Name: Produzione di Nurr-1 specifici anticorpi policlonali gratuito di cross-reattività contro i suoi omologhi, Chiudi Nor1 e Nur77 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 30 s
Description: Impara a produrre anticorpi policlonali Nurr-1 specifici senza cross-reattività contro Nor1 e Nur77. Questo metodo di immunologia rimuove anticorpi cross-reattivi usando domini proteici divergenti e cromatografia.

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Questo lavoro è stato supportato da sovvenzioni NIH (NS070577 e NS084869).

Nota: la composizione di tutte le soluzioni citate di seguito può essere trovato nella Tabella Materiali / attrezzature. 1. Proteina A Colonna anticorpi Purificazione <ol><li> Equilibrare una proteina A Spin Column e tutti i buffer necessari a temperatura ambiente per 15 minuti prima di iniziare la procedura. </li><li> Diluire il siero immune 1: 1 con Proteina A IgG Binding Buffer. (5 ml di siero è consigliato). </li><li> Battere delicatamente una proteina A Spin Column sul banco per rimuovere la resina che può essere presentato nel tappo. Togliere il tappo superiore e far scattare delicatamente la chiusura di fondo. Porre la colonna in un tubo di raccolta da 15 ml e lasciare soluzione di storage di scarico. </li><li> Aggiungere 5 ml di Proteina A IgG Binding Buffer e consentire la soluzione di scendere. </li><li> Applicare il siero immune diluito alla colonna e raccogliere il flow-through. Per ottenere i migliori risultati, aggiungere un volume di campione che contiene una concentrazione di anticorpi inferiore all&#39;80% di anticorpo vincolante capacit della colonnaa. </li><li> Lavare la colonna con 15 ml di Proteina A IgG Binding Buffer o finché l&#39;assorbanza a 280 nm è inferiore a 0,1. </li><li> Aggiungere 100 ml di neutralizzazione tampone a cinque tubi di raccolta etichettati. </li><li> Aggiungere 5 ml di IgG Elution Buffer alla colonna di Proteina A e raccogliere 1 ml frazioni ciascuna delle provette contenenti 100 ml di tampone di neutralizzazione. </li><li> Misurare l&#39;assorbanza di ogni frazione a 280 nm frazioni e piscina con un&#39;assorbanza maggiore di 0,5. Tenere le frazioni in pool sul ghiaccio fino al momento per la dialisi. </li><li> Rigenerare colonna aggiungendo 8 ml di IgG Elution Buffer e lasciare che la soluzione di fluire attraverso la colonna. </li><li> Lavare la colonna con la soluzione Binding Protein A IgG finché il pH dell&#39;eluente ritorna 7.4. </li><li> Conservare la colonna aggiungendo 5 ml di soluzione di conservazione (0,02% di sodio azide in PBS). Quando circa 3 ml rimangono nella colonna, coperchio inferiore e fissare il tappo superiore. Conservare la colonna a 4 ° C. </li><li> Determinare la lunghezza otubo di dialisi f necessaria in base alle istruzioni del produttore. Utilizzando 16 millimetri tubo diametro piatti utilizzano 5,47 centimetri di lunghezza del tubo per ml di soluzione da dializzato. Tagliare il tubo e risciacquare con PBS pH 7,4 per 15 a 30 min. </li><li> Piegare e tagliare una estremità del tubo di dialisi, trasferire l&#39;IgG pool contenente frazioni a tubo di dialisi equilibrati in PBS pH 7,4 e chiudere l&#39;altra estremità. </li><li> Dializzare a temperatura ambiente contro 200 volumi di PBS pH 7,4 per 2 ore. </li><li> Cambiare il tampone di dialisi (fresca PBS pH 7.4) e dializza per altri 2 ore a temperatura ambiente. </li><li> Modificare il buffer di dialisi (PBS fresco pH 7,4) e dializza notte a 4 ° C. </li><li> Conservare la soluzione di anticorpi dializzata a 4 ° C fino al momento di procedere con ulteriori fasi di purificazione. </li><li> Valutare la concentrazione di anticorpi con il suo assorbimento a 280 nm e il coefficiente di assorbimento molare di anticorpi a 280 nm di 210.000 M -1 cm -1 12. </li></ol> 2. Accoppiamento di LBD proteine ​​per AminoLink Giunto in resina <ol><li> Preparare due colonne, una per Nor1 e l&#39;altro per Nur77. Seguite lo stesso protocollo per entrambe le proteine. </li><li> Scongelare la proteina da accoppiare alla resina su ghiaccio. Determinare la concentrazione di proteine ​​utilizzando il coefficiente di estinzione molare e la sua assorbanza a 280 nm 12. <ol><li> In alternativa, utilizzare un saggio determinazione delle proteine, come l&#39;acido bicinconinico test 13. Se la proteina viene disciolta in un cambio-ammina contenente tampone Dializzare o tampone contro il tampone di accoppiamento. Se la proteina è in un tampone adatto (non ammine libere) diluire 4 volte in Coupling Buffer. </li></ol></li><li> Utilizzare 2 ml di resina per 2 mg di proteina. Tutte le fasi che seguono sono per la resina 2 ml in una colonna di 10 ml. Fino a 10 mg di proteine ​​possono essere collegati per 1 ml di resina (2 ml di 1: 1 slurry). </li><li> Preparare una colonna 10 ml spingendo una fritta al fondo e funzionante PBS pH 7,4 attraverso di essa. Cap tha fondo della colonna e aggiungere 2 ml di Coupling Buffer. </li><li> Aggiungere il volume desiderato di slurry (4 ml per ottenere 2 ml di resina) per la colonna, rimuovere il tappo inferiore e far defluire colonna. Lavare la colonna con un totale di 6 ml (volume 3 resina-letto) di Coupling Buffer e che la colonna di scarico. Dopo il buffer di accoppiamento sia scolato, sostituire il tappo inferiore. </li><li> Aggiungere 2-4 ml di proteina sospese in Coupling Buffer alla colonna (mantenere una aliquota della soluzione proteica di valutare l&#39;efficienza di accoppiamento confrontando la concentrazione proteica dell&#39;eluato nel passo 2.11 utilizzando l&#39;assorbanza a 280 nm o saggio bicinconinico) . Cap e mescolare fine su fine di avere una soluzione omogenea. </li><li> Pesare una provetta 1,8 ml vuoto e passare alla cappa aspirante. Trasferire accuratamente NaCNBH 3 (circa 0,05 g) nel tubo pre-pesato. Chiudere la provetta e pesare la provetta contenente NaCNBH 3. Non aprire il tubo