Name: Fluorescenza Biomembrane Forza Probe: quantificazione simultanea di Cinetica recettore-ligando e Binding-indotta intracellulare segnalazione su una singola cella (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 9 s
Description: Scopri la tecnica BFP per misurare simultaneamente la cinetica di legame recettore-ligando e la segnalazione del calcio in singole cellule T. Questo metodo utilizza eritrociti biotinilati come trasduttori di forza ultra-sensibili.

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La ricerca relativa a questo articolo e lo sviluppo della tecnologia fBFP nel laboratorio Zhu sono stati supportati da sovvenzioni NIH AI044902, AI077343, AI038282, HL093723, HL091020, GM096187 e TW008753. Ringraziamo Evan Evans per aver inventato questo potente strumento sperimentale, e i membri del laboratorio Evans, Andrew Leung, Koji Kinoshita, Wesley Wong e Ken Halvorsen, per averci aiutato a costruire il BFP. Ringraziamo anche gli altri membri del laboratorio Zhu, Fang Kong, Chenghao Ge e Kaitao Li, per il loro aiuto nello sviluppo della strumentazione.

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<li>Binnig, G., Quate, C. F., Gerber, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+Force+Microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">Atomic Force Microscope.</a> Physical Review Letters. 56, 930-933 (1986).</li>
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<li>Kong, F., Garcia, A. J., Mould, A. P., Humphries, M. J., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Demonstration+of+catch+bonds+between+an+integrin+and+its+ligand%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Demonstration of catch bonds between an integrin and its ligand.</a> The Journal of cell biology. 185, 1275-1284 (2009).</li>
<li>Yago, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catch+bonds+govern+adhesion+through+L-selectin+at+threshold+shear%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Catch bonds govern adhesion through L-selectin at threshold shear.</a> The Journal of cell biology. 166, 913-923 (2004).</li>
<li>Yago, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+glycoprotein+Ibalpha+forms+catch+bonds+with+human+WT+vWF+but+not+with+type+2B+von+Willebrand+disease+vWF%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">Platelet glycoprotein Ibalpha forms catch bonds with human WT vWF but not with type 2B von Willebrand disease vWF.</a> The Journal of clinical investigation. 118, 3195-3207 (2008).</li>
<li>Chesla, S. E., Selvaraj, P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+two-dimensional+receptor-ligand+binding+kinetics+by+micropipette%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Measuring two-dimensional receptor-ligand binding kinetics by micropipette.</a> Biophysical journal. 75, 1553-1572 (1998).</li>
<li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+kinetics+of+two-dimensional+TCR+and+pMHC+interactions+determine+T-cell+responsiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The kinetics of two-dimensional TCR and pMHC interactions determine T-cell responsiveness.</a> Nature. 464, 932-936 (2010).</li>
<li>Heinrich, V., Wong, W. P., Halvorsen, K., Evans, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+biomolecular+interactions+by+fast+three-dimensional+tracking+of+laser-confined+carrier+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir+%3A+the+ACS+journal+of+surfaces+and+colloids%22%5BJournal%5D)">Imaging biomolecular interactions by fast three-dimensional tracking of laser-confined carrier particles.</a> Langmuir : the ACS journal of surfaces and colloids. 24, 1194-1203 (2008).</li>
<li>Chen, W., Evans, E. A., McEver, R. P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+receptor-ligand+interactions+between+surfaces+by+thermal+fluctuations%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Monitoring receptor-ligand interactions between surfaces by thermal fluctuations.</a> Biophysical journal. 94, 694-701 (2008).</li>
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<li>Evans, E., Leung, A., Heinrich, V., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+switching+and+coupling+between+two+dissociation+pathways+in+a+P-selectin+adhesion+bond%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Mechanical switching and coupling between two dissociation pathways in a P-selectin adhesion bond.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 11281-11286 (2004).</li>
<li>Ju, L., Dong, J. -f, Cruz, M. A., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+N-terminal+Flanking+Region+of+the+A1+Domain+Regulates+the+Force-dependent+Binding+of+von+Willebrand+Factor+to+Platelet+Glycoprotein+Ib%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The N-terminal Flanking Region of the A1 Domain Regulates the Force-dependent Binding of von Willebrand Factor to Platelet Glycoprotein Ib.</a> Journal of Biological Chemistry. 288, (2013).</li>
<li>Chen, W., Lou, J., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forcing+switch+from+short-+to+intermediate-+and+long-lived+states+of+the+alphaA+domain+generates+LFA-1%2FICAM-1+catch+bonds%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Forcing switch from short- to intermediate- and long-lived states of the alphaA domain generates LFA-1/ICAM-1 catch bonds.</a> The Journal of biological chemistry. 285, 35967-35978 (2010).</li>
<li>Chen, W., Lou, J., Evans, E. A., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observing+force-regulated+conformational+changes+and+ligand+dissociation+from+a+single+integrin+on+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Observing force-regulated conformational changes and ligand dissociation from a single integrin on cells.</a> The Journal of cell biology. 199, 497-512 (2012).</li>
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<li>Liu, B., Chen, W., Evavold, B. D., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accumulation+of+dynamic+catch+bonds+between+TCR+and+agonist+peptide-MHC+triggers+T+cell+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Accumulation of dynamic catch bonds between TCR and agonist peptide-MHC triggers T cell signaling.</a> Cell. 157, 357-368 (2014).</li>
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<li>Chen, W., Zarnitsyna, V. I., Sarangapani, K. K., Huang, J., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+Receptor-Ligand+Binding+Kinetics+on+Cell+Surfaces%3A+From+Adhesion+Frequency+to+Thermal+Fluctuation+Methods%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+molecular+bioengineering%22%5BJournal%5D)">Measuring Receptor-Ligand Binding Kinetics on Cell Surfaces: From Adhesion Frequency to Thermal Fluctuation Methods.</a> Cellular and molecular bioengineering. 1, 276-288 (2008).</li>
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<li>Xiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+and+kinetics+of+force-induced+conformational+changes+of+an+alphaA+domain-containing+integrin%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Structural basis and kinetics of force-induced conformational changes of an alphaA domain-containing integrin.</a> PloS one. 6, e27946(2011).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Un esperimento di successo fBFP comporta alcune considerazioni critiche. In primo luogo, per il calcolo forza di essere affidabile, la micropipetta, l&#39;RBC, ed il tallone della sonda devono essere allineati come vicino coassiale possibile. La proiezione del RBC all&#39;interno della pipetta dovrebbe essere circa un diametro della sonda pipetta in modo che l&#39;attrito tra RBC e la pipetta è trascurabile. Per un tipico RBC umana, il diametro ottimale pipetta è 2.0-2.4 micron, che produce un migliore adattamento di Eq...

