Name: Un sistema organotipica High Throughput per la caratterizzazione di droga sensibilità di primaria multicampo cellule del mieloma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: Scopri un sistema organotipico high-throughput per caratterizzare la sensibilità ai farmaci di cellule primarie di mieloma multiplo. Questo metodo ricostruisce il microambiente del midollo osseo e consente la quantificazione longitudinale non invasiva della vitalità cellulare.

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Questa ricerca è stata finanziata dallo Stato della Florida Bankhead-Coley Science Team Grant (2BT03), il National Institutes of Health / National Cancer Institute (1R21CA164322-01) e del Moffitt Cancer Center Science Team Grant. Questo lavoro è stato supportato in parte dal Fondo ricerca traslazionale core al H. Lee Moffitt Cancer Center &amp; Research Institute, un NSC designato Comprehensive Cancer Center (P30-CA076292). L&#39;accesso alle cellule primarie è stato reso possibile grazie alla Total Cancer Care protocollo presso il Moffitt Cancer Center.

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<li>McMillin, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+cell-specific+bioluminescence+platform+to+identify+stroma-induced+changes+to+anticancer+drug+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Tumor cell-specific bioluminescence platform to identify stroma-induced changes to anticancer drug activity.</a> Nat Med. 16, 483-489 (2010).</li>
<li>Koh, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+cells+for+microscopy+using+cytospin%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Preparation of cells for microscopy using cytospin.</a> Methods Enzymol. 533, 235-240 (2013).</li>
<li>Al-Quran, S. Z., Yang, L., Magill, J. M., Braylan, R. C., Douglas-Nikitin, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+bone+marrow+plasma+cell+infiltrates+in+multiple+myeloma%3A+the+added+value+of+CD138+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Pathol%22%5BJournal%5D)">Assessment of bone marrow plasma cell infiltrates in multiple myeloma: the added value of CD138 immunohistochemistry.</a> Hum Pathol. 38, 1779-1787 (2007).</li>
<li>Najar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stromal+cells+promote+or+suppress+the+proliferation+of+T+lymphocytes+from+cord+blood+and+peripheral+blood%3A+the+importance+of+low+cell+ratio+and+role+of+interleukin-6%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stromal cells promote or suppress the proliferation of T lymphocytes from cord blood and peripheral blood: the importance of low cell ratio and role of interleukin-6.</a> Cytotherapy. 11, 570-583 (2009).</li>
<li>Scott, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+i+trialist%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Oncol%22%5BJournal%5D)">Phase i trialist.</a> Lancet Oncol. 13, 236(2012).</li>
</ol>

Gli autori non hanno alcun conflitto di interessi da rivelare.

In sintesi, questo è un metodo di throughput potente e alta quantificare chemiosensibilità delle cellule MM primarie ed ex vivo farmacodinamica dei farmaci in una ricostruzione del midollo osseo. I passaggi critici all&#39;interno questo protocollo sono il corretto semina dei pozzi e focalizzazione adeguata (vedi Figura 2 per i risultati attesi): assicurare che le cellule stromali MM e sono uniformemente distribuiti, che le cellule stromali sono aderenti al fondo del pozzo, che tutti MM cellule...