esterno della cappa. </li><li> Sulla base del pesoNaCNBH 3 trasferito nel tubo, ottenere una soluzione 5 M aggiungendo 1 M NaOH. Il peso molecolare di NaCNBH 3 è 62.84 g quindi 0,05 g è pari a (0,05 / 62,84 = 7,96 x 10 -4 moli) 7,96 x 10 -4 moli. Per fare una soluzione add 5 M (7.96 x 10 -4/5) 159 ml di 1 M NaOH. </li><li> Misurare il volume totale della reazione che il volume di resina in considerazione. Aggiungere 10 ml di 5 M NaCNBH 3 per ml di reazione. <ol><li> Ad esempio: per un volume di reazione 4 ml aggiungere 40 ml di 5 M NaCNBH 3. Per 1 ml di resina e 3 ml di proteina aggiunta, il volume totale di 4 ml. </li></ol></li><li> Chiudere la colonna e mescolare fine su fine. Fissare la colonna su un rotatore tubo e lasciare che la reazione continui notte a 4 ° C. </li><li> Al mattino, portare la colonna alla cappa chimica e con attenzione rimuovere il tappo alcuni gas potrebbe essersi formata. Scolate la colonna in una provetta pulita e salvare l&#39;eluato per misurare l&#39;aria di proteinecentrazione usando l&#39;assorbanza a 280 nm Metodo 12 o il dosaggio dell&#39;acido bicinconinico e confrontarlo con la concentrazione della proteina di partenza al punto 2.6. </li><li> Lavare la resina con 4 ml di Coupling Buffer e lasciare che lo scarico della colonna. </li></ol> 3. Bloccare rimanente Siti <ol><li> Lavare la resina con 4 ml di tampone di tempra. Scolare e sostituire il tappo inferiore. Aggiungere 2 ml di tampone di tempra e sospendere la resina. </li><li> Valutare il volume totale di reazione misurando il volume di resina e il volume tampone quenching quindi aggiungere 10 ml di 5 M NaCNBH 3 per ml di volume di reazione. </li><li> Mescolare delicatamente a temperatura ambiente per 30 min end-over-end. Dopo 30 min, portare la colonna nella cappa. Rimuovere con attenzione la parte superiore e poi togliere il tappo inferiore e far defluire colonna in un tubo di scarico. </li><li> Lavare la colonna con 5 volumi in resina di soluzione di lavaggio. Monitorare i lavaggi per la presenza di proteine ​​residue misurando asso del eluatorbance a 280 nm. Proteine ​​disaccoppiato vengono lavati dalla alta concentrazione salina. </li><li> Lavare la resina con 6 ml di degasato PBS pH 7,4 contenente 0,02% di sodio azide. Mantenere la colonna a 4 ° C fino al momento dell&#39;uso. </li></ol> 4. Purificazione di Nurr1 anticorpi specifici <ol><li> Lavare la colonna accoppiata Nur77 LBD con 10 ml di PBS pH 7.4 e lasciare che la colonna di scarico. Chiudere la parte inferiore della colonna e posizionare il Nur77 LBD colonna accoppiato drenato in un nuovo tubo di raccolta 15 ml. </li><li> Aggiungere 5 ml di proteine ​​A anticorpi purificati anti-Nurr1, tappare la colonna e posto su un rotatore a 4 ° C per 1 ora. Rimuovere i tappi superiore e inferiore e raccogliere il flusso attraverso. Mettere da parte sul ghiaccio fino al momento di aggiungere alla colonna accoppiata Nor1 LBD. </li><li> Lavare la colonna accoppiata Nor1 LBD con 10 ml di PBS pH 7.4 e lasciare che la colonna di scarico. Chiudere la parte inferiore della colonna e posizionare il Nor1 LBD colonna accoppiato in un tubo di raccolta 15 ml. </li><li> Aggiungere il flusso attraverso dal colpo di Stato Nur77 LBDcolonna led, cap colonna e posto su un rotatore a 4 ° C per 1 ora. Rimuovere i tappi superiore e inferiore e raccogliere il flusso attraverso. </li><li> Misurare la concentrazione dell&#39;anticorpo misurando l&#39;assorbanza a 280 nm. </li></ol> Analisi basata su ELISA 5. di purificata Anti-Nurr1 anticorpo <ol><li> Aggiungere 100 ml di proteine ​​(2,5 mg / ml) per i pozzetti di una piastra da 96 pozzetti. Se il test 3 diverse proteine, aggiungere 100 ml di proteine ​​1 nei pozzetti A1 a H4, 100 microlitri di proteine ​​2, a pozzi A5 a H8 e 100 microlitri di proteine ​​3 a pozzi A9 a H12. Coprire la piastra e incubare una notte a 4 ° C. </li><li> Lavare i pozzetti due volte con 300 microlitri per pozzetto di PBS pH 7,4 e aggiungere 300 ml di tampone bloccante ELISA all&#39;intero pozzetti rivestiti di antigene e incubare 2 ore a temperatura ambiente. </li><li> Mentre la piastra blocca preparare una diluizione iniziale desiderato di purificato anticorpo anti-Nurr1 (che vanno da 10 a 100 mg / ml) in tampone bloccante ELISA. </li><li> Dopo 2 ore di blocco, sostituire il buffer del blocco ELISA con 100 ml di fresco buffer di blocco ELISA a tutti i pozzetti. </li><li> Aggiungere 100 ml di diluito anticorpo anti-Nurr1 purificata per tutti i pozzi nella riga A. serialmente diluire gli anticorpi trasferendo 100 ml di soluzione da riga A ai pozzetti nella riga B seguita da trasferimento di 100 ml di soluzione da riga B alla riga C proseguendo verso il basso per remare G. Dopo la miscelazione delle soluzioni in pozzi in fila G scartare l&#39;extra 100 ml. Wells nella riga H ricevono solo i primi 100 ml di tampone di bloccaggio. Incubare a temperatura ambiente per 1 ora. </li><li> Lavare la piastra di tre (3) volte con 300 microlitri per pozzetto di 0,05% Tween 20 in PBS pH 7,4 e asciugare la piastra per rimuovere il tampone di lavaggio in eccesso. </li><li> Aggiungere 100 ml di perossidasi di rafano (HRP) IgG anti-coniglio di capra coniugato diluito in un tampone blocco ELISA (1: 8.000 diluizione; la gamma tipica è da 1: 5.000 a 1: 25.000). Incubare a temperatura ambiente per 1 ora. </li><li> Lavare le th piastraree (3) volte come descritto in 5.6. Lavare tutti i pozzetti da riempiendole con 300 ml di acqua deionizzata. Tamponare l&#39;acqua in eccesso capovolgendo la piastra su carta assorbente. </li><li> Aggiungere 100 pl di 3, 3 &#39;, 5, 5&#39; tetrametilbenzidina (riscaldato a temperatura ambiente) a tutti i pozzetti e incubare 15 a 30 minuti al buio a temperatura ambiente. </li><li> Arrestare la reazione aggiungendo 50 ml di 2 NH 2 SO 4. </li><li> Leggere l&#39;assorbanza a 450 nm sottraendo sfondo a 650 nm. </li></ol>

