Un sistema semplificato per la valutazione delle cellule Mechanosensing e Durotaxis In Vitro

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di fornire un sistema semplificato per l'analisi del durex cellulare attraverso il quale molte cellule di mammifero migrano preferenzialmente verso un substrato più rigido. Ciò si ottiene preparando prima substrati di polimetilsuboxano o PDMS di rigidità definita. Successivamente, il PDMS preparato viene versato in ciascun pozzetto di una piastra a sei pozzetti e vengono rimosse eventuali bolle d'aria.

Le camere Durex vengono quindi completate dal posizionamento di un vetrino di copertura sterilizzato sopra il PDMS in ciascun pozzetto per creare una sovrapposizione. Il passaggio finale consiste nel seminare le cellule nelle camere di Duro Taxes a una densità che dia alle cellule spazio sufficiente per migrare senza interazioni significative con altre cellule. In definitiva, la microscopia su cellule vive viene utilizzata per studiare gli axxis nelle cellule migranti.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come la poliacrilammide, è che c'è un unico passaggio tra il PDMS morbido e il vetro rigido invece delle alternative in gel a gradiente. Anche il rivestimento di PDMS con matrice extracellulare Componenti come la fibronectina non richiedono la reticolazione chimica, necessaria per i gel di poliacrilammide. Per preparare prima una piastra di coltura tissutale a sei pozzetti, strappare la bilancia con una provetta conica da 50 millilitri.

Pesare circa 10 grammi della soluzione di poli-dimetil subersano o di base PDMS nella provetta da 50 millilitri. Per un substrato di 90 a uno, dividere il peso misurato della soluzione di base PDMS per 90. Per determinare la quantità corretta di soluzione di reticolante necessaria, aggiungere la quantità calcolata di soluzione di reticolante PDMS alla miscela di reticolante di base A-P-D-M-S miscelata vigorosamente per cinque minuti a temperatura ambiente.

Utilizzando una piccola spatola in questa fase, il composto conterrà un piccolo numero di bolle d'aria. Centrifugare il substrato PDMS in una centrifuga da banco per cinque minuti a 50 volte. G.Aggiungere la temperatura ambiente per rimuovere le bolle se ci sono ancora bolle.

Dopo i cinque minuti di centrifugazione, pipettare nuovamente un millilitro del substrato PDMS 90 in uno in ciascun pozzetto della coltura tissutale trattata. Piastra a sei pozzetti. Eventuali bolle d'aria residue presenti nel PDMS possono essere eliminate in questa fase facendole scoppiare con un ago calibro 21.

Lasciare stendere il PDMS per 30 minuti nel pozzo. Quindi far bollire il bicchiere da 12 millimetri Numero uno, il coperchio scivola in acqua distillata per cinque minuti, per un totale di tre volte. Posizionare un vetrino coprioggetto asciutto in ciascun pozzetto della piastra di coltura tissutale toccando delicatamente un lato del coperchio.

Infilare nella soluzione PDMS e quindi far cadere il vetrino coprioggetto sul PDMS. Quando il vetrino coprioggetto si deposita, il PDMS inizierà a invadere i bordi del vetrino coprioggetto, ma non lo coprirà completamente. Questo genererà un'interfaccia tra il PDMS e il vetro dopo l'indurimento.

Incubare la piastra a 70 gradi Celsius in forno per 16 ore per polimerizzare il PDMS. Infine, posizionare la piastra in una cappa per colture cellulari e sterilizzare con UV per 10 minuti. Rivestire ogni camera di durox con un millilitro di fibronectina in soluzione salina tamponata con fosfato senza calcio e magnesio per un'ora a 30 gradi Celsius.

Assicurarsi che l'intera superficie sia immersa nella fibronectina in soluzione PBS. Preparare l'albumina sierica bovina all'1% di natura termica o BSA pesando 0,5 grammi di BSA e sciogliendola in 50 millilitri di filtro PBS. Sterilizzare una soluzione attraverso un filtro a punta da 22 micron prima di riscaldare a 80 gradi Celsius per 12 minuti.

