Name: Un In Vitro Modello per la misurazione Risposte immunitarie Malaria nel contesto della coinfezione da HIV (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Scopri come misurare le risposte immunitarie innate alla malaria nel contesto dell'infezione cronica da HIV. Questo modello in vitro utilizza cellule mononucleate del sangue periferico e analisi citometrica per valutare l'attività delle citochine.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

C.A.M.F. e L.S. hanno partecipato alla progettazione del protocollo, all'acquisizione e all'analisi dei dati e alla stesura dell'articolo. 
Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Kain, il Dr. Loutfy, il Dr. Wasmuth e il Dr. Ayi per i loro contributi.
C.F. è stato supportato da una borsa di studio post-dottorato CTN/Ontario HIV Treatment Network (OHTN). L.S. è supportato da un OHTN Junior Investigator Development Award. Il presente lavoro è stato supportato da una sovvenzione operativa del Canadian Institutes of Health Research (CIHR) (MOP-13721 e 115160) e da una sovvenzione CIHR New Investigator Catalyst.

<ol><li>Graham, A. L., Cattadori, I. M., Lloyd-Smith, J. O., Ferrari, M. J., Bjørnstad, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission+consequences+of+coinfection%3A+cytokines+writ+large%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+parasitology%22%5BJournal%5D)">Transmission consequences of coinfection: cytokines writ large.</a> Trends in parasitology. 23 (6), 284-291 (2007).</li>
<li>French, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+rates+of+malarial+fever+with+deteriorating+immune+status+in+HIV-1-infected+Ugandan+adults%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS+%28London%2C+England%29%22%5BJournal%5D)">Increasing rates of malarial fever with deteriorating immune status in HIV-1-infected Ugandan adults.</a> AIDS (London, England). 15 (7), 899-906 (2001).</li>
<li>Hoffman, I. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+Plasmodium+falciparum+malaria+on+HIV-1+RNA+blood+plasma+concentration%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS+%28London%2C+England%29%22%5BJournal%5D)">The effect of Plasmodium falciparum malaria on HIV-1 RNA blood plasma concentration.</a> AIDS (London, England). 13 (4), 487-494 (1999).</li>
<li>Kamya, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+HIV-1+infection+on+antimalarial+treatment+outcomes+in+Uganda%3A+a+population-based+study%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+infectious+diseases%22%5BJournal%5D)">Effect of HIV-1 infection on antimalarial treatment outcomes in Uganda: a population-based study.</a> The Journal of infectious diseases. 193 (1), 9-15 (2006).</li>
<li>Kublin, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+Plasmodium+falciparum+malaria+on+concentration+of+HIV-1-RNA+in+the+blood+of+adults+in+rural+Malawi%3A+a+prospective+cohort+study%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Effect of Plasmodium falciparum malaria on concentration of HIV-1-RNA in the blood of adults in rural Malawi: a prospective cohort study.</a> Lancet. 365 (9455), 233-240 (2005).</li>
<li>Mermin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+co-trimoxazole+prophylaxis%2C+antiretroviral+therapy%2C+and+insecticide-treated+bednets+on+the+frequency+of+malaria+in+HIV-1-infected+adults+in+Uganda%3A+a+prospective+cohort+study%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Effect of co-trimoxazole prophylaxis, antiretroviral therapy, and insecticide-treated bednets on the frequency of malaria in HIV-1-infected adults in Uganda: a prospective cohort study.</a> Lancet. 367 (9518), 1256-1261 (2006).</li>
<li>Patnaik, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+HIV-1+serostatus%2C+HIV-1+RNA+concentration%2C+and+CD4+cell+count+on+the+incidence+of+malaria+infection+in+a+cohort+of+adults+in+rural+Malawi%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+infectious+diseases%22%5BJournal%5D)">Effects of HIV-1 serostatus, HIV-1 RNA concentration, and CD4 cell count on the incidence of malaria infection in a cohort of adults in rural Malawi.</a> The Journal of infectious diseases. 192 (6), 984-991 (2005).</li>
<li>Whitworth, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+HIV-1+and+increasing+immunosuppression+on+malaria+parasitaemia+and+clinical+episodes+in+adults+in+rural+Uganda%3A+a+cohort+study%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Effect of HIV-1 and increasing immunosuppression on malaria parasitaemia and clinical episodes in adults in rural Uganda: a cohort study.</a> Lancet. 356 (9235), 1051-1056 (2000).</li>
<li>Xiao, L., Owen, S. M., Rudolph, D. L., Lal, R. B., Lal, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodium+falciparum+antigen-induced+human+immunodeficiency+virus+type+1+replication+is+mediated+through+induction+of+tumor+necrosis+factor-alpha%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+infectious+diseases%22%5BJournal%5D)">Plasmodium falciparum antigen-induced human immunodeficiency virus type 1 replication is mediated through induction of tumor necrosis factor-alpha.</a> The Journal of infectious diseases. 177 (2), 437-445 (1998).</li>
<li>Francesconi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV%2C+malaria+parasites%2C+and+acute+febrile+episodes+in+Ugandan+adults%3A+a+case-control+study%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS+%28London%2C+England%29%22%5BJournal%5D)">HIV, malaria parasites, and acute febrile episodes in Ugandan adults: a case-control study.</a> AIDS (London, England). 15 (18), 2445-2450 (2001).</li>
<li>Finney, C. A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+infection+deregulates+Tim-3+expression+on+innate+cells%3A+combination+antiretroviral+therapy+results+in+partial+restoration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+acquired+immune+deficiency+syndromes%22%5BJournal%5D)">HIV infection deregulates Tim-3 expression on innate cells: combination antiretroviral therapy results in partial restoration.</a> Journal of acquired immune deficiency syndromes. 63 (2), 161-167 (2013).</li>
<li>Finney, C. A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+infection+deregulates+innate+immunity+to+malaria+despite+combination+antiretroviral+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS+%28London%2C+England%29%22%5BJournal%5D)">HIV infection deregulates innate immunity to malaria despite combination antiretroviral therapy.</a> AIDS (London, England). 27 (3), 325-335 (2013).</li>
<li>Ljungstrom, I., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLjungstrom%2C+I+%22Methods+in+Malaria+Research%22">Methods in Malaria Research</a>. , 4th edition, MR4/ATCC. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.mr4.org/Publications/MethodsinMalariaResearch.aspx">http://www.mr4.org/Publications/MethodsinMalariaResearch.aspx</a> (2013).</li>
<li>Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real+time+quantitative+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Real time quantitative PCR.</a> Genome Res. 6 (10), 986-994 (1996).</li>