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<li>Hawk, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NR4A+nuclear+receptors+support+memory+enhancement+by+histone+deacetylase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">NR4A nuclear receptors support memory enhancement by histone deacetylase inhibitors.</a> J. Clin. Invest. 122 (10), 3593-3602 (2012).</li>
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<li>Gill, S. C., von Hippel, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calculation+of+protein+extinction+coefficients+from+amino+acid+sequence+data%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Calculation of protein extinction coefficients from amino acid sequence data.</a> Anal. Biochem. 182 (2), 319-326 (1989).</li>
<li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Anal. Biochem. 150 (1), 76-85 (1985).</li>
<li>Zetterström, R. H., Williams, R., Perlmann, T., Olson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+expression+of+the+immediate+early+transcription+factors+Nurr1+and+NGFI-B+suggests+a+gene+regulatory+role+in+several+brain+regions+including+the+nigrostriatal+dopamine+system%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res.+Mol.+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Cellular expression of the immediate early transcription factors Nurr1 and NGFI-B suggests a gene regulatory role in several brain regions including the nigrostriatal dopamine system.</a> Brain Res. Mol. Brain Res. 41 (1-2), 111-120 (1996).</li>
<li>Xiao, Q., Castillo, S. O., Nikodem, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+messenger+RNAs+for+the+orphan+nuclear+receptors+Nurr1+and+Nur77+%28NGFI-B%29+in+adult+rat+brain+using+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Distribution of messenger RNAs for the orphan nuclear receptors Nurr1 and Nur77 (NGFI-B) in adult rat brain using in situ hybridization.</a> Neuroscience. 75 (1), 221-230 (1996).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il successo di questo protocollo si basa sulla disponibilità di proteine ​​pure per la caratterizzazione degli anticorpi sollevati contro un determinato membro della famiglia delle proteine ​​di interesse. Non vi è alcuna necessità di purificare gli anticorpi utilizzando proteina A / G finché non è chiaramente dimostrato che sussistono notevoli reazioni crociate di ELISA e Western blotting. Come indicato nel testo, è importante evitare che sospende la proteina (s) di essere reticolato alla c...

