Un sistema organotipica High Throughput per la caratterizzazione di droga sensibilità di primaria multicampo cellule del mieloma

L'obiettivo generale di questa procedura è quantificare la chemosensibilità delle cellule primarie di mieloma multiplo a un pannello di agenti chemioterapici. Questo viene ottenuto innanzitutto mescolando cellule di mieloma multiplo isolate da prelievi freschi di aspirato midollare con stroma derivato dal paziente e collagene precoltura. Nel secondo passaggio, la miscela di cellule viene seminata su una piastra a multi-pozzetti.

Le cellule vengono quindi trattate con gli agenti chemioterapici di interesse e la piastra viene trasferita nell'incubatore di un microscopio con palchetto motorizzato per l'acquisizione sequenziale di immagini delle cellule durante un periodo di incubazione di 96 ore. In definitiva, un algoritmo di analisi delle immagini digitali può essere utilizzato per generare curve di vitalità per ciascun farmaco e concentrazione. I principali vantaggi di questa tecnica rispetto ai saggi di vitalità ad endpoint esistenti sono che essa consente di testare diversi agenti chemioterapici su un singolo campione del paziente e che la vitalità delle cellule del paziente può essere misurata longitudinalmente per diversi giorni senza la necessità di separare le cellule dalla stroma o dalla matrice.

Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia dei tumori ematopoietici, poiché in teoria può essere utilizzata per prevedere la risposta clinica a specifici regimi di chemioterapia. Abbiamo avuto per la prima volta l'idea di questo protocollo quando ci siamo resi conto che sostituire le nostre originali lamelle microfluidiche con piastre a pozzetti avrebbe notevolmente ridotto i costi e il tempo necessari per completare l'esperimento. Per preparare colture co-colturali primarie di mieloma multiplo e cellule staminali mesenchimali derivate dal midollo osseo con una pipetta multicanale, iniziare sospendendo le cellule a una concentrazione sei volte superiore a quella finale in RPMI 1640.

Successivamente, mescolare 50 microlitri di ciascun tipo cellulare con collagene di tipo I appena preparato fino a un volume finale di 300 microlitri. Quindi utilizzare una pipetta multicanale per dispensare manualmente otto microlitri della miscela cellule-matrice al centro di ogni pozzetto di una piastra da 384 pozzetti e centrifugare la piastra per concentrare tutte le cellule nello stesso piano focale.

Dopo la centrifugazione, incubare le piastre in condizioni di coltura cellulare per un'ora per consentire al gel di polimerizzare. Quindi aggiungere 80 microlitri di mezzo di crescita supplementato in ogni pozzetto e incubare la piastra tutta la notte per permettere allo stroma di aderire al fondo della piastra. Per preparare colture co-colturali di stroma di mieloma multiplo con una pipetta robotica, iniziare sospendendo 300 microlitri di cellule di mieloma multiplo positive per CD138 e 300 microlitri di cellule stromali in RPMI 1640, mezzo alla densità finale desiderata moltiplicata per sei, come appena dimostrato.

Quindi mescolare entrambi i tipi cellulari in una provetta da 1,5 millilitri etichettata CD138 positivo e posizionare la provetta in un incubatore per colture cellulari. Successivamente, sospendere 60 microlitri della linea cellulare di mieloma multiplo appropriata e 60 microlitri delle cellule stromali in RPMI 1640, mezzo a sei volte la densità finale desiderata, e mescolare entrambi i tipi cellulari in una provetta da 1,5 millilitro etichettata con questa seconda provetta linea cellulare, quindi incubare a 37 gradi Celsius. Sul pipettatore robotico caricare il file dello script per la semina cellulare.

Quindi posizionare una scatola di punte per pipetta da 200 microlitri nella stazione A, una piastra micropiastre nella stazione B e una piastra sterile da 84 pozzetti nella stazione E del robot. Successivamente, mescolare la miscela di cellule CD138 positive con il tubo di mezzo premiscelato CD138 appena preparato e trasferire 1,5 millilitri della soluzione cellulare risultante nel pozzetto numero uno della piastra micropiastre.

Mettere il resto delle cellule sul ghiaccio e avviare il programma. Il robot seminerà le prime 176 pozzetti della piastra da 384 pozzetti e poi si interromperà. Utilizzare questo intervallo per trasferire le cellule CD138 positive rimanenti nel secondo pozzetto della piastra microlitro e