<li>Universal SYBR green quantitative PCR protocol [Internet]. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/protocols/biology/sybr-green-qpcr.html">http://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/protocols/biology/sybr-green-qpcr.html</a> (2014).</li>
<li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2-DDCT+method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-DDCT method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li>
<li>Hensmann, M., Kwiatkowski, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+basis+of+early+cytokine+response+to+Plasmodium+falciparum%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+immunity%22%5BJournal%5D)">Cellular basis of early cytokine response to Plasmodium falciparum.</a> Infection and immunity. 69 (4), 2364-2371 (2001).</li>
<li>Artavanis-Tsakonas, K., Riley, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immune+response+to+malaria%3A+rapid+induction+of+IFN-gamma+from+human+NK+cells+by+live+Plasmodium+falciparum-infected+erythrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Innate immune response to malaria: rapid induction of IFN-gamma from human NK cells by live Plasmodium falciparum-infected erythrocytes.</a> J Immunol. 169 (6), 2956-2963 (2002).</li>
<li>Lambros, C., Vanderberg, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchronization+of+Plasmodium+falciparum+erythrocytic+stages+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+parasitology%22%5BJournal%5D)">Synchronization of Plasmodium falciparum erythrocytic stages in culture.</a> The Journal of parasitology. 65 (3), 418-420 (1979).</li>
<li>Ludlow, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+inhibits+phagocytosis+and+inflammatory+cytokine+responses+of+human+monocyte-derived+macrophages+to+P.+falciparum+infected+erythrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">HIV-1 inhibits phagocytosis and inflammatory cytokine responses of human monocyte-derived macrophages to P. falciparum infected erythrocytes.</a> PloS one. 7 (2), e32102(2012).</li>
<li>Weinberg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viability+and+functional+activity+of+cryopreserved+mononuclear+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+diagnostic+laboratory+immunology%22%5BJournal%5D)">Viability and functional activity of cryopreserved mononuclear cells.</a> Clinical and diagnostic laboratory immunology. 7 (4), 714-716 (2000).</li>
<li>Fowke, K. R., Behnke, J., Hanson, C., Shea, K., Cosentino, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis%3A+a+method+for+evaluating+the+cryopreservation+of+whole+blood+and+peripheral+blood+mononuclear+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunological%22%5BJournal%5D)">Apoptosis: a method for evaluating the cryopreservation of whole blood and peripheral blood mononuclear cells.</a> Journal of immunological. 244 (1-2), 139-144 (2000).</li>
<li>Jeurink, P. V., Vissers, Y. M., Rappard, B., Savelkoul, H. F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+responses+in+fresh+and+cryopreserved+peripheral+blood+mononuclear+cells%3A+kinetics+of+cell+viability%2C+cellular+subsets%2C+proliferation%2C+and+cytokine+production%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">T cell responses in fresh and cryopreserved peripheral blood mononuclear cells: kinetics of cell viability, cellular subsets, proliferation, and cytokine production.</a> Cryobiology. 57 (2), 91-103 (2008).</li>
<li>Kvarnström, M., Jenmalm, M. C., Ekerfelt, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+cryopreservation+on+expression+of+Th1+and+Th2+cytokines+in+blood+mononuclear+cells+from+patients+with+different+cytokine+profiles%2C+analysed+with+three+common+assays%3A+an+overall+decrease+of+interleukin-4%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Effect of cryopreservation on expression of Th1 and Th2 cytokines in blood mononuclear cells from patients with different cytokine profiles, analysed with three common assays: an overall decrease of interleukin-4.</a> Cryobiology. 49 (2), 157-168 (2004).</li>
<li>Venkataraman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+cryopreservation+of+immune+responses.+XI.+Heightened+secretion+of+tumor+necrosis+factor-alpha+by+frozen+human+peripheral+blood+mononuclear+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Effects of cryopreservation of immune responses. XI. Heightened secretion of tumor necrosis factor-alpha by frozen human peripheral blood mononuclear cells.</a> Cryobiology. 34 (3), 276-283 (1997).</li>
<li>Venkataraman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+cryopreservation+on+immune+responses.+X.+Decrease+in+interleukin-12+production+by+frozen+human+peripheral+blood+mononuclear+cells+is+mediated+by+the+endogenously+hypersecreted+interleukin-10%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Effects of cryopreservation on immune responses. X. Decrease in interleukin-12 production by frozen human peripheral blood mononuclear cells is mediated by the endogenously hypersecreted interleukin-10.</a> Cryobiology. 33 (5), 581-588 (1996).</li>
<li>Reimann, K. A., Chernoff, M., Wilkening, C. L., Nickerson, C. E., Landay, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preservation+of+lymphocyte+immunophenotype+and+proliferative+responses+in+cryopreserved+peripheral+blood+mononuclear+cells+from+human+immunodeficiency+virus+type+1-infected+donors%3A+implications+for+multicenter+clinical+trials%5BTitle%5D)+AND+%22The+ACTG+Immunology+Advanced.+Clinical+and+diagnostic+laboratory+immunology%22%5BJournal%5D)">Preservation of lymphocyte immunophenotype and proliferative responses in cryopreserved peripheral blood mononuclear cells from human immunodeficiency virus type 1-infected donors: implications for multicenter clinical trials.</a> The ACTG Immunology Advanced. Clinical and diagnostic laboratory immunology. 7 (3), 352-359 (2000).</li>
<li>Bennett, S., Breit, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variables+in+the+isolation+and+culture+of+human+monocytes+that+are+of+particular+relevance+to+studies+of+HIV%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+leukocyte+biology%22%5BJournal%5D)">Variables in the isolation and culture of human monocytes that are of particular relevance to studies of HIV.</a> Journal of leukocyte biology. 56 (3), 236-240 (1994).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il nostro protocollo è stato ottimizzato al fine di studiare più realisticamente la co-infezione HIV-malaria in vitro. In primo luogo, i globuli rossi umani freschi e siero sono necessari per la cultura parassita della malaria. Questo è fondamentale per ottenere una popolazione sana di parassiti della malaria. Lisati parassiti non possono essere sostituiti per i parassiti dal vivo come la produzione di citochine è molto più rapido e intenso quando si utilizza dal vivo P. falciparum infettato R...