Cellula-cellula e cellula-matrice extracellulare (ECM) adesione è mediata dal legame tra i recettori della superficie cellulare, proteine ​​ECM, e / o lipidi 1. Binding consente cellule formano strutture funzionali 1, così come riconoscono, comunicare e reagiscono all&#39;ambiente 1-3. A differenza di proteine ​​solubili (ad esempio, citochine e fattori di crescita) che si legano da un tridimensionale (3D) fase fluida sui recettori di superficie cellulare, i recettori di adesione cellulare formano legami con i propri ligandi attraverso una stretta spazi di giunzione per colmare due superfici contrapposte che limitano molecolare diffusione in un dimensionale interfaccia due (2D) 4-7. In contrasto con la cinetica 3D che sono comunemente misurata mediante analisi di legame tradizionali (ad esempio, di risonanza plasmonica di superficie o SPR), cinetica 2D devono essere quantificati con le tecniche specializzate, come microscopia a forza atomica (AFM) 8-10, flusso camera di 11,12, micropipetta 13,14, otticapinzette 15 e vigore biomembrane sonda (BFP) 16-21. Più che semplicemente fornendo linkage fisico per coesione cellulare, molecole di adesione sono un componente importante della macchina di segnalazione per la cella di comunicare con l&#39;ambiente circostante. C&#39;è stato un crescente interesse per comprendere come l&#39;impegno ligando di molecole di adesione avvia segnale intracellulare e come il segnale iniziale viene trasdotto all&#39;interno della cellula. Intuitivamente, proprietà del recettore-ligando può influire i segnali che induce. Tuttavia, è difficile sezionare rapporti meccanicistici tra l&#39;interazione extracellulare ed eventi di segnalazione intracellulare utilizzando insieme tradizionale di saggi biochimici causa delle loro molte limitazioni, ad esempio, una risoluzione temporale povero e la totale assenza di risoluzione spaziale. Metodi che permettono sia biofisica (2D cinetica legame recettore-ligando) e biochimiche osservazioni (segnalazione) su Live esistentele cellule sono substrati di rigidità sintonizzabile 22, elastomeri array pilastro 23 e dispositivi camera di flusso / microfluidica incorporato con capacità di fluorescenza 24-26. Tuttavia, letture di segnalamento e il legame al recettore-ligando devono essere ottenuti separatamente (più spesso con metodi diversi), rendendo difficile sezionare relazioni temporali e spaziali delle caratteristiche dei titoli con eventi di segnalazione. Convenzionale BFP è una spettroscopia di forza ultrasensibile con alta risoluzione spazio-temporale 17. Esso utilizza una cella flessibile rossi del sangue (RBC) come un sensore di forza, che consente la misurazione della cinetica 2D singola molecola, le proprietà meccaniche e cambiamenti conformazionali 14,16,19-21,27-29. Un BFP a base di immagini a fluorescenza (fBFP) correla la cinetica di legame recettore-ligando con la segnalazione cellulare vincolante-attivato a scala singola molecola. Con questa impostazione, in attività di segnalazione delle cellule in situ nel contesto meccanicamente superficialistimolazione cal è stata osservata in cellule T 27. Il fBFP è versatile e può essere utilizzato per studi di adesione e segnalazione cellulare mediata da altre molecole di altre celle.

