Name: Progettato Vascolarizzato muscolare Flap (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-11T09:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 18 s
Description: Scopri come creare un lembo muscolare vascolarizzato per la ricostruzione della parete addominale utilizzando scaffold biodegradabili e cellule autologhe. Questo metodo offre un'alternativa innovativa alla chirurgia ricostruttiva tradizionale.

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Questa ricerca è stata supportata dal 281501 di sovvenzione del Consiglio europeo della ricerca FP7, ENGVASC.

Tutti gli studi sugli animali sono stati approvati dal Comitato delle Etico di esperimenti su animali del Technion. Per questa procedura, topi nudi atimici sono stati usati per evitare il rigetto immunologico. Se si utilizza un altro tipo di mouse, i topi dovrebbero essere rasata prima della procedura chirurgica e la somministrazione di ciclosporina (o un altro sostituto anti-rigetto) è raccomandato. 1. Ponteggio Preparazione e Cell Embedding <ol><li> Preparare ponteggi composto da 1: 1 miscela di poli-L-lattico-acido (PLLA) e polilattico-glicolico-co-acido (PLGA), nel modo seguente: <ol><li> Sciogliere 500 mg di PLLA e 500 mg di PLGA in 10 ml di cloroformio. </li><li> Aggiungere 0,24 ml della soluzione di polimero a 0,4 g di particelle di cloruro di sodio raccolti in Teflon stampi. Utilizzare un diametro di 212-600 micron di sale. Lasciare che il cloroformio evaporare O / N. </li><li> Percolare il sale utilizzando acqua distillata che porta a interconnessi scaffold 3D porosi. </li><li> Tagliare pezzi di polimeriutilizzando un paio di forbici, poi immergere in 70% di etanolo (v / v) per 30 minuti e lavare 3 volte in PBS per 2 minuti prima dell&#39;uso. </li></ol></li><li> Preparare un tri-coltura delle seguenti cellule in 1: medio cella 1 endoteliale (EGM-2 integrato con i componenti del suo kit proiettile e medie cellule muscolari (mezzo essenziale minimo di Dulbecco (DMEM), supplementato con siero bovino fetale al 10% (FBS ), 2,5% tampone HEPES, 100 U / ml di penicillina, e 0,1 mg / ml di streptomicina (Pen-Strep Solution). <ol><li> Utilizzare 0,5 x 10 6 C2C12 mioblasti, 0,9 x 10 6 vena ombelicale cellule endoteliali umane (HUVEC) e 0,2 x 10 6 normali fibroblasti dermici umani (NHDF). </li></ol></li><li> Mescolare insieme le cellule in una provetta e centrifugare a 200 xg per 4 minuti, aspirare il terreno e risospendere il pellet in una miscela di soluzione di matrice extracellulare freddo 4 microlitri ghiaccio e 4 microlitri medio cellule. </li><li> Tagliare un pezzo di 10 mm x 7 mm x 1 mm (lunghezza x larghezza x spessore) PLLA / PLGUn ponteggio e Seed la sospensione cellulare in una piastra da 6 pozzetti, lasciare che la soluzione matrice extracellulare solidificare (30 min, 37 ° C, 5% CO 2) prima di aggiungere 4 ml di mezzo cellulare. </li><li> Incubare le impalcature per dieci giorni prima dell&#39;impianto e sostituire il mezzo a giorni alterni. </li></ol> 2. Prima di avviare la procedura chirurgica <ol><li> Preparare e sterilizzare (autoclave) i seguenti strumenti chirurgici: un piccolo, multa, forbici diritte, un paio di forbici a molla, una scala, pinze punta fine, una pinza dentata e un porta-aghi. </li><li> Preparare una miscela di ketamina: soluzione xylazina in una provetta mescolando 425 ml di ketamina e 75 xylazina microlitri in una siringa da 1 ml. </li><li> Diluire 0,3 mg / ml in soluzione fisiologica sterile buprenorfina (1,20). </li></ol> 3. Flap costruzione (Graft impianto) <ol><li> Utilizzando una siringa da insulina, anestetizzare il mouse con un&#39;iniezione intraperitoneale di ketamina: xylazina (35 microlitri per20 g di peso corporeo). </li><li> Sottocutanea iniettare buprenorfina (concentrazione finale di 0,05-0,1 mg / kg) prima della opperation. </li><li> Posizionare il mouse su un palco riscaldato a 37 ° C, per assicurare una temperatura corporea normale, e quindi fissare il mouse utilizzando un bendaggio adesivo. </li><li> Utilizzando punte di cotone, amministrare lubrificante pomata occhio agli occhi del mouse (per evitare la disidratazione). </li><li> Usando punte di cotone, pulire il sito di incisione con iodio e poi con il 70% di etanolo, per stabilire un campo di lavoro asettico. </li><li> Utilizzando piccole forbici e pinze, fare un&#39;incisione attraverso la pelle, dal livello del ginocchio per legamento inguinale, parallelo ai vasi femorali, fino l&#39;arteria femorale e vena (AV) navi sono esposti. </li><li> Tenere la pelle verso il basso con un divaricatore, per ottenere un migliore accesso al tessuto. </li><li> Utilizzando forbici primavera e pinze, isolare con cura i vasi arteria e vena femorale dal tessuto circostante. Inizia dal livello della lig inguinaleament alla biforcazione dei vasi epigastrici superiori. Lasciare la profunda intatto, al fine di preservare il flusso di sangue alla gamba e prevenire la conseguente