Co-infezione, infezione da infezioni multiple concomitanti, è la norma in ambienti naturali. Co-infezione può avere un grande impatto sulla patologia della malattia e sulla gestione clinica di ogni infezione. Nel contesto di co-infezione, il vaccino e l&#39;efficacia dei farmaci, così come test diagnostico, può essere influenzato negativamente (rivisto in 1). Tuttavia, nonostante la sua importanza, la maggior parte delle ricerche patogeno ritiene infezioni solo singoli. La malaria e HIV-1 (HIV) sono le principali cause di morbilità e mortalità a livello mondiale. Aree di malaria e l&#39;HIV endemicità condividono una vasta sovrapposizione geografica, mettendo a milioni di persone a rischio di co-infezione e di conseguenza a rischio di più grave malattia clinica 2-10. Le due malattie interagiscono negativamente. Negli individui affetti da HIV, la carica virale HIV più alti e le diminuzioni temporanee CD4 + T-cellule può essere visto nel corso di una infezione della malaria, mentremalaria oneri parassita e il rischio di malaria clinica e grave sono più alti in co-infettati individui 2,3,5,7,8,10. I meccanismi attraverso i quali l&#39;HIV aumenta la malaria gravità non sono pienamente compresi e meritano ulteriori indagini. Qui si descrive un metodo con cui la malaria e la co-infezione HIV possono essere studiati in vitro. In particolare, questo metodo consente per l&#39;esame delle risposte immunitarie specifiche per malaria nel contesto dell&#39;infezione da HIV. Il nostro protocollo descrive un sistema versatile di co-coltura con cellule mononucleate del sangue periferico appena isolate (PBMC) isolati da donatori infetti cronicamente da HIV e in vitro colta P. falciparum parassitati eritrociti (PfRBC). L&#39;impatto dell&#39;HIV terapia antiretrovirale nelle risposte può essere esaminata usando PBMC prospetticamente raccolti da HIV (+) i donatori pre e post-terapia. Abbiamo usato questo sistema per studiare l&#39;impatto dell&#39;infezione da HIVsulle risposte immunitarie innate specifiche malaria 11,12, e sono stati in grado di determinare che IFNγ e TNF risposte specifiche per malaria sono alterate nelle cellule NK, cellule NKT, γδ cellule T da HIV (+) i donatori pre e post-HIV terapia antiretrovirale . Inoltre, siamo stati in grado di utilizzare questo sistema per determinare che le funzioni monocitiche sono anche compromesse HIV (+) i donatori, ma recuperare post-HIV terapia antiretrovirale.