<table><tbody><tr><td>Fosfato di sodio monobasico monoidrato (NaH2PO4 &bull; H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638</td><td>Preparazione tampone fosfato</td></tr><tr><td>Anhy. Fosfato di sodio bibasico (Na2HPO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7907</td><td>Preparazione tampone fosfato</td></tr><tr><td>Carbonato di sodio (Na2CO3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2127</td><td>Preparazione tampone carbonato/bicarbonato</td></tr><tr><td>Bicarbonato di sodio (NaHCO3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td>Carbonato/bicarbonato Preparazione del tampone</td></tr><tr><td>Cloruro di sodio (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td>N2-5% Preparazione del tampone</td></tr><tr><td>Cloruro di potassio (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td>N2-5% Preparazione del tampone</td></tr><tr><td>Fosfato di potassio monobasico (KH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td>N2-5% Preparazione del tampone</td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td>Preparazione del tampone N2-5%</td></tr><tr><td>MAL-PEG3500-NHS</td><td>JenKem</td><td>A5002-1</td><td>Funzionalizzazione delle perle</td></tr><tr><td>Biotina-PEG3500-NHS</td><td>JenKem</td><td>A5026-1</td><td>Biotinilazione dei globuli rossi</td></tr><tr><td>Nistatina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N6261</td><td>Regolazione dell'osmolarità dei globuli rossi</td></tr><tr><td>Idrossido di ammonio (NH4OH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-6899</td><td>Perla di vetro silanizzazione</td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>BDH</td><td>67-56-1</td><td>Silanizzazione di perle di vetro</td></tr><tr><td>30% Perossido di idrogeno (H2O2)</td><td>J. T. Barker</td><td>Jan-86</td><td>Silanizzazione di perle di vetro</td></tr><tr><td>Acido acetico (glaciale)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ARK2183</td><td>Silanizzazione di perle di vetro</td></tr><tr><td>3-Mercaptopropiltrimethoxysilane (MPTMS)</td><td>Uct Specialties, llc</td><td>4420-74-0</td><td>Funzionalizzazione di perle</td></tr> di <tr><td>vetro Borosilicato Perle di vetro</td><td>Distrilab Particle Technology</td><td>9002</td><td>Funzionalizzazione di perle di vetro</td></tr><tr><td>Streptavidina&minus; Maleimmide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9415</td><td>Funzionalizzazione con perle di vetro</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0336</td><td>Funzionalizzazione del ligando</td></tr><tr><td>Fura2-AM</td><td>Life Technologies</td><td>F-1201</td><td>Caricamento intracellulare del colorante a fluorescenza del calcio</td></tr><tr><td>Dimetilsolfossido (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td>Caricamento intracellulare del colorante a fluorescenza del calcio</td></tr><tr><td>Perle di Quantibrite PE</td><td>BD Biosciences</td><td>340495</td><td>Quantificazione della densità</td></tr><tr><td>Citometro a flusso</td><td>BD Biosciences</td><td>BD LSR II</td><td>Quantificazione della densità</td></tr><tr><td>Tubo capillare 0,7-1,0 mm x 30 pollici</td><td>Kimble Chase</td><td>46485-1</td><td>Produzione di micropipette</td></tr><tr><td>Flaming/Brown Estrattore di micropipette Strumento</td><td>sutter</td><td>P-97</td><td>Produzione di micropipette</td></tr><tr><td>Pipetta