Un sistema semplificato per la valutazione delle cellule Mechanosensing e Durotaxis

L'obiettivo generale di questa procedura è fornire un sistema semplificato per l'analisi della durotassi, ovvero il fenomeno attraverso il quale molte cellule mammifere migrano preferenzialmente verso un substrato più rigido. Questo risultato si ottiene innanzitutto preparando substrati di polidimetilsilossano (PDMS) con rigidità definita. Successivamente, il PDMS preparato viene versato in ogni pozzetto di una piastra a sei pozzetti e vengono rimossi eventuali bolle d'aria.

Le camere Durex vengono quindi completate posizionando un coprivetrino sterilizzato sulla parte superiore del PDMS in ogni pozzetto, creando così un sovrastrato. L'ultimo passaggio consiste nell'inseminare le cellule nelle camere Duro taxes a una densità che permetta alle cellule sufficiente spazio per migrare senza interazioni significative con altre cellule. Infine, si utilizza la microscopia su cellule vive per studiare gli assi nelle cellule in migrazione.

Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come il poliacrilammide, è che esiste un unico passaggio tra il PDMS morbido e il vetro rigido, a differenza delle alternative con gel a gradiente. Inoltre, rivestire il PDMS con componenti della matrice extracellulare come la fibronectina non richiede un legame incrociato chimico, necessario invece per i gel di poliacrilammide. Per preparare una piastra da coltura cellulare a sei pozzetti, prima di tutto strappare la bilancia con un tubo conico da 50 millilitri.

Pesare circa 10 grammi della soluzione base di poli dimetil silossano o PDMS nel tubo da 50 millilitri. Per un rapporto di 90 a 1 tra substrato e reticolante, dividere il peso misurato della soluzione base di PDMS per 90. Per determinare la quantità corretta di soluzione reticolante necessaria, aggiungere la quantità calcolata di soluzione reticolante per PDMS alla miscela base di A-P-D-M-S e reticolante, mescolando vigorosamente per cinque minuti a temperatura ambiente.

Utilizzando in questa fase una spatola piccola, la miscela conterrà un piccolo numero di bolle d'aria. Centrifugare il substrato in PDMS in una centrifuga da banco per cinque minuti a 50 ×g. Aggiungere la temperatura ambiente per rimuovere le bolle qualora fossero ancora presenti.

Dopo i cinque minuti, centrifugare nuovamente ed aspirare un millilitro del substrato PDMS 90:1 in ciascun pozzetto della piastra per colture cellulari trattata. Piastra a sei pozzetti. Eventuali bolle d'aria rimaste nel PDMS possono essere eliminate in questa fase forandole con un ago da 21 gauge.

Lasciare che il PDMS si espanda per 30 minuti nel pozzetto. Successivamente, far bollire vetrini di vetro da 12 millimetri di tipo numero uno in acqua distillata per cinque minuti, per un totale di tre volte. Posizionare un vetrino asciutto in ciascun pozzetto della piastra per colture cellulari toccando delicatamente un lato del vetrino.

Inserire la lamellina nella soluzione di PDMS e quindi appoggiarla delicatamente sul PDMS. Mentre la lamellina si posiziona, il PDMS comincerà a espandersi oltre i bordi della lamellina, senza però coprirla completamente. Dopo la polimerizzazione, si formerà un'interfaccia tra il PDMS e il vetro.

Incubare la piastra a 70 gradi Celsius in un forno per 16 ore per indurire il PDMS. Infine, posizionare la piastra in una cappa per colture cellulari e sterilizzare con raggi UV per 10 minuti. Rivestire ogni camera durox con un millilitro di fibronectina in soluzione salina tamponata al fosfato senza calcio e magnesio per un'ora a 30 gradi Celsius.

Assicurarsi che l'intera superficie sia immersa nella soluzione di fibronectina in PBS. Preparare l'albumina sierica bovina (BSA) al 1% denaturata termicamente pesando 0,5 grammi di BSA e sciogliendoli in 50 millilitri di PBS filtrato. Sterilizzare la soluzione attraverso un filtro da 0,22 micron prima di riscaldarla a 80 gradi Celsius per 12 minuti.