Il fattore di trascrizione Nurr1 e suoi omologhi (Nur77 e Nor1) appartengono al recettore nucleare sottofamiglia 4A (NR4A) 1. Essi sono anche i recettori orfani perché i loro ligandi endogeni non sono ancora identificati. Nurr1 è stato clonato nel 1992 e, anche se si sa essere espressa nel cervello 2, il suo ruolo essenziale per lo sviluppo e la manutenzione dei neuroni dopaminergici del mesencefalo è stato rivelato da studi sui topi knockout 3. Inoltre, il suo ruolo importante per il mantenimento dei neuroni dopaminergici del mesencefalo è stato recentemente dimostrato da uno studio KO condizionale 4. A causa di queste eleganti studi che dimostrano ruoli critici di Nurr1 per i neuroni dopaminergici del mesencefalo, molti studi successivi hanno in gran parte concentrati sul mesencefalo neuroni dopaminergici e malattia neurodegenerativa, la dopamina legati, il morbo di Parkinson (PD) 5. In particolare, Nurr1 è espresso non solo nelle dopamina mesencefalo (MDA) neuroni, ma anche in diaree cerebrali versetto 2, suggerendo che essa può avere ruoli funzionali in molti settori non-DA, che è fortemente supportati da studi più recenti mostrano che Nurr1 svolge un ruolo importante in varie funzioni cerebrali. Per alcuni esempi, è stato dimostrato che le attività di memoria che inducono come l&#39;apprendimento, o di altri compiti ippocampo-dipendente risultano in up-regolazione dell&#39;espressione Nurr1 nell&#39;ippocampo 6,7. Inoltre, abbattere di espressione Nurr1 nell&#39;ippocampo era sufficiente a ridurre la memoria a lungo termine e / o di plasticità sinaptica 8-11, fortemente suggerendo che Nurr1 svolge diversi ruoli in molte aree del cervello. Così, per capire meglio l&#39;espressione di cellule di tipo specifico e subcellulare di Nurr1, è auspicabile utilizzare anticorpi specifici Nurr1, che non presentano alcuna cross-reattività ai suoi omologhi Nur77 o Nor1. Questo documento descrive un protocollo di pre-adsorbimento per generare anticorpi specifici Nurr1 e presentare dati aggiuntivi che mostrano la sua specificità.

<table><tbody><tr><td>Dominio di legame del ligando purificato da Nurr1, Nor 1 e Nur77</td><td></td><td></td><td>Soluzione di stoccaggio della colonna</td></tr><tr><td>AminoLink Coupling Resin e kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>44890</td><td></td></tr><tr><td>Colonna di spin Protein A</td><td>Thermo Scientific</td><td>89978</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>96 pozzetti Piastre a fondo flate, flangia alta, 330 &mu; l</td><td>Thermo Scientific</td><td>3455</td><td></td></tr><tr><td>10% Siero di capra normale</td><td>KPL</td><td>50-675-69</td><td></td></tr><tr><td>Diluente di latte/ Concentrato bloccante&nbsp;</td><td>KPL</td><td>50-82-01</td><td></td></tr><tr><td>Tampone di eluizione IgG</td><td>Thermo Scientific</td><td>21004</td><td></td></tr><tr><td>Kit per il dosaggio delle proteine Micro BCA</td><td>Thermo Scientific</td><td>23235</td><td></td></tr><tr><td>Rafano Perossidasi coniugata di capra anti-coniglio IgG (H+L)</td><td>Thermo Scientific</td><td>31460</td><td></td></tr><tr><td>Resina Ni-NTA</td><td>Thermo Scientific</td><td>88221</td><td></td></tr><tr><td>3, 3', 5, 5' Tetrametilbenzidina</td><td>Thermo Scientific</td><td>34028</td><td></td></tr><tr><td>2N H2SO4</td><td>Macron Fine Chemicals</td><td>H381 05</td><td></td></tr><tr><td>Proteina A IgG Cuscinetto legante</td><td>Thermo Scientific</td><td>21001</td><td></td></tr><tr><td>IgG Elution Buffer</td><td>Thermo Scientific</td><td>21004</td><td></td></tr><tr><td>Colonna Soluzione</td><td></td><td></td> di conservazione <td>Fosfato tamponato Soluzione salina contenente azoturo di sodio allo 0,02%</td></tr><tr><td>Tubi per dialisi pretrattati Spectra/Por 7</td><td>Spectrum Labs</td><td>132128</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Colonne monouso</td><td>Thermo Scientific</td><td>29924</td><td></td></tr><tr><td>Tampone di accoppiamento AminoLink 0,1M</td><td></td><td></td><td>fosfato di sodio, 0,05% NaN3, pH 7,0</td></tr><tr><td>Tampone</td><td></td><td></td> di estinzione <td>1M Tris. HCI, 0,05% NaN3, pH 7,4</td></tr><tr><td>Soluzione</td><td></td><td></td> di lavaggio <td>1M NaCl, 0,05% NaN3</td></tr><tr><td>Tampone</td><td></td><td></td> bloccante ELISA <td>1% Siero di cavallo normale (NHS), 1% Siero di capra normale (NGS) in 1X diluente di latte KPL</td></tr><tr><td>Soluzione</td><td></td><td></td><td>di conservazione PBS pH 7,4 contenente 0,02% di azoturo di sodio</td></tr><tr><td>Micropipette: 10 &mu; l; 20 &mu; l; 200 &mu; l; 1000 &mu; </td><td></td><td></td><td></td>l</tr></tbody></table>

