Name: Fluorescenza Biomembrane Forza Probe: quantificazione simultanea di Cinetica recettore-ligando e Binding-indotta intracellulare segnalazione su una singola cella (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 9 s
Description: Scopri la tecnica BFP per misurare simultaneamente la cinetica di legame recettore-ligando e la segnalazione del calcio in singole cellule T. Questo metodo utilizza eritrociti biotinilati come trasduttori di forza ultra-sensibili.

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La ricerca relativa a questo articolo e lo sviluppo della tecnologia fBFP nel laboratorio Zhu sono stati supportati da sovvenzioni NIH AI044902, AI077343, AI038282, HL093723, HL091020, GM096187 e TW008753. Ringraziamo Evan Evans per aver inventato questo potente strumento sperimentale, e i membri del laboratorio Evans, Andrew Leung, Koji Kinoshita, Wesley Wong e Ken Halvorsen, per averci aiutato a costruire il BFP. Ringraziamo anche gli altri membri del laboratorio Zhu, Fang Kong, Chenghao Ge e Kaitao Li, per il loro aiuto nello sviluppo della strumentazione.

<ol><li>Aplin, A. E., Howe, A., Alahari, S. K., Juliano, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+transduction+and+signal+modulation+by+cell+adhesion+receptors%3A+the+role+of+integrins%2C+cadherins%2C+immunoglobulin-cell+adhesion+molecules%2C+and+selectins%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+reviews%22%5BJournal%5D)">Signal transduction and signal modulation by cell adhesion receptors: the role of integrins, cadherins, immunoglobulin-cell adhesion molecules, and selectins.</a> Pharmacological reviews. 50, 197-263 (1998).</li>
<li>Davis, M. M., Bjorkman, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+antigen+receptor+genes+and+T-cell+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">T-cell antigen receptor genes and T-cell recognition.</a> Nature. 334, 395-402 (1988).</li>
<li>Dado, D., Sagi, M., Levenberg, S., Zemel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+control+of+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Regenerative+medicine%22%5BJournal%5D)">Mechanical control of stem cell differentiation.</a> Regenerative medicine. 7, 101-116 (2012).</li>
<li>Edwards, L. J., Zarnitsyna, V. I., Hood, J. D., Evavold, B. D., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+T+cell+recognition+of+antigen%3A+significance+of+two-dimensional+kinetic+parameters%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+immunology%22%5BJournal%5D)">Insights into T cell recognition of antigen: significance of two-dimensional kinetic parameters.</a> Frontiers in immunology. 3, 86(2012).</li>
<li>Zhu, C., Jiang, N., Huang, J., Zarnitsyna, V. I., Evavold, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+from+in+situ+analysis+of+TCR-pMHC+recognition%3A+response+of+an+interaction+network%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+reviews%22%5BJournal%5D)">Insights from in situ analysis of TCR-pMHC recognition: response of an interaction network.</a> Immunological reviews. 251, 49-64 (2013).</li>
<li>Huang, J., Meyer, C., Zhu, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+antigen+recognition+at+the+cell+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+immunology%22%5BJournal%5D)">T cell antigen recognition at the cell membrane.</a> Molecular immunology. 52, 155-164 (2012).</li>
<li>Zarnitsyna, V., Zhu, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+triggering%3A+insights+from+2D+kinetics+analysis+of+molecular+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+biology%22%5BJournal%5D)">T cell triggering: insights from 2D kinetics analysis of molecular interactions.</a> Physical biology. 9, 045005(2012).</li>
<li>Binnig, G., Quate, C. F., Gerber, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+Force+Microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">Atomic Force Microscope.</a> Physical Review Letters. 56, 930-933 (1986).</li>
<li>Marshall, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+catch+bonds+involving+cell-adhesion+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Direct observation of catch bonds involving cell-adhesion molecules.</a> Nature. 423, 190-193 (2003).</li>
<li>Kong, F., Garcia, A. J., Mould, A. P., Humphries, M. J., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Demonstration+of+catch+bonds+between+an+integrin+and+its+ligand%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Demonstration of catch bonds between an integrin and its ligand.</a> The Journal of cell biology. 185, 1275-1284 (2009).</li>