<table><tbody><tr><td>anticorpi</td><td>alanina Sigma</td><td>A7377</td><td></td></tr><tr><td>(vedi altra tabella)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD Cytofix/Cytoperm con BD GolgiPlug</td><td>BD</td><td>555028</td><td>include brefeldina A, tampone cytofix/cytoperm e tampone permanente/lavaggio</td></tr><tr><td>BD Vacutainer ACD Solution A</td><td>BD</td><td>364506</td><td></td></tr><tr><td>BD Vacutainer Sodium Heparin</td><td>BD</td><td>17-1440-02</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (senza calcio, senza magnesio)</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Sigma</td><td>F1051</td><td>inattivare a caldo prima dell'uso</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-02</td><td></td></tr><tr><td>gentamicina (10 mg/ml)</td><td>Gibco</td><td>15710-064</td><td></td></tr><tr><td>Hema3 Staining Set</td><td>Fisher</td><td>122-911</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>ipossantina</td><td>Sigma</td><td>H9636</td><td></td></tr><tr><td>Ionomicina</td><td>Sigma</td><td>I3909</td><td></td></tr><tr><td>MEM aminoacidi non essenziali (10 mM)</td><td>Gibco</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>PMA</td><td></td><td>Sigma P8139</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 polvere</td><td>Life-Technologies</td><td>31800-022</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 con L-glutammina e HEPES</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30255.01</td><td></td></tr><tr><td>bicarbonato di sodio (polvere, coltura cellulare)</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato di sodio (100 mM)</td><td>Gibco</td><td>11360</td><td></td></tr><tr><td>Tris (base Trizma)</td><td>Sigma</td><td>T6066</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Ambion</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue (0.4%)</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>BD CompBead</td><td>BD</td><td>552843, 552845</td><td>dipende dagli anticorpi utilizzati</td></tr><tr><td>Miscela di gas parassita</td><td>Per ordine</td><td></td> speciale <td>3% CO2, 1% O2, saldo N2</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.2 &#956; m unità</td><td></td><td></td><td></td>filtrante</tr><tr><td>Vetrini Vetrini</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>T25</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Palloni T75 Fiasche</td><td></td><td></td><td></td></tr> da <tr><td>50 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr>Piastre <td></td><td></td><td></td><td>di coltura a 24 pozzetti</td></tr><tr><td>scollegate Pipette</td><td></td><td></td><td></td>Pasteur</tr><tr><td>tappate</td><td></td> <td>Pipette Pasteur</td><td></td></tr><tr><td>pipette sterili per trasferimento emocitometro</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>citometro</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>a flusso (3 laser)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anticorpi utilizzati per citometria a flusso</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-TNF</td><td>eBiosciences</td><td>551487</td><td>FITC (fluoroforo)
2 &#956; l</td></tr><tr><td>Anti-IFN&#947;</td><td>Biolegend</td><td>506507</td><td>PE (fluoroforo) 
20 &#956; l</td></tr><tr><td>Anti-CD8</td><td>Biolegend</td><td>300914</td><td>PE-Cy7 (fluoroforo) 
1 &#956; l</td></tr><tr><td>Biolegenda anti-CD14</td><td>; BD Biosciences</td><td>325624; 551487</td><td>Biotina (fluoroforo) 
0,5 &#956; l
Streptavin PE-TR (fluoroforo) 
0,1 &#956; l</td></tr><tr><td>Anti-CD56</td><td>Biolegend</td><td>318322</td><td>PerCP/Cy5.5 (fluoroforo) 
5 &#956; l</td></tr><tr><td>Anti-&#947; &#948;</td><td>Biolegend</td><td>331212</td><td>APC (fluoroforo)
5 &#956; l</td></tr><tr><td>Anti-CD3</td><td>Biolegend</td><td>300426</td><td>APC-Cy7 (fluoroforo) 
5 &#956; l</td></tr><tr><td>Anti-CD4</td><td>Biolegend</td><td>317424</td><td>Blu Pacifico (fluoroforo)
1 &#956; l</td></tr></tbody></table>