microforce</td><td>Narishige</td><td>MF-900</td><td>Micropipetta per la produzione di</td></tr><tr><td>olio minerale</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2629-1</td><td>Assemblaggio della camera</td></tr><tr><td>Coperchio del microscopio Vetro</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-G</td><td>Assemblaggio della camera</td></tr><tr><td>Micro-iniettore</td><td>World Precision Instruments</td><td>MF34G-5</td><td>Assemblaggio della camera</td></tr><tr><td>Siringa da 1 ml</td><td>BD&nbsp;</td><td>Assemblaggio della</td><td>camera</td>309602</tr><tr><td>Assemblaggio della micropipetta</td><td>Narishige</td><td>HI-7</td><td>Assemblaggio della camera</td></tr><tr><td>Parti meccaniche e adattatori progettati in casa mediante lavorazione CNC.</td><td>Strumento di Biofisica</td><td>Tutte le parti sono personalizzate secondo i disegni CAD.</td><td>Sistema BFP</td></tr><tr><td>Microscopio (TiE invertito)</td>Sistema <td>Nikon</td><td>MEA53100</td><td>BFP</td></tr><tr><td>Obiettivo CFI Piano Fluor 40x (NA 0,75, WD 0,72 mm, Spg)</td><td>Sistema Nikon</td><td>MRH00401</td><td>BFP</td></tr><tr><td>Fotocamera, GE680, 640 x 480, GigE, 1/3" CCD, mono</td><td>Graftek Imaging</td><td>02-2020C</td><td>Sistema BFP</td></tr><tr><td>Prosilica GC1290 - ICX445, 1/3", C-Mount, 1280 x 960, Mono., CCD, ADC a 12 bit</td><td>Graftek Imaging</td><td>02-2185A</td><td>BFP sistema</td></tr><tr><td>Testa di sonda submicronica manuale con telecomando ad alta risoluzione</td><td>Sistema Karl Suss</td><td>PH400</td><td>BFP</td></tr><tr><td>Tavolo antivibrante (5' x 3')</td><td>Sistema TMC</td><td>77049089</td><td>BFP</td></tr><tr><td>Tavolino traslante manuale 3D</td><td>Newport</td><td>462-XYZ-M</td><td></td></tr><tr><td>Software CAD 3D SolidWorks</td><td>SOLIDWORKS Corp.</td><td>Versione 2012 SP5</td><td>Sistema BFP</td></tr> Software <tr><td>LabVIEW National</td><td>Instruments</td><td>Versione 2009</td><td>Sistema BFP, programma BFP</td></tr><tr><td>Stadio piezotraslante 3D</td><td>Physik Instrumente</td><td>M-105.3P</td><td>Sistema BFP</td></tr><tr><td>Piezo accuator lineare</td><td>Physik Instrumente</td><td>P-753.1CD</td><td>Sistema BFP</td></tr><tr><td>Software</td><td></td> Micromanager <td>Versione 1.4</td><td>Sistema fBFP, fluorescenza programma di imaging</td></tr><tr><td>Dual Cam (DC-2)</td><td>Fotometria</td><td>77054724</td><td>sistema fBFP</td></tr><tr><td>Filtro di emissione Dual Cam (T565LPXR)</td><td>Fotometria</td><td>77054725</td><td>sistema fBFP</td></tr><tr><td>Telecamera a fluorescenza</td><td>Hamamatsu</td><td>ORCA-R2 C10600-10B</td><td>Sistema fBFP</td></tr><tr><td>Film plastico di paraffina (Parafilm)</td><td>Bemis Company, Inc</td><td>Sigillatura della bottiglia</td><td>PM996</td></tr><tr><td>Carbonato/ tampone bicarbonato (pH 8,5)</td><td></td><td></td><td>8,4 g/L carbonato di sodio (Na2CO3), 10,6 g/L bicarbonato di sodio (NaHCO3)</td></tr><tr><td>Tampone fosfato (pH 6,5-6,8)</td><td></td><td></td><td>27,6 g/L NaPhosphate monobasico (NaH2PO4 &; H2O), 28,4 g/L Anhy. NaFosfato dibasico (Na2HPO4)</td></tr><tr><td>N2-5% tampone (pH 7,2)</td><td></td><td></td><td>20,77 g/L cloruro di potassio (KCl), 2,38 g/L cloruro di sodio (NaCl), 0,13 g/L fosfato di potassio monobasico (KH2PO4), 0,71 g/L di anhy. sodio fosfato bibasico (Na2HPO4), 9,70 g/L di saccarosio</td></tr></tbody></table>