L&#39;obiettivo di questo metodo è quello di caratterizzare la sensibilità ai farmaci del mieloma multiplo (MM) cellule primarie ad un pannello di agenti ex vivo, il più vicino possibile alle condizioni fisiologiche, e con sufficiente precisione che questi risultati possono essere utilizzati per identificare chemioresistente sub popolazioni nel carico tumorale e, in ultima analisi, di parametrizzare modelli computazionali studiati per valutare la risposta clinica. Modelli di calcolo sono strumenti potenti per analizzare sistemi complessi, quali le interazioni tumore-ospite-terapia. Tuttavia, i modelli sono solo buono come i dati utilizzati per parametrizzare loro. Sfortunatamente, la maggior parte dei dati disponibili in letteratura non possono essere utilizzati nella forma attuale di parametrizzare tali modelli, in quanto spesso vengono ottenuti in condizioni sperimentali reciprocamente esclusivi. Così, nuovi esperimenti sono spesso richiesti con l&#39;obiettivo di ottenere il set di parametri sperimentali necessari. La maggior parte dei saggi di vitalità, tuttavia, sono distruttive e thCi limitati a un piccolo numero di punti di tempo, spesso solo uno. Questo ostacola notevolmente l&#39;utilizzo di test di chemiosensibilità a parametrizzare modelli computazionali, dal momento che tali esperimenti non riescono a fornire informazioni sulla dinamica temporale del sistema. Ciò è particolarmente vero con le cellule tumorali primari, che sono spesso limitati a pochi milioni per campione, e hanno una vita breve dopo la biopsia, limitando così il numero di condizioni sperimentali. Inoltre, la maggior parte dei saggi di vitalità richiedono la separazione del cancro dai non-cancro (stroma) cellule al momento della quantificazione, che aggiunge lavoro extra al protocollo, perturba ulteriormente le cellule, e limita il numero di esperimenti che possono essere eseguite . 40 anni fa, salmone e collaboratori 1 hanno proposto il loro famoso in vitro colonie formazione per la valutazione di chemiosensibilità delle cellule tumorali. Purtroppo questo test trovate alterne fortune a causa del piccolo numero di mye multiplaloma (MM) campioni di pazienti che erano in grado di formare colonie in condizioni di controllo: è stato stimato che solo un piccolo sottogruppo di 0.001% al 0,1% di cellule di MM sono stati in grado di riprodursi, di essere definiti come le cellule staminali mieloma multiplo 2. Questo limita significativamente il tasso di successo del saggio e il numero di farmaci che possono essere testati in una sola volta, anche in modelli più recenti 3. La questione è molto più importante ora, quando gli agenti mm (standard o sperimentali) sono più numerose di quattro decenni fa. Una limitazione importante di questi primi saggi è la loro uscita dicotomizzate: o un paziente è &quot;sensibili&quot; o &quot;resistenti&quot; ad un particolare farmaco. Non vengono fornite informazioni relative al grado di sensibilità ed eterogeneità della popolazione tumorale. Pertanto, i pazienti con piccole sottopopolazioni di cellule resistenti rapida crescita sarebbero classificate come &quot;sensibili&quot; per la terapia, ma sarebbe ricaduta a breve, e quindi non benEFIT dal trattamento. Data l&#39;importanza della durata della risposta in termini di sopravvivenza globale (OS) dei pazienti oncologici 4,5, è chiaro come questi test non sono stati in grado di stimare correttamente OS coerente. Per aggirare queste limitazioni, e di essere in grado di generare modelli computazionali specifici del paziente che stimare la risposta clinica personalizzato ad un pannello di farmaci, abbiamo sviluppato un metodo per la sensibilità ai farmaci test non distruttivo di mieloma multiplo (MM) linee cellulari e cellule di MM primarie in un ex vivo ricostruzione del midollo microambiente osseo, tra cui matrice extracellulare e stroma 6. Questa analisi, tuttavia, aveva la limitazione di basarsi su un particolare diapositiva microfluidico commerciale, le cui dimensioni e costo limitato il numero di esperimenti o farmaci che potrebbero essere effettuata una volta in un determinato materiale. Il sistema qui descritto estende questo saggio originale in un alto-throughput organotipica piattaforma dose-risposta, per lo screening in vitro di farmaci, basato su un algoritmo di analisi di immagine digitale non distruttivo quantificare la vitalità cellulare. Ogni bene in 384 e 1.536 pozzetti piastre è una ricostruzione in 3D del midollo microambiente osseo, incluse le cellule primarie di MM, matrice extracellulare, e stroma e fattori di crescita di derivazione del paziente. Microscopia diretta e analisi digitale sono utilizzati per rilevare eventi morte cellulare a concentrazioni del farmaco diversi, che vengono utilizzati per generare superfici dose-risposta. Dai dati in vitro, un modello matematico identifica la dimensione e la chemiosensibilità delle sub-popolazioni all&#39;interno carico tumorale del paziente, e può essere utilizzato per simulare il tumore risponderà al farmaco (s) in condizioni fisiologiche in un regime clinica 6 ( Figura 1). Le principali innovazioni di questa piattaforma sono: (a) piccolo numero di cellule tumorali richiesti (1.000-10.000 per concent drogarazione); (B) la valutazione di efficacia dei farmaci in condizioni fisiologiche (matrice extracellulare, stroma, i fattori di crescita di derivazione del paziente); (C) Nessuna tossicità da vitalità marcatori 7 dal momento che solo l&#39;imaging in campo chiaro è usato, quindi non c&#39;è bisogno di trasfettare cellule con fluorescenza 8 o bioluminescenza 9; (D) l&#39;imaging continuo fornisce effetto del farmaco in funzione della concentrazione e tempo di esposizione (farmacodinamica); e (e) l&#39;integrazione tra modelli in vitro e computazionali evolutivi, stimare esito clinico 6 (Silva et al., in preparazione). Il fattore chiave che permette l&#39;algoritmo di analisi di immagine digitale di discernere cancro da cellule stromali è la differente affinità al fondo del pozzo: cellule di MM non aderiscono, e rimangono in sospensione nella matrice, mentre le cellule stromali aderire al fondo del bene e poi allungare. Questa separazione si verifica anche se MM e stroma unre seminate allo stesso tempo, e si verifica durante il processo / N O di incubazione. La fase di arresto nella centrifuga seguente semina della piastra accelera ulteriormente questo processo. Di conseguenza, le cellule MM appaiono nell&#39;immagine come dischi luminosi rotonda circondata da un anello scuro, mentre lo stroma mantiene un profilo basso e più scura (Figura 2). Così, il test nella sua forma attuale è la più adatta per le cellule tumorali non aderenti, anche se adeguamenti dell&#39;algoritmo potrebbe essere fatto al cancro e stroma separata sulla base di altre caratteristiche morfologiche, come la dimensione e la forma. In questo protocollo descriviamo due tipi di matrice extracellulare (collagene e matrice di membrana basale) e due tipi di co-culture, con (midollo derivate cellule staminali mesenchimali ossee) BMSC e HUVEC, rappresenta le nicchie interstiziali e perivascolari del midollo osseo rispettivamente. Utilizzando una piastra a 384 pozzetti, 5 concentrazioni per droga e due repliche, siamo stati in grado di TESt fino a 31 diversi farmaci con il campione di un singolo paziente. In piastre 1.536 pozzetti questo numero è 127. Figura 3 illustra lo schema attualmente utilizzata per la semina delle cellule manuale, mentre supplementare figura 1 rappresenta la distribuzione ottimale utilizzando una pipetta robotica. Nel disegno di figura 3, ogni piatto 384 pozzetti può trasportare 3 campioni di pazienti con 7 diversi farmaci, o un campione paziente testato con 21 farmaci. Ogni farmaco è rappresentato da 5 concentrazioni, e ciascuna condizione è seminato in duplicato. 4 pozzetti di controllo (nessun farmaco è mio) vengono seminate per ogni set di 7 farmaci (ad esempio, pozzi 36-39, 126-129 e 200-203). Per garantire l&#39;efficacia dei farmaci utilizzati, una linea cellulare di mieloma umano (ad esempio, H929 o MM1.S) è anche inseminate, drogato in duplicato alla più alta concentrazione di ciascuno dei farmaci utilizzati (pozzi 76-89). Il controllo linea cellulare positiva assicura che i farmaci utilizzati hanno sufficiente potenza, dal momento che le loro curve dose-risposta sono ac comparabiliEsperimenti Ross. Due pozzi sono seminati con una linea cellulare di mieloma come controllo per le condizioni ambientali, in altre parole, per rilevare possibili problemi nel banco superiore incubatore durante l&#39;imaging (pozzi 75 e 90). L&#39;enumerazione dei pozzetti segue un andamento a zig-zag in modo da ridurre la distanza coperta dalla fase motorizzato del microscopio, che riduce il tempo di acquisizione e riduce l&#39;usura dell&#39;apparecchiatura.

