Name: Isolatie en Primaire Cultuur van de muis endotheelcellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 20 s
Description: Leer een eenvoudige methode om endotheelcellen te isoleren uit de muis aorta zonder speciale apparatuur. Dit protocol levert hoge celviabiliteit en is ideaal voor cardiovasculair onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Deze studie wordt ondersteund door de American Heart Association Scientist Development Grant 13SDG16930098 en de National Science Foundation of China Youth Award 81300240 (PI: Wang). We danken Roberto Mendez van Wayne State University voor de hulp bij het voorbereiden van het manuscript.

1. Isolatie van Aorta van Muizen Al de hier beschreven procedures werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite van Wayne State University. <ol><li> Zet de muis in de inductie kamer van het anesthesieapparaat. Stel de isofluraan stroom naar 4% samen met 25% verse lucht en 75% O2. Verdoven van de muis door inademing van isofluraan (4% voor inductie, ± 1,0% voor het onderhoud) in combinatie met 25% lucht fris en 75% O 2 via inductie kamer, gevolgd door een speciale neuskegel. LET OP: anesthesie met isofluraan kan worden geleverd in 75% zuurstof / 25% lucht of in 100% zuurstof. </li><li> Controleer de muis om de 5 min tot het juiste niveau van de anesthesie wordt bereikt (gebrek aan terugtrekking tot teen knijpen). </li><li> Neem de muis uit de inductie kamer en blijven isofluraan inhalatie echter de speciale neuskegel die is aangesloten op het anesthesieapparaat. Schakel deisofluraan stroom naar 1% anesthesie te handhaven. </li><li> Hoewel het onder narcose, zet de muis op een operatie pad, gepositioneerd op zijn rug. Gebruik laboratorium tape om de ledematen te beveiligen. </li><li> Gebruik een warmtelamp om de muis te warm te houden. Houd de lamp in een redelijke afstand van de muis, zodat de muis zal niet oververhitting. </li><li> Spray de borst met 70% ethanol. </li><li> Gebruik dissectie schaar om de buik te openen vanaf de middellijn, en bloot de abdominale aorta. Open de borstholte bloot en het hart en de longen. </li><li> Snijd de aorta abdominalis in het midden met dissectie schaar om het bloed vrij. </li><li> Vul een 1 ml spuit (25 G naald) met 1 ml PBS dat 1000 U / ml heparine. Injecteer PBS dat 1000 U / ml heparine aan de linkerventrikel en de aorta perfuseren. Duw het hart en de longen met een pincet in de grote slagaders naar de rechterkant van de muizen om de thoracale aorta bloot. </li><li> Snel verwijderen van de thoracale aorta met behulp van micro-dissection tang en zet het in ijskoud 1x PBS (steriele), dan is de container te vervoeren in een laminaire luchtstroom kap. </li><li> Plaats een 1 ml injectiespuit voorzien van 25 G naald in een uiteinde van de aorta, en voorzichtig spoel de aorta met ijskoude PBS om het bloed te verwijderen. </li><li> Gebruik micro-dissectie tang om zoveel mogelijk van de bijgevoegde vetweefsel en kleine zijdelingse vaartuigen af ​​mogelijk. </li><li> Onmiddellijk over de aorta endotheel groeimedium. </li><li> Snijd de aorta tot 1 mm ringen met een steriele scalpel. Harvest ongeveer 8 - 10 ringen per aorta. </li><li> Open elke ring aorta met een paar micro-dissectie schaar. </li></ol> 2. Zaad van de Aorta segmenten op Matrix <ol><li> Wanneer niet in gebruik, houdt de groeifactor gereduceerde matrix -20 ° C om stolling te voorkomen. Zet de groeifactor gereduceerde matrix 4 ° C ten minste gedurende de nacht volledig ontdooien toe. </li><li> Voorkoelen een 6-wells plaat en pipetpunten tot -20 ° C gedurende ten minste10 minuten. Zet de 6-wells plaat op het ijs en de vacht een putje van de plaat met 1 ml matrix zonder dat er eventuele luchtbellen. Plaats de plaat in een 37 ° C incubator gedurende 20 minuten om de matrix te stollen. </li><li> Implanteer de aorta stukken op de gestolde matrix steriele micro-dissectie pincet. Leg de stukken lumen-side-down op de matrix zonder het aanraken van het endotheel. Place 3-4 aorta segmenten dicht bij elkaar op de matrix. </li><li> Voeg net genoeg endotheliale celgroei medium aan segmenten natte (~ 200 pi) te houden. </li><li> Incubeer de plaat bij 37 ° C onder 5% CO2 gedurende 4 tot 6 uur. Aan het eind van de dag precies zoveel medium om de aorta segmenten bestrijken. </li><li> Houd u aan de aorta-segment kiemen periodiek onder een fasecontrastmicroscoop. Controleer gemiddeld niveau en de celgroei elke dag. medium toe te voegen indien nodig aorta segmenten bedekt te houden. </li><li> Op de 4e dag, verwijder voorzichtig de medium en verwijder de aorta segmenten from de matrix met behulp