Successivamente, aspirare la soluzione di fibronectina e lavare le camere tre volte con PBS. Aggiungere un millilitro di BSA denaturato a caldo in PBS a ciascun pozzetto e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente, tripsina occhi e contare le cellule scelte mentre le camere durex si bloccano con il calore. BSA denaturato aspira la soluzione di BSA dalle camere appena prima delle celle di placcatura.

Piastra 10.000 cellule in un volume di due millilitri in ciascun pozzetto della camera doax. Utilizzando il terreno richiesto per il particolare tipo di cellula scelta, lasciare che le cellule aderiscano e si diffondano sul substrato per quattro ore in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius con il 5% di CO2, eseguire l'imaging di cellule vive su un microscopio invertito utilizzando il contrasto di fase con un obiettivo 10x. Il microscopio deve essere dotato di una camera umidificata ambientale chiusa, che consenta il controllo della temperatura a 37 gradi Celsius e al 5% di CO2 durante l'imaging a lungo termine.

Per imaging, dopo che le cellule si sono diffuse per circa 3,5 ore, assemblare la piastra nella camera del microscopio. Lasciare equilibrare i campioni nella camera per 30 minuti. Impostare la visita multipunto automatizzata sul microscopio, se disponibile.

Concentrati sull'interfaccia tra il PDMS e il vetrino coprioggetto e scegli i punti da visualizzare intorno all'interfaccia. Con una media di 40 punti per immagine della camera Durex, le celle ogni 10 minuti per un massimo di 16 ore, la regione di interesse apparirà come due linee con la linea esterna corrispondente al bordo del vetrino coprioggetto e la linea interna corrispondente all'interfaccia effettiva tra il PDMS e il vetrino coprioggetti. Per analizzare i dati, generare un foglio di calcolo come quello mostrato nel protocollo di testo.

Conta il numero di eventi di attraversamento dal PDMS alla superficie del vetro e viceversa da ogni filmato generato. Un evento di attraversamento è definito come il nucleo cellulare che passa oltre il confine tra il PDMS e il vetro in entrambe le direzioni. Registra il numero di eventi di attraversamento nella colonna appropriata del foglio di calcolo Excel per quantificare più incroci.

Conta il numero di volte in cui la cella ha attraversato l'interfaccia. Tale numero dovrebbe essere registrato nella colonna Excel corrispondente al substrato su cui si trovava la cella alla fine del filmato. Ripeti l'analisi per ogni cella che attraversa l'interfaccia nel filmato.

Escludi le celle che migrano fuori dal campo visivo Durante l'imaging. Calcola la percentuale di cellule che sono migrate dalla PDMS alla superficie del vetro e quindi hanno subito il Duro Texas. Per farlo.

Sommare il numero di eventi di attraversamento da soft a hard e gli eventi di attraversamento multipli che si sono conclusi con hard e dividere per il numero totale di eventi di crossing. Calcola la percentuale di incroci multipli dividendo il totale degli incroci multipli per il numero totale di incroci per iniziare a capire il meccanismo molecolare con cui le cellule corrispondono a segnali meccanici nel loro ambiente. Proteine specifiche possono essere abbattute utilizzando IRNA, come mostrato qui.

Circa il 70% delle cellule di controllo trattate con irna presentava axxis. In netto contrasto, quando il gap CD è stato abbattuto utilizzando l'RNAi, le cellule non avevano alcuna preferenza sul fatto che migrassero sul substrato duro o morbido. Inoltre, le celle di knockdown del gap CD hanno attraversato il multiplo di confine.

Mentre le cellule trattate con irna di controllo generalmente attraversano il confine solo una volta rappresentative tracce di controllo. Le cellule di Irna mostrano che le cellule generalmente migrano attraverso il confine una sola volta e rimangono preferenzialmente sulla superficie più rigida rispetto al gap CD. Irna ha trattato le cellule che non hanno dimostrato una preferenza per nessuna delle due rigidità e hanno attraversato il confine più volte.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare i substrati PDMS, assemblare le camere duris e quantificare le tasse DUR.