Successivamente, aspirare la soluzione di fibronectina e lavare le camere tre volte con PBS. Aggiungere un millilitro di BSA denaturata termicamente in PBS in ogni pozzetto e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente, mentre si trattano enzimaticamente gli occhi con tripsina e si contano le cellule di interesse, durante il blocco delle camere con la BSA denaturata. Aspirare la soluzione di BSA dalle camere immediatamente prima della semina delle cellule.

Piastrare 10.000 cellule in un volume di due millilitri in ogni pozzetto della camera doax. Utilizzando il mezzo necessario per il particolare tipo cellulare scelto, lasciare che le cellule aderiscano e si espandano sul substrato per quattro ore in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius con 5%CO2; eseguire l'immagine di cellule vive su un microscopio invertito utilizzando il contrasto di fase con un obiettivo 10x. Il microscopio dovrebbe essere dotato di una camera ambientale chiusa e umidificata, che permetta il controllo della temperatura a 37 gradi Celsius e di 5%CO2 durante l'acquisizione di immagini a lungo termine.

Immagini, dopo che le cellule si sono espanse per circa 3,5 ore, assemblare la piastra nella camera del microscopio. Lasciare equilibrare i campioni nella camera per 30 minuti. Impostare un'acquisizione automatizzata multipunto sul microscopio, se disponibile.

Concentrarsi sull'interfaccia tra il PDMS e il vetrino di copertura e scegliere punti da acquisire lungo tutta l'interfaccia. Con una media di 40 punti per camera Durex, acquisire le immagini delle cellule ogni 10 minuti per un massimo di 16 ore; la regione di interesse apparirà come due linee, con la linea esterna corrispondente al bordo del vetrino e la linea interna corrispondente all'effettiva interfaccia tra il PDMS e il vetrino. Per analizzare i dati, generare un foglio di calcolo simile a quello mostrato nel protocollo testuale.

Contare il numero di eventi di attraversamento dal PDMS alla superficie di vetro e viceversa per ciascun filmato generato. Un evento di attraversamento è definito come il passaggio del nucleo cellulare oltre il confine tra PDMS e vetro in una qualsiasi direzione. Registrare il numero di eventi di attraversamento nella colonna appropriata del foglio di calcolo Excel per quantificare i passaggi multipli.

Contare il numero di volte in cui la cellula ha attraversato l'interfaccia. Questo numero deve essere registrato nella colonna di Excel corrispondente al substrato su cui si trovava la cellula al termine del filmato. Ripetere l'analisi per ogni cellula che attraversa l'interfaccia nel filmato.

Escludere le cellule che migrano al di fuori del campo visivo durante l'acquisizione delle immagini. Calcolare la percentuale di cellule che hanno migrato dal PDMS alla superficie di vetro e che quindi hanno subito il Duro Texas. Per fare ciò.

Sommare il numero di eventi di attraversamento da morbido a duro e gli eventi multipli di attraversamento che terminano su duro, quindi dividere per il numero totale di eventi di attraversamento. Calcolare la percentuale di attraversamenti multipli dividendo il totale degli attraversamenti multipli per il numero totale di attraversamenti, per iniziare a comprendere il meccanismo molecolare attraverso cui le cellule rispondono ai segnali meccanici del loro ambiente. Specifiche proteine possono essere ridotte mediante RNA interferente (IRNA), come mostrato in questo caso.

Circa il 70% delle cellule di controllo trattate con RNAi ha mostrato un asse. In netto contrasto, quando CD gap è stato ridotto mediante RNAi, le cellule non hanno mostrato alcuna preferenza nel migrare sul substrato duro o morbido. Inoltre, le cellule con riduzione di CD gap hanno attraversato più volte il confine.

Mentre le cellule trattate con irna di controllo in genere attraversano il confine una sola volta, tracce rappresentative di cellule con irna di controllo mostrano che queste cellule migrano attraverso il confine una volta sola e tendono a rimanere sulla superficie più rigida rispetto alle cellule trattate con irna contro CD gap, che non mostrano preferenza per nessuna delle due rigidità e attraversano il confine più volte.

Dopo aver guardato questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare i substrati in PDMS, assemblare le camere duris e quantificare le DUR taxes.