Name: Un sistema semplificato per la valutazione delle cellule Mechanosensing e Durotaxis In Vitro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 50 s
Description: Impara a studiare la durotassi cellulare con un sistema semplificato in vitro utilizzando substrati PDMS di rigidità definita. Questo metodo consente l'imaging in tempo reale delle cellule mammifere in migrazione.

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Questo lavoro è sostenuto da NIH R01 GM47607, CA163296 e NSF 1.334.493 di CET. Ringraziamo i membri del laboratorio Turner per la lettura critica del manoscritto. Tutti i dati riportati nella presente relazione sono stati riprodotti da permesso da Wormer et al. 2014 11.

1. Preparazione di Durotaxis Chambers <ol><li> Per preparare un 6-pozzetti di coltura tissutale, tarare la bilancia con un tubo da 50 ml. Pesare circa 10 g della soluzione di base PDMS nel tubo da 50 ml (la soluzione è abbastanza viscoso). </li><li> Per 90: 1 substrato (Compliance di ~ 1 kPa), dividere il peso misurato della soluzione di base PDMS nel tubo 90 per determinare la corretta quantità di soluzione reticolante necessaria. Aggiungere la quantità calcolata di soluzione reticolante PDMS al tubo stesso. Esempio: 10 g / 90 = 0,11 g. Aggiungere 0,11 g della soluzione reticolante PDMS alla soluzione di base PDMS. NOTA: La base e reticolante soluzioni sono entrambi forniti nel kit PDMS. </li><li> Mescolare energicamente la miscela base / reticolante PDMS per 5 minuti a temperatura ambiente usando una piccola spatola. A questo punto la miscela contiene un gran numero di bolle d&#39;aria. </li><li> Centrifugare il substrato PDMS in una centrifuga da banco per 5 min a 50 xg a temperatura ambiente per rimuovere l&#39;bubbles. Se ci sono ancora bolle dopo 5 min, centrifuga di nuovo. </li><li> Pipettare 1 ml di 90: 1 PDMS substrato in ciascun pozzetto della coltura di tessuti trattati 6 pozzetti. Eventuali bolle d&#39;aria residue presenti nei PDMS possono essere eliminate in questa fase estraendo usando un ago 21 G. Lasciare le PDMS a diffondere per 30 minuti nel pozzo. </li><li> Bollire 12 millimetri di vetro # 1 coprioggetto in acqua distillata per 5 min. Ripetere due volte e memorizzare i coprioggetti in acqua distillata. </li><li> Mettere uno, coprioggetto secco in ciascun pozzetto della piastra di coltura tissutale toccando delicatamente un lato del vetrino nella soluzione PDMS poi cadere il vetrino sui PDMS. Come il coprioggetto deposita, PDMS cominceranno ad invadere sui bordi del vetrino, ma non copre completamente. Questo genera un&#39;interfaccia tra le PDMS e vetro dopo la polimerizzazione (vedere Figura 1A, B). </li><li> Incubare la piastra a 70 ° C in un forno per 16 ore per curare (indurimento) PDMS. Posizionare il plate in una cappa di coltura cellulare e UV sterilizzare per 10 min. NOTA: E &#39;meglio per rendere le piastre entro un paio di giorni di utilizzo. Tuttavia, le piastre possono essere avvolte in Parafilm senza tampone e conservati a 4 ° C fino a 2 settimane senza alcuna diminuzione nella qualità. </li></ol> 2. Cella placcatura NOTA: Se studiare l&#39;effetto di knockdown siRNA-mediata, eseguire il colpo con le istruzioni del produttore o il protocollo ottimizzato per il tipo cellulare di scelta. <ol><li> Coat ogni durotaxis camera con 1 ml di 10 mg / ml in PBS fibronectina senza calcio e magnesio per 1 ora a 37 ° C. In alternativa, la fibronectina può essere applicato il giorno prima dell&#39;analisi incubando le PDMS con 10 ug / ml in PBS fibronectina per 16 ore a 4 ° C. Assicurarsi che l&#39;intera superficie è immersa nel fibronectina in soluzione PBS. </li><li> Preparare calore denaturato 1% di BSA. Pesare 0,5 g BSA e scioglierlo in 50 ml di PBS.Filtro sterilizzare la soluzione attraverso un