Fluorescenza Biomembrane Forza Probe: quantificazione simultanea di Cinetica recettore-ligando e Binding-indotta intracellulare segnalazione su una singola cella

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di misurare simultaneamente il recettore, il simile e il legame e di osservare la segnalazione del calcio indotta dal legame su una singola cellula. Ciò si ottiene isolando prima la biotina e regolando l'osmolarità dei globuli rossi umani o RBC per utilizzarli come trasduttori di forza ultrasensibili. Il secondo passo consiste nella funzionalizzazione delle perle di vetro su microscala, che include la pulizia, la dilatazione e il rivestimento del ligando.

Successivamente, le cellule T vengono isolate e incubate con il colorante di calcio meno 2:00 AM, il che consente l'osservazione della concentrazione intracellulare di ioni calcio. La fase finale consiste nella preparazione delle micropipette nella camera sperimentale che sono appositamente necessarie per la configurazione dell'esperimento. In definitiva, la bio sonda di forza a membrana a fluorescenza o tecnica BFP viene utilizzata per mostrare l'adesione di una cellula a una perlina rivestita di ligando, misurare la cinetica di legame del ligando del recettore e nel frattempo monitorare il livello intracellulare di calcio.

Questa tecnica è utile per capire come la forza meccanica viene rilevata dalle cellule T attraverso il riconoscimento degli androgeni. Uno dei principali vantaggi di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti è che FBIP può misurare contemporaneamente la cinetica di legame del ligando del recettore e una segnalazione intracellulare. Le parti impegnative di questo protocollo includono la produzione manuale di micro percorsi pep dei diametri corretti, il prelievo di celle e api con micro PEP e l'assemblaggio della sonda di forza, che all'inizio può fallire, anche se non poteva essere qui per la dimostrazione di questo video.

Il co-autore Arnold G, che ha recentemente completato il suo dottorato di ricerca nel mio laboratorio, ha contribuito in modo significativo alla convalida iniziale della fabbricazione del protocollo FBAP. Prelevare da 8 a 10 microlitri di sangue da una puntura del dito e aggiungere a un millilitro di bicarbonato di carbonato, tamponare a getto, lasciare vortice o pipettare la miscela e centrifugare per un minuto a 900 G.Scartare il surnatante prima di eseguire il tampone di bicarbonato di carbonato. Lavare ancora una volta.

Quindi, mescolare 10 microlitri della confezione di globuli rossi risultante, 171 microlitri di tampone bicarbonato e 1049 microlitri di biotina. Soluzione linker PEG NHS e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti. Utilizzando le stesse procedure di lavaggio prima di lavare la miscela di globuli rossi risultante una volta con tampone di bicarbonato e poi due volte con N due tampone al 5%.

Successivamente, diluire la nistatina in N due tampone al 5%. Per ottenere una concentrazione finale di 40 microlitri per millilitro, mescolare cinque microlitri di globuli rossi biotinilati con 71,4 microlitri di soluzione di nistatina e incubare per un'ora a zero gradi Celsius. Infine, lavare i campioni due volte con N due tampone al 5% e conservare i globuli rossi biotinilati con N due tampone al 5% più 0,5% di BSA in frigorifero, montare un pezzo di micro pipetta da tre pollici sull'estrattore per micro pipette.

Fare clic sul pulsante di trazione in modo che il centro del capillare venga riscaldato dalla macchina e il capillare venga tirato sulle due estremità per creare due capillari con punte affilate, che sono le pipette grezze. Quindi montare una pipetta grezza sul supporto della micropipetta Forgiare il calore per fondere la sfera di vetro sulla forgia. Inserire la punta della pipetta grezza all'interno della sfera di vetro.