van een steriele naald zonder onderbreking van de groeiende endotheelcellen. </li><li> Voeg 2 ml van nieuwe endotheliale celgroei medium en laat de endotheelcellen blijven prolifereren op matrijs van 2 - 3 dagen. </li></ol> 3. Eerste Passage van de muis endotheelcellen <ol><li> Coat nieuw T12.5 kolf met gelatine (0,1%), incuberen bij 37 ° C gedurende 30 minuten. </li><li> Was de platen matrix zorgvuldig met steriel 37 ° C PBS. </li><li> Voeg 2 ml neutraal protease (50 U / ml) aan de matrix platen en incubeer bij kamertemperatuur op platform rocker met af en toe schudden. Controleer de cellen onder een fase-contrast microscoop om ervoor te zorgen dat de meerderheid van de cellen worden losgemaakt. </li><li> Voeg 2 ml D-Val de neutrale protease te inactiveren. </li><li> Verzamel de bovenstaande vloeistof voorzichtig in een 15 ml centrifugebuis. Was de plaat met 2 ml D-Val en het verzamelen van de bovenstaande vloeistof. </li><li> Centrifugeer de celsuspensie bij 900 xg gedurende 5 minuten bij room temperatuur. </li><li> Resuspendeer de celpellet in 4 ml van endotheliale celgroei medium en plaat het T12.5 kolf bekleed met gelatine. Incubeer de cellen bij 37 ° C, 5% CO2 gedurende 2 uur. </li><li> Vervang het medium. Incubeer de cellen bij 37 ° C, 5% CO2 totdat ze 85% - 90% confluent. </li></ol> 4. Passage van de muis endotheelcellen <ol><li> Laag twee nieuwe T12.5 flessen met gelatine (0,1%), incuberen bij 37 ° C gedurende 30 minuten. Voorverwarmen trypsine-EDTA (0,25% trypsine, 0,02 EDTA in PBS) en steriel PBS bij 37 ° C gedurende ongeveer 15 minuten. </li><li> Was de cellen voorzichtig met steriel 37 ° C PBS. </li><li> Voeg 0,5 ml trypsine-EDTA (0,25% trypsine, 0,02 EDTA in PBS) en incubeer bij 37 ° C gedurende ~ 1 minuut of totdat de meeste cellen ronddraaien. </li><li> Voeg 2 ml van endotheliale celgroei medium om de destructie te stoppen. Pipet de celsuspensie op en neer binnen de kolf meerdere malen. Gebruik indien nodig een celschraper om de cellen te verzamelen. </li><li> Verzamel de celsuspensie in een 15 ml centrifugebuis. Centrifugeer de celsuspensie bij 900 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Resuspendeer de celpellet in 4 ml van endotheliale celgroei medium en plaat 2 T12.5 flessen bekleed met gelatine. Incubeer de cellen bij 37 ° C, 5% CO2 gedurende 2 uur. </li><li> Vervang het medium. Incubeer de cellen bij 37 ° C, 5% CO2 totdat ze 85% - 90% confluent. </li><li> Gebruik de muis endotheelcellen na 2-3 passages. </li></ol> 5. Analyse van de muis endotheelcellen <ol><li> Re-bord van de cellen. <ol><li> Coat een 6-wells plaat met gelatine (0,1%), incuberen bij 37 ° C gedurende 30 minuten. Spoel de plaat met PBS. </li><li> Verwarm de trypsine-EDTA en steriele PBS tot 37 ° C gedurende ongeveer 15 minuten. </li><li> Was de cellen met steriel PBS 3 keer. Voeg 0,5 ml trypsine / EDTA aan de cellen geïncubeerd ~ 1 min bij 37 ° C or totdat het merendeel van de cellen ronddraaien. </li><li> Voeg 2 ml van endotheliale celgroei medium om de destructie te stoppen. Pipet de celsuspensie op en neer binnen de kolf meerdere malen. Indien nodig een celschraper om de cellen te verzamelen. </li><li> Verzamel de celsuspensie in een 15 ml centrifugebuis. Centrifugeer de celsuspensie bij 900 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Verwijder het supernatant, resuspendeer de cellen in endotheliale celgroei medium. Zaad de cellen in 6-well plaat gecoat met gelatine aan de dichtheid van 3 x 10 5 / putje. </li><li> Incubeer de cellen overnacht bij 37 ° C, 5% CO2 om de cellen te hechten aan het kweekoppervlak. </li></ol></li><li> Dil-ac-LDL uptaken en Ulex -lectin bindend. <ol><li> Bewaar de 1,1&#39;-dioctadecyl-3,3,3 &#39;, 3&#39;-tetramethylindo carbocyanine-perchloraat gelabelde geacetyleerde LDL (Dil-Ac-LDL) bij -20 ° C. Voordat kleuring, ontdooien Dil-ac-LDL op ijs. De voorraad Dil-ac-LDL solutie is 1 mg / ml. Bewaar de FITC-gelabelde Ulex europaeus agglutinine (Ulex -Lectin, 1 ug / ml) bij 4 ° C. De voorraad Ulex -Lectin oplossing is 1 mg / ml. WINKEL Hoechst 33342 bij 4 ° C. De voorraad Hoechst 33342 oplossing is 100 ug / ml. </li><li> Voeg 10 ul van Dil-Ac-LDL stockoplossing aan 1 ml kweekmedium tot een uiteindelijke concentratie van 10 ug / ml te maken. </li><li> Voorafgaand aan kleuring, verwijder de oude medium en was de cellen in elk putje met een nieuw medium. </li><li> Haal het nieuwe medium en voeg de Dil-ac-LDL kleuring medium. </li><li> Incubeer de cellen bij 37 ° C, 5% CO2 gedurende 1 uur. </li><li> Was de cellen met steriel 1x PBS 3 keer. </li><li> Voeg 1 ml 10% formaline om de cellen te