filtro di 0,22 micron e riscaldare a 80 ° C per 12 min. Nota: Preparare questa soluzione il giorno prima cella di placcatura e conservare a 4 ° C. </li><li> Aspirare la soluzione fibronectina e lavare 3 volte con PBS. Aggiungere 1 ml di calore denaturato BSA in PBS ad ogni pozzetto ed incubare per 30 minuti a RT. </li><li> Trypsinize e contare le cellule di scelta, mentre le camere durotaxis stanno bloccando con il calore denaturato BSA. </li><li> Piastra 1 x 10 5 cellule in un volume di 2 ml in ciascun pozzetto della camera durotaxis, utilizzando il supporto desiderato per il particolare tipo di cellula di scelta. Permettono alle cellule di aderire e diffondere sul substrato per 4 ore in un incubatore umidificato a 37 ° C con 5% di CO 2. NOTA: cellule U2OS sono normalmente mantenute in DMEM con 10% FBS, supplementato con 2 mM L-glutammina, 1 mM sodio piruvato, e 10 UI / ml di penicillina, 10 mg / ml di streptomicina. NOTA: il numero di cellule usato in questo esempio è ottimizzato perCellule U2OS. Ottimizzazione per altri tipi di cellule può essere richiesto. Questa densità dà le cellule sufficiente per migrare senza interazioni significative con altre cellule. </li></ol> Imaging 3. Live-cell <ol><li> Eseguire l&#39;imaging cellulare dal vivo su un microscopio invertito, con contrasto di fase con un obiettivo 10X. Il microscopio deve essere dotato di un ambiente, camera umidificata chiusa, permettendo il controllo di temperatura a 37 ° C e 5% CO 2 durante l&#39;imaging a lungo termine. </li><li> Dopo che le cellule si sono diffuse per circa 3,5 ore, montare la placca nella camera microscopio. Lasciare il campione (s) per equilibrare nella camera per 30 min. </li><li> Impostare automatizzato, multi-punto in visita sul microscopio, se disponibile. Focus su l&#39;interfaccia tra le 90: 1 PDMS e il vetrino di vetro e scegliere i punti per l&#39;immagine in tutto l&#39;interfaccia con una media di 40 punti per durotaxis camera. Immagine le cellule ogni 10 min per un massimo di 16 ore. NOTA: Il regione di interesse apparirà come due linee, con la linea esterna corrispondente al bordo del vetrino e la linea interna corrispondente all&#39;interfaccia effettiva tra le PDMS e il vetrino. Vedere la Figura 1B. </li></ol> Analisi 4. I dati <ol><li> Generare un foglio di calcolo come nella tabella 1. </li><li> Contare il numero di eventi di attraversamento dalle PDMS alla superficie di vetro e viceversa da ogni film generato. Registrare il numero di eventi di attraversamento nell&#39;apposita colonna nel foglio di calcolo Excel. NOTA: Un evento di crossing è definito come il nucleo cellulare passando sopra il confine tra le PDMS e vetro in entrambe le direzioni. </li><li> Per quantificare attraversare più, contare il numero di volte che la cella è transitato dall&#39;interfaccia. Tale numero deve essere registrato nella colonna di Excel corrispondente al substrato su cui la cella era situato alla fine del film. Ripetere l&#39;analisi per ogni cellula che attraversa l&#39;interfaccia in tfilm che. Escludere le cellule che migrano fuori dal campo visivo durante l&#39;imaging. NOTA: È anche importante verificare, da cellule contando all&#39;inizio dell&#39;esperimento, che le cellule sono in grado di aderire ugualmente ai PDMS fibronectina rivestite coprioggetto e superfici di vetro. </li><li> Calcolare la percentuale di cellule che migrato da PDMS alla superficie del vetro (cioè, durotaxis subito). Aggiungere il numero di attraversare gli eventi da morbido a duro e gli eventi di attraversamento più che si sono concluse sul disco e dividere per il numero totale di eventi di attraversamento. </li><li> Calcolare la percentuale di attraversare più dividendo il numero di attraversare più volte per il numero totale di incroci. </li></ol>