produzione di nurr-1 specifici anticorpi policlonali gratuito di cross-reattività contro i suoi omologhi, chiudi nor1 e nur77

Production of Nurr-1 Specific Polyclonal Antibodies Free of Cross-reactivity Against Its Close Homologs, Nor1 and Nur77

La sottofamiglia 4 del recettore nucleare (NR4A) è composta da 3 proteine correlate che condividono un dominio di legame del DNA (DBD) e un dominio di legame del ligando (LBD). La proteina 1 correlata al recettore nucleare (Nurr1 o NR4A2) svolge un ruolo chiave nel mantenimento del sistema dopaminergico. Le disfunzioni della dopamina associate al gene Nurr1 includono, tra le altre, il morbo di Parkinson, la schizofrenia e la depressione maniacale. Inoltre, prove recenti indicano che Nurr1 è espresso anche in altre aree cerebrali come l'ippocampo e svolge un ruolo fondamentale per l'apprendimento e la memoria. Gli altri membri della famiglia sono il fattore di crescita nervoso IB (Nur77 o NR4A1) e il recettore orfano 1 di derivazione neuronica (NOR1 o NR4A3). Per aiutare a studiare i precisi ruoli funzionali di Nurr1 nelle disfunzioni neuronali dopaminergiche e in altre regioni cerebrali, erano necessari anticorpi privi di reattività crociata contro Nur77 e NOR1. Poiché le proteine sono più divergenti nei loro LBD che nei loro domini di legame al DNA, l'immunizzazione con LBD purificati dovrebbe produrre anticorpi specifici per Nurr1 con reattività minime contro Nur77 e/o NOR1. Sebbene gli anticorpi anti-Nurr1 siano stati generati con successo, questi hanno mostrato una significativa immunoreattività contro gli altri membri della famiglia. La cromatografia di affinità su proteina A immobilizzata seguita da pre-adsorbimento contro LBD immobilizzati di Nur77 e NOR1 ha prodotto anticorpi specifici per Nurr1 privi di cross-reattività. Qui, indirizziamo selettivamente gli anticorpi contro un membro specifico di una famiglia di proteine altamente conservata, immunizzando gli animali con le loro regioni più divergenti, quindi rimuovendo gli anticorpi reattivi incrociati mediante pre-adsorbimento. L'obiettivo del protocollo è quello di aumentare la specificità degli anticorpi policlonali attraverso il pre-adsorbimento contro antigeni cross-reattivi.

Un confronto di proteine ​​una colonna purificato anticorpi specifici Nurr1 con proteina purificata a anticorpi anti-Nurr1 seguita da passaggio attraverso Nur77 LBD e Nor1 LBD colonne è mostrato in figura 1. Come si vede, proteina A-purificato anticorpi Nurr1 mostrato un forte legame di Nurr1 LBD. Tuttavia, ha anche mostrato significativo legame Nur77 LBD e Nor1 LBD. Quando gli anticorpi della proteina A-purificata Nurr1 sono stati ulteriormente purificati contro Nur77 LBD e Nor1 LBD, l&#39;affinità fin...

Qui, miriamo selettivamente agli anticorpi contro un membro specifico di una famiglia di proteine altamente conservata, immunizzando gli animali con le loro regioni più divergenti, seguiti dalla rimozione di anticorpi reattivi incrociati mediante pre-adsorbimento.

Produzione di Nurr-1 specifici anticorpi policlonali gratuito di cross-reattività contro i suoi omologhi, Chiudi Nor1 e Nur77

The nuclear receptor subfamily 4 (NR4A) is composed of 3 related proteins sharing a DNA binding domain (DBD) and a ligand-binding domain (LBD). The ...