Raffreddare la sfera di vetro e tirare la pipetta grezza per romperla dall'esterno, lasciando la punta all'interno della sfera. Ripetere questa procedura fino a ottenere l'orifizio della punta desiderato per costruire la camera della cella, prima tagliata a 40 millimetri per 22 millimetri per 0,2 millimetri di vetrino utilizzando un tagliavetro in due pezzi da 40 millimetri per 11 millimetri per 0,2 millimetri. La camera della cella è costruita sulle fondamenta di un portacamera fatto in casa costituito da due pezzi di quadrati di metallo e da una maniglia che li collega insieme.

Usando la grazia, incollare un vetrino coprioggetto sul lato inferiore del supporto della camera in modo che colleghi i due quadrati di metallo. Allo stesso modo, incollare l'altro vetrino coprioggetto sul lato superiore, che formerà una camera parallela della cella del vetrino. Quindi, utilizzare la pipetta per iniettare 200 microlitri di tampone sperimentale tra i due vetrini.

Assicurarsi che il tampone sia attaccato a entrambi i vetrini. Ruotare delicatamente e scuotere la camera per lasciare che il tampone tocchi entrambe le estremità della camera. Quindi iniettare con cura l'olio minerale in entrambi i lati della camera, fiancheggiando la zona cuscinetto sperimentale, sigillando così il tampone dall'aria aperta.

Le perle sono bcs e bersagli rispettivamente nelle regioni superiore, centrale e inferiore della zona cuscinetto. Per iniziare l'esperimento BFP, accendi il microscopio e la fonte di luce.

Posizionare la camera sul tavolino principale del microscopio. Il passo successivo consiste nell'installare tutte e tre le micropipette del BFP. La sonda a sinistra serve per afferrare un RBC.

L'obiettivo a destra è quello di afferrare la cella e l'aiutante in basso a destra serve per afferrare una perlina da installare, utilizzare un micro iniettore per riempire una micro pipetta con tampone sperimentale. Estrarre la micropipetta dal supporto della pipetta e tenerla in una posizione più bassa per consentire al liquido di gocciolare dal puntale. Inserire rapidamente la micropipetta nel puntale di supporto, assicurandosi che nessuna bolla d'aria penetri nella micropipetta.

Durante l'inserimento, serrare la vite del supporto, quindi montare ciascun supporto per pipette sul micromanipolatore corrispondente. Spingere la micropipetta verso la camera in modo che i puntali entrino nell'area del tampone della camera. Regolare la posizione della micropipetta e trovarla nel campo visivo del microscopio.

Muoviti nel livello del portacamera per trovare le colonie dei tre elementi. Una per una, regolare la posizione della micropipetta corrispondente ruotando le manopole dei manipolatori per consentire alla punta della micropipetta di avvicinarsi a una cellula o a un micrometallo, aspirare la cellula o il micro. Regolando la pressione all'interno della micropipetta corrispondente, tutte e tre le micropipette cattureranno gli elementi corrispondenti.

Muoviti all'interno dello stadio portacamera per trovare uno spazio aperto lontano dalle colonie degli elementi iniettati dove verrà eseguito l'esperimento. Cambia la modalità visiva del microscopio per visualizzare l'immagine sul programma del computer. Spostare tutti e tre gli elementi sui puntali delle pipette nel campo visivo del programma.

Quindi, allineare il tallone della sonda e l'RBC e manovrare con cautela il tallone della sonda all'apice dell'RBC. Ora urtare brevemente la perlina sui globuli rossi e ritrarla delicatamente, regolare la pressione della micropipetta ausiliaria per soffiare via delicatamente la perlina in modo che rimanga incollata all'apice dei globuli rossi. Allontanare la pipetta ausiliaria e allineare il target e il cordone di probe sul programma.

Nella finestra del campo visivo, utilizzare gli strumenti del programma per misurare i rispettivi raggi della micropipetta della sonda, l'RBC e l'area di contatto circolare tra l'RBC e il cordone della sonda. Questi valori consentono di stimare la costante elastica dell'RBC mediante l'equazione elencata nel protocollo di testo. Dopo aver inserito la costante della molla RBC desiderata nel programma, tracciare una linea orizzontale attraverso l'apice RBC, che produrrà una curva nella finestra adiacente che indica la luminosità di ciascun pixel.