fluorescenza biomembrane forza probe: quantificazione simultanea di cinetica recettore-ligando e binding-indotta intracellulare segnalazione su una singola cella

Fluorescence Biomembrane Force Probe: Concurrent Quantitation of Receptor-ligand Kinetics and Binding-induced Intracellular Signaling on a Single Cell

Recettore-ligando membrana mediano molte funzioni cellulari. Cinetica Binding e segnalazione a valle innescato da queste interazioni molecolari sono probabilmente influenzate dall&#39;ambiente meccanico in cui legame e segnalazione avvengono. Uno studio recente ha dimostrato che la forza meccanica può regolare il riconoscimento dell&#39;antigene da e attivazione del recettore delle cellule T (TCR). Ciò è stato reso possibile da una nuova tecnologia che abbiamo sviluppato e fluorescenza Definito sensore di forza biomembrane (fBFP), che combina spettroscopia di forza singola molecola con microscopia a fluorescenza. L&#39;utilizzo di un globulo rosso umano ultra-morbido come il sensore di forza sensibile, una macchina fotografica ad alta velocità e in tempo reale, le tecniche di monitoraggio delle immagini, la fBFP è di ~ 1 PN (10 -12 N), ~ 3 nm e ~ 0.5 msec a forza, risoluzione spaziale e temporale. Con il fBFP, si può misurare con precisione singoli cinetica di legame recettore-ligando ai sensi del regolamento vigente e allo stesso tempo l&#39;immagine vincolante-attivato cal intracellularecico segnalazione su una singola cellula dal vivo. Questa nuova tecnologia può essere utilizzata per studiare altri recettore-ligando di membrana e la segnalazione in altre cellule sotto regolazione meccanica.

La tecnica BFP è stato lanciato da laboratorio Evans nel 1995 17. Questo strumento picoforce è stato ampiamente utilizzato per misurare le interazioni di proteine ​​immobilizzate su superfici, in modo da analizzare la cinetica bidimensionali di molecole di adesione interagire con i loro ligandi 16,19,20, 30, per misurare l&#39;elasticità molecolare 21,29, e per determinare proteine ​​conformazionale cambia 21. Per un fBFP, un ulteriore set di dispositivi epi-fluorescenza conne...

Descriviamo una tecnica per misurare contemporaneamente la cinetica di legame del singolo recettore-ligando regolata dalla forza e l'imaging in tempo reale della segnalazione del calcio in un singolo linfocita T.

Fluorescenza Biomembrane Forza Probe: quantificazione simultanea di Cinetica recettore-ligando e Binding-indotta intracellulare segnalazione su una singola cella

Membrane receptor-ligand interactions mediate many cellular functions. Binding kinetics and downstream signaling triggered by these molecular interactions ...