repareren. Plaats de plaat kamertemperatuur gedurende ongeveer 30 min. </li><li> Was de cellen met steriel 1x PBS 3 keer. Vermijd licht. </li><li> Voeg 1 mL steriel 1x PBS dat 10 pi van Ulex -Lectin bevat. </li><li> Incubeer de cellen bij kamertemperatuur temperatuopnieuw in het donker gedurende 1 uur. </li><li> Verwijder de Ulex-lectine door de cellen te wassen met steriele PBS 1x 3 keer. </li><li> Voeg Hoechst 33342 tot een eindconcentratie van 1 ug / ml, incubeer 10 minuten in het donker. </li><li> Bekijk de fluorescentie van Dil-Ac-LDL (rood, excitatiegolflengte van 576 nm), Ulex -Lectin (groen, excitatiegolflengte van 519 nm) en Hoechst (blauw excitatie golflengte van 361 nm) met een omgekeerde fluorescentiemicroscoop. </li></ol></li><li> Fluorescerende kleuring voor CD31, VEGFR2, eNOS, VE cadherine en calponine. <ol><li> WINKEL FITC-geconjugeerd anti-muis CD31 antilichaam, eNOS antilichaam, VE-cadherine antilichaam FITC-geconjugeerd anti-konijnen IgG bij 4 ° C in het donker. WINKEL VEGFR2 antilichaam bij -20 ° C. </li><li> Was de cellen met steriel 1x PBS 3 keer. </li><li> Voeg 1 ml 10% formaline om de cellen te repareren. Plaats de plaat kamertemperatuur gedurende ongeveer 30 min. </li><li> Was de cellen met steriel 1x PBS 3 keer. </li><li> Om CD31 vlekken, voeg 1 ml steriel 1xPBS dat 10 pl CD31-FITC antilichaam bevat. Om vlekken hetzij VEGFR2, eNOS, VE-cadherine of calponine, voeg 1 ml steriel 1x PBS dat 4 pl VEGFR2, eNOS bevat, VE-cadherine of calponine primaire antilichaam, respectievelijk. </li><li> Incubeer de cellen op ijs gedurende 1 h in het donker. </li><li> Verwijder de antilichamen door de cellen te wassen met steriele PBS 3 keer. </li><li> Voor de kleuring van VEGFR2, eNOS, VE-cadherine of calponine, voeg 1 ml steriel PBS dat 1 x 10 pl FITC-geconjugeerd anti-konijn-IgG bevat. Incubeer de cellen op ijs gedurende 1 h in het donker. Verwijder de IgG door de cellen te wassen met steriele PBS 3 keer. </li><li> Voeg Hoechst 33342 tot een eindconcentratie van 1 ug / ml, incubeer 10 minuten in het donker. </li><li> Bekijk de fluorescentie van CD31, VEGFR2, eNOS, VE-cadherine calponine (groen, excitatie golflengte van 518-535 nm) en Hoechst (blauw, excitatie golflengte van 361 nm) met een omgekeerde fluorescentiemicroscoop. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Simionescu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implications+of+early+structural-functional+changes+in+the+endothelium+for+vascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+thrombosis%2C+and+vascular+biology%22%5BJournal%5D)">Implications of early structural-functional changes in the endothelium for vascular disease.</a> Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 27, 266-274 (2007).</li>
<li>Cid, M. C., Segarra, M., Garcia-Martinez, A., Hernandez-Rodriguez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cells%2C+antineutrophil+cytoplasmic+antibodies%2C+and+cytokines+in+the+pathogenesis+of+systemic+vasculitis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+rheumatology+reports%22%5BJournal%5D)">Endothelial cells, antineutrophil cytoplasmic antibodies, and cytokines in the pathogenesis of systemic vasculitis.</a> Current rheumatology reports. 6, 184-194 (2004).</li>
<li>Wang, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C-Reactive+protein-induced+endothelial+microparticle+generation+in+HUVECs+is+related+to+BH4-dependent+NO+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+vascular+research%22%5BJournal%5D)">C-Reactive protein-induced endothelial microparticle generation in HUVECs is related to BH4-dependent NO formation.</a> Journal of vascular research. 44, 241-248 (2007).</li>
<li>Wang, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+circulating+CD31%2B%2FCD42-+microparticles+are+associated+with+impaired+systemic+artery+elasticity+in+healthy+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+hypertension%22%5BJournal%5D)">Increased circulating CD31+/CD42- microparticles are associated with impaired systemic artery elasticity in healthy subjects.</a> American journal of hypertension. 20, 957-964 (2007).</li>
<li>Mackay, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterisation+of+human+pulmonary+microvascular+endothelial+cells+from+patients+with+severe+emphysema%5BTitle%5D)+AND+%22Respiratory+research%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterisation of human pulmonary microvascular endothelial cells from patients with severe emphysema.</a> Respiratory research. 14, 23(2013).</li>