<li>Yago, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catch+bonds+govern+adhesion+through+L-selectin+at+threshold+shear%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Catch bonds govern adhesion through L-selectin at threshold shear.</a> The Journal of cell biology. 166, 913-923 (2004).</li>
<li>Yago, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+glycoprotein+Ibalpha+forms+catch+bonds+with+human+WT+vWF+but+not+with+type+2B+von+Willebrand+disease+vWF%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">Platelet glycoprotein Ibalpha forms catch bonds with human WT vWF but not with type 2B von Willebrand disease vWF.</a> The Journal of clinical investigation. 118, 3195-3207 (2008).</li>
<li>Chesla, S. E., Selvaraj, P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+two-dimensional+receptor-ligand+binding+kinetics+by+micropipette%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Measuring two-dimensional receptor-ligand binding kinetics by micropipette.</a> Biophysical journal. 75, 1553-1572 (1998).</li>
<li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+kinetics+of+two-dimensional+TCR+and+pMHC+interactions+determine+T-cell+responsiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The kinetics of two-dimensional TCR and pMHC interactions determine T-cell responsiveness.</a> Nature. 464, 932-936 (2010).</li>
<li>Heinrich, V., Wong, W. P., Halvorsen, K., Evans, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+biomolecular+interactions+by+fast+three-dimensional+tracking+of+laser-confined+carrier+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir+%3A+the+ACS+journal+of+surfaces+and+colloids%22%5BJournal%5D)">Imaging biomolecular interactions by fast three-dimensional tracking of laser-confined carrier particles.</a> Langmuir : the ACS journal of surfaces and colloids. 24, 1194-1203 (2008).</li>
<li>Chen, W., Evans, E. A., McEver, R. P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+receptor-ligand+interactions+between+surfaces+by+thermal+fluctuations%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Monitoring receptor-ligand interactions between surfaces by thermal fluctuations.</a> Biophysical journal. 94, 694-701 (2008).</li>
<li>Evans, E., Ritchie, K., Merkel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+force+technique+to+probe+molecular+adhesion+and+structural+linkages+at+biological+interfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical%22%5BJournal%5D)">Sensitive force technique to probe molecular adhesion and structural linkages at biological interfaces.</a> Biophysical. 68, 2580-2587 (1995).</li>
<li>Evans, E., Leung, A., Heinrich, V., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+switching+and+coupling+between+two+dissociation+pathways+in+a+P-selectin+adhesion+bond%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Mechanical switching and coupling between two dissociation pathways in a P-selectin adhesion bond.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 11281-11286 (2004).</li>
<li>Ju, L., Dong, J. -f, Cruz, M. A., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+N-terminal+Flanking+Region+of+the+A1+Domain+Regulates+the+Force-dependent+Binding+of+von+Willebrand+Factor+to+Platelet+Glycoprotein+Ib%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The N-terminal Flanking Region of the A1 Domain Regulates the Force-dependent Binding of von Willebrand Factor to Platelet Glycoprotein Ib.</a> Journal of Biological Chemistry. 288, (2013).</li>
<li>Chen, W., Lou, J., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forcing+switch+from+short-+to+intermediate-+and+long-lived+states+of+the+alphaA+domain+generates+LFA-1%2FICAM-1+catch+bonds%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Forcing switch from short- to intermediate- and long-lived states of the alphaA domain generates LFA-1/ICAM-1 catch bonds.</a> The Journal of biological chemistry. 285, 35967-35978 (2010).</li>
<li>Chen, W., Lou, J., Evans, E. A., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observing+force-regulated+conformational+changes+and+ligand+dissociation+from+a+single+integrin+on+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Observing force-regulated conformational changes and ligand dissociation from a single integrin on cells.</a> The Journal of cell biology. 199, 497-512 (2012).</li>
