Isolamento e colture primarie di cellule di topo aortica endoteliali

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di utilizzare un metodo semplice per isolare ed espandere le cellule endoteliali dall'aorta del topo senza l'uso di attrezzature speciali. Altri metodi utilizzati per isolare le cellule endoteliali sono per lo più applicati al cuore o al polmone, non all'aorta. Questa tecnica per l'aorta fornisce una resa considerevolmente più elevata, un'elevata vitalità cellulare e non richiede attrezzature o tecniche speciali.

Mentre questi si applicano allo studio delle cellule endoteliali primarie provenienti da topi knockout o murini provengono dalla maggior parte dei modelli di malattia. Questo protocollo è molto utile e facile da praticare. Avvia questo protocollo all'inizio della giornata.

Dopo aver anestetizzato un topo e aver confermato la mancanza di riflessi, posizionare il topo supino su un cuscinetto chirurgico e posizionare una lampada riscaldante su di esso per mantenere la sua temperatura corporea. Quindi igienizzare l'addome spruzzandolo con etanolo al 70%. Successivamente, con le forbici da dissezione, aprire l'addome lungo la linea mediana per esporre l'aorta addominale.

Quindi, apri la cavità toracica per esporre il cuore e i polmoni. Ora, rilascia il sangue dal topo sezionandolo lungo la linea centrale dell'aorta. Quindi, nel ventricolo sinistro, iniettare 1000 unità di eparina e un millilitro di PBS, perfondendo così l'aorta.

Dopo la perfusione, spingere da parte gli organi che ostacolano, rimuovere rapidamente l'aorta toracica e trasferirla in PBS ghiacciato. Sotto una cappa a flusso d'aria laminare, sciacquare delicatamente l'aorta con PBS ghiacciato per rimuovere il sangue residuo utilizzando un ago e una siringa calibro 25. Quindi, utilizzando una pinza per microdissezione, rimuovere il più possibile il tessuto adiposo attaccato e i vasi laterali.

Il tempo che intercorre tra l'arresto cardiaco e la semina del segmento aortico sulla matrice è fondamentale per la vitalità dell'endotelio. Quindi, rimuovendo il tessuto adiposo periarterioso e il tessuto connettivo, evitando di allungare l'aorta, e limitare anche il tempo dedicato a questo passaggio. Al massimo, 15 minuti.

Quindi, trasferire l'aorta pulita nel mezzo di crescita endoteliale e tagliare l'aorta in anelli di un millimetro con un bisturi. Un'aorta produce fino a 10 anelli. Quindi, aprire ogni anello con le forbici per microdissezione.

Per iniziare, metti una piastra a sei pozzetti sul ghiaccio e ricoprila con un millilitro di soluzione di matrice senza versare bolle d'aria. Quindi, trasferire la piastra in un'incubatrice per 20 minuti in modo che la matrice si solidifichi. Una volta solidificati, i pezzi dell'aorta possono essere posizionati sulla matrice, con il lume rivolto verso il basso.

Fallo senza toccare l'endotelio. Posizionare tre o quattro segmenti in ogni pozzetto. Quindi, versa quanto basta sul terreno di coltura sui segmenti per mantenerli bagnati.

Successivamente, trasferiscili in un incubatore con il 5% di anidride carbonica per circa quattro-sei ore. Alla fine della giornata, aggiungi altro terreno in modo che i segmenti siano coperti. Nei prossimi giorni, i segmenti aortici germoglieranno periodicamente.

Monitorare quotidianamente la germinazione mediante microscopia a contrasto di fase. Regolare contemporaneamente il livello del medio. Il quarto giorno, rimuovere con cura il terreno e rimuovere delicatamente i segmenti aortici.

Non disturbare le cellule che crescono sulla matrice. Quindi, aggiungere due millilitri di terreno fresco alle cellule endoteliali sulla matrice e continuare la coltura per due o tre giorni. Il momento in cui rimuovere i segmenti aortici dalla matrice è fondamentale per la purezza delle cellule endoteliali.

Il segmento deve essere rimosso prima dello sviluppo della rete di tubi, altrimenti le cellule saranno contaminate da fibroblasti o cellule muscolari lisce. Per iniziare, prepara un pallone T12.5 con lo 0.1% di gelatina e incubalo per 30 minuti. Successivamente, lavare accuratamente le piastre della matrice con PBS riscaldato, quindi aggiungere 100 unità di proteasi neutra a ciascun pozzetto e incubare le piastre a temperatura ambiente su una piattaforma a bilanciere agitando occasionalmente.

Quando le cellule appaiono staccate sotto contrasto di fase, aggiungere due millilitri di d-Val a ciascun pozzetto per terminare la reazione. Esaminare i pozzetti, quindi raccogliere i surnatanti in una provetta da 15 millilitri. Quindi, centrifugare la provetta a 900 gs per cinque minuti e risospendere il pellet di celle in quattro millilitri di terreno.

Immergere la sospensione nel pallone preparato e incubare le cellule per due ore. Quindi, sostituire il terreno e continuare l'incubazione per tre o quattro giorni fino a quando le cellule non sono confluenti all'85-90%. Quando le celle sono pronte, preparare altri due palloni T12.5 per far passare le celle come prima.

Quindi, lavare le cellule con PBS riscaldato e utilizzare circa mezzo millilitro di tripsina-EDTA per staccarne la maggior parte entro un minuto dall'incubazione. Quindi, termina questa reazione con due millilitri di terreno. Ora, far passare la sospensione attraverso una pipetta più volte e trasferirla in una provetta da 15 millilitri.

Quindi, centrifugare le celle a 900 g per cinque minuti e risospendere il pellet in quattro millilitri di terreno. Quindi, dividere la sospensione tra i due matracci preparati e lasciarli incubare per due ore. Quindi, sostituisci il terreno e continua a far crescere le cellule fino alla confluenza come prima.

Dopo due o tre di questi passaggi, caratterizzare le cellule. Utilizzando il protocollo descritto, è stata osservata la germinazione spontanea delle cellule endoteliali per i segmenti di aorta di topo dopo due giorni di coltura. Dopo quattro giorni, numerose cellule endoteliali sono migrate lontano dal segmento e i germogli di nuova formazione hanno continuato a estendersi dal segmento e dal ramo.

Dopo aver coltivato queste cellule e averle fatte passare una volta, le cellule avevano una forma di fuso e un aspetto simile a un ciottolo. Le cellule attaccate sono state quindi marcate con Dil-ac-LDL e Ulex Lectina per un'ora. Anche i nuclei sono stati colorati.

La maggior parte delle cellule era doppiamente positiva per l'assorbimento di Dil-ac-LDL e il legame con Ulex. Dopo il secondo passaggio, oltre il 95% delle cellule era positivo per la molecola di adesione delle cellule endoteliali piastriniche uno. Le cellule erano positive anche per VEGFR2, VE-caderina ed eNOS.

Inoltre, le cellule erano per lo più negative per il marcatore della muscolatura liscia calpoina. Questo protocollo offre una grande opportunità per studiare le attività endoteliali specifiche di molecole bersaglio e può essere eseguito in modelli murini knockout e transgenici, rendendolo molto utile nel campo della ricerca cardiovascolare.