<li>Marelli-Berg, F. M., Peek, E., Lidington, E. A., Stauss, H. J., Lechler, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+endothelial+cells+from+murine+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunological+methods%22%5BJournal%5D)">Isolation of endothelial cells from murine tissue.</a> Journal of immunological methods. 244, 205-215 (2000).</li>
<li>Bowden, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+alpha4+integrin+and+VCAM-1+in+CD18-independent+neutrophil+migration+across+mouse+cardiac+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+research%22%5BJournal%5D)">Role of alpha4 integrin and VCAM-1 in CD18-independent neutrophil migration across mouse cardiac endothelium.</a> Circulation research. 90, 562-569 (2002).</li>
<li>Lu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palmitate+induces+apoptosis+in+mouse+aortic+endothelial+cells+and+endothelial+dysfunction+in+mice+fed+high-calorie+and+high-cholesterol+diets%5BTitle%5D)+AND+%22Life+sciences%22%5BJournal%5D)">Palmitate induces apoptosis in mouse aortic endothelial cells and endothelial dysfunction in mice fed high-calorie and high-cholesterol diets.</a> Life sciences. 92, 1165-1173 (2013).</li>
<li>Atkins, G. B., Jain, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+differentiation%3A+molecular+mechanisms+of+specification+and+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+thrombosis%2C+and+vascular+biology%22%5BJournal%5D)">Endothelial differentiation: molecular mechanisms of specification and heterogeneity.</a> Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 31, 1476-1484 (2011).</li>
<li>Aitsebaomo, J., Portbury, A. L., Schisler, J. C., Patterson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brothers+and+sisters%3A+molecular+insights+into+arterial-venous+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+research%22%5BJournal%5D)">Brothers and sisters: molecular insights into arterial-venous heterogeneity.</a> Circulation research. 108, 929-939 (2008).</li>
<li>Shimamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drugs+and+foods+on+contraction+of+endothelial+cells+as+a+key+mechanism+in+atherogenesis+and+treatment+of+atherosclerosis+with+endothelial-cell+relaxants+%28cyclic+AMP+phosphodiesterase+inhibitors%29%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+experimental+medicine+and+biology%22%5BJournal%5D)">Drugs and foods on contraction of endothelial cells as a key mechanism in atherogenesis and treatment of atherosclerosis with endothelial-cell relaxants (cyclic AMP phosphodiesterase inhibitors).</a> Advances in experimental medicine and biology. 60, 77-105 (1975).</li>
<li>Chiu, J. J., Chien, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+disturbed+flow+on+vascular+endothelium%3A+pathophysiological+basis+and+clinical+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+reviews%22%5BJournal%5D)">Effects of disturbed flow on vascular endothelium: pathophysiological basis and clinical perspectives.</a> Physiological reviews. 91, 327-387 (2011).</li>
<li>Gimbrone, M. A. Jr, Topper, J. N., Nagel, T., Anderson, K. R., Garcia-Cardena, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+dysfunction%2C+hemodynamic+forces%2C+and+atherogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Endothelial dysfunction, hemodynamic forces, and atherogenesis.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 902, 239-240 (2000).</li>
<li>Rostgaard, J., Qvortrup, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopic+demonstrations+of+filamentous+molecular+sieve+plugs+in+capillary+fenestrae%5BTitle%5D)+AND+%22Microvascular+research%22%5BJournal%5D)">Electron microscopic demonstrations of filamentous molecular sieve plugs in capillary fenestrae.</a> Microvascular research. 53, 1-13 (1997).</li>
<li>Brutsaert, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+endothelial-myocardial+signaling%3A+its+role+in+cardiac+growth%2C+contractile+performance%2C+and+rhythmicity%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+reviews%22%5BJournal%5D)">Cardiac endothelial-myocardial signaling: its role in cardiac growth, contractile performance, and rhythmicity.</a> Physiological reviews. 83, 59-115 (2003).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Deze studie toont een eenvoudige methode om te isoleren en cultuur endotheliale cellen van een muis aorta zonder speciale apparatuur. De immunofluorescentie kleuring gaf aan dat de meerderheid van de cellen endotheliale cellen na de tweede doorgang. Er wordt gesuggereerd dat cellen in tweede tot derde doorgang geschikt voor in vitro en in vivo experimenten endothele studie biologie. De Key Notes from the Present Protocol Er zijn...