ischemia. </li><li> Piegare l&#39;innesto (dal punto 1) intorno al AV femorale esposta, sotto la profunda e al di sopra della biforcazione al tibiale e proneal AV, e unire le estremità con 8-0 punti di sutura in seta. </li><li> Per garantire la vascolarizzazione dell&#39;impianto dai capillari che spuntano solo dai vasi femorali AV, avvolgere un pezzo di lattice sterile intorno al trapianto, e suturare con 6-0 punti di sutura. </li><li> Chiudere la pelle sovrastante con 4-0 punti di sutura in seta. </li><li> Monitorare il mouse strettamente fino al recupero dall&#39;anestesia e ogni giorno successivo, fino a quando l&#39;innesto viene trasferito come lembo. Sottocutanea iniettare buprenorfina (concentrazione finale di 0,05-0,1 mg / kg) due volte al giorno per 2-3 giorni. NOTA: Utilizzare soluzione salina in ogni fase, per evitare la disidratazione del tessuto esposto. </li></ol> 4. Flap Transfer <ol><li> Ad una odue settimane dopo l&#39;impianto, anestetizzare il mouse con un&#39;iniezione intraperitoneale di ketamina: xilazina (35 ml / 20 g), utilizzando una siringa da insulina. </li><li> Sottocutanea iniettare buprenorfina (concentrazione finale di 0,05-0,1 mg / kg) prima della opperation. </li><li> Posizionare il mouse su un palco riscaldato a 37 ° C, per assicurare una temperatura corporea normale, e quindi fissare il mouse utilizzando un bendaggio adesivo. </li><li> Utilizzando punte di cotone, applicare lubrificante pomata occhio agli occhi del mouse (per evitare la disidratazione). </li><li> Utilizzando punte di cotone, pulire il sito di incisione (dalla zona del ginocchio per l&#39;addome) con iodio e poi con il 70% di etanolo, per stabilire un campo di lavoro asettico. </li><li> Utilizzando un paio di forbici e pinze, aprire con attenzione i punti di sutura nella pelle e, utilizzando un paio di forbici, fare un&#39;incisione attraverso la pelle parallela al legamento inguinale, proseguendo attraverso la pelle ventrale. </li><li> Rimuovere con attenzione il pezzo di lattice con una pinza ed esporre il lembo vascolarizzato. </li><li> Utilizzando un SCISSors e pinze, sezionare il lembo di tessuto dal tessuto circostante. </li><li> Utilizzando una pinza e un porta-aghi, legare l&#39;estremità distale del femore AV con 8-0 punti di sutura in seta per prevenire le emorragie dal AV. Poi, cauterizzare la AV a livello del ginocchio, distalmente al tessuto impiantato ripiegato e le suture 8-0. </li><li> Trasferire delicatamente il AV femorale avvolto dal trapianto, verso la parete addominale ventrale, evitando di danneggiare l&#39;arteria, per determinare a quale distanza il difetto a tutto spessore dovrebbe essere fatto. ATTENZIONE: Tirando l&#39;arteria troppo per evitare di danneggiare l&#39;arteria. </li><li> Utilizzando una multa forbici, fare un&#39;incisione nella parete addominale ventrale. </li><li> Utilizzando un paio di forbici a molla, fare un&#39;incisione nel muscolo retto addominale. Rimuovere un segmento x 0,8 centimetri circa 1 cm del muscolo retto addominale con la pelle sovrastante. </li><li> Trasferire il AV femorale, avvolto dal trapianto vascolarizzato, come un lembo assiale, al difetto a tutto spessore nel abdom ventralemuro inale. </li><li> Suturare il lembo di tessuto muscolare circostante, utilizzando 8-0 punti di sutura in seta, per evitare ernia. </li><li> Per evitare di sutura gli organi interni, aumentare il muscolo con una pinza quando la sutura del lembo al muscolo addominale. Lasciare la cute ventrale esposta per simulare l&#39;effetto di una completa difetto della parete addominale. </li><li> Coprire la ferita della pelle con garza iodato e una benda sterile per prevenire la contaminazione della superficie esposta. </li><li> Suturare la pelle della gamba utilizzando 4-0 suture di seta. </li><li> Monitorare il mouse strettamente fino al recupero dall&#39;anestesia e ogni giorno successivo, fino recupero del lembo. Sottocutanea iniettare buprenorfina (concentrazione finale di 0,05-0,1 mg / kg) due volte al giorno per 2-3 giorni. </li><li> NOTA: Utilizzare soluzione salina in ogni fase per evitare la disidratazione del tessuto esposto. </li></ol> 5. Determinazione di Ecografia Vascolare perfusione del Graft NOTA: Prima di trasferimento, la perfusione vascolare of l&#39;innesto viene misurata a una e due settimane dopo l&#39;impianto, con l&#39;ecografia. <ol><li> Anestetizzare il mouse utilizzando 2% isoflurano. </li><li> Posizionare il mouse su una fase mobile riscaldato a 38 ° C, per assicurare una temperatura corporea normale, e quindi fissare il mouse utilizzando un bendaggio adesivo. </li><li> Trova l&#39;arteria e vena vasi femorali con trasduttore non lineare impostata sul B-mode. </li><li> Esaminate la pervietà dei vasi femorali dell&#39;innesto utilizzando il trasduttore impostato sulla modalità colore Doppler. </li><li> Preparare agente non mirato contrasto secondo le istruzioni del produttore. </li><li> Collegare