L'obiettivo generale di questa procedura è aumentare la specificità degli anticorpi contro proteine strettamente correlate rimuovendo gli anticorpi cross-reattivi. Questo viene ottenuto innanzitutto identificando i domini proteici con la maggiore divergenza tra proteine omologhe. Il secondo passaggio consiste nell'esprimere e purificare questi domini proteici.In seguito, questi domini proteici vengono accoppiati tramite il terminale N o C a una matrice di cromatografia. In questa dimostrazione viene utilizzato Spheros. L'ultimo passaggio consiste nell'incubare il siero immune con resine accoppiate a ciascun dominio cross-reattivo.Infine, vengono eseguiti Eliza e il blotting di Western per valutare l'efficacia della procedura. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'uso di anticorpi monoclonali o la purificazione per affinità, è che possiamo mantenere l'affinità verso il bersaglio desiderato eliminando al contempo gli epitopi conosciuti per la reattività incrociata. Generalmente, le persone nuove a questo metodo incontrano difficoltà perché la proteina che stanno cercando di studiare è instabile.La dimostrazione di questa procedura sarà effettuata dal Dott. Uri Kim, ricercatore postdottorato del nostro laboratorio. Questo studio richiede due colonne, una per il recettore orfano derivato dai neuroni, noto come nor1, e l'altra per il fattore di crescita neuronale IB, noto come nor-77. Poiché lo stesso protocollo si applica ad entrambe le proteine, verrà illustrata soltanto la preparazione di una colonna.Scongelare la proteina da accoppiare alla resina su ghiaccio, quindi determinare la concentrazione proteica utilizzando il suo coefficiente di estinzione molare e l'assorbanza a 280 nanometri. Utilizzare due millilitri di resina per due milligrammi di proteina. Tutti i passaggi successivi si riferiscono a due millilitri di resina.In una colonna da 10 millilitri, preparare una colonna da 10 millilitri spingendo una FR sul fondo e facendo passare PBS a pH 7,4 attraverso di essa. Chiudere il fondo della colonna e aggiungere due millilitri di buffer di accoppiamento. Aggiungere quattro millilitri della sospensione nella colonna per ottenere due millilitri di resina.Rimuovere il tappo inferiore e lasciare scolare la colonna. Lavare la colonna con un totale di sei millilitri o tre volumi della resina del tampone di accoppiamento e lasciare scolare la colonna. Dopo lo svuotamento del tampone di accoppiamento, sostituire il tappo inferiore.Successivamente, aggiungere due a quattro millilitri di proteina sospesa nel buffer di accoppiamento alla colonna. Conservare un'aliquote della soluzione proteica per valutare l'efficienza di accoppiamento. In seguito, chiudere la colonna e mescolare ruotandola delicatamente da un'estremità all'altra.Per ottenere una soluzione omogenea, misurare il volume totale della reazione, tenendo conto del volume della resina, e aggiungere 10 microlitri di boroidruro di sodio 5 M per ogni millilitro di reazione. Chiudere la colonna e mescolare capovolgendola ripetutamente. Fissare la colonna su un agitatore rotante e lasciare proseguire la reazione per tutta la notte.A quattro gradi Celsius nella mattina seguente, portare la colonna nella cappa chimica e rimuovere con attenzione il tappo poiché potrebbe essersi formato del gas. Svuotare la colonna in un tubo pulito e conservare il filtrato. La concentrazione proteica dell'IIT verrà misurata e confrontata con la concentrazione proteica iniziale.Per valutare l'efficienza di accoppiamento, lavare la resina con quattro millilitri di buffer di accoppiamento e lasciare defluire la colonna. Una volta che il dominio di legame per il ligando, o LBD, è stato accoppiato alla resina, il passo successivo consiste nel bloccare i siti rimanenti. Per iniziare questa procedura, lavare la resina con quattro millilitri di buffer di quenching, far defluire e sostituire il tappo inferiore.Aggiungere due millilitri di tampone di arresto della reazione e sospendere la resina. Valutare il volume totale della reazione misurando il volume della resina e quello del tampone di arresto. Aggiungere 10 microlitri di boroidruro di sodio cinque molarità per ogni millilitro di volume di reazione.Mescolare delicatamente a temperatura ambiente per 30 minuti. Alla fine, portare la colonna nella cappa. Rimuovere con attenzione il tappo superiore, quindi rimuovere il tappo inferiore e lasciare defluire la colonna in un tubo per rifiuti.Lavare la colonna con cinque volumi di resina della soluzione di lavaggio. Monitorare i lavaggi per la presenza di proteine residue misurando l'assorbanza a 280 nanometri. Le proteine non legate vengono rimosse dalla concentrazione elevata di sale. Infine, lavare la resina con sei millilitri di PBS DGAs contenente lo 0,02% di azoturo di sodio, mantenendo la colonna a quattro gradi Celsius fino al momento dell'uso.Iniziare la procedura di purificazione degli anticorpi specifici contro la neuro uno lavando la colonna coniugata NORE 77 LBD con 10 millilitri di PBS e lasciando