L'obiettivo generale di questa procedura è misurare simultaneamente il legame recettoriale e osservare il segnale del calcio indotto dal legame a livello di singola cellula. Questo risultato si ottiene innanzitutto isolando il biotino e regolando l'osmolarità degli eritrociti umani o RBC per utilizzarli come trasduttore di forza ultra-sensibile. Il secondo passaggio consiste nel funzionalizzare delle microsfere di vetro, operazione che comprende pulizia, dilatazione e rivestimento con ligando.Successivamente, i linfociti T vengono isolati e incubati con il colorante per il calcio fewer 2:00 AM, che permette l'osservazione della concentrazione intracellulare di ioni calcio. Il passaggio finale consiste nel preparare le micropipette nella camera sperimentale, necessarie specificamente per l'allestimento dell'esperimento. Infine, la tecnica del biosensore a membrana fluorescente per la misura della forza, o metodo BFP, viene utilizzata per mostrare l'adesione di una cellula a una microsfera rivestita di ligando, misurare la cinetica di legame tra recettore e ligando e, nel contempo, monitorare il livello di calcio intracellulare.Questa tecnica è utile per comprendere come le cellule T percepiscono la forza meccanica attraverso il riconoscimento degli androgeni. Un vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti è che la FBIP può misurare simultaneamente la cinetica di legame tra recettore e ligando e un segnale intracellulare. Le parti più difficili di questo protocollo includono la produzione manuale di micro pep di diametro corretto, la raccolta di cellule e di api con micro PEP e l'assemblaggio della sonda di forza, che potrebbe non riuscire al primo tentativo, anche se lui non è potuto essere presente per la dimostrazione di questo video.Il coautore Arnold G., che ha recentemente completato il suo dottorato nel mio laboratorio, ha contribuito in modo significativo alla validazione iniziale della fabbricazione del protocollo FBAP. Ottenere da otto a dieci microlitri di sangue da una puntura al dito e aggiungerli a un millilitro di tampone carbonato bicarbonato, lasciare vorticare o pipettare la miscela e centrifugare per un minuto a 900 ×g. Eliminare il soprannatante prima di eseguire il lavaggio con tampone carbonato bicarbonato. Lavare ancora una volta.Successivamente, mescolare 10 microlitri del concentrato di globuli rossi ottenuto con 171 microlitri di tampone carbonato bicarbonato e 1049 microlitri di biotina. Soluzione di legante PEG NHS e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti. Utilizzando le stesse procedure di lavaggio precedenti, lavare il miscuglio di globuli rossi ottenuto una volta con tampone carbonato bicarbonato e quindi due volte con N due 5% tampone.Successivamente, diluire la Nistatina nel buffer N2 al 5%. Per ottenere una concentrazione finale di 40 microlitri per millilitro, mescolare 5 microlitri di globuli rossi biotinilati con 71,4 microlitri di soluzione di Nistatina e incubare per un'ora a zero gradi Celsius. Infine, lavare i campioni due volte con il buffer N2 al 5% e conservare i globuli rossi biotinilati nel buffer N2 al 5% più 0,5% di BSA in frigorifero. Montare un pezzo di micropipetta da tre pollici sul tiratore di micropipette.Fare clic sul pulsante di trazione in modo che la parte centrale della capillare venga riscaldata dalla macchina e la capillare venga tirata alle due estremità per ottenere due capillari con punte affilate, che costituiscono le pipette grezze. Successivamente, montare una pipetta grezza sul supporto della pipetta del microfornello e riscaldare per fondere la sfera di vetro sul fornello. Inserire la punta della pipetta grezza all'interno della sfera di vetro.Raffreddare la sfera di vetro e tirare la pipetta grezza per romperla dall'esterno, lasciando la sua estremità all'interno della sfera. Ripetere questa procedura fino a ottenere l'orifizio desiderato all'estremità. Per costruire la camera per cellule, tagliare innanzitutto una lamella di dimensioni 40 millimetri per 22 millimetri per 0,2 millimetri usando un tagliavetro, ottenendo due pezzi di dimensioni 40 millimetri per 11 millimetri per 0,2 millimetri. La camera per cellule è costruita sulla base di un supporto per camera artigianale composto da due quadrati di metallo e da un manico che li collega insieme.Utilizzando una colla di precisione, incollare un coprioggetto sul lato inferiore del supporto della camera in modo che copra i due quadrati metallici. Analogamente, incollare l'altro coprioggetto sul lato superiore, in modo da formare una camera a coprioggetti paralleli. Successivamente, utilizzare la pipetta per iniettare 200 microlitri di tampone sperimentale tra i due coprioggetti.Assicurarsi che il tampone entri in contatto con entrambi i vetrini. Ruotare e agitare delicatamente la camera per far sì che il tampone raggiunga entrambe le estremità della camera. Quindi, iniettare con attenzione l'olio minerale su entrambi i lati della camera, affiancando la zona del tampone sperimentale, sigillando così il tampone dall'aria aperta.Iniettare sospensioni di prob. Le perle sono bcs e i bersagli nelle regioni superiore, media e inferiore della zona tampone rispettivamente. Per iniziare l'esperimento BFP, accendere il microscopio e la sorgente luminosa.Posizionare la camera sullo stadio principale del microscopio. Il passaggio successivo consiste nell'installare tutte e tre le micropipette del BFP. La sonda a sinistra serve per afferrare un globulo rosso.La destinazione in basso a destra consiste nell'afferrare la cellula e l'aiutante in basso a destra serve per afferrare una perlina da installare; utilizzare un microiniettore per riempire posteriormente una micropipetta con il buffer sperimentale. Rimuovere la micropipetta dal supporto e tenerla in una posizione più bassa in modo che il liquido goccioli dalla punta. Inserire rapidamente la micropipetta nella punta del supporto, assicurandosi che nessuna bolla d'aria entri nella micropipetta.Durante l'inserimento, stringere la vite del supporto, quindi montare ciascun supporto per