un catetere vena della coda (12 cm tubo con un ago 27 G) ad una siringa da 1 ml riempito con soluzione fisiologica. Fissare la siringa accanto al mouse sulla fase di riscaldamento (per evitare il movimento della siringa). </li><li> Collegare il catetere alla vena della coda del mouse e fissare l&#39;ago. </li><li> Iniettare alcuni dei salina sia garantire che le iniezioni vengono effettuate in vena e per riempireil tubo con soluzione salina (per evitare bolle d&#39;aria). </li><li> Riempire una siringa da 1 ml con 70 ml di mezzo di contrasto e sostituire la siringa salina con la siringa agente di contrasto. </li><li> Impostare la ultrasuoni per iniezione immagine del mezzo di contrasto. Nelle proprietà della modalità non lineare impostare il numero di fotogrammi da 1.500 e l&#39;impulso di interruzione 30% delle esposizioni. NOTA: Dopo l&#39;impulso interruzione, le microbolle ri-riempire i vasi ad una velocità che dipende dalla portata delle microbolle nei capillari ed è indipendente dalla velocità di iniezione delle microbolle. Il numero di fotogrammi può essere modificato a seconda del tempo di riempimento 19,20. </li><li> Iniettare lentamente il mezzo di contrasto nella vena della coda. </li><li> Cattura immagini in modalità contrasto non lineare del sistema ad ultrasuoni ad alta risoluzione. </li><li> Analizzare i risultati utilizzando il software, come descritto in precedenza 19,20. <ol><li> Disegnare una regione di interesse (ROI) sull&#39;immagine ottenuta immediatamente dopo l&#39;impulso interruzione nel contrasto modalità. Il ROI dovrebbe delineare l&#39;area riempita solo dal mezzo di contrasto. </li><li> Calcolare il miglioramento picco (PE), che è il rapporto tra l&#39;intensità media del segnale non lineare dopo l&#39;iniezione delle microbolle contro dopo l&#39;impulso interruzione, ed è una misura del volume di perfusione. </li><li> Calcolare la portata, che è determinato dal tempo (T) che deve trascorrere prima del segnale di picco (P). </li></ol></li></ol> 6. Determinazione della misura di Graft Vascolarizzazione NOTA: Il grado di innesto di tessuto vascolarizzazione è determinata una o due settimane dopo l&#39;impianto. <ol><li> Utilizzando una siringa da insulina, anestetizzare il mouse con un&#39;iniezione intraperitoneale di ketamina: xilazina (35 ml / 20 g). </li><li> Uso 1 siringa ml, per via endovenosa iniettare 200 ml di 10 mg / isotiocianato-destrano coniugato ml fluoresceina (FITC-destrano, MW = 500.000) nella vena della coda. &lt;/ li&gt; <li> Dieci secondi dopo il completamento dell&#39;iniezione, eutanasia il mouse per dislocazione cervicale. </li><li> Aprire la gamba del mouse e esporre l&#39;innesto. </li><li> Lavare la zona di innesto con tampone fosfato (PBS) e applicare il 10% formalina tamponata neutra. </li><li> Immagine l&#39;innesto nella gamba del mouse, utilizzando un microscopio confocale. </li><li> Quantificare densità dei vasi funzionale (FVD). <ol><li> Isolare il canale verde (eccitazione = 488 nm) delle immagini microscopiche confocale. </li><li> Passare le immagini risultanti attraverso un filtro passa-alto, per accentuare le strutture ad alto contrasto. </li><li> Utilizzare un filtro despeckling per rimuovere il rumore che potrebbe essere stato amplificato dal filtro passa-alto. </li><li> Impostare il valore di soglia sulla immagine risultante; il valore di soglia è regolata in modo che le caratteristiche e le strutture dell&#39;immagine originale sono visibili nell&#39;immagine binaria. </li><li> Applicare una size-soglia in modo che solo i gruppi di pixel connessi più grandi del siz definitae soglia rimangono nell&#39;immagine binaria. </li><li> Delineare lo scheletro dei vasi del trapianto utilizzando l&#39;algoritmo di Zhang-Suen 21. </li><li> Calcolare il FVD sommando le lunghezze della linea mediana di ciascun recipiente e dividendo il risultato per l&#39;area della ROI. </li></ol></li></ol> 7. immunoistologica e istologica colorazione della Graft <ol><li> Colorazione immunoistologico <ol><li> Dopo confocale, recuperare il trapianto utilizzando un piccolo forbici e pinze. Sezionare i vasi AV nelle due estremità dell&#39;innesto e recuperare l&#39;innesto. </li><li> Fissare gli innesti nel 10% formalina tamponata neutra per 30 minuti - 2 ore. </li><li> Posizionare gli innesti in cassette istologia e conservare in etanolo al 70% fino a paraffina. </li><li> Incorpora in paraffina utilizzando una fissazione standard incorporare il protocollo 22 e affettare le paraffina tessuti in 5 micron fette utilizzando un microtomo. Tagliate tutto il tessuto perpendicolarmente al AVvasi. </li><li> Deparaffinare sezioni incluse in paraffina per immersione in 100% xilene due volte, per 10 minuti ciascuno. </li><li> Disponete le diapositive di una da 250 ml di plastica vaschetta Coplin. </li><li> Reidratare per immersioni seriali in concentrazioni decrescenti di etanolo (100%, 96%, 90%, 80%, 70%, 50%, 30% e