<li>Judokusumo, E., Tabdanov, E., Kumari, S., Dustin, M. L., Kam, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanosensing+in+T+lymphocyte+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Mechanosensing in T lymphocyte activation.</a> Biophysical journal. 102, L5-L7 (2012).</li>
<li>Bashour, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD28+and+CD3+have+complementary+roles+in+T-cell+traction+forces%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">CD28 and CD3 have complementary roles in T-cell traction forces.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 2241-2246 (2014).</li>
<li>Nesbitt, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+glycoprotein+Ib%2FV%2FIX+and+integrin+alpha+IIbbeta+3-dependent+calcium+signals+cooperatively+regulate+platelet+adhesion+under+flow%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Distinct glycoprotein Ib/V/IX and integrin alpha IIbbeta 3-dependent calcium signals cooperatively regulate platelet adhesion under flow.</a> The Journal of biological chemistry. 277, 2965-2972 (2002).</li>
<li>Mazzucato, M., Pradella, P., Cozzi, M. R., De Marco, L., Ruggeri, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+cytoplasmic+calcium+signals+in+a+2-stage+platelet+activation+process+induced+by+the+glycoprotein+Ibalpha+mechanoreceptor%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Sequential cytoplasmic calcium signals in a 2-stage platelet activation process induced by the glycoprotein Ibalpha mechanoreceptor.</a> Blood. 100, 2793-2800 (2002).</li>
<li>Lefort, C. T., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+arrest+by+LFA-1+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+immunology%22%5BJournal%5D)">Neutrophil arrest by LFA-1 activation.</a> Frontiers in immunology. 3, 157(2012).</li>
<li>Liu, B., Chen, W., Evavold, B. D., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accumulation+of+dynamic+catch+bonds+between+TCR+and+agonist+peptide-MHC+triggers+T+cell+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Accumulation of dynamic catch bonds between TCR and agonist peptide-MHC triggers T cell signaling.</a> Cell. 157, 357-368 (2014).</li>
<li>Lou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-enhanced+adhesion+regulated+by+a+selectin+interdomain+hinge%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Flow-enhanced adhesion regulated by a selectin interdomain hinge.</a> The Journal of cell biology. 174, 1107-1117 (2006).</li>
<li>Fiore, V. F., Ju, L., Chen, Y., Zhu, C., Barker, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+catch+of+a+Thy-1-alpha5beta1%2Bsyndecan-4+trimolecular+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+communications%22%5BJournal%5D)">Dynamic catch of a Thy-1-alpha5beta1+syndecan-4 trimolecular complex.</a> Nature communications. 5, 4886(2014).</li>
<li>Chen, W., Zarnitsyna, V. I., Sarangapani, K. K., Huang, J., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+Receptor-Ligand+Binding+Kinetics+on+Cell+Surfaces%3A+From+Adhesion+Frequency+to+Thermal+Fluctuation+Methods%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+molecular+bioengineering%22%5BJournal%5D)">Measuring Receptor-Ligand Binding Kinetics on Cell Surfaces: From Adhesion Frequency to Thermal Fluctuation Methods.</a> Cellular and molecular bioengineering. 1, 276-288 (2008).</li>
<li>Marshall, B. T., Sarangapani, K. K., Lou, J., McEver, R. P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+history+dependence+of+receptor-ligand+dissociation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical%22%5BJournal%5D)">Force history dependence of receptor-ligand dissociation.</a> Biophysical. 88, 1458-1466 (2005).</li>
<li>Xiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+and+kinetics+of+force-induced+conformational+changes+of+an+alphaA+domain-containing+integrin%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Structural basis and kinetics of force-induced conformational changes of an alphaA domain-containing integrin.</a> PloS one. 6, e27946(2011).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Un esperimento di successo fBFP comporta alcune considerazioni critiche. In primo luogo, per il calcolo forza di essere affidabile, la micropipetta, l&#39;RBC, ed il tallone della sonda devono essere allineati come vicino coassiale possibile. La proiezione del RBC all&#39;interno della pipetta dovrebbe essere circa un diametro della sonda pipetta in modo che l&#39;attrito tra RBC e la pipetta è trascurabile. Per un tipico RBC umana, il diametro ottimale pipetta è 2.0-2.4 micron, che produce un migliore adattamento di Eq...