pipetta sul relativo micromanipolatore. Spingere la micropipetta verso la camera in modo che le loro punte entrino nell'area del buffer della camera. Regolare la posizione della micropipetta e individuarle nel campo visivo del microscopio.Spostarsi sul palchetto del supporto della camera per individuare le colonie dei tre elementi. Uno alla volta, regolare la posizione della micropipetta corrispondente ruotando le manopole dei manipolatori in modo da avvicinare la punta della micropipetta a una cellula o a un microsfera, aspirando la cellula o il microsfera. Regolando la pressione all'interno della micropipetta corrispondente, tutte e tre le micropipette cattureranno i rispettivi elementi.Spostarsi sul supporto della camera per trovare uno spazio libero lontano dalle colonie degli elementi iniettati dove verrà eseguito l'esperimento. Passare alla modalità visiva del microscopio per visualizzare l'immagine sul programma del computer. Portare tutti e tre gli elementi sulle punte della pipetta nel campo visivo del programma.Successivamente, allineare la microsfera sonda con l'eritrocita e manovrare con attenzione la microsfera fino all'apice dell'eritrocita. Ora toccare brevemente la microsfera contro l'eritrocita e ritrarla delicatamente; regolare la pressione della micropipetta ausiliaria per soffiare leggermente e allontanare la microsfera, in modo che rimanga incollata all'apice dell'eritrocita. Spostare la pipetta ausiliaria e allineare la microsfera bersaglio e quella sonda sul programma.Nella finestra del campo visivo, utilizzare gli strumenti del programma per misurare i rispettivi raggi della micropipetta sonda, dell'eritrocita e dell'area di contatto circolare tra l'eritrocita e la microsfera della sonda. Questi valori consentono la stima della costante elastica dell'eritrocita mediante l'equazione riportata nel protocollo testuale. Dopo aver inserito nel programma il valore desiderato della costante elastica dell'eritrocita, tracciare una linea orizzontale lungo l'apice dell'eritrocita, il che produrrà una curva nella finestra adiacente che indica l'intensità luminosa di ciascun pixel.Trascinare la linea di soglia in modo che si trovi all'incirca a metà della profondità della curva. Successivamente, selezionare la modalità di esperimento desiderata: saggio di adesione mediante fluttuazione termica, saggio di frequenza di adesione o saggio a forza costante. Impostare i parametri secondo necessità.Fare clic su "start", che permette al programma di muovere la pipetta bersaglio e di spingere il bersaglio a contatto e a distanza dalla sonda; in parallelo verranno raccolti i dati e registrata in tempo reale la posizione del microsfera sonda. Arrestare il programma cliccando sul pulsante "stop experiment", al quale punto apparirà una finestra. Per consentire il salvataggio dei dati acquisiti, utilizzare la funzione di fluorescenza del sistema BFP attivando la sorgente di luce di eccitazione e la telecamera per fluorescenza, che sono controllate da un programma separato.Quindi selezionare i parametri per l'immagine di fluorescenza, inclusi guadagno, tempo di esposizione e canali di eccitazione. Seguire tutte le preparazioni indicate nel protocollo dell'esperimento BFP, inclusa l'allineamento della sonda e della cellula target per consentire la visualizzazione in tempo reale dell'immagine fluorescente della cellula target eccitata da luce a 340 nanometri o 380 nanometri. Utilizzare lo strumento di sezionamento per delimitare approssimativamente l'area all'interno della quale la cellula rimarrà per tutta la durata del periodo di registrazione.Successivamente, fare clic contemporaneamente su "record" e su "start clicking". La funzione record permette a una luce di 340 nanometri e 380 nanometri di eccitare alternativamente il colorante fluorescente intracellulare. Una coppia di immagini fluorescenti corrispondenti verrà registrata alternativamente, circa una ogni secondo.Fare clic su "start" avvia l'esperimento BFP per l'analisi dell'interazione molecolare e l'esperimento di imaging della fluorescenza per monitorare la segnalazione del calcio intracellulare, procedendo quindi all'analisi dei dati come descritto nel protocollo testuale. Nel tempo, le curve dei dati grezzi della forza, la forza viene ricavata dal tracciamento del cambiamento di posizione del bead del pro. In assenza di un evento di adesione, la forza tornerà a zero nel segnale temporale inverso della forza dopo che la cellula bersaglio è stata ritratta dalla superficie del bead.Al contrario, in un evento di forza di rottura, l'adesione si manifesterà con un rapido aumento della forza a un livello positivo durante la retrazione, seguito da un rapido ritorno a zero. In un evento di durata, la forza positiva sarà mantenuta costante per realizzare una fase di plateau. La lunghezza del plateau corrisponde alla durata.Eseguendo ripetutamente cicli dell'esperimento VFP, verrà ottenuta una curva della forza in funzione del tempo. Qui sono mostrate le immagini fluorescenti di alcune o due cellule T caricate, eccitate mediante canali di luce a 340 nanometri e 380 nanometri. Entrambe le immagini mostrano chiaramente i contorni della cellula, indicando una buona colorazione della cellula. Dopo aver ricavato i dati di cinetica di legame e i dati di fluorescenza da una cellula T, nel medesimo grafico vengono presentate sia la curva del tempo di vita cumulativo sia la curva del livello di calcio, al fine di individuare la correlazione tra queste due grandezze.Ora dovresti avere una buona comprensione di come eseguire l'esperimento A-F-B-I-P. Durante questa procedura, è importante ricordarsi di verificare la presenza di eventuali difetti nella sonda di forza, come il diametro della micropipetta, la lunghezza della protrusione della cellula di gomma e la posizione della microsfera.Tutto ciò influirà sull'accuratezza della misurazione della forza. Questa tecnica apre la strada ai ricercatori nel campo della biologia meccanica molecolare per studiare il meccanismo della trasduzione meccanica in tutti i possibili sistemi biologici.