Het vasculaire endotheel is niet alleen een barrièrelaag die bloed en weefsel scheidt, wordt het beschouwd als een grote endocriene klier die zich uitstrekt over de gehele vaatstelsel met een oppervlakte van 400 vierkante meter 1. Het welzijn van het endotheel essentieel vasculaire homeostase. Disfunctionele endotheel participeert in diverse cardiovasculaire aandoeningen, zoals atherosclerose, vasculitis en ischemie / reperfusie letsel, etc. 2-4. Tot op heden worden de specifieke cellulaire en moleculaire mechanismen die betrokken zijn bij deze ziekte instellingen niet goed begrepen als gevolg van de diffuse anatomische aard van het endotheel. De muis is een belangrijk model voor het onderzoek, omdat genetische manipulatie technieken zijn meer ontwikkeld in muizen dan in elke andere zoogdiersoorten. Echter de isolatie van primaire muis endotheelcellen als bijzonder moeilijk omdat de geringe omvang van de aorta maakt enzymatic vertering van endotheel onpraktisch. Verklaarden sommige procedures voor het isoleren en zuiveren EC vereist 5-7. Het doel van dit protocol is een eenvoudige methode te isoleren en te expanderen endotheliale cellen van de muis aorta zonder speciale apparatuur. In dit protocol wordt de vers geïsoleerde aorta in kleine segmenten en gezaaid op een matrijs met het endothelium naar beneden om voor endotheliale kiemen. Na segmenten worden verwijderd, worden endotheelcellen uitgebreid in-endotheel voorkeur medium en zijn klaar voor experimenten na twee of drie passages. De voordelen van de beschreven werkwijze zijn de volgende: 1) aanzienlijk hoge aantallen endotheelcellen worden geoogst van een aorta; 2) levensvatbaarheid van de cellen is goed bewaard gebleven; en 3) geen speciale uitrusting of techniek nodig. Het een effectief middel van het identificeren van specifieke cellulaire en moleculaire mechanismen endotheelcellen pathofysiologie. Voor degenen die geïnteresseerd zijn in het bestuderen van zijn primary gekweekte endotheelcellen van ofwel gen knock-out muizen, gen knock-in muizen of muizen ziekte model, dit protocol is erg handig en makkelijk om te oefenen.