acqua bidistillata (DDW)) per 3 minuti ciascuno. </li><li> Preparare la soluzione smascheramento dell&#39;antigene diluendo 2,35 ml di soluzione di smascheramento dell&#39;antigene con 250 ml di DDW. Riscaldare la soluzione antigene smascheramento per 2 minuti in un forno impostato a 95 ° C. </li><li> Inserire i vetrini nella soluzione di antigene smascheramento preriscaldata e riscaldare di nuovo per 3 minuti in un forno a microonde impostato a 95 ° C. Raffreddare i vetrini a 50 ° C. </li><li> Riscaldare di nuovo per 2 minuti e poi raffreddare a RT. </li><li> Incubare i vetrini in 3,3% H 2 O 2 soluzione in metanolo per 10 minuti, a temperatura ambiente per estinguere l&#39;attività di perossidasi endogena e quindi risciacquare due volte in PBS. </li><li> Preparare una camera di incubazione: posto abso bagnatofogli rbent all&#39;interno di una scatola di istologia e asciugare le diapositive usando tergicristalli compito delicato. </li><li> Circle l&#39;area della sezione sul vetrino utilizzando una penna idrofobico e incubare per 30 min a temperatura ambiente, con circa 50 ml di siero di capra una soluzione bloccante (2%, preparato in PBS) per fetta. </li><li> Diluire il coniglio anti-CD31 anticorpo 1:50 in soluzione bloccante, applicare circa il 50 microlitri anticorpo per fetta e incubare O / N, a 4 ° C. Lavare 3 volte con PBS, 5 minuti ciascuno. </li><li> Diluire la capra biotinilato anti-coniglio anticorpo secondario 1: 400 in PBS, posto sopra scivoli circa 50 ml di anticorpi per fetta e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Lavare 3 volte con PBS, 5 minuti ciascuno. </li><li> Diluire streptavidina-perossidasi 1: 400 in PBS, applicare circa 50 microlitri per fetta e incubare con vetrini per 30 minuti, a temperatura ambiente. Lavare 3 volte con PBS, 5 minuti ciascuno. </li><li> Applicare circa 50 ml di aminoethylcarbazole (AEC) substrato per fetta, secondo il produttore &amp; #8217; s istruzioni. Immergere i vetrini in DDW per arrestare la reazione. </li><li> Stain i nuclei in blu immergendo sezioni in circa 50 ml di soluzione di ematossilina di Mayer per 2 min. Lavare delicatamente in acqua e poi coprire le sezioni con mezzo di montaggio. </li><li> Quantificare CD31-positivo colorazione utilizzando un approccio a doppio cieco. CD31 colorazione appare come una macchia marrone. Scegliere 4-5 campi differenti in un campo visivo di ingrandimento 40X sotto un microscopio binoculare. Contare il numero di lumen CD31-positivo. <ol><li> Calcolare il numero medio di lumen CD31-positive per scaffold dividendo il numero totale di lumen contato con il numero di campi e fieldarea (secondo i dati binoculare). NOTA: Il volume di reagente applicato deve essere sufficiente a coprire l&#39;intera fetta delineato. </li></ol></li></ol></li><li> Colorazione istologica <ol><li> Fissare innesti nel 10% formalina tamponata neutra. </li><li> Innesti Incorpora in paraffina utilizzando le normalifissazione e le procedure di incorporamento. </li><li> Rimuovere la paraffina dalle sezioni incluse in paraffina per immersione in 100% xilene due volte per 10 min. </li><li> Lavaggio rapido due volte per la reidratazione in 100% di isopropanolo. </li><li> Lavaggio rapido due volte il 95% di etanolo. </li><li> Lavare tre volte in acqua di rubinetto. </li><li> Immergere in ematossilina per 10 min. </li><li> Lavare tre volte in acqua di rubinetto. </li><li> Immere in Eosina per 2 min. </li><li> Lavaggio rapido disidratare in etanolo al 95% due volte. </li><li> Veloce lavaggio 100% di isopropanolo due volte. </li><li> Veloce lavaggio 100% xilene due volte. </li><li> Coprire con colla DPX con vetro di copertura spessore di 1,5 mm. </li><li> Immagine utilizzando microscopio in 40X di ingrandimento. </li></ol></li></ol> 8. Proprietà meccaniche Assessment <ol><li> Recuperare l&#39;innesto con un piccolo forbici e pinze. </li><li> Sciacquare il trapianto in PBS. </li><li> Misurare la larghezza e lo spessore dell&#39;innesto e calcolare l&#39;area della sezione trasversale come larghezza moltiplicato per lo spessore. </li><li> Noivia e lo strumento di prova per generare una curva sforzo-deformazione degli innesti idrati. <ol><li> Montare l&#39;innesto tra le impugnature di trazione del sistema e misurare la lunghezza finale tra le due impugnature (ad esempio, lunghezza iniziale). </li><li> Applicare una velocità di deformazione di 0,01 mm / sec, fino alla rottura. </li><li> Registrare la forza sviluppata e lo spostamento utilizzando il protocollo del produttore. </li><li> Generare una curva sforzo-deformazione in Matlab. <ol><li> Calcolare ceppo secondo spostamento diviso per la lunghezza iniziale. Lo stress è calcolata come la forza misurata divisa per l&#39;area della sezione trasversale. </li><li> Determinare rigidità come la pendenza lineare regione nella curva sforzo-deformazione e il punto di massimo della curva è la resistenza a trazione. </li></ol></li></ol></li></ol>