Cellula-cellula e cellula-matrice extracellulare (ECM) adesione è mediata dal legame tra i recettori della superficie cellulare, proteine ​​ECM, e / o lipidi 1. Binding consente cellule formano strutture funzionali 1, così come riconoscono, comunicare e reagiscono all&#39;ambiente 1-3. A differenza di proteine ​​solubili (ad esempio, citochine e fattori di crescita) che si legano da un tridimensionale (3D) fase fluida sui recettori di superficie cellulare, i recettori di adesione cellulare formano legami con i propri ligandi attraverso una stretta spazi di giunzione per colmare due superfici contrapposte che limitano molecolare diffusione in un dimensionale interfaccia due (2D) 4-7. In contrasto con la cinetica 3D che sono comunemente misurata mediante analisi di legame tradizionali (ad esempio, di risonanza plasmonica di superficie o SPR), cinetica 2D devono essere quantificati con le tecniche specializzate, come microscopia a forza atomica (AFM) 8-10, flusso camera di 11,12, micropipetta 13,14, otticapinzette 15 e vigore biomembrane sonda (BFP) 16-21. Più che semplicemente fornendo linkage fisico per coesione cellulare, molecole di adesione sono un componente importante della macchina di segnalazione per la cella di comunicare con l&#39;ambiente circostante. C&#39;è stato un crescente interesse per comprendere come l&#39;impegno ligando di molecole di adesione avvia segnale intracellulare e come il segnale iniziale viene trasdotto all&#39;interno della cellula. Intuitivamente, proprietà del recettore-ligando può influire i segnali che induce. Tuttavia, è difficile sezionare rapporti meccanicistici tra l&#39;interazione extracellulare ed eventi di segnalazione intracellulare utilizzando insieme tradizionale di saggi biochimici causa delle loro molte limitazioni, ad esempio, una risoluzione temporale povero e la totale assenza di risoluzione spaziale. Metodi che permettono sia biofisica (2D cinetica legame recettore-ligando) e biochimiche osservazioni (segnalazione) su Live esistentele cellule sono substrati di rigidità sintonizzabile 22, elastomeri array pilastro 23 e dispositivi camera di flusso / microfluidica incorporato con capacità di fluorescenza 24-26. Tuttavia, letture di segnalamento e il legame al recettore-ligando devono essere ottenuti separatamente (più spesso con metodi diversi), rendendo difficile sezionare relazioni temporali e spaziali delle caratteristiche dei titoli con eventi di segnalazione. Convenzionale BFP è una spettroscopia di forza ultrasensibile con alta risoluzione spazio-temporale 17. Esso utilizza una cella flessibile rossi del sangue (RBC) come un sensore di forza, che consente la misurazione della cinetica 2D singola molecola, le proprietà meccaniche e cambiamenti conformazionali 14,16,19-21,27-29. Un BFP a base di immagini a fluorescenza (fBFP) correla la cinetica di legame recettore-ligando con la segnalazione cellulare vincolante-attivato a scala singola molecola. Con questa impostazione, in attività di segnalazione delle cellule in situ nel contesto meccanicamente superficialistimolazione cal è stata osservata in cellule T 27. Il fBFP è versatile e può essere utilizzato per studi di adesione e segnalazione cellulare mediata da altre molecole di altre celle.