<table><tbody><tr><td>4- of 6 weken oude muizen</td><td>Jackson Laboratory</td><td>#000664</td><td></td></tr><tr><td>Steriele 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS)</td><td>Gibco</td><td>#10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Steriele 1x PBS met 1.000 U/mL heparine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3149</td><td></td></tr><tr><td>Endothelecelgroeimedium (Dulbeccos’ gemodificeerd Eagles-medium [DMEM] met 25 mM HEPES [Gibco, #12320-032], aangevuld met 100 μg/mL endothelecelgroeisupplement uit runderhersenweefsel [ECGS, Sigma, #2759], 10% foetaal runder serum [FBS, Gibco, #10082-147], 1.000 U/mL heparine [Sigma Aldrich, H3149], 10.000 U/mL penicilline en 10 mg/mL streptomycine [Gibco, #15140-122])</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Groeifactor gereduceerde matrix</td><td>BD Biosciences</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>Neutrale proteinase (Dispase, 1 U/mL, Fisher Scientific, #CB-40235) en D-Val medium (D-Valine, 0,034 g/L, Sigma, #1255), in Dulbeccos’ gemodificeerd Eagles-medium, laag glucose (Gibco, #12320-032)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,1’-dioctadecyl-3,3,3’,3’- tetramethylindo-carbocyanineperchloraat-gelabelde acetyleerde LDL (Dil-ac-LDL)</td><td>Life Technologies</td><td>L3484</td><td></td></tr><tr><td>FITC-gelabelde Ulex europaeus agglutinine (Ulex-lectine)</td><td>Sigma</td><td>L9006</td><td></td></tr><tr><td>Anti-muis CD31-FITC-geconjugeerd antilichaam</td><td>BD Biosciences</td><td>553372</td><td></td></tr><tr><td>Anti-muis vasculair endotheelgroeifactorreceptor 2-antilichaam</td><td>Cell Signaling</td><td>9698</td><td></td></tr><tr><td>Anti-muis endotheelstikstofoxidesynthase</td><td>Abcam</td><td>ab5589</td><td></td></tr><tr><td>Anti-muis vasculair endotheel-cadherine</td><td>Abcam</td><td>33168</td><td></td></tr><tr><td>Anti-muis calponine</td><td>Abcam</td><td>700</td><td></td></tr><tr><td>FITC-geconjugeerd anti-konijn IgG</td><td>Sigma</td><td>F6005</td><td></td></tr><tr><td>1 mL-spuiten met 25-G naald</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-900-04222</td><td></td></tr><tr><td>100 mm Peri-schalen</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-202-516</td><td></td></tr><tr><td>Cellenkweekplaten met zes putjes</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-1B</td><td></td></tr><tr><td>T12,5-kweekflacon</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-202-076</td><td></td></tr><tr><td>Scharen, pincetten, microdissectiescharen en pincetten, scalpelmes</td><td>Fine Science Tools, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anesthesieapparaat met isofluraan</td><td>Webster Veterinary Supply</td><td>07-806-3204</td><td></td></tr><tr><td>Verwarmingslamp</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge-apparaat</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inverteerde fasecontrastmicroscoop</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inverteerde fluorescentiemicroscoop</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