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

I progressi in ingegneria dei tessuti sono stati raggiunti con una crescente domanda per i tessuti sostitutivi per la ricostruzione dei vari tipi di tessuto. Una varietà di sintesi 1,17,18 e biologici 14-16 materiali, nonché i metodi di fabbricazione sono stati valutati per la loro capacità di far fronte a queste esigenze. Tuttavia, nonostante i progressi nella cura clinica e in ingegneria dei tessuti, il restauro di difetti della parete addominale a tutto spessore rimane una sfida. Un tessuto adeg...

Difetti della parete addominale spesso sorgono a seguito di traumi gravi, il trattamento del cancro, le ustioni e la rimozione della rete infetti. Questi difetti spesso comportano una significativa perdita di tessuto, che richiedono procedure chirurgiche complesse e la presentazione di una grande sfida per i chirurghi plastici di ricostruzione 1-4. Ricercatori di ingegneria dei tessuti alla ricerca di nuove fonti per i tessuti artificiali hanno esplorato diversi materiali, fonti di cellule e fattori di crescita. Restauri positivo di vari tessuti, come trachea 5,6, vescica 7, cornea 8, 9 e osso pelle 10, per impiantazione di tessuti ingegnerizzati sono stati segnalati in precedenza. Tuttavia, la fabbricazione di uno spesso ingegneria tessutale vascolarizzato, in particolare per la ricostruzione di grandi difetti, rimane una sfida significativa in ingegneria dei tessuti. Uno dei principali fattori limitanti lo spessore di un costrutto tessuto vitale è il controllo dell&#39;alimentazione di ossigeno ad suoi svantaggicellule tituent. Quando basandosi sulla diffusione, costruire spessore è limitato a quello di uno strato molto sottile. La distanza massima tra ossigeno e nutrienti capillari fornitura in vivo è di circa 200 micron, che è correlato con il limite diffusione dell&#39;ossigeno 11,12. Vascolarizzazione insufficiente può provocare ischemia tissutale e aumentare al riassorbimento del tessuto o necrosi 13. Inoltre, il materiale ideale utilizzato per la ricostruzione del tessuto deve essere biocompatibile e non immunogenica. Deve anche essere in grado di promuovere una maggiore integrazione di cellule ospiti con il biomateriale, e mantenendo l&#39;integrità strutturale. Vari biologici 14-16 e sintetiche 1,17,18 matrici sono stati precedentemente esplorati per la ricostruzione dei tessuti, ma il loro uso rimane limitato a causa della mancanza di afflusso di sangue efficace, infezioni o la forza del tessuto insufficiente. In questo studio, un biocompatibile, cell-embimpalcatura edded composto da Food and Drug Administration (FDA) l&#39;acido L-lattico poli -approvato (PLLA) / poli acido lattico-co-glicolico (PLGA), è stato impiantato intorno all&#39;arteria femorale e vena (AV) le navi di un topo nudo e separato dal tessuto circostante, assicurando vascolarizzazione solo dai vasi AV. Una settimana dopo l&#39;impianto, l&#39;innesto è stato vitale, denso e ben vascolarizzato. Questo tessuto vascolarizzato spessore con vasi AV, è stato poi trasferito come lembo peduncolato un difetto a tutto spessore addominale nel mouse stesso. Una settimana dopo il trasferimento, il lembo era praticabile, vascolarizzato e ben integrato con il tessuto circostante, tenendo forza sufficiente a sostenere visceri addominali. Così, la spessa, lembo di tessuto vascolarizzato ingegneria, recanti un peduncolo autologo, presenta un nuovo metodo per la riparazione di difetti della parete addominale a tutto spessore.