<table><tbody><tr><td>Fosfato di sodio monobasico monoidrato (NaH2PO4 &bull; H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638</td><td>Preparazione tampone fosfato</td></tr><tr><td>Anhy. Fosfato di sodio bibasico (Na2HPO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7907</td><td>Preparazione tampone fosfato</td></tr><tr><td>Carbonato di sodio (Na2CO3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2127</td><td>Preparazione tampone carbonato/bicarbonato</td></tr><tr><td>Bicarbonato di sodio (NaHCO3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td>Carbonato/bicarbonato Preparazione del tampone</td></tr><tr><td>Cloruro di sodio (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td>N2-5% Preparazione del tampone</td></tr><tr><td>Cloruro di potassio (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td>N2-5% Preparazione del tampone</td></tr><tr><td>Fosfato di potassio monobasico (KH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td>N2-5% Preparazione del tampone</td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td>Preparazione del tampone N2-5%</td></tr><tr><td>MAL-PEG3500-NHS</td><td>JenKem</td><td>A5002-1</td><td>Funzionalizzazione delle perle</td></tr><tr><td>Biotina-PEG3500-NHS</td><td>JenKem</td><td>A5026-1</td><td>Biotinilazione dei globuli rossi</td></tr><tr><td>Nistatina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N6261</td><td>Regolazione dell'osmolarità dei globuli rossi</td></tr><tr><td>Idrossido di ammonio (NH4OH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-6899</td><td>Perla di vetro silanizzazione</td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>BDH</td><td>67-56-1</td><td>Silanizzazione di perle di vetro</td></tr><tr><td>30% Perossido di idrogeno (H2O2)</td><td>J. T. Barker</td><td>Jan-86</td><td>Silanizzazione di perle di vetro</td></tr><tr><td>Acido acetico (glaciale)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ARK2183</td><td>Silanizzazione di perle di vetro</td></tr><tr><td>3-Mercaptopropiltrimethoxysilane (MPTMS)</td><td>Uct Specialties, llc</td><td>4420-74-0</td><td>Funzionalizzazione di perle</td></tr> di <tr><td>vetro Borosilicato Perle di vetro</td><td>Distrilab Particle Technology</td><td>9002</td><td>Funzionalizzazione di perle di vetro</td></tr><tr><td>Streptavidina&minus; Maleimmide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9415</td><td>Funzionalizzazione con perle di vetro</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0336</td><td>Funzionalizzazione del ligando</td></tr><tr><td>Fura2-AM</td><td>Life Technologies</td><td>F-1201</td><td>Caricamento intracellulare del colorante a fluorescenza del calcio</td></tr><tr><td>Dimetilsolfossido (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td>Caricamento intracellulare del colorante a fluorescenza del calcio</td></tr><tr><td>Perle di Quantibrite PE</td><td>BD Biosciences</td><td>340495</td><td>Quantificazione della densità</td></tr><tr><td>Citometro a flusso</td><td>BD Biosciences</td><td>BD LSR II</td><td>Quantificazione della densità</td></tr><tr><td>Tubo capillare 0,7-1,0 mm x 30 pollici</td><td>Kimble Chase</td><td>46485-1</td><td>Produzione di micropipette</td></tr><tr><td>Flaming/Brown Estrattore di micropipette Strumento</td><td>sutter</td><td>P-97</td><td>Produzione di micropipette</td></tr><tr><td>Pipetta microforce</td><td>Narishige</td><td>MF-900</td><td>Micropipetta per la produzione di</td></tr><tr><td>olio minerale</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2629-1</td><td>Assemblaggio della camera</td></tr><tr><td>Coperchio del microscopio Vetro</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-G</td><td>Assemblaggio della camera</td></tr><tr><td>Micro-iniettore</td><td>World Precision Instruments</td><td>MF34G-5</td><td>Assemblaggio della camera</td></tr><tr><td>Siringa da 1 ml</td><td>BD&nbsp;</td><td>Assemblaggio della</td><td>camera</td>309602</tr><tr><td>Assemblaggio della micropipetta</td><td>Narishige</td><td>HI-7</td><td>Assemblaggio della camera</td></tr><tr><td>Parti meccaniche e adattatori progettati in casa mediante lavorazione CNC.</td><td>Strumento di Biofisica</td><td>Tutte le parti sono personalizzate secondo i disegni CAD.</td><td>Sistema BFP</td></tr><tr><td>Microscopio (TiE invertito)</td>Sistema <td>Nikon</td><td>MEA53100</td><td>BFP</td></tr><tr><td>Obiettivo CFI Piano Fluor 40x (NA 0,75, WD 0,72 mm, Spg)</td><td>Sistema Nikon</td><td>MRH00401</td><td>BFP</td></tr><tr><td>Fotocamera, GE680, 640 x 480, GigE, 1/3" CCD, mono</td><td>Graftek Imaging</td><td>02-2020C</td><td>Sistema BFP</td></tr><tr><td>Prosilica GC1290 - ICX445, 1/3", C-Mount, 1280 x 960, Mono., CCD, ADC a 12 bit</td><td>Graftek Imaging</td><td>02-2185A</td><td>BFP sistema</td></tr><tr><td>Testa di sonda submicronica manuale con telecomando ad alta risoluzione</td><td>Sistema Karl Suss</td><td>PH400</td><td>BFP</td></tr><tr><td>Tavolo antivibrante (5' x 3')</td><td>Sistema TMC</td><td>77049089</td><td>BFP</td></tr><tr><td>Tavolino traslante manuale 3D</td><td>Newport</td><td>462-XYZ-M</td><td></td></tr><tr><td>Software CAD 3D SolidWorks</td><td>SOLIDWORKS Corp.</td><td>Versione 2012 SP5</td><td>Sistema BFP</td></tr> Software <tr><td>LabVIEW National</td><td>Instruments</td><td>Versione 2009</td><td>Sistema BFP, programma BFP</td></tr><tr><td>Stadio piezotraslante 3D</td><td>Physik Instrumente</td><td>M-105.3P</td><td>Sistema BFP</td></tr><tr><td>Piezo accuator lineare</td><td>Physik Instrumente</td><td>P-753.1CD</td><td>Sistema BFP</td></tr><tr><td>Software</td><td></td> Micromanager <td>Versione 1.4</td><td>Sistema fBFP, fluorescenza programma di imaging</td></tr><tr><td>Dual Cam (DC-2)</td><td>Fotometria</td><td>77054724</td><td>sistema fBFP</td></tr><tr><td>Filtro di emissione Dual Cam (T565LPXR)</td><td>Fotometria</td><td>77054725</td><td>sistema fBFP</td></tr><tr><td>Telecamera a fluorescenza</td><td>Hamamatsu</td><td>ORCA-R2 C10600-10B</td><td>Sistema fBFP</td></tr><tr><td>Film plastico di paraffina (Parafilm)</td><td>Bemis Company, Inc</td><td>Sigillatura della bottiglia</td><td>PM996</td></tr><tr><td>Carbonato/ tampone bicarbonato (pH 8,5)</td><td></td><td></td><td>8,4 g/L carbonato di sodio (Na2CO3), 10,6 g/L bicarbonato di sodio (NaHCO3)</td></tr><tr><td>Tampone fosfato (pH 6,5-6,8)</td><td></td><td></td><td>27,6 g/L NaPhosphate monobasico (NaH2PO4 &; H2O), 28,4 g/L Anhy. NaFosfato dibasico (Na2HPO4)</td></tr><tr><td>N2-5% tampone (pH 7,2)</td><td></td><td></td><td>20,77 g/L cloruro di potassio (KCl), 2,38 g/L cloruro di sodio (NaCl), 0,13 g/L fosfato di potassio monobasico (KH2PO4), 0,71 g/L di anhy. sodio fosfato bibasico (Na2HPO4), 9,70 g/L di saccarosio</td></tr></tbody></table>