un<em&gt; in vitro</em&gt; modello per la misurazione risposte immunitarie malaria nel contesto della coinfezione da hiv

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

La co-infezione da malaria e HIV è una priorità sanitaria crescente. Tuttavia, la maggior parte della ricerca sulla malaria o sull'HIV si concentra attualmente su ciascuna infezione individualmente. Sebbene sia fondamentale comprendere le dinamiche della malattia per ciascuno di questi agenti patogeni in modo indipendente, è anche importante che le interazioni tra questi agenti patogeni siano studiate e comprese. 
Abbiamo sviluppato un modello versatile in vitro di co-infezione HIV-malaria per studiare le risposte immunitarie dell'ospite alla malaria nel contesto dell'infezione da HIV. Il nostro modello consente lo studio dei fattori secreti nei surnatanti cellulari, nella superficie cellulare e nei marcatori proteici intracellulari, nonché dei livelli di espressione dell'RNA. Il disegno sperimentale e i metodi utilizzati limitano la variabilità e promuovono l'affidabilità e la riproducibilità dei dati. 
Tutti i patogeni utilizzati in questo modello sono patogeni umani naturali (Plasmodium falciparum e HIV-1) e tutte le cellule infette sono naturalmente infettate e utilizzate fresche. Utilizziamo eritrociti umani parassitati con P. falciparum e mantenuti in coltura continua in vitro. Otteniamo cellule mononucleate del sangue periferico appena isolate da volontari con infezione cronica da HIV. Ogni condizione utilizzata ha un controllo appropriato (P. falciparum parassitato vs. eritrociti normali) e ogni donatore infetto da HIV ha un controllo HIV non infetto, da cui le cellule vengono raccolte lo stesso giorno. Questo modello fornisce un ambiente realistico per studiare le interazioni tra i parassiti della malaria e le cellule immunitarie umane nel contesto dell'infezione da HIV.

I grafici rappresentano i livelli di produzione IFNγ da cellule NKT (figura 2), utilizzando CD56 + CD3 + γδ- cancelli avere la popolazione di cellule NKT (dati non mostrati). Le cellule sono state coltivate per 72 ore prima della colorazione. Una volta macchiati, 100.000 cellule CD3 + sono state acquistate sul citofluorimetro di ottenere abbastanza grandi popolazioni di NK, NKT e cellule γδ (cellule di interesse). Un minimo di 5.600 cellule NKT sono visualizzate su ogni grafico. Produzione di TNF è otte...

