Visualizzazione di condrociti intercalazione e direzionale proliferazione via Zebrabow Analisi cellulare clonale nella cartilagine del Embryonic Meckel

L'obiettivo generale del seguente esperimento è visualizzare l'intercollazione e l'estensione dei condrociti mediante analisi clonale di cellule zebra bow. Questo viene ottenuto generando una linea SOX10 ERT2 Cre zebra bow M per ottenere una ricombinazione specifica del tessuto nella cartilagine craniofacciale e negli embrioni ai fini dell'analisi clonale. Successivamente, gli embrioni vengono trattati con tamoxifene allo stadio dei 10 somiti per tre ore al fine di indurre il processo di ricombinazione.

Quindi si selezionano gli embrioni che esprimono l'attività di CRE e una forte espressione della proteina fluorescente rossa o RFP, e gli embrioni vengono montati per l'analisi dell'immagine della cartilagine craniofacciale C. I risultati mostrano un'analisi cellulare multispettrale dei condrociti craniofacciali basata sull'immagine confocale. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come la colorazione S in blu o alle linee transgeniche come so e GFP o SOX e kde, è che zebra bow ci permette di osservare e seguire specificamente popolazioni cellulari clonali coinvolte nella formazione di un organo.

Per preparare la raccolta degli embrioni al primo giorno, allestire diverse coppie di maschi e femmine di sox, 10 ERT due Cree zebra bow M di pesci zebra transgenici in vaschette di accoppiamento divise tra le 17:00 e le 18:00 del giorno successivo, dopo aver verificato al microscopio ottico che gli embrioni hanno raggiunto lo stadio a 10 cellule, e al microscopio fluorescente con filtro RFP. Isolare gli embrioni di colore rosso brillante e trasferirli in una nuova capsula di Petri con mezzo E tre fresco per indurre la ricombinazione Cree. Aggiungere alla capsula di Petri una soluzione di idrossi tamoxifene a 10 micromolari e incubare gli embrioni a 28,5 gradi Celsius per tre ore.

Quindi travasare la soluzione di Tamoxifene in un contenitore per rifiuti biologici e utilizzare l'E3 per lavare più volte gli embrioni dopo averli incubati tutta la notte fino allo stadio di 28-29 somiti; trasferire gli embrioni in una soluzione di E3 con PTU e reinserirli nell'incubatrice. Per visualizzare le strutture craniofacciali completamente sviluppate, selezionare embrioni a 4 DPF con un segnale rosso intenso e espressione gialla di Cree nella retina. Dopo aver anestetizzato un embrione in Trica, seguendo il protocollo indicato nel testo, trasferirlo in una piastra di Petri contenente una goccia di Metilcellulosa su un vetrino pulito per microscopia confocale.

Posizionare una goccia di Methylcellulose fresca e utilizzare una punta di micropipetta per montare l'embrione in posizione dorsale, avendo cura di non toccarlo direttamente con un coprioggetto 25 per 25. Coprire l'embrione e utilizzare il coprioggetto per manipolarlo, se necessario. Per acquisire l'immagine dell'embrione, utilizzare un obiettivo secco da 20x.

Per mettere a fuoco il campione, premere il pulsante L 100 sul microscopio, quindi selezionare il pulsante di configurazione confocale. Fare clic su auto e selezionare CFP per il canale uno, GFP per il canale due e RFP o M cherry per il canale tre. Chiudere quindi la finestra.

Accendere i canali due e tre prima di fare clic sul pulsante di rimozione dell'interblocco. Quindi fare clic su play per iniziare la scansione. Dopo aver regolato le impostazioni, acquisire le immagini desiderate e salvarle nel formato software del confocale e anche in formato TIF per l'elaborazione delle immagini per canale.

Per eseguire l'imaging CFP, spegnere i canali due e tre e accendere il canale uno senza modificare l'area di fuoco. Riaggiustare le impostazioni di scansione prima di acquisire le immagini, salvare le immagini come appena descritto ed eseguire l'elaborazione delle immagini come descritto da Pan e colleghi, come mostrato qui. La visualizzazione tradizionale della cartilagine mediante colorazione con Sian blue su preparati interi si è rivelata di grande valore nell'osservazione della cartilagine mekel in via di sviluppo ed è comunemente utilizzata per visualizzare l'organizzazione cellulare finale, al fine di analizzare ulteriormente i condrociti in via di sviluppo nel tempo mediante tracciamento della linea cellulare.

L'utilizzo di linee transgeniche SOX 10 kda è stato impiegato per studiare la migrazione cellulare e la convergenza con estensione in embrioni vivi, mediante imaging in tempo reale della linea transgenica zebra bow m. Per studiare ulteriormente l'organizzazione dei condrociti nella struttura scheletrica craniofacciale C, si rivela il processo di interallineamento e allungamento dei condrociti che media l'estensione e la crescita della cartilagine di Meckel. Questa figura mostra la mandibola di embrioni transgenici UI zebra bow M Sox 10 ERT due Cree tra 3D PF e cinque giorni dopo la fecondazione.

La mascella inferiore è meglio visualizzata in vista ventrale, in modo da ottenere un'immagine chiara dell'organizzazione cellulare nel cartilagine meles come mostrato qui. I colori stabili e ereditati permettono un facile tracciamento delle linee cellulari e la mappatura del destino delle cellule della cresta neurale cranica. La singola cellula blu sembra migrare e intercalarsi tra le cellule vicine, quindi si allunga lungo l'asse anteriore-posteriore per formare un condro sito di forma uniforme, mantenendo così la forma globale del cartilagine meles mentre si estende in direzione anteriore.

Questa tecnica apre la strada ai ricercatori nel campo dello sviluppo felino per esaminare il condro nella formazione dello scheletro del pesce zebra.