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Sistema automatico per le misure di fluorescenza singola molecola di superficie, immobilizzato Biomolecole

Ci descrive un metodo che misura la cinetica del trasporto ionico di proteine ​​di membrana a fianco sito-specifica analisi dei cambiamenti conformazionali mediante fluorescenza su singole cellule. Questa tecnica è adattabile a canali ionici, trasportatori e pompe ioniche e può essere utilizzato per determinare vincoli di distanza tra le subunità proteiche.

Esaminando la dinamica conformazionale delle proteine ​​di membrana In situ Con il sito-diretta Etichettatura fluorescenza

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Spettroscopia di fluttuazione della fluorescenza per studiare l'interazione delle proteine a contatto cellulare

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Questo protocollo descrive come utilizzare la microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale per visualizzare e tracciare singoli recettori sulla superficie delle cellule viventi e quindi analizzare la mobilità laterale del recettore, le dimensioni dei complessi recettoriali e per visualizzare le interazioni transitorie recettore-recettore. Questo protocollo può essere esteso ad altre proteine di membrana.

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Recentemente sono stati sviluppati numerosi biosensori di forza basati su FRET, che consentono la risoluzione proteina-specifica della forza intracellulare. In questo protocollo, dimostriamo come uno di questi sensori, progettato per il linker della proteina del complesso nucleoscheletro-citoscheletro (LINC) Nesprin-2G, possa essere utilizzato per misurare le forze di actomiosina sul complesso nucleare LINC.

Un protocollo per l&#39;utilizzo di trasferimento di energia per risonanza (FRET) biosensori -force per misurare le forze meccaniche in tutto il complesso LINC nucleare

Questo protocollo descrive un approccio di basato su spettroscopia di fluorescenza fluttuazione per indagare le interazioni tra proteine che mediano interazioni cellula-cellula, cioè proteine localizzate nelle giunzioni delle cellule, direttamente nelle cellule viventi. Forniamo le linee guida dettagliate sulla calibrazione dello strumento, acquisizione dati e analisi, comprese le correzioni al fonti possibili manufatto.

Un'analisi di spettroscopia di fluorescenza fluttuazione delle interazioni proteina-proteina a contatti cellula-cellula

Qui, presentiamo un protocollo per l'uso simultaneo di Förster risonanza energia basati sul trasferimento di tensione sensori per misurare recupero carico e fluorescenza della proteina dopo photobleaching per misurare la dinamica della proteina che permette la misurazione di sensibili alla forza dynamics della proteina nelle cellule viventi.

Misurazione delle dinamiche di sensibili alla forza della proteina in cellule viventi, utilizzando una combinazione di tecniche di fluorescenza

Questo protocollo presenta un metodo per misurare il legame dei nucleotidi adenina ai recettori in tempo reale in un ambiente cellulare. Il legame è misurato come trasferimento di energia di risonanza di Förster (FRET) tra derivati del nucleotide trinitrofenile e proteine marcate con un amminoacido fluorescente non canonico.

Misurare il legame nucleotidico a proteine di membrana intatte e funzionali in tempo reale

Presentiamo un protocollo sperimentale e un flusso di lavoro di analisi dei dati per eseguire la spettroscopia di correlazione incrociata a fluorescenza a doppio colore (FCCS) combinata con il trasferimento di energia di risonanza di Förster (FRET) per studiare la dinamica del recettore di membrana nelle cellule vive utilizzando le moderne tecniche di etichettatura a fluorescenza.

Spettroscopia di correlazione incrociata a fluorescenza a doppio colore per studiare l'interazione proteina-proteina e la dinamica proteica nelle cellule vive

Qui, descriviamo una serie di metodi per caratterizzare l'interazione delle proteine con membrane di cellule o microvescicole.

Analisi dell'interazione di proteine marcate fluorescenti con microvescicole fosfolipidiche artificiali utilizzando la citometria a flusso quantitativa

Scopri la tecnica BFP per misurare simultaneamente la cinetica di legame recettore-ligando e la segnalazione del calcio in singole cellule T. Questo metodo utilizza eritrociti biotinilati come trasduttori di forza ultra-sensibili.

Fluorescenza Biomembrane Forza Probe: quantificazione simultanea di Cinetica recettore-ligando e Binding-indotta intracellulare segnalazione su una singola cella (Video) | JoVE Journal

Fluorescenza Biomembrane Forza Probe: quantificazione simultanea di Cinetica recettore-ligando e Binding-indotta intracellulare segnalazione su una singola cella

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