<table><tbody><tr><td>piccole forbici dritte fini</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>14090-09</td><td></td></tr><tr><td>forbici a molla</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>15003-08</td><td></td></tr><tr><td>pinza dritta con punta fine</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>pinza seghettata&nbsp;</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>11050-10</td><td></td></tr><tr><td>porta aghi</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>12500-12</td><td></td></tr><tr><td>Cauterizzatore per piccoli vasi&nbsp;</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>18000-00</td><td></td></tr><tr><td>Duratears</td><td>Alcon</td><td>5686</td><td></td></tr><tr><td>Sedaxylan</td><td>Euravet</td><td>DJ03</td><td></td></tr><tr><td>Clorketam 1000</td><td>Vetoquinol</td><td>4A0726B</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfina</td><td>vetmarket</td><td>B15100</td><td></td></tr><tr><td>4-0 suture di seta</td><td>Suture Assut</td><td>647</td><td></td></tr><tr><td>6-0 suture in polipropilene</td><td>Suture Assut</td><td>9351F</td><td></td></tr><tr><td>8-0 suture di seta</td><td>Suture Assut</td><td>684568</td><td></td></tr><tr><td>Siringa da insulina (ago da 6 mm)</td><td>Sistema</td> ecografico ad alta risoluzione BD <td>324911</td><td></td></tr><tr><td>Vevo 2100</td><td>VisualSonics inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trasduttore non lineare MS250</td><td>VisualSonics inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mezzo di contrasto non mirato per micromarcatori</td><td>VisualSonics inc.</td>Catetere per vena caudale <td>VS-11694</td><td></td></tr><tr><td></td><td>VisualSonics inc.</td><td>VS-11912</td><td></td></tr><tr><td>Vevo 2100 software</td><td>VisualSonics inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>destrano coniugato con isotiocianato di fluoresceina</td><td>Sigma</td><td>FD500S</td><td></td></tr><tr><td>Matlab</td><td>Mathworks, MA, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimtech</td><td>34120</td><td></td></tr><tr><td>soluzione di smascheramento dell'antigene</td><td>Vector laboratories</td><td>H-3300</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo anti-CD31</td><td>Abcam&nbsp;</td><td>ab28364</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo biotinilato di capra anti-coniglio (secondario)</td><td>Vector laboratories</td><td>BA-1000</td><td></td></tr><tr><td>streptavidina-perossidasi</td><td>Jackson</td><td>016-030-084</td><td></td></tr> Soluzione di <tr><td>amaratossilina di Mayer</td><td>Kit substrato Sigma-Aldrich</td><td>MHS-16</td><td></td></tr><tr><td>aminoetilcarbazolo (AEC)</td><td>Tecnologie per la vita, Invitrogen&nbsp;</td><td>00-2007</td><td></td></tr><tr><td>Vectamount</td><td>Vector laboratori</td><td>H-5501</td><td></td></tr></tbody></table>

progettato vascolarizzato muscolare flap

Engineered Vascularized Muscle Flap

Uno dei principali fattori che limitano lo spessore di un costrutto tissutale e la sua conseguente vitalità e applicabilità in vivo, è il controllo dell'apporto di ossigeno al microambiente cellulare, poiché la diffusione passiva è limitata a uno strato molto sottile. Sebbene siano stati descritti vari materiali per ripristinare l'integrità dei difetti a tutto spessore della parete addominale, nessun materiale si è ancora dimostrato ottimale, a causa della bassa vascolarizzazione dell'innesto, del rigetto dei tessuti, dell'infezione o delle proprietà meccaniche inadeguate. Questo protocollo descrive un mezzo per ingegnerizzare un lembo completamente vascolarizzato, con uno spessore rilevante per la ricostruzione del tessuto muscolare. I costrutti di acido polilattico/acido polilattico-co-glicolico incorporati in cellule vengono impiantati intorno all'arteria e alla vena femorale del topo e mantenuti in vivo per un periodo di una o due settimane. L'innesto vascolarizzato viene quindi trasferito come un lembo verso un difetto a tutto spessore realizzato nell'addome. Questa tecnica sostituisce la necessità di sacrificamenti di tessuti autologhi e può consentire l'uso di lembi vascolarizzati ingegnerizzati in vitro in molte applicazioni chirurgiche.

Vascolarizzazione del trapianto e la perfusione in vivo Gli innesti sono stati impiantati una o due settimane prima del loro trasferimento come lembi assiali. A uno e due settimane dopo l&#39;impianto, l&#39;osservazione al lordo della zona dell&#39;innesto rivelato innesti di tessuto vitali e vascolarizzate. Questi innesti dimostrato di essere altamente vascolarizzati, come determinato mediante immunocolorazione CD31 positivo (Figura 1A) e altamente perfuso, come e...

Ad oggi, i difetti dei tessuti spessi vengono tipicamente ricostruiti applicando lembi di tessuto autologo o tessuti ingegnerizzati. In questo protocollo, presentiamo un nuovo metodo per l'ingegnerizzazione di un lembo di tessuto vascolarizzato con un peduncolo autologo, per fungere da sostituto dei lembi autologhi.

Progettato Vascolarizzato muscolare Flap

One of the main factors limiting the thickness of a tissue construct and its consequential viability and applicability in vivo, is the control of oxygen ...

