dell'analisi clonale. Successivamente, gli embrioni vengono trattati con tamoxifene allo stadio dei 10 somiti per tre ore al fine di indurre il processo di ricombinazione.Quindi si selezionano gli embrioni che esprimono l'attività di CRE e una forte espressione della proteina fluorescente rossa o RFP, e gli embrioni vengono montati per l'analisi dell'immagine della cartilagine craniofacciale C. I risultati mostrano un'analisi cellulare multispettrale dei condrociti craniofacciali basata sull'immagine confocale. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come la colorazione S in blu o alle linee transgeniche come so e GFP o SOX e kde, è che zebra bow ci permette di osservare e seguire specificamente popolazioni cellulari clonali coinvolte nella formazione di un organo.Per preparare la raccolta degli embrioni al primo giorno,

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Biologia dello sviluppo

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Sezionamento ottico e visualizzazione del disco intervertebrale dallo sviluppo embrionale alla degenerazione

Questo protocollo descrive in dettaglio l'isolamento dei condrociti, dei condroprogenitori derivati dal dosaggio di adesione della fibronectina (FAA-CP) e dei condroprogenitori migratori (MCP) dalla cartilagine articolare umana. Copre la digestione enzimatica, l'adesione della fibronectina e i saggi basati sulla migrazione per isolare e caratterizzare queste cellule.

Isolamento di condrociti e condroprogenitori mediante adesione della fibronectina e saggio migratorio

In questo studio, descriviamo un metodo semplice per eseguire l'analisi del colorante blu di Evans (EBD) sulle larve di pesce zebra.  Questa tecnica è un potente strumento per la caratterizzazione dell'integrità del muscolo scheletrico e la delineazione di modelli di distrofia muscolare di zebrafish, ed è un metodo prezioso per lo sviluppo di nuove terapie.

Analisi delle larve Zebrafish muscolo scheletrico Integrità con Blu di Evans Dye

Scopri la visualizzazione dell'intercalazione dei condrociti nella cartilagine craniofaciale di Danio rerio mediante analisi clonale Zebrabow. Questo metodo consente l'osservazione dinamica del comportamento cellulare durante la formazione dell'organo.

Visualizzazione di condrociti intercalazione e direzionale proliferazione via Zebrabow Analisi cellulare clonale nella cartilagine del Embryonic Meckel (Video) | JoVE Journal

Visualizzazione di condrociti intercalazione e direzionale proliferazione via Zebrabow Analisi cellulare clonale nella cartilagine del Embryonic Meckel

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