Lungo questa linea, trascinare la linea di soglia in modo che si trovi a circa la metà della profondità della curva. Quindi, selezionare la modalità di esperimento desiderata, il saggio di fluttuazione termica, il saggio di frequenza di adesione o il saggio di forza a bloccaggio. Impostare i parametri come desiderato.

Fare clic su Start, che consente al programma di spostare la pipetta target e guidare il target dentro e fuori dal contatto con la sonda Verrà eseguita la raccolta dei dati e in parallelo, che registra la posizione del cordone pro in tempo reale. Arresta il programma facendo clic sul pulsante interrompi esperimento in cui verrà visualizzata una finestra. Per consentire il salvataggio dei dati acquisiti per utilizzare la funzione di fluorescenza del sistema BFP ha acceso la sorgente luminosa di eccitazione e la camera a fluorescenza, che sono controllate da un programma separato.

Quindi selezionare i parametri per l'imaging a fluorescenza, inclusi l'esposizione al guadagno e i canali di eccitazione. Seguire tutte le preparazioni del protocollo dell'esperimento BFP, compreso l'allineamento della sonda e del bersaglio per consentire la visualizzazione dell'immagine fluorescente in tempo reale della cellula bersaglio eccitata da una luce di eccitazione a 340 nanometri o 380 nanometri. Utilizzare lo strumento di sezionamento per sezionare approssimativamente l'area all'interno della quale la cella rimarrà durante l'intero periodo di registrazione.

Quindi, fai clic contemporaneamente su registra e inizia a fare clic. La registrazione consente a una luce a 340 nanometri e 380 nanometri di eccitare alternativamente il die di fluorescenza intracellulare. Una coppia di immagini a fluorescenza corrispondenti saranno registrate alternativamente circa una al secondo.

Cliccando su start inizia l'esperimento BFP per l'analisi dell'interazione molecolare e l'esperimento di imaging a fluorescenza per monitorare la segnalazione intracellulare del calcio procede all'analisi dei dati come descritto nel protocollo di testo. Nelle curve dei dati grezzi della forza temporale, la forza è derivata dal tracciamento del cambiamento di posizione del cordone pro. In un evento di assenza di aderenza, la forza tornerà a zero nel segnale di inversione temporale della forza dopo che la cella target è stata ritratta dalla superficie del cordone.

Al contrario, in un evento di forza di rottura, l'adesione si manifesterà con una rapida elevazione della forza a un livello positivo durante la retrazione, seguita da un rapido calo a zero. In un evento di vita, la forza positiva sarà bloccata per realizzare un plateau. La lunghezza dell'altopiano è una vita.

Conducendo ripetuti cicli di esperimenti VFP, si deriverà una curva forza contro tempo. Qui sono mostrate le immagini fluorescenti di alcune o due cellule T caricate dopo l'eccitazione da parte di canali luminosi a 340 nanometri e 380 nanometri. Entrambe le immagini mostrano contorni chiari della cellula, indicando che la cellula è stata colorata bene Dopo che i dati sulla cinetica di legame e i dati sulla fluorescenza sono stati derivati da una cellula T, sia la curva del tempo di vita cumulativo che la curva del livello di calcio sono presentate nella stessa figura per trovare la correlazione tra di loro.

Ora dovresti avere una buona comprensione di come eseguire l'esperimento A-F-B-I-P. Durante questa procedura. È importante ricordarsi di controllare se c'è qualche difetto nella sonda di forza, come il diametro della micropipetta, la lunghezza della sporgenza della cella di gomma e la posizione del cordone.

Tutto ciò influenzerà l'accuratezza della misurazione della forza. Questa tecnica apre la strada ai ricercatori nel campo della biologia meccanica molecolare per studiare il meccanismo della trasduzione meccanica in tutti i possibili sistemi biologici.