La co-infezione umana è difficile da replicare in vitro. Tuttavia, i parassiti della malaria umana possono essere facilmente coltivati in vitro, così come le cellule mononucleate del sangue periferico umano appena isolate e naturalmente infettate dall'HIV. Ciò fornisce un modello eccellente per studiare le risposte immunitarie precoci ai parassiti della malaria nel contesto della co-infezione da HIV.

Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Modello per la misurazione Risposte immunitarie Malaria nel contesto della coinfezione da HIV

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è osservare la risposta immunitaria innata alla malaria in un contesto di infezione cronica da HIV. Questo viene ottenuto innanzitutto coltivando parassiti vivi di P. falciparum in globuli rossi umani; in un secondo passaggio, cellule mononucleate del sangue periferico ottenute da donatori sieropositivi e da donatori non infetti vengono co-coltivate con globuli rossi infettati dal parassita della malaria.In definitiva, l'analisi mediante citometria a flusso viene utilizzata per valutare l'attività citochinica delle cellule immunitarie innate di persone sieropositive per l'HIV rispetto a quella di controlli non infetti. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo delle co-infezioni. Ad esempio, in che modo la presenza di un'infezione come l'HIV influisce sulla risposta immunitaria nei confronti di una seconda infezione come la malaria? Per sincronizzare i parassiti, centrifugare la coltura parassitaria e lisare i parassiti allo stadio di trofozooiti nel pellet con 19 volumi di soluzione di alanina a 37 gradi Celsius, a temperatura ambiente. Dopo 15 minuti, centrifugare le cellule nel mezzo RPMI zero per due volte.Regolare l'ematocrito al 3% in R-P-M-I-A dopo il secondo lavaggio. Quindi gassare il flacone e riposizionarlo nell'incubatrice a 37 gradi Celsius fino a quando i trofozoiti raggiungono una parassitemia del 5-10% per calcolare la parassitemia del campione. Dispensare un campione di 10 microlitri dallo strato ematico su un vetrino e utilizzare un secondo vetrino per creare un film sottile di sangue dopo che il sangue si è asciugato.Colorare il vetrino utilizzando un kit di colorazione HEMA tre secondo il protocollo del produttore. Per calcolare il numero totale di globuli rossi infetti. Contare 300 cellule mediante microscopia ottica e confrontare il numero di eritrociti parassitati colorati di viola scuro con il numero di cellule non infette colorate di rosa chiaro per determinare l'ematocrito.Utilizzare un emocitometro per determinare il numero di globuli rossi per millilitro di coltura del parassita. Quindi centrifugare nuovamente la coltura del parassita e risospendere le cellule a sei volte 10 alla sesta eritrociti parassitati per millilitro in R-P-M-I-S più per isolare i campioni di sangue diluito di PBMC umani ottenuti da donatori HIV positivi o HIV negativi in un volume uguale di DPBS freddo. Successivamente, aggiungere 15 millilitri di Fial a temperatura ambiente in un tubo da 50 millilitri per ciascun campione.25 millilitri di soluzione DPBS di sangue, seguiti da un'accurata stratificazione di fino a 25 millilitri di sangue e soluzione DPBS. Con una pipetta sterile per trasferimento in plastica, separare le cellule mediante centrifugazione e quindi utilizzare una pipetta sterile per trasferimento in plastica per raccogliere i PBMC dall'interfaccia. Trasferire aliquote di fino a 20 millilitri di PBMC in singole provette da 50 millilitri.Quindi portare il volume totale di ogni provetta a 50 millilitri con DPBS sterile e freddo. Ora centrifugare nuovamente le cellule e risospendere il pellet in 50 millilitri di DPBS sterile fresco per ulteriori due lavaggi dopo l'ultimo lavaggio. Risospendere le cellule in 10 millilitri di R-P-M-I-S plus per il conteggio, quindi regolare i PBMC a una concentrazione finale di 10 × 10⁶ cellule per millilitro in R-P-M-I-S plus per impostare la co-infezione.Le colture iniziano seminando un milione di PBMC appena isolati, positivi e negativi per HIV, in 100 microlitri di R-P-M-I-S più per pozzetto in una piastra a 24 pozzetti. Portare il volume totale di ogni pozzetto a 500 microlitri aggiungendo 400 microlitri di R-P-M-I-S più, quindi aggiungere in triplicato e in un volume totale di 500 