<ol><li>Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+elasticity+directs+stem+cell+lineage+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Matrix elasticity directs stem cell lineage specification.</a> Cell. 126 (4), 677-689 (2006).</li>
<li>Paszek, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tensional+homeostasis+and+the+malignant+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Tensional homeostasis and the malignant phenotype.</a> Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).</li>
<li>Levental, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+crosslinking+forces+tumor+progression+by+enhancing+integrin+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling.</a> Cell. 139 (5), 891-906 (2009).</li>
<li>Lo, C. M., Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+movement+is+guided+by+the+rigidity+of+the+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Cell movement is guided by the rigidity of the substrate.</a> Biophysical Journal. 79 (1), 144-152 (2000).</li>
<li>Plotnikov, S. V., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guiding+cell+migration+by+tugging%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Guiding cell migration by tugging.</a> Current Opinion in Cell Biology. 25 (5), 619-626 (2013).</li>
<li>Choquet, D., Felsenfeld, D. P., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+rigidity+causes+strengthening+of+integrin-cytoskeleton+linkages%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix rigidity causes strengthening of integrin-cytoskeleton linkages.</a> Cell. 88 (1), 39-48 (1997).</li>
<li>Balaban, N. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+and+focal+adhesion+assembly%3A+a+close+relationship+studied+using+elastic+micropatterned+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Force and focal adhesion assembly: a close relationship studied using elastic micropatterned substrates.</a> Nature Cell Biology. 3 (5), 466-472 (2001).</li>
<li>Provenzano, P. P., Keely, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+signaling+through+the+cytoskeleton+regulates+cell+proliferation+by+coordinated+focal+adhesion+and+Rho+GTPase+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Mechanical signaling through the cytoskeleton regulates cell proliferation by coordinated focal adhesion and Rho GTPase signaling.</a> Journal of Cell Science. 124 (8), 1195-1205 (2011).</li>
<li>Wang, Y. L., Pelham, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+a+flexible%2C+porous+polyacrylamide+substrate+for+mechanical+studies+of+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Preparation of a flexible, porous polyacrylamide substrate for mechanical studies of cultured cells.</a> Methods in Enzymology. 298, 489-496 (1998).</li>
<li>Prager-Khoutorsky, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+polarization+is+a+matrix-rigidity-dependent+process+controlled+by+focal+adhesion+mechanosensing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Fibroblast polarization is a matrix-rigidity-dependent process controlled by focal adhesion mechanosensing.</a> Nature Cell Biology. 13 (12), 1457-1465 (2011).</li>
<li>Wormer, D. B., Davis, K. A., Henderson, J. H., Turner, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+focal+adhesion-localized+CdGAP+regulates+matrix+rigidity+sensing+and+durotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+ONE%22%5BJournal%5D)">The focal adhesion-localized CdGAP regulates matrix rigidity sensing and durotaxis.</a> PloS ONE. 9 (3), e91815(2014).</li>
<li>Trichet, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+of+a+large-scale+mechanosensing+mechanism+for+cellular+adaptation+to+substrate+stiffness%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Evidence of a large-scale mechanosensing mechanism for cellular adaptation to substrate stiffness.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (18), 6933-6938 (2012).</li>
<li>Eyckmans, J., Boudou, T., Yu, X., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hitchhiker%E2%80%99s+guide+to+mechanobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">A hitchhiker’s guide to mechanobiology.</a> Developmental Cell. 21 (1), 35-47 (2011).</li>
<li>Martinac, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanosensitive+ion+channels%3A+molecules+of+mechanotransduction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Mechanosensitive ion channels: molecules of mechanotransduction.</a> Journal of Cell Science. 117 (12), 2449-2460 (2004).</li>
<li>Jafar-Nejad, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sec15%2C+a+component+of+the+exocyst%2C+promotes+notch+signaling+during+the+asymmetric+division+of+Drosophila+sensory+organ+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Sec15, a component of the exocyst, promotes notch signaling during the asymmetric division of Drosophila sensory organ precursors.</a> Developmental Cell. 9 (3), 351-363 (2005).</li>
</ol>

Gli autori non hanno conflitti da rivelare.