isolatie en primaire cultuur van de muis endotheelcellen

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

Het vasculaire endotheel is essentieel voor de normale vasculaire homeostase. Zijn disfunctie speelt een rol bij verschillende cardiovasculaire aandoeningen. De muis is een belangrijk model voor onderzoek naar hart- en vaatziekten. Deze studie demonstreert een eenvoudige methode om endotheelcellen uit de muisaorta te isoleren en te kweken zonder speciale apparatuur. Om endotheelcellen te isoleren, wordt de thoracale aorta snel uit het lichaam van de muis verwijderd en wordt het aangehechte vetweefsel en bindweefsel van de aorta verwijderd. De aorta wordt in ringen van 1 mm gesneden. Elke aortaring wordt geopend en op een matrix met verminderde groeifactoren geplaatst met het endotheel naar beneden. De segmenten worden ongeveer 4 dagen gekweekt in een medium voor endotheelcelgroei. De endotheeluitlopers beginnen al vanaf dag 2. De segmenten worden vervolgens verwijderd en de cellen worden continu gekweekt totdat ze confluent zijn. De endotheelcellen worden verzameld met behulp van neutrale proteinase en gekweekt in een medium voor endotheelcelgroei voor nog twee passages voordat ze worden gebruikt voor experimenten. Immunofluorescentiekleuring wees uit dat na de tweede passage de meerderheid van de cellen dubbel positief was voor Dil-ac-LDL-opname, Lectine-binding en CD31-kleuring, de typische kenmerken van endotheelcellen. Het wordt gesuggereerd dat cellen in de tweede tot derde passage geschikt zijn voor in vitro en in vivo experimenten om de endotheliale biologie te bestuderen. Ons protocol biedt een effectieve manier om specifieke cellulaire en moleculaire mechanismen in de fysiopathologie van endotheelcellen te identificeren.

Endotheelcellen Kiemen Spontane endotheelcellen kiemen gestart vanuit een muis aorta segment. De muisaorta segment liet men groeien op een groeifactor gereduceerde matrix dan in endotheliale celgroei medium voor 4 dagen. De endotheelcellen kiemen verschijnt meestal in 2-4 dagen. Microfoto&#39;s werden genomen op dag 4 (Figuur 1). Zoals getoond in de foto&#39;s, talrijke endotheelcellen migreren van het segment. De nieuw gevormde spruiten blijven uitstrekken ...

De vasculaire endotheelcellen spelen een belangrijke rol bij veel belangrijke cardiovasculaire aandoeningen. Dit artikel beschrijft een eenvoudige methode om endotheelcellen te isoleren en uit te breiden van de muisaorta zonder het gebruik van speciale apparatuur. Ons protocol biedt een effectieve manier om mechanismen in de fysiopathologie van endotheelcellen te identificeren.

Isolatie en Primaire Cultuur van de muis endotheelcellen

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Het algemene doel van deze procedure is om een eenvoudige methode te gebruiken om endotheelcellen uit de muzaorta te isoleren en te expanderen zonder gebruik te maken van speciale apparatuur. Andere methoden voor het isoleren van endotheelcellen worden hoofdzakelijk toegepast op het hart of de longen, en niet op de aorta. Deze techniek voor de aorta biedt een aanzienlijk hogere opbrengst, een hoge celviabiliteit en vereist geen speciale apparatuur of technieken.Hoewel deze methoden van toepassing zijn op het bestuderen van primaire endotheliale cellen van zowel knockout- als muizen, die afkomstig zijn uit de meeste ziektemodellen, is dit protocol zeer nuttig en eenvoudig uit te voeren. Start dit protocol aan het begin van de dag.Nadat een muis is geanestheseerd en het uitblijven van een reflex is bevestigd, wordt de muis in rugligging op een chirurgisch onderlegdoekje geplaatst en wordt er een warmtelamp boven gepositioneerd om de lichaamstemperatuur op peil te houden. Desinfecteer vervolgens de buik door deze te bespuiten met 70% ethanol. Open daarna de buikholte met dissectiescharen langs de middenlijn om de abdominale aorta bloot te leggen.Open vervolgens de borstholte om het ha

isolation-and-primary-culture-of-mouse-aortic-endothelial-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

We beschrijven hier een protocol voor het kweken van muizen pulmonale endotheelcellen. Deze methode bestaat uit mechanische en enzymatische longweefsel dissociatie evenals een 2-staps zuiveringsproces met behulp van anti-PECAM-1 en anti-ICAM-2 antilichamen geconjugeerd aan magnetische korrels, die een pure endotheelcellen bevolking van voornamelijk microvasculaire oorsprong produceert.