microlitri per pozzetto tre milioni di globuli rossi non infetti o tre milioni di globuli rossi parassitati alle cellule infette da HIV e non infette da HIV. Posizionare la piastra per co-infezione in un incubatore per colture cellulari.Successivamente, al termine del periodo sperimentale appropriato, centrifugare le cellule e raccogliere 700 microlitri di supernatante di coltura da ciascun campione. Centrifugare accuratamente il supernatante per rimuovere eventuali detriti, quindi suddividere i campioni in aliquote adeguate. Etichettare le provette e congelarle a meno 20 gradi Celsius o inferiore per analisi successive.Da sei a otto ore prima dell'analisi della produzione di citochine specifiche per cellula, trattare i campioni con un microlitro di 1000 D per felden, per pozzetto, al termine dell'incubazione. Collocare la piastra sul ghiaccio per 15 minuti.Quindi utilizzare una pipetta sterile per rimuovere le cellule dal fondo della piastra e trasferirle in provette microcentrifuga etichettate. Adesso centrifugare le cellule e risospendere i pellet in 500 microlitri di buffer per citometria a flusso. Dividere le cellule in modo che ogni campione abbia almeno una provetta per la colorazione completa con anticorpi.Un tubo per la colorazione con anticorpo di controllo fluorescente meno uno include anche un singolo controllo di citometria a flusso non colorato. Quindi etichettare le cellule con la colorazione completa di anticorpi e quelle del controllo fluorescente meno uno in 50 microlitri di tampone per citometria a flusso con una concentrazione pre-titolata di fluorocromo. Quattro anticorpi coniugati ai marcatori di superficie cellulari desiderati a quattro gradi Celsius e protetti dalla luce dopo 20 minuti.Lavare i campioni in un millilitro di buffer per citometria a flusso e aggiungere 100 microlitri di soluzione citofissa/citoperm a ogni provetta. Dopo 20 minuti a quattro gradi Celsius al buio, lavare le cellule in un millilitro di buffer di lavaggio per permeabilizzazione, centrifugare le cellule e risospendere i pellet in 100 microlitri di buffer di lavaggio per permeabilizzazione, aggiungendo una concentrazione pre-titolerata di anticorpi marcati con fluoro 4 specifici per i marcatori intracellulari di interesse desiderati agli anticorpi totali. Campioni di colorazione.Incubare tutti i tubi per 30 minuti a quattro gradi Celsius, protetti dalla luce. Successivamente, lavare i campioni con un millilitro di buffer di lavaggio per permeabilizzazione per ogni tubo. Infine, fissare i pellet in 300 microlitri di buffer per citometria a flusso a bassa concentrazione, integrato con il 1% di paraformaldeide per 15 minuti al fine di neutralizzare l'HIV prima dell'analisi mediante citometria a flusso. In questi grafici, vengono mostrati i livelli di produzione di interferone gamma da parte delle cellule T natural killer in individui positivi e negativi all'HIV esposti a globuli rossi parassitati o a globuli rossi non infetti di controllo.Si noti la risposta immunitaria innata soppressa all'infezione malarica osservata nei PBMC positivi per l'HIV, evidenziata dalla mancata produzione di interferone gamma in presenza di globuli rossi parassitati, rispetto alla robusta produzione di citochine mostrata dai PBMC di individui negativi per l'HIV. Pertanto, non dimenticare che lavorare con l'HIV è estremamente pericoloso e che è necessario adottare precauzioni come eseguire tutti i passaggi all'interno di una cappa biologica di livello due, indossare l'equipaggiamento di sicurezza appropriato ed evitare l'uso di oggetti appuntiti in vetro e di un'aspiratore durante l'esecuzione di questi protocolli.

an-vitro-model-for-measuring-immune-responses-to-malaria-context-hiv

Research

Ricerca

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Un<em&gt; In vitro</em&gt; Co-infezione da modello per lo studio<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt;-HIV-1 in Interazioni umane Le cellule immunitarie primarie derivate da monociti

Questo video dimostra l'infezione ex vivo del tessuto mucoso uterino umano con il virus dell'immunodeficienza umana di tipo 1, HIV-1, e il loro mantenimento sopra spugne di gelatina all'interfaccia aria-liquido. Questo metodo consente di monitorare la replicazione e la patogenesi dell'HIV-1 all'interno dei tessuti umani.