fluorescenza biomembrane forza probe: quantificazione simultanea di cinetica recettore-ligando e binding-indotta intracellulare segnalazione su una singola cella

Fluorescence Biomembrane Force Probe: Concurrent Quantitation of Receptor-ligand Kinetics and Binding-induced Intracellular Signaling on a Single Cell

Recettore-ligando membrana mediano molte funzioni cellulari. Cinetica Binding e segnalazione a valle innescato da queste interazioni molecolari sono probabilmente influenzate dall&#39;ambiente meccanico in cui legame e segnalazione avvengono. Uno studio recente ha dimostrato che la forza meccanica può regolare il riconoscimento dell&#39;antigene da e attivazione del recettore delle cellule T (TCR). Ciò è stato reso possibile da una nuova tecnologia che abbiamo sviluppato e fluorescenza Definito sensore di forza biomembrane (fBFP), che combina spettroscopia di forza singola molecola con microscopia a fluorescenza. L&#39;utilizzo di un globulo rosso umano ultra-morbido come il sensore di forza sensibile, una macchina fotografica ad alta velocità e in tempo reale, le tecniche di monitoraggio delle immagini, la fBFP è di ~ 1 PN (10 -12 N), ~ 3 nm e ~ 0.5 msec a forza, risoluzione spaziale e temporale. Con il fBFP, si può misurare con precisione singoli cinetica di legame recettore-ligando ai sensi del regolamento vigente e allo stesso tempo l&#39;immagine vincolante-attivato cal intracellularecico segnalazione su una singola cellula dal vivo. Questa nuova tecnologia può essere utilizzata per studiare altri recettore-ligando di membrana e la segnalazione in altre cellule sotto regolazione meccanica.