L'obiettivo generale di questa procedura è creare un lembo di tessuto ben vascolarizzato da utilizzare per la ricostruzione di difetti della parete addominale a tutto spessore. Questo viene ottenuto preparando innanzitutto un'impalcatura biodegradabile in acido polilattico polilattico-co-glicolico. Successivamente, vengono seminate cellule endoteliali, cellule muscolari e fibroblasti, e l'innesto viene coltivato in vitro per consentire alle cellule di autoassemblarsi.Quindi il tessuto ingegnerizzato viene impiantato attorno all'arteria e alle vene femorali del topo, dove subisce un'anastomosi con i vasi dell'ospite e diventa altamente vascolarizzato. Infine, il tessuto viene trasferito come lembo peduncolato in una lesione parietale addominale a tutto spessore. In ultima analisi, la vascolarizzazione dell'innesto viene dimostrata mediante ecografia, iniezione di destrano al tempo T e immunomarcatura per CD31, mentre la rigidità del lembo viene valutata utilizzando uno strumento di prova biodinamico.I principali vantaggi di questo metodo rispetto a quelli esistenti sono una minore mobilità del sito donatore e un'elevata vitalità del lembo ingegnerizzato, che può essere utilizzato per la costruzione di tessuti molli a spessore completo. Questo metodo può essere d'aiuto per i pazienti con difetti della parete addominale a tutto spessore. La procedura sarà dimostrata dalla dottoressa Dana Egozi, chirurgo plastico, che collabora con il mio laboratorio, e sarà assistita da Anina Freimann.Dopo aver preparato i supporti e incorporato le cellule secondo il protocollo descritto nel testo, sterilizzare in autoclave i seguenti strumenti chirurgici: una piccola forbice dritta fine, una forbice a molla, una pinzetta dritta a punta fine, una pinzetta dentata, pinzette di Hudson, un portaaigo e un bisturi con lama numero 15. Preparare una miscela di 425 microlitri di chetamina e 75 microlitri di silodsin in un tubo da microcentrifuga e trasferirla in una siringa. Successivamente, diluire 0,3 milligrammi per millilitro di buprenorfina in rapporto di uno a 20 in soluzione salina sterile.Dopo aver anestetizzato il topo seguendo il protocollo descritto, posizionarlo su un supporto, riscaldarlo a 37 gradi Celsius per mantenere la temperatura corporea normale e fissarlo al supporto con un cerotto adesivo. Utilizzando bastoncini di cotone, detergere il sito dell'incisione con iodio seguito da etanolo al 70% per creare un campo operatorio asettico. Dopo aver verificato il livello di sedazione, praticare un'incisione attraverso la cute con un bisturi, dal ginocchio al legamento inguinale, parallela ai vasi femorali, fino a esporre l'arteria e la vena femorali.Utilizzare clip o aghi per tenere ferma la pelle. Quindi, con forbici a molla e pinze, a partire dall'arteria femorale e dalla vena femorale al di sotto della profonda e al di sopra della biforcazione verso le arterie tibiale e peronea, isolare con attenzione i vasi arteriosi e venosi femorali dal tessuto circostante. Lasciare intatta la vena profonda al fine di preservare il flusso ematico alla gamba e prevenire successivi episodi di ischemia.Successivamente, avvolgere l'innesto precedentemente preparato attorno all'arteria e vena femorali esposte, al di sotto della profonda e al di sopra della biforcazione verso le arterie e vene tibiali e proneali, e unirne le estremità mediante suture di seta 8-0. Per garantire la vascolarizzazione dell'impianto esclusivamente tramite i capillari provenienti dai vasi artero-venosi femorali, posizionare un pezzo di lattice sterilizzato sotto l'innesto, quindi avvolgerlo attorno all'innesto e alla sutura utilizzando seta 6-0. Infine, chiudere la cute sovrastante mediante suture di seta 4-0.Iniettare sottocutaneamente la buprenorfina due volte al giorno per due o tre giorni. Monitorare attentamente il topo fino al risveglio dall'anestesia e ogni giorno successivamente fino al trasferimento dell'innesto come leso. Da una a due settimane dopo l'innesto, dopo aver anestetizzato il topo, posizionare l'animale sul piano riscaldato e fissarlo.Dopo aver pulito il sito delle incisioni come mostrato precedentemente in questo video, utilizzare forbici e pinze per aprire con attenzione i punti di sutura nella cute e, con un bisturi, praticare un'incisione perpendicolare al legamento inguinale, proseguendo attraverso la cute ventrale. Usando un bisturi, effettuare un'incisione nella parete addominale ventrale. Rimuovere con cura il pezzo di lattice ed esporre la lemba vascolarizzata.Quindi, con forbici e pinze, dissezionare il lembo di tessuto dal tessuto circostante. Con sutura in seta 8-0, legare l'estremit&agrave; distale dell'arteria e della vena femorale per prevenire emorragie dall'AV. Successivamente cauterizzare l'AV al ginocchio, in posizione distale rispetto al tessuto impiantato ripiegato e alle suture 8-0. Trasferire delicatamente l'arteria e la vena femorale racchiuse dall'innesto verso la parete addominale ventrale, evitando danni all'arteria, al fine di determinare a quale distanza debba essere praticato il difetto a tutto spessore.Con forbici chirurgiche, effettuare un'incisione nel muscolo retto addominale ed asportare un segmento di circa un centimetro per 0,8 centimetri di muscolo insieme alla cute sovrastante. Trasferire il lembo assiale AV femorale racchiuso dal trapianto vascolarizzato al difetto di pieno spessore nella parete addominale ventrale, utilizzando suture di seta 8-0 per prevenire un'ernia. Suturare il lembo al tessuto muscolare circostante.Quindi, con seta 4-0, suturare la pelle della gamba. Lasciare la pelle ventrale esposta per simulare l'effetto di un difetto completo della parete addominale. Con garza iodata e una medicazione sterile, coprire la ferita cutanea per prevenire la contaminazione dell'area esposta.Somministrare la buprenorfina come precedentemente descritto in questo video. Monitorare attentamente l'animale fino al risveglio dall'anestesia e ogni giorno successivamente fino al recupero del lembo, per gli studi descritti nel protocollo testuale. A una e due settimane dopo l'innesto, l'osservazione macroscopica dell'area del trapianto ha rivelato innesti di tessuto vitali e altamente vascolarizzati, come determinato da una positiva immunomarcatura per CD31.I trapianti di tessuto sono risultati anche altamente perfusi, come evidenziato dall'iniezione di dextrano-FITC nella vena della coda e da misurazioni ecografiche. Questo grafico dimostra che molti vasi erano già osservabili già una settimana dopo l'innesto, numero che è aumentato significativamente dopo un'ulteriore settimana nelle vicinanze dei vasi AV. Come mostrato qui, la pervietà e l'integrità post-femorali dopo l'innesto del trapianto sono state confermate mediante imaging ecografico in modalità Doppler a colori.Il blu e il rosso rappresentano il flusso sanguigno nel trapianto. Inoltre, l'esame ecografico ha rivelato una perfusione nell'area del trapianto leggermente maggiore dopo l'innesto rispetto a una settimana dopo. L'esame macroscopico delle lembi cutanee una settimana dopo il trasferimento ha mostrato che esse si erano fissate saldamente ai tessuti circostanti.Confrontando lembi con cellule incorporate pre-vascularizzati e innesti acellulari non vascularizzati di controllo, i primi hanno mostrato proprietà meccaniche superiori, incluse rigidità e resistenza, che hanno anche determinato una minore deiscenza e un minor numero di erniazioni. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in circa 30 minuti se effettuata correttamente. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica apre la strada ai chirurghi plastici per trattare pazienti affetti da difetti della parete addominale a tutto spessore, nonché da altri difetti complessi e significativi dei tessuti molli.