Qui descriviamo un semplice test per studiare durotaxis in migrazione delle cellule. Un punto di forza di questo saggio è la facilità di preparazione delle camere durotaxis con PDMS. La rigidità dei substrati può essere facilmente manipolata modificando il rapporto di soluzione di base PDMS a reticolante per consentire lo studio di varie rigidità nel test. Tuttavia, una potenziale limitazione del sistema è che le cellule sono esposte a un solo cambiamento di rigidità del substrato rispetto a sperimentare un gradiente ri...

La matrice extracellulare (ECM) è costituito da una serie complessa di proteine ​​strutturali e reticolazione compreso collagene, fibronectina e laminina. Anche se è noto che l&#39;ECM fornisce un importante supporto strutturale per tessuti cellulari, ci sono sempre più prove per indicare che le cellule rispondono attivamente ai cambiamenti fisici nel loro ambiente ECM per regolare i processi cellulari diversi, tra cui la sopravvivenza cellulare, la differenziazione e la migrazione delle cellule. Ad esempio, le differenze nella rigidità della ECM può guidare le cellule staminali mesenchimali verso differenti linee, con i substrati molli (~ 1 kPa) promuovono lignaggi neurogene mentre rigidi (~ 25 kPa) substrati di promuovere la differenziazione osteogenica 1. Analogamente, un aumento della rigidità matrice stromale ha dimostrato di promuovere la tumorigenesi mammaria cellule epiteliali ed invasione nel 2,3 tessuto circostante. Un aspetto particolarmente interessante di questo mechanosignrisultati dell&#39;attività aling in un processo noto come durotaxis, in cui le cellule migrano preferenzialmente verso un substrato più rigido 4,5. Le cellule rilevano costantemente le caratteristiche fisiche del loro ambiente extracellulare attraverso recettore integrina legame alla ECM. Questo, a sua volta, promuove l&#39;accumulo di numerose proteine ​​strutturali e segnalazione ai loro domini citoplasmatici per guidare la formazione di strutture adesive note come adesioni focali o contatti focali 6,7. Dal momento che le integrine non hanno attività enzimatica intrinseca, i segnali vengono inoltrati dal ECM attraverso queste proteine ​​accessorie per coordinare la risposta delle cellule al loro ambiente mutevole 8. Di conseguenza, l&#39;identificazione e la caratterizzazione delle proteine ​​chiave coinvolte nella regolazione mechanosignaling e durotaxis è un&#39;importante area di ricerca. Vari sistemi modello sono stati sviluppati per studiare durotaxis in vitro, ma la maggior parte hannoutilizzati collagene rivestite poliacrilammide substrati 4. Tuttavia, la preparazione dei substrati di poliacrilammide può essere tecnicamente impegnativo e il collagene utilizzato in questi saggi deve essere chimicamente reticolato al substrato 9. Polidimetilsilossano (PDMS) substrati hanno dimostrato di presentare proprietà meccaniche paragonabili ai substrati di poliacrilammide 10. Tuttavia, substrati PDMS vengono preparate semplicemente miscelando un rapporto della base di reticolante e questi substrati possono essere rivestiti con proteine ​​ECM senza la necessità di reticolazione chimica, rendendo così più facile PDMS uno strumento per studiare gli effetti di rigidità sul comportamento cellulare. Qui, si descrive come preparare una semplice camera di durotaxis in cui un substrato morbido PDMS è integrato con un coprioggetto vetro rigido. Il saggio, come indicato di seguito, fornisce un metodo rapido e semplice per lo studio durotaxis. Per questo studio abbiamo utilizzato cellule di osteosarcoma U2OS umane combinate con siRNA-mediataatterramento di cdGAP per studiare il ruolo di questa proteina di adesione focale durotaxis 11. È importante sottolineare che questo protocollo può essere facilmente adattato alle esigenze individuali. Altri tipi cellulari possono essere sostituiti per le cellule U2OS e qualsiasi proteina possono essere abbassati o overexpressed per determinare gli effetti sul comportamento cellulare durante durotaxis. Inoltre, questo protocollo può essere adattato per incorporare le proteine ​​fluorescenti tag per analizzare le loro dinamiche e comportamento utilizzando FRAP o preoccuparsi approcci.