La tecnica BFP è stato lanciato da laboratorio Evans nel 1995 17. Questo strumento picoforce è stato ampiamente utilizzato per misurare le interazioni di proteine ​​immobilizzate su superfici, in modo da analizzare la cinetica bidimensionali di molecole di adesione interagire con i loro ligandi 16,19,20, 30, per misurare l&#39;elasticità molecolare 21,29, e per determinare proteine ​​conformazionale cambia 21. Per un fBFP, un ulteriore set di dispositivi epi-fluorescenza conne...

Descriviamo una tecnica per misurare contemporaneamente la cinetica di legame del singolo recettore-ligando regolata dalla forza e l'imaging in tempo reale della segnalazione del calcio in un singolo linfocita T.

Fluorescenza Biomembrane Forza Probe: quantificazione simultanea di Cinetica recettore-ligando e Binding-indotta intracellulare segnalazione su una singola cella

Membrane receptor-ligand interactions mediate many cellular functions. Binding kinetics and downstream signaling triggered by these molecular interactions ...

L'obiettivo generale di questa procedura è misurare simultaneamente il legame recettoriale e osservare il segnale del calcio indotto dal legame a livello di singola cellula. Questo risultato si ottiene innanzitutto isolando il biotino e regolando l'osmolarità degli eritrociti umani o RBC per utilizzarli come trasduttore di forza ultra-sensibile. Il secondo passaggio consiste nel funzionalizzare delle microsfere di vetro, operazione che comprende pulizia, dilatazione e rivestimento con ligando.Successivamente, i linfociti T vengono isolati e incubati con il colorante per il calcio fewer 2:00 AM, che permette l'osservazione della concentrazione intracellulare di ioni calcio. Il passaggio finale consiste nel preparare le micropipette nella camera sperimentale, necessarie specificamente per l'allestimento dell'esperimento. Infine, la tecnica del biosensore a membrana fluorescente per la misura della forza, o metodo BFP, viene utilizzata per mostrare l'adesione di una cellula a una microsfera rivestita di ligando, misurare la cinetica di legame tra recettore e ligando e, nel contempo, monitorare il livello di calcio intracellulare.Questa tecnica è utile per comprendere come le cellule T

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Utilizzando un spettralmente risolta a due fotoni sistema di imaging microscopia, a livello di pixel mappe di Förster Resonance Energy Transfer (FRET) efficienze sono ottenute per le cellule che esprimono recettori di membrana ipotizzato per formare omo-oligomeriche complessi. Dal FRET mappe efficienza, siamo in grado di stimare le informazioni stechiometrico sui complessi oligomeri in fase di studio.

Quantificazione in vivo di G interazioni proteina recettore accoppiato con spettralmente risolte microscopia a due fotoni

Questo video dimostra l'uso della spettroscopia di fluttuazione della fluorescenza per rilevare l'interazione tra le proteine della superficie cellulare ai contatti cellula-cellula. Esprimendo il recettore di adesione transmembrana di interesse marcato con una proteina fluorescente e mescolando due diverse popolazioni cellulari che ospitano due etichette fluorescenti spettralmente separate, la trans-interazione tra i recettori di due cellule vicine con fluorescenza di colore diverso viene...

Spettroscopia di fluttuazione della fluorescenza per studiare l'interazione delle proteine a contatto cellulare

In questo video, le sonde di forza a biomembrana (BFP) vengono utilizzate per misurare le forze tra recettori e ligandi. Questa tecnica è in grado di rilevare le interazioni monitorando la pressione necessaria per rompere i legami tra il pMHC coniugato sulle perle della sonda e i TCR sulle cellule bersaglio.

Sonda di forza biomembrana per quantificare le interazioni recettore-ligando

La basato sulla fluorescenza calcio saggio mobilitazione qui descritto è un sistema di screening inversa farmacologia media produttività per l'identificazione di ligando funzionalmente attivazione (s) di orfani accoppiato a proteina G recettori (GPCR).