<table><tbody><tr><td>EVOS FL AUTO</td><td>AMG</td><td>AMAFD1000+ AMC1000</td><td>Microscopio digitale dotato di tavolino motorizzato e incubatore da banco.</td></tr><tr><td>piastra a 384 pozzetti CellBind</td><td>CORNING CLS3683</td><td>SIGMA</td><td>Corning CellBIND piastre a 384 pozzetti piastra a 384 pozzetti, polistirene, superficie CellBIND, sterile, fondo piatto trasparente, nero, con coperchio</td></tr><tr><td>piastra a 1.536 pozzetti CellBind</td><td>CORNING CLS3832</td><td>ALDRICH</td><td>Corning piastre a 1.536 pozzetti, base bassa, trattamento superficiale CellBIND, sterile</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque Plus&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>GE17-1440-02 SIGMA</td><td>Per in vitro isolamento di linfociti dal sangue periferico umano.</td></tr><tr><td>CD138 perline magnetiche</td><td>Miltenyi&nbsp;</td><td>130-051-301</td><td>Sfere magnetiche coniugate anticorpali per la selezione di cellule CD138+.</td></tr><tr><td>Colonne LS</td><td>Miltenyi&nbsp;</td><td>&nbsp; 130-042-401</td><td>Colonna per la separazione delle celle.</td></tr><tr><td>Separatore MidiMACS</td><td>Miltenyi&nbsp;</td><td>130-042-302</td><td>Magnete per colonna di separazione.</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6909 SIGMA</td><td>ECM Gel di Engelbreth-Holm-Swarm sarcoma murino</td></tr><tr><td>Getrex</td><td>Life Technologies</td><td>A1413201</td><td>senza LDEV Fattore di crescita ridotto Matrice della membrana basale</td></tr><tr><td>HUVEC</td><td>Life Technologies</td><td>C-003-25P-B</td><td>Cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC)</td></tr><tr><td>RPMI-1640 media</td><td>GIBCO</td><td>11875-093</td><td>RPMI 1640 Medium + L-Glutammina + Rosso Fenolo</td></tr><tr><td>FBS Inattivato a caldo</td><td>GIBCO</td><td>10082-147</td><td>Siero fetale bovino, certificato, inattivato a caldo, origine statunitense</td></tr><tr><td>3,1 mg/ml Collagene bovino di tipo I</td><td>Soluzione avanzata di</td> collagene bovino <td>Biomatrix 5005-B</td><td>, Tipo I, 3 mg/ml, 100 ml</td></tr><tr><td>Precision XS</td><td>BIOTEK</td><td></td><td>PRC3841 Sistema di pipettatori robotizzato</td></tr></tbody></table>