<table><tbody><tr><td>Polidimetilsilossano (PDMS)</td><td>Dow Corning</td><td>3097358-1004</td><td>Sylgard 184 Kit di elastomeri siliconici</td></tr><tr><td>#1 Vetro di copertura 12 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-82</td><td></td></tr><tr><td>Piastra a 6 pozzetti</td><td>Celltreat</td><td>229106</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Cellgro</td><td>15-017-CM</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutammina</td><td>Cellgro</td><td>25-005-CI</td><td></td></tr><tr><td>Sodio Piruvato</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP356-100</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina/Streptomicina</td><td>Cellgro</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina</td><td>BD Biosciences</td><td>610077</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen</td><td>21600-044</td><td></td></tr><tr><td>Tubi di falco</td><td>Celltreat</td><td>229456</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>U2OS cellule</td><td>ATCC</td><td>HTB-96</td><td></td></tr></tbody></table>

un sistema semplificato per la valutazione delle cellule mechanosensing e durotaxis<em&gt; in vitro</em

A Simplified System for Evaluating Cell Mechanosensing and Durotaxis In Vitro

Le proprietà meccaniche e composizione della matrice extracellulare sono molto variabili tra i tipi di tessuto. Questo connettivo diversità stroma del tessuto notevolmente comportamento impatti cella per regolare i processi normali e patologiche tra cui la proliferazione cellulare, la differenziazione, la segnalazione di adesione e la migrazione direzionale. A questo proposito, la capacità innata di certi tipi di cellule a migrare verso un substrato matrice rigida, o meno compatibile è indicato come durotaxis. Questo fenomeno ha un ruolo importante durante lo sviluppo embrionale, la riparazione delle ferite e l&#39;invasione delle cellule tumorali. Qui, descriviamo un test semplice per studiare durotaxis, in vitro, utilizzando polidimetilsilossano (PDMS) substrati. Preparazione del descritto durotaxis camere crea un&#39;interfaccia tra la rigidità relativamente morbido gel PDMS e un vetrino di vetro rigida. Nell&#39;esempio fornito, abbiamo usato queste durotaxis alloggiamenti per dimostrare un ruolo per il Cdc42 / Rac1 GTPasi prote attivazionein, cdGAP, in mechanosensing e durotaxis regolazione nelle cellule umane U2OS osteosarcoma. Questo test è facilmente adattabile ad altri tipi e / o atterramento di altre proteine ​​di interesse cellulari per esplorare i loro rispettivi ruoli nel mechanosignaling e durotaxis.

Uno schema della camera durotaxis è mostrato nella Figura 1A. Substrato PDMS molle (90: 1 miscela di base di PDMS a reticolante soluzioni) si sviluppa in un piatto 6 pozzo e un vetrino di vetro è posto sulla parte superiore delle PDMS, che poi ricopre parzialmente la superficie superiore del vetrino, creando un&#39;interfaccia tra i due substrati di conformità diverso. La rigidità del substrato PDMS morbido è ~ 1 kPa, che è paragonabile alla conformità tipica del tessuto cerebrale, ment...

Molte cellule di mammifero migrano preferenzialmente verso una matrice o substrato più rigido attraverso la durotassi. L'obiettivo di questo protocollo è quello di fornire un semplice sistema in vitro che possa essere utilizzato per studiare e manipolare i comportamenti della durotassi cellulare incorporando substrati di polidimetilsilossano (PDMS) di rigidità definita, interfacciati con vetrini.

Un sistema semplificato per la valutazione delle cellule Mechanosensing e Durotaxis<em&gt; In Vitro</em

The composition and mechanical properties of the extracellular matrix are highly variable between tissue types. This connective tissue stroma diversity ...