defluire la colonna. Chiudere il fondo della colonna e posizionare la colonna coniugata neuro 77 LBD drenata in un nuovo tubo da raccolta da 15 millilitri. Aggiungere 5 millilitri di proteina, ovvero anticorpi anti neuro uno purificati, alla colonna e chiuderla. Posizionare la colonna su un agitatore rotante a 4 gradi Celsius per un'ora.Successivamente, rimuovere i tappi superiore e inferiore e raccogliere il flusso iniziale. Mettere da parte il flusso iniziale su ghiaccio fino al momento in cui dovrà essere aggiunto al nor. Una colonna accoppiata LBD.Risciacquare la colonna accoppiata al nor-uno LBD con 10 millilitri di PBS e lasciare defluire il liquido; chiudere l'estremità inferiore della colonna e posizionare la colonna accoppiata al nor-uno LBD in un tubo di raccolta da 15 millilitri. Aggiungere il flusso passante dalla colonna accoppiata al north-77 LBD. Chiudere la colonna e posizionarla su un rotore a quattro gradi Celsius per un'ora.Dopo un'ora, rimuovere i tappi superiore e inferiore e raccogliere il flusso in uscita. Misurare la concentrazione dell'anticorpo misurando l'assorbanza a 280 nanometri.L'anticorpo anti nore uno purificato viene successivamente analizzato mediante Eliza. Aggiungere 100 microlitri di proteina nei pozzetti di una piastra a 96 pozzetti. Se si esegue il test con tre proteine diverse, aggiungere 100 microlitri di proteina uno nei pozzetti da A1 a H4, 100 microlitri di proteina due nei pozzetti da A5 a H8 e 100 microlitri di proteina tre nei pozzetti da A9 a H12.Coprire la piastra e incubare tutta la notte a quattro gradi Celsius fino alla mattina seguente. Lavare i pozzetti rivestiti due volte con 300 microlitri per pozzetto di PBS. Quindi aggiungere 300 microlitri di buffer bloccante Eliza in tutti i pozzetti rivestiti con antigene e incubare a temperatura ambiente per due ore.Dopo due ore di bloccaggio, sostituire il buffer di bloccaggio dell'ELIZA in ciascun pozzetto con 100 microlitri di buffer di bloccaggio fresco per l'ELIZA. Aggiungere 100 microlitri di anticorpo anti-EU uno purificato diluito in tutti i pozzetti della riga A e incubare a temperatura ambiente per un'ora dopo un'ora.Lavare la piastra tre volte con tween 20 0,05%. Dopo il terzo lavaggio, tamponare la piastra per rimuovere l’eccesso di soluzione di lavaggio. Aggiungere 100 microlitri di perossidasi di ravanello, coniugata con anticorpo caprino anti-rabbia IgG, diluita nel buffer bloccante Eliza, in ogni pozzetto e incubare a temperatura ambiente per un’ora. Dopo un’ora, lavare la piastra tre volte con tween 20 0,05% come indicato in precedenza, dopo il terzo lavaggio.Risciacquare tutte le pozzette riempiendole con 300 microlitri di acqua deionizzata, rimuovere l'eccesso di acqua capovolgendo la piastra su carta assorbente. Aggiungere 100 microlitri di tetraetilbenzidina tre tre primi, cinque, cinque primi a tutte le pozzette, portare a temperatura ambiente e incubare per 15-30 minuti al buio a temperatura ambiente. Arrestare la reazione aggiungendo 50 microlitri di acido solforico 2 N a ciascuna pozzetta.Infine, leggere l'assorbanza a 450 nanometri. Sottrarre il valore di fondo a 650 nanometri per un confronto delle proteine. Un confronto di proteine purificate senza anticorpi specifici.Un anticorpo purificato anti-Noro uno, dopo essere stato fatto passare attraverso colonne di LBD no 77 e LBD no uno, ha mostrato che, sebbene l'anticorpo anti-no uno purificato con proteina A abbia mostrato un forte legame con LBD no uno, ha inoltre evidenziato un legame significativo con LBD no 77 e con LBD no uno. Un'ulteriore purificazione dell'anti-no uno contro LBD no 77 e LBD no uno ha completamente eliminato questa reattività incrociata. Questa specificità è stata ulteriormente dimostrata mediante analisi Western blot di estratti da cellule trasfettate con vettori di espressione contenenti nor uno, nor uno e nor 77 marcati con Mick. Gli anticorpi anti-Mick hanno rivelato che ciascuna proteina full-length era espressa al proprio peso molecolare atteso. L'anticorpo anti-nor uno purificato con proteina A ha rilevato in modo robusto la proteina full-length nor uno, ma ha rilevato anche nor uno e nor 77, sebbene con minore efficienza.Al contrario, l'anticorpo purificato completamente contro nor uno non ha mostrato alcuna reattività incrociata rilevabile verso nor uno e nor 77. L'analisi immunohistochimica dei neuroni dopaminergici del mesencefalo con l'anticorpo purificato completamente contro nor uno ha confermato l'espressione marcata di nor uno. L'immunohistochimica utilizzando l'idrossilasi della tirosina ha inoltre rivelato che neuro uno è espressa esclusivamente nel nucleo dei neuroni dopaminergici del mesencefalo nell'area della sostanza nera. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in due giorni se effettuata correttamente. Non dimenticare che lavorare con idruro di sodio può essere estremamente pericoloso e precauzioni come operare in una cappa chimica devono essere sempre adottate durante l'esecuzione di questa procedura.