un sistema organotipica high throughput per la caratterizzazione di droga sensibilità di primaria multicampo cellule del mieloma

An Organotypic High Throughput System for Characterization of Drug Sensitivity of Primary Multiple Myeloma Cells

In questo lavoro descriviamo un nuovo approccio che unisce ex vivo test di sensibilità di droga e l&#39;analisi di immagini digitali per stimare chemiosensibilità ed eterogeneità di mieloma multiplo (MM), le cellule derivate da pazienti. Questo approccio consiste nel seminare cellule di MM primarie appena estratti da aspirati midollari nelle camere di microfluidica attuate in piastre multi-così, ognuno composto da una ricostruzione del microambiente midollare, tra cui matrice extracellulare (collagene o membrana basale matrice) e stroma (paziente- le cellule staminali mesenchimali derivate) o cellule endoteliali umane di derivazione (HUVECs). Le camere sono drogati con diversi agenti e concentrazioni, e vengono esposte in sequenza per 96 ore attraverso il microscopio a campo luminoso, in un microscopio motorizzato dotato di una fotocamera digitale. Software di analisi dell&#39;immagine digitale rileva le cellule vive e morte dalla presenza o assenza di movimento della membrana, e genera le curve di cambiamento della redditività in funzione of concentrazione di farmaco e il tempo di esposizione. Usiamo un modello computazionale per determinare i parametri di chemiosensibilità della popolazione tumorale per ciascun farmaco, così come il numero di sub-popolazioni presenti come misura di eterogeneità tumorale. Questi modelli su misura del paziente possono poi essere utilizzati per simulare regimi terapeutici e valutare la risposta clinica.

Il flusso di questo esperimento è brevemente descritto nella Figura 1 Se tutti i passaggi sono stati completati con successo, le immagini ottenute con il microscopio dovrebbe essere equivalente alla Figura 2:. Vivono cellule di MM devono essere chiaramente visibili come dischi luminosi e BMSCs o HUVECs dovrebbero essere appena visibile e ben distribuita in background. Come si vede nella figura 2A, cellule di MM variano nel formato da un paziente all&#39;altro, ma in gen...

Descriviamo un test di sensibilità ai farmaci ad alto rendimento per cellule primarie di mieloma multiplo. Consiste in una ricostruzione del microambiente del midollo osseo (compresa la matrice extracellulare e lo stroma) in piastre multipozzetto e in un metodo non invasivo per la quantificazione longitudinale della vitalità cellulare.

Un sistema organotipica High Throughput per la caratterizzazione di droga sensibilità di primaria multicampo cellule del mieloma

In this work we describe a novel approach that combines ex vivo drug sensitivity assays and digital image analysis to estimate chemosensitivity and ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quantificare la chemosensibilità delle cellule primarie di mieloma multiplo a un pannello di agenti chemioterapici. Questo viene ottenuto innanzitutto mescolando cellule di mieloma multiplo isolate da prelievi freschi di aspirato midollare con stroma derivato dal paziente e collagene precoltura. Nel secondo passaggio, la miscela di cellule viene seminata su una piastra a multi-pozzetti.Le cellule vengono quindi trattate con gli agenti chemioterapici di interesse e la piastra viene trasferita nell'incubatore di un microscopio con palchetto motorizzato per l'acquisizione sequenziale di immagini delle cellule durante un periodo di incubazione di 96 ore. In definitiva, un algoritmo di analisi delle immagini digitali può essere utilizzato per generare curve di vitalità per ciascun farmaco e concentrazione. I principali vantaggi di questa tecnica rispetto ai saggi di vitalità ad endpoint esistenti sono che essa consente di testare diversi agenti chemioterapici su un singolo campione del paziente e che la vitalità delle cellule del paziente può essere misurata longitudinalmente per diversi giorni senza la necessità di separare le cellule dalla st

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Determinazione del ruolo delle cellule simili ai neutrofili nella sensibilità delle cellule di linfoma a un farmaco in esame

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Un sistema organotipica High Throughput per la caratterizzazione di droga sensibilità di primaria multicampo cellule del mieloma

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