L'obiettivo generale di questa procedura è fornire un sistema semplificato per l'analisi della durotassi, ovvero il fenomeno attraverso il quale molte cellule mammifere migrano preferenzialmente verso un substrato più rigido. Questo risultato si ottiene innanzitutto preparando substrati di polidimetilsilossano (PDMS) con rigidità definita. Successivamente, il PDMS preparato viene versato in ogni pozzetto di una piastra a sei pozzetti e vengono rimossi eventuali bolle d'aria.Le camere Durex vengono quindi completate posizionando un coprivetrino sterilizzato sulla parte superiore del PDMS in ogni pozzetto, creando così un sovrastrato. L'ultimo passaggio consiste nell'inseminare le cellule nelle camere Duro taxes a una densità che permetta alle cellule sufficiente spazio per migrare senza interazioni significative con altre cellule. Infine, si utilizza la microscopia su cellule vive per studiare gli assi nelle cellule in migrazione.Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come il poliacrilammide, è che esiste un unico passaggio tra il PDMS morbido e il vetro rigido, a differenza delle alternative con gel a gradiente. Inoltre, rivestire il PDMS con componenti della matrice extracellulare come la fibronectina non richiede un legame incrociato chimico, necessario invece per i gel di poliacrilammide. Per preparare una piastra da coltura cellulare a sei pozzetti, prima di tutto strappare la bilancia con un tubo conico da 50 millilitri.Pesare circa 10 grammi della soluzione base di poli dimetil silossano o PDMS nel tubo da 50 millilitri. Per un rapporto di 90 a 1 tra substrato e reticolante, dividere il peso misurato della soluzione base di PDMS per 90. Per determinare la quantità corretta di soluzione reticolante necessaria, aggiungere la quantità calcolata di soluzione reticolante per PDMS alla miscela base di A-P-D-M-S e reticolante, mescolando vigorosamente per cinque minuti a temperatura ambiente.Utilizzando in questa fase una spatola piccola, la miscela conterrà un piccolo numero di bolle d'aria. Centrifugare il substrato in PDMS in una centrifuga da banco per cinque minuti a 50 ×g. Aggiungere la temperatura ambiente per rimuovere le bolle qualora fossero ancora presenti.Dopo i cinque minuti, centrifugare nuovamente ed aspirare un millilitro del substrato PDMS 90:1 in ciascun pozzetto della piastra per colture cellulari trattata. Piastra a sei pozzetti. Eventuali bolle d'aria rimaste nel PDMS possono essere eliminate in questa fase forandole con un ago da 21 gauge.Lasciare che il PDMS si espanda per 30 minuti nel pozzetto. Successivamente, far bollire vetrini di vetro da 12 millimetri di tipo numero uno in acqua distillata per cinque minuti, per un totale di tre volte. Posizionare un vetrino asciutto in ciascun pozzetto della piastra per colture cellulari toccando delicatamente un lato del vetrino.Inserire la lamellina nella soluzione di PDMS e quindi appoggiarla delicatamente sul PDMS. Mentre la lamellina si posiziona, il PDMS comincerà a espandersi oltre i bordi della lamellina, senza però coprirla completamente. Dopo la polimerizzazione, si formerà un'interfaccia tra il PDMS e il vetro.Incubare la piastra a 70 gradi Celsius in un forno per 16 ore per indurire il PDMS. Infine, posizionare la piastra in una cappa per colture cellulari e sterilizzare con raggi UV per 10 minuti. Rivestire ogni camera durox con un millilitro di fibronectina in soluzione salina tamponata al fosfato senza calcio e magnesio per un'ora a 30 gradi Celsius.Assicurarsi che l'intera superficie sia immersa nella soluzione di fibronectina in PBS. Preparare l'albumina sierica bovina (BSA) al 1% denaturata termicamente pesando 0,5 grammi di BSA e sciogliendoli in 50 millilitri di PBS filtrato. Sterilizzare la soluzione attraverso un filtro da 0,22 micron prima di riscaldarla a 80 gradi Celsius per 12 minuti.Successivamente, aspirare la soluzione di fibronectina e lavare le camere tre volte con PBS. Aggiungere un millilitro di BSA denaturata termicamente in PBS in ogni pozzetto e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente, mentre si