Visualizzazione di condrociti intercalazione e direzionale proliferazione via Zebrabow Analisi cellulare clonale nella cartilagine del Embryonic Meckel

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di visualizzare l'intercollazione e l'estensione dei condrociti tramite l'analisi delle cellule clonali dell'arco di zebra. Ciò si ottiene generando una linea SOX 10 ERT two Cree zebra bow M per ottenere una ricombinazione tessuto-specifica nella cartilagine craniale facciale e negli embrioni per l'analisi clonale. Successivamente, gli embrioni vengono pulsati con tamoxifene allo stadio 10, quindi acaro per tre ore al fine di indurre il processo di ricombinazione.

Quindi gli embrioni vengono selezionati per l'espressione dell'attività CRE e della forte espressione fluorescente rossa o RFP, e gli embrioni vengono montati per l'imaging della cartilagine craniofacciale C. I risultati mostrano un'analisi cellulare multispettrale dei condrociti cranio-facciali basata sull'imaging confocale. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come la colorazione S in blu o le linee transgeniche come so e GFP o SOX e kde, è che l'arco zebrato ci permette di osservare e seguire in modo specifico le popolazioni di cellule clonali coinvolte nella formazione di un organo.

Per prepararsi alla raccolta degli embrioni il primo giorno, allestisci diverse coppie maschili e femminili di sox, 10 ERT due Cree zebra bow M pesci zebra transgenici in vasche di accoppiamento divise tra le cinque e le 18:00 del giorno successivo, dopo aver verificato al microscopio ottico che gli embrioni hanno raggiunto lo stadio di cellulite 10 al microscopio a fluorescenza con un filtro RFP. Isolare gli embrioni rosso vivo e trasferirli in una nuova capsula di Petri con terreno E tre fresco per indurre la ricombinazione Cree. Aggiungere 10 micromolari di soluzione di idrossitamoxifene alla piastra di Petri e incubare gli embrioni a 28,5 gradi Celsius per tre ore.

Quindi decantare la soluzione di tamoxifene in un contenitore per rifiuti biologici e utilizzare E tre per lavare gli embrioni più volte dopo aver incubato gli embrioni durante la notte a 28-29, quindi stadio di acaro, trasferire gli embrioni in una soluzione di E tre PTU e rimetterli nell'incubatrice. Per visualizzare le strutture craniofacciali C completamente sviluppate, selezionare gli embrioni a quattro DPF con un segnale rosso intenso e un'espressione di Cree gialla nella retina. Dopo aver anestetizzato un embrione in Trica, secondo il protocollo di testo, trasferirlo in una capsula di Petri contenente una goccia di metilcellulosa su un vetrino confocale pulito.

Posizionare una goccia di metilcellulosa fresca e utilizzare una punta di micro caricatore per montare l'embrione posizionato dorsalmente facendo attenzione a non toccarlo direttamente con un vetrino coprioggetti 25 per 25. Copri l'embrione e usa il vetrino coprioggetto per manipolare l'embrione, se necessario. Per l'imaging dell'embrione, utilizzare un obiettivo a lente asciutta 20x.

Per mettere a fuoco il soggetto, premere il pulsante L 100 sul microscopio, quindi selezionare il pulsante di configurazione confocale. Fare clic su auto e selezionare il CFP per il canale uno, GFP per il canale due e RFP o M cherry per il canale tre. Quindi chiudi la finestra.

Attiva i canali due e tre prima di fare clic sul pulsante di rimozione dell'interblocco. Quindi fare clic su Riproduci per avviare la scansione. Dopo aver regolato le impostazioni, acquisire le immagini desiderate e salvarle nel formato software confocale e in formato TIF per l'elaborazione delle immagini per canale.

Per eseguire l'imaging CFP, spegnere i canali due e tre e attivare il canale uno senza modificare l'area di messa a fuoco. Regolare nuovamente le impostazioni di scansione prima di acquisire le immagini, salvare le immagini come appena descritto ed eseguire l'elaborazione delle immagini come descritto da pan e colleghi, come mostrato qui. La visualizzazione tradizionale della cartilagine mediante colorazione blu dell'intero Monte Sian è stata preziosa nell'osservazione della cartilagine mekel in via di sviluppo e comunemente utilizzata per visualizzare l'organizzazione cellulare finale per analizzare ulteriormente i condrociti in via di sviluppo nel corso del tracciato del lignaggio nel tempo.

L'utilizzo di linee transgeniche SOX 10 kda è stato utilizzato per studiare la migrazione, la convergenza e l'estensione cellulare in embrioni vivi utilizzando l'imaging dal vivo della linea transgenica zebra bow m. Per studiare ulteriormente l'organizzazione dei condrociti nella struttura scheletrica craniofacciale C rivela il processo di intercollazione e allungamento dei condrociti che media l'estensione e la crescita della cartilagine di Meckel. Questa figura mostra la mascella inferiore da UI zebra bow M Sox 10 ERT due embrioni transgenici Cree tra 3D PF e cinque giorni dopo la fecondazione.

La mascella inferiore è meglio raffigurata ventralmente per consentire una visione chiara dell'organizzazione cellulare nella cartilagine del meles, come mostrato qui. I colori mantenuti ed ereditati in modo stabile consentono un facile tracciamento del lignaggio e la mappatura del destino delle cellule della cresta neurale cranica. La singola cellula blu sembra migrare e interpolare con le cellule vicine, quindi si allunga lungo l'asse anteriore posteriore per formare un sito di condri di forma uniforme, mantenendo così la forma globale della cartilagine del meles mentre si estende anteriormente.

Questa tecnica apre la strada ai ricercatori nel campo dello sviluppo del gatto per esaminare il condro nella formazione scheletrica del pesce zebra.