Un modello di infezione della mucosa cervicale umana per studiare la patogenesi dell'HIV in condizioni ex vivo

Questo video dimostra la generazione di un modello di coltura cellulare di co-infezione malaria-HIV in vitro. Le cellule mononucleate del sangue periferico infettate da HIV co-coltivate con eritrociti parassitati da Plasmodium falciparum potenzialmente si supportano a vicenda e forniscono informazioni sulle risposte immunitarie e sulla progressione della malattia nelle co-infezioni da HIV e malaria.

Generazione di un modello di coltura cellulare in vitro di coinfezione malaria-HIV

Il video dimostra una tecnica per generare un modello murino umanizzato con immunità ingegnerizzata basata su cellule staminali contro il virus dell'immunodeficienza umana (HIV). Il tessuto del timo fetale umano e le cellule staminali ematopoietiche (HSC) ingegnerizzate vengono impiantate nella capsula renale di un topo gravemente immunocompromesso. Le HSC, che esprimono i recettori chimerici dell'antigene (CAR) contro l'HIV, sono mescolate in una miscela proteica gelatinosa che ne promuove la...

Costruzione di un modello murino umanizzato con immunità ingegnerizzata contro l'HIV

Abbiamo sviluppato un test in vitro per studiare il ruolo delle vie immunomodulanti nella regolazione della secrezione di citochine da HIV-specifiche cellule T CD4.

In vitro per valutare l&#39;impatto di immunoregolatorio Pathways su HIV-specifica CD4 T effettrici delle cellule di funzione

La tubercolosi e la malaria sono due delle infezioni più diffuse negli esseri umani e le principali cause di morbilità e mortalità nelle popolazioni povere nei tropici. Abbiamo stabilito un sistema modello sperimentale per lo studio esito della malaria, tubercolosi coinfezione nei topi dopo la sfida con entrambi i patogeni tramite il loro percorso naturale di infezione.

Un modello sperimentale per studiare la tubercolosi, la malaria coinfezione sulla trasmissione naturale di Mycobacterium tuberculosis E Plasmodium berghei</i

Gli invade parassita della malaria e replicati all'interno delle cellule rosse del sangue. La valutazione accurata di invasione merozoite e parassitemia è quindi fondamentale per la valutazione nel corso di infezione malarica. Qui si descrive un protocollo basato citometria a flusso per la misurazione di questi parametri in un modello murino di malaria.

In Vivo Valutazione del roditore Plasmodium parassitemia e merozoite Invasion di Citometria a flusso

Questo protocollo descrive i metodi per costruire un modello murino umanizzato di midollo osseo/fegato/timo con immunità ingegnerizzata basata su cellule staminali contro l'infezione da HIV.

Cellule staminali base Immunità Engineered contro l&#39;infezione da HIV nel modello umanizzato mouse

Descriviamo un modello murino di malaria cerebrale sperimentale e mostriamo come la patologia infiammatoria e microvascolare possa essere monitorata in vivo utilizzando la risonanza magnetica.

Tracciamento in vivo di sviluppo dell&#39;edema e patologia microvascolare in un modello di malaria cerebrale sperimentale mediante l&#39;utilizzo di immagini a risonanza magnetica

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di fornire istruzioni su come misurare la capacità degli anticorpi presenti nella sera o nel plasma degli individui, naturalmente esposti all'infezione da Plasmodium falciparum, di opsonizzare e indurre la fagonitosi degli etriciti infettati da parassiti (IE).

Misurazione di anticorpi che inducono la fagonenza acquisita naturalmente ai parassiti Plasmodium falciparum mediante un'analisi basata sulla citometria del flusso

Qui descriviamo un nuovo metodo per aiutare a chiarire i meccanismi dell'immunità cellulare al Plasmodium durante la fase ematica dell'infezione. Questo è un test in vitro che misura l'uccisione dei globuli rossi infetti da parte dei linfociti citotossici.

In vitro Saggio dell'uccisione dei globuli rossi infetti da plasmodio da parte di linfociti citotossici

Scopri come misurare le risposte immunitarie innate alla malaria nel contesto dell'infezione cronica da HIV. Questo modello in vitro utilizza cellule mononucleate del sangue periferico e analisi citometrica per valutare l'attività delle citochine.

Un

Esplora altri video