trattano enzimaticamente gli occhi con tripsina e si contano le cellule di interesse, durante il blocco delle camere con la BSA denaturata. Aspirare la soluzione di BSA dalle camere immediatamente prima della semina delle cellule.Piastrare 10.000 cellule in un volume di due millilitri in ogni pozzetto della camera doax. Utilizzando il mezzo necessario per il particolare tipo cellulare scelto, lasciare che le cellule aderiscano e si espandano sul substrato per quattro ore in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius con 5%CO2; eseguire l'immagine di cellule vive su un microscopio invertito utilizzando il contrasto di fase con un obiettivo 10x. Il microscopio dovrebbe essere dotato di una camera ambientale chiusa e umidificata, che permetta il controllo della temperatura a 37 gradi Celsius e di 5%CO2 durante l'acquisizione di immagini a lungo termine.Immagini, dopo che le cellule si sono espanse per circa 3,5 ore, assemblare la piastra nella camera del microscopio. Lasciare equilibrare i campioni nella camera per 30 minuti. Impostare un'acquisizione automatizzata multipunto sul microscopio, se disponibile.Concentrarsi sull'interfaccia tra il PDMS e il vetrino di copertura e scegliere punti da acquisire lungo tutta l'interfaccia. Con una media di 40 punti per camera Durex, acquisire le immagini delle cellule ogni 10 minuti per un massimo di 16 ore; la regione di interesse apparirà come due linee, con la linea esterna corrispondente al bordo del vetrino e la linea interna corrispondente all'effettiva interfaccia tra il PDMS e il vetrino. Per analizzare i dati, generare un foglio di calcolo simile a quello mostrato nel protocollo testuale.Contare il numero di eventi di attraversamento dal PDMS alla superficie di vetro e viceversa per ciascun filmato generato. Un evento di attraversamento è definito come il passaggio del nucleo cellulare oltre il confine tra PDMS e vetro in una qualsiasi direzione. Registrare il numero di eventi di attraversamento nella colonna appropriata del foglio di calcolo Excel per quantificare i passaggi multipli.Contare il numero di volte in cui la cellula ha attraversato l'interfaccia. Questo numero deve essere registrato nella colonna di Excel corrispondente al substrato su cui si trovava la cellula al termine del filmato. Ripetere l'analisi per ogni cellula che attraversa l'interfaccia nel filmato.Escludere le cellule che migrano al di fuori del campo visivo durante l'acquisizione delle immagini. Calcolare la percentuale di cellule che hanno migrato dal PDMS alla superficie di vetro e che quindi hanno subito il Duro Texas. Per fare ciò.Sommare il numero di eventi di attraversamento da morbido a duro e gli eventi multipli di attraversamento che terminano su duro, quindi dividere per il numero totale di eventi di attraversamento. Calcolare la percentuale di attraversamenti multipli dividendo il totale degli attraversamenti multipli per il numero totale di attraversamenti, per iniziare a comprendere il meccanismo molecolare attraverso cui le cellule rispondono ai segnali meccanici del loro ambiente. Specifiche proteine possono essere ridotte mediante RNA interferente (IRNA), come mostrato in questo caso.Circa il 70% delle cellule di controllo trattate con RNAi ha mostrato un asse. In netto contrasto, quando CD gap è stato ridotto mediante RNAi, le cellule non hanno mostrato alcuna preferenza nel migrare sul substrato duro o morbido. Inoltre, le cellule con riduzione di CD gap hanno attraversato più volte il confine.Mentre le cellule trattate con irna di controllo in genere attraversano il confine una sola volta, tracce rappresentative di cellule con irna di controllo mostrano che queste cellule migrano attraverso il confine una volta sola e tendono a rimanere sulla superficie più rigida rispetto alle cellule trattate con irna contro CD gap, che non mostrano preferenza per nessuna delle due rigidità e attraversano il confine più volte.Dopo aver guardato questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare i substrati in PDMS, assemblare le camere duris e quantificare le DUR taxes.