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Questo video mostra una procedura per la produzione di anticorpi ricombinanti contro la metallopeptidasi. I plasmidi ricombinanti che trasportano i geni per l'anticorpo, la proteina fluorescente verde e la resistenza agli antibiotici vengono trasfettati in cellule epiteliali con lipofectamina. Le cellule trasfettate vengono selezionate e coltivate per generare anticorpi ricombinanti.

Un metodo per produrre anticorpi ricombinanti contro la metallopeptidasi

Nel corso degli ultimi anni, saggi cellulari vivi sono stati utilizzati con successo per rilevare gli anticorpi contro gli antigeni di superficie e conformazionale. Qui, descriviamo un metodo con elevate throughput citometria consentire l'analisi di grandi coorti di pazienti. Individuazione di anticorpi romanzo migliorare la diagnosi e il trattamento di disturbi immuno-mediata.

High-throughput Citometria a Flusso test cellulare per individuare gli anticorpi per N-metil-D-aspartato Receptor o dopamina-2 recettore nel siero umano

Qui, descriviamo un metodo per esprimere e purificare norovirus di alta qualità sporgenti (P) domini in E. coli per l'utilizzo in studi di cristallografia a raggi X. Questo metodo può essere applicato ad altri domini calicivirus P, così come le proteine ​​non-strutturali, cioè., Proteina virale genoma-linked (VPG), proteasi, e RNA RNA dipendente polimerasi (RdRp).

Produzione di Norovirus umani sporgenti Domini in<em&gt; E. coli</em&gt; Per la cristallografia a raggi X

Qui, gli autori presentano un protocollo semplice ed efficiente per definire un epitopo antigenico lineare utilizzando un anticorpo monoclonale purificato e la scansione dei peptidi attraverso l'ibridazione dot-blot. L'epitopo identificato può quindi essere utilizzato in applicazioni terapeutiche e diagnostiche.

Identificazione di un Epitopo Lineare B-cell monoclonale riconosciuto Peptide scansione-assistito

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Generazione di anticorpi monoclonali umani discriminante da rari B antigene-specifiche cellule circolanti nel sangue

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Un semplice Cell-based immunofluorescenza per rilevare autoanticorpi contro il recettore N-metil-D-aspartato (NMDA) nel sangue

Questo articolo fornisce un protocollo dettagliato per la preparazione e la valutazione degli anticorpi monoclonali contro prodotti naturali per l'utilizzo in vari test immunologici. Questa procedura comprende l'immunizzazione, la fusione cellulare, ELISA competitiva indiretto per clone positivo di screening e preparazione di ibridoma monoclonale. A vostra disposizione anche le specifiche per la caratterizzazione dell'anticorpo usando MALDI-TOF-MS e le analisi di ELISA.

Generazione di anticorpi monoclonali contro prodotti naturali

Qui presentiamo un metodo di cytometry di flusso basato su cellulare per rilevare anticorpi neutralizzanti o altri fattori che interferiscono con l'assorbimento cellulare di terapie sostitutive enzima in una matrice umana, come un liquido spinale cerebrale (CSF) o siero umano.

Rilevazione degli anticorpi che neutralizzano l'assorbimento cellulare di terapie di sostituzione enzimatica con un'analisi Cell-based

La proteina anticorpale ricombinante espressa nelle cellule pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO e negli anticorpi monoclonali prodotti utilizzando la tecnologia tradizionale dell'ibridoma possono riconoscere e legarsi alla proteina N dell'aminopeptidasi suina (APN).

Produzione di anticorpi monoclonali contro l'aminopeptidasi N nell'epitelio della mucosa intestinale suina

Misurazione della coppia di imbardata Drosophila legato con il misuratore di coppia consente il controllo squisito neuroscienziato della situazione stimolo degli animali sperimentali. Insieme con gli strumenti genetico unico disponibile nel moscerino della frutta, questo paradigma è utilizzato per una vasta gamma di ricerca neurobiologica.

L&#39;apprendimento della Drosophila operante presso il misuratore di coppia

Impara a produrre anticorpi policlonali Nurr-1 specifici senza cross-reattività contro Nor1 e Nur77. Questo metodo di immunologia rimuove anticorpi cross-reattivi usando domini proteici divergenti e cromatografia.

Produzione di Nurr-1 specifici anticorpi policlonali gratuito di cross-reattività contro i suoi omologhi, Chiudi Nor1 e Nur77

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