Isolatie en Cultuur van Pulmonary endotheelcellen van neonatale muizen

Hersenmicrovasculaire endotheelcellen (BMEC) zijn onderling verbonden door specifieke junctionele eiwitten die een sterk gereguleerde barrière vormen die bloed en het centrale zenuwstelsel (CZS) scheiden, de zogenaamde bloed-hersenbarrière (BBB). De isolatie van primaire muis-hersenmicrovasculaire endotheelcellen, zoals besproken in dit protocol, maakt gedetailleerde in vitro studies van de BBB mogelijk.

Isolatie van Primary Muriene Brain microvasculaire endotheelcellen

We beschrijven een betrouwbare methode om primaire tumorspecifieke endotheelcellen te isoleren en te kweken van genetisch gemanipuleerde muismodellen.

Isolatie en Cultuur Uitbreiding van Tumor-specifieke endotheelcellen

Het doel van dit protocol is de isolatie en kweektechnieken van murine primaire vasculaire gladde spiercellen (VSMC's) van de coronaire circulatie demonstreren. Zodra VSMC's werden geïsoleerd, kunnen ze worden gebruikt voor vele standaard kweektechnieken.

Isolatie van muizen coronaire vasculaire gladde spiercellen

Dit protocol is opgesteld om onze methode voor het isoleren van muizen coronaire endotheelcellen te delen, met als doel beeldvorming of om moleculair-biologische experimenten uit te voeren.

Isolatie van muis coronaire endotheelcellen

Microvasculaire endotheliale cellen van skeletspieren (MMEC) vorm van de binnenwand van de spier haarvaten en reguleren beide, uitwisseling van vloeistoffen/moleculen en migratie van (afweercellen) tussen spierweefsel en bloed. Isolatie van primaire lymfkliertest MMEC, kunt zoals hier beschreven, u uitgebreide in vitro onderzoeken van de "myovascular-eenheid".

Isolatie van primaire lymfkliertest skeletspieren microvasculaire endotheliale cellen

Er wordt een effectieve enzymatische methode voor de isolatie van primaire varkens aorta endotheel cellen (pAECs) beschreven. De geïsoleerde primaire pAECs kan worden gebruikt om de immuunrespons en coagulatie reactie bij xenotransplantatie te onderzoeken.

Isolatie en cultuur van primaire aorta-endotheel cellen van miniatuur varkens

Hier schetsen en demonstreren we een protocol voor primaire muis lever sinusoïdale endotheelcel (LSEC) isolatie. Het protocol is gebaseerd op levercollageaseperfusie, niet-parenchymale celzuivering door centrifugeren met lage snelheid en CD146 magnetische kraalselectie. We fenotyperen en karakteriseren deze geïsoleerde LSEC's ook met behulp van flowcytometrie en scanning elektronenmicroscopie.

Isolatie en karakterisering van primaire leverbijholteelcellen van muizen

We presenteren een methode voor het isoleren van endotheelcellen en kernen uit het lumen van muiscarotisslagaders die zijn blootgesteld aan stabiele of verstoorde stroomomstandigheden om eencellige omics-experimenten uit te voeren.

Isolatie van endotheelcellen uit het lumen van muisslagaders voor eencellige multi-omics-experimenten

In dit artikel werden primaire longendotheelcellen geïsoleerd en gekweekt uit neonatale muizen.

Isolatie van primaire longendotheelcellen van muizen

Er wordt een protocol gepresenteerd voor de isolatie en primaire kweek van hersenmicrovasculaire endotheelcellen (BMEC's) uit neonataal muishersenweefsel om een robuust in vitro model te genereren voor het bestuderen van de functie van bloed-hersenbarrière onder fysiologische en pathologische omstandigheden.

Isolatie en kweek van microvasculaire endotheelcellen van muizenhersenen

Leer een eenvoudige methode om endotheelcellen te isoleren uit de muis aorta zonder speciale apparatuur. Dit protocol levert hoge celviabiliteit en is ideaal voor cardiovasculair onderzoek.

Isolatie en Primaire Cultuur van de muis endotheelcellen

Meer video's verkennen