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L'ECIS / Taxi sistema è un sistema automatico, in tempo reale test che misura chemiotassi cellulari. In questo saggio, cellule si muovono sotto uno strato di agarosio per arrivare ad un elettrodo bersaglio. Movimento cellulare è misurata dalla comparsa di resistenza a 0 corrente alternata.

Misura della chemiotassi cellulari con ECIS / Taxi

Al fine di identificare nuove mutazioni che influenzano la meccanosensazione, abbiamo progettato un test che misura la risposta comportamentale alla stimolazione tattile delle setole di mosca nei cloni mutanti generati dal metodo MARCM. La combinazione di tecniche consente l'identificazione di mutazioni meccanosensibili che altrimenti sarebbero letali.

Un test comportamentale per Mechanosensation di cloni in marcm-based<em&gt; Drosophila melanogaster</em

aderenze superficie cellulare sono centrali in meccanotrasduzione, in quanto trasmettono tensione meccanica e avviare le vie di segnalazione coinvolte nella omeostasi dei tessuti e lo sviluppo. Qui, vi presentiamo un protocollo per sezionare i percorsi biochimici che si attivano in risposta a tensione, utilizzando microsfere magnetiche rivestite ligando e di applicazione della forza di recettori di adesione.

Analizzando cellulare superficie di adesione ritocca in risposta alla tensione meccanica utilizzando biglie magnetiche

Qui descriviamo i metodi per la valutazione della risposta cellulare alla stimolazione meccanica acuta. Nell'analisi della base di microscopia, esaminiamo la localizzazione di biosensori fluorescente etichettati dopo breve stimolazione con flusso di shear. Ci prova anche l'attivazione di varie proteine di interesse in risposta alla stimolazione meccanica acuta biochimicamente.

Valutazione della risposta di Dictyostelium discoideum alla stimolazione meccanica acuta

Nuovi strumenti per la ricerca di mechanobiology sono necessari per capire lo stress come meccanico attiva vie biochimiche e suscita risposte biologiche. Qui, presenteremo un nuovo metodo per stimolazione meccanica selettiva degli animali immobilizzati con una trappola di microfluidica permettendo di imaging ad alta risoluzione delle risposte cellulari.

Utilizzando un dispositivo di microfluidica per stimolazione meccanica e alta risoluzione Imaging di c. elegans

Presentiamo una configurazione di pinzette ottiche accoppiate al microscopio un foglio leggero e la sua attuazione a sonda meccanica delle cellule senza perline nell'embrione della drosofila .

Tastatura meccanica delle cellule con pinzette ottiche senza tallone nell'embrione della drosofila

Le forze meccaniche sono importanti per controllare la migrazione cellulare. Questo protocollo dimostra l'uso di idrogel elastici che possono essere deformati utilizzando una micropipetta di vetro e un micromanipolatore per stimolare le cellule con un gradiente di rigidità locale per suscitare cambiamenti nella struttura cellulare e nella migrazione.

Analisi A singola cella Durotaxis per valutare il controllo meccanico del movimento cellulare e gli eventi di segnalazione correlati

La piattaforma Integrative Toolkit to Analyze Cellular Signals (iTACS) automatizza il processo di misurazione simultanea di un'ampia varietà di segnali chimici e meccanici nelle cellule aderenti. iTACS è progettato per facilitare lo sviluppo guidato dalla comunità e consentire ai ricercatori di utilizzare tutte le funzionalità della piattaforma indipendentemente dal loro background educativo.

Toolkit integrativo per analizzare i segnali cellulari: forze, movimento, morfologia e fluorescenza

Questo lavoro presenta un protocollo flessibile per l'utilizzo della tecnologia FLECS (fluorescently labeled elastomeric contractible surfaces) in formato microwell per una quantificazione semplificata e hands-off delle forze contrattili a singola cellula basata sugli spostamenti visualizzati di micropattern proteici fluorescenti.

Analisi semplificata e ad alta produttività della contrattilità a cella singola utilizzando elastomeri micropatterati

Il presente protocollo descrive la progettazione, la fabbricazione e la caratterizzazione di un sistema microfluidico in grado di allineare, immobilizzare e comprimere con precisione centinaia di embrioni di Drosophila melanogaster con un intervento minimo da parte dell'utente. Questo sistema consente l'imaging ad alta risoluzione e il recupero di campioni per l'analisi post-stimolazione e può essere scalato per adattarsi ad altri sistemi biologici multicellulari.

Meccanostimolazione di organismi pluricellulari attraverso un sistema di compressione microfluidica ad alta produttività

Presentato qui è un metodo per fenotipizzare meccanicamente singole cellule utilizzando una piattaforma microfluidica basata sull'elettronica chiamata mechano-node-pore sensing (mechano-NPS). Questa piattaforma mantiene un throughput moderato di 1-10 cellule / s misurando sia le proprietà biofisiche elastiche che viscose delle cellule.

Rilevamento meccano-nodo-pore: una piattaforma rapida e senza etichette per misure viscoelastiche monocellulari multiparametriche

Impara a studiare la durotassi cellulare con un sistema semplificato in vitro utilizzando substrati PDMS di rigidità definita. Questo metodo consente l'imaging in tempo reale delle cellule mammifere in migrazione.

Un sistema semplificato per la valutazione delle cellule Mechanosensing e Durotaxis

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