Research

Ricerca

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingegneria

Vascolarizzato Composite Allotransplantations (VCA) sono diventati una realtà clinica. Tuttavia, la vasta applicazione clinica di VCA è limitata dalla immunosoppressione multi-farmaco cronica. Gli autori presentano un modello animale grande affidabile e riproducibile per tradurre nuove strategie immunomodulatori che possono minimizzare o potenzialmente eliminare la necessità di immunosoppressione in VCA.

Un modificata eterotopica suina Hind Arto Trapianto Modello traslazionale vascolarizzato composito allotrapianto (VCA) La ricerca

Qui, vi presentiamo un protocollo per generare ingegneria dei tessuti dei vasi innesti che sono funzionali per l'innesto in topi con un doppio semina cellule staminali pluripotenti indotte in parte (PiPSC) - derivato cellule muscolari lisce e PiPSC - cellule endoteliali derivate su una nave decellularized ponteggio bioreattore.

Generazione e innesto delle navi tissutale in un modello di topo

Questa è una linea guida per la costruzione di tessuto vascolarizzato in vivo utilizzando un circuito arterovenoso microchirurgico o una configurazione peduncolare a flusso continuo all'interno di una camera di ingegneria tissutale. I tessuti vascolarizzati generati possono essere impiegati per la rigenerazione degli organi e la sostituzione di difetti tissutali, nonché per test farmacologici e modellazione della malattia.

Ingegneria dei tessuti da parte intrinseca Vascolarizzazione in un<em&gt; In Vivo</em&gt; Camera ingegneria dei tessuti

Questo articolo descrive i passaggi necessari per sollevare un lembo libero epigastrico fasciocutaneo e trasferirlo al collo nel ratto.

Un modello di trasferimento del tessuto libero: The Rat Epigastrica libero Flap

Qui presentiamo un protocollo per l'uso del maiale superiore dell'arteria epigastric perforator flap come un modulo di apprendimento per testa e collo ricostruzione microvascolare.

Porcino come un modulo di formazione per ricostruzione microvascolare del collo e testa

L'alloinnesto in composito vascolarizzato offre benefici che alterano la vita ai riceventi trapianti, ma le cause biologiche del rigetto del trapianto e della vascolopatia restano poco comprese. Il modello chirurgico del roditore presentato qui offre un modello di trapianto riproducibile e clinicamente rilevante, permettendo ai ricercatori di valutare gli eventi di rigetto e le potenziali strategie terapeutiche per prevenirne l'insorgenza.

Modificato Eterotopic Hindarto Osteomyocutaneo flap modello nel ratto per traslazionale vascolarizzazione composito Allotransplantazione ricerca

Il presente protocollo descrive il modello di lembo fascio-cutaneo suino e il suo potenziale utilizzo nella ricerca sui tessuti compositi vascolarizzati.

Un modello affidabile di lembo fascio-cutaneo suino per studi di bioingegneria di allotrapianti compositi vascolarizzati

I lembi ingegnerizzati richiedono una rete vascolare funzionale incorporata. In questo protocollo, presentiamo un metodo per fabbricare un lembo di tessuto stampato in 3D contenente una rete vascolare gerarchica e le sue anastomosi microchirurgiche dirette all'arteria femorale di ratto.

Fabbricazione di lembi vascolari ingegnerizzati utilizzando tecnologie di stampa 3D

Il protocollo descrive l'approvvigionamento chirurgico e la successiva decellularizzazione dei lembi suini vascolarizzati mediante la perfusione di detergente dodecilsolfato di sodio attraverso la vascolarizzazione del lembo in un bioreattore di perfusione personalizzato.

Approvvigionamento e perfusione-decellularizzazione di lembi vascolarizzati suini in un bioreattore di perfusione personalizzato

Questo protocollo descrive la tecnica chirurgica per il prelievo di un modello di lembo perforatore umano basato sul pedicolo dell'arteria epigastrica inferiore profonda, destinato alla ricerca sperimentale.

Un modello sperimentale di lembo DIEP umano per indagare strategie di conservazione per allografi compositi vascolarizzati e lembi liberi

Scopri come creare un lembo muscolare vascolarizzato per la ricostruzione della parete addominale utilizzando scaffold biodegradabili e cellule autologhe. Questo metodo offre un'alternativa innovativa alla chirurgia ricostruttiva tradizionale.

Progettato Vascolarizzato muscolare Flap

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