Caratterizzazione di G recettori accoppiati alla proteina da un calcio di Mobilitazione Assay Basato sulla fluorescenza

Questo protocollo descrive come utilizzare la microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale per visualizzare e tracciare singoli recettori sulla superficie delle cellule viventi e quindi analizzare la mobilità laterale del recettore, le dimensioni dei complessi recettoriali e per visualizzare le interazioni transitorie recettore-recettore. Questo protocollo può essere esteso ad altre proteine di membrana.

Ad alta risoluzione Spatiotemporal Analisi del recettore Dynamics per singola molecola di microscopia a fluorescenza

Questo protocollo descrive un approccio di basato su spettroscopia di fluorescenza fluttuazione per indagare le interazioni tra proteine che mediano interazioni cellula-cellula, cioè proteine localizzate nelle giunzioni delle cellule, direttamente nelle cellule viventi. Forniamo le linee guida dettagliate sulla calibrazione dello strumento, acquisizione dati e analisi, comprese le correzioni al fonti possibili manufatto.

Un'analisi di spettroscopia di fluorescenza fluttuazione delle interazioni proteina-proteina a contatti cellula-cellula

Descriviamo un approccio di imaging per la determinazione dello stato oligomerico oligomerico medio degli oligomeri mEGFP-tagged-receptor indotti dal legame del ligando nella membrana plasmatica delle cellule viventi. Il protocollo si basa sulla microscopia TIRF (Total Internal Reflection Fluorescence) combinata con l'analisi di Number and Brightness (N&amp;B).

Dinamica di oligomerizzazione dei recettori delle superfici cellulari nelle cellule viventi mediante microscopia a fluorescenza totale di riflessione interna combinata con l'analisi del numero e della luminosità

Questo protocollo presenta un metodo per misurare il legame dei nucleotidi adenina ai recettori in tempo reale in un ambiente cellulare. Il legame è misurato come trasferimento di energia di risonanza di Förster (FRET) tra derivati del nucleotide trinitrofenile e proteine marcate con un amminoacido fluorescente non canonico.

Misurare il legame nucleotidico a proteine di membrana intatte e funzionali in tempo reale

Presentiamo un metodo per l'acquisizione di corsi di tempo reporter a fluorescenza da singole cellule utilizzando array micropatterned. Il protocollo descrive la preparazione di array a cella singola, la configurazione e il funzionamento della microscopia time-lapse di scansione a celle vive e uno strumento di analisi delle immagini open source per la preselezione automatizzata, il controllo visivo e il tracciamento dei corsi di tempo di fluorescenza integrati nelle celle per sito di adesione.

Imaging a cellule vive di array a cella singola (LISCA) - una tecnica versatile per quantificare la cinetica cellulare

Presentiamo un protocollo sperimentale e un flusso di lavoro di analisi dei dati per eseguire la spettroscopia di correlazione incrociata a fluorescenza a doppio colore (FCCS) combinata con il trasferimento di energia di risonanza di Förster (FRET) per studiare la dinamica del recettore di membrana nelle cellule vive utilizzando le moderne tecniche di etichettatura a fluorescenza.

Spettroscopia di correlazione incrociata a fluorescenza a doppio colore per studiare l'interazione proteina-proteina e la dinamica proteica nelle cellule vive

Qui, descriviamo una serie di metodi per caratterizzare l'interazione delle proteine con membrane di cellule o microvescicole.

Analisi dell'interazione di proteine marcate fluorescenti con microvescicole fosfolipidiche artificiali utilizzando la citometria a flusso quantitativa

Scopri la tecnica BFP per misurare simultaneamente la cinetica di legame recettore-ligando e la segnalazione del calcio in singole cellule T. Questo metodo utilizza eritrociti biotinilati come trasduttori di forza ultra-sensibili.

Fluorescenza Biomembrane Forza Probe: quantificazione simultanea di Cinetica recettore-ligando e Binding-indotta intracellulare segnalazione su una singola cella (Video) | JoVE Journal

Fluorescenza Biomembrane Forza Probe: quantificazione simultanea di Cinetica recettore-ligando e Binding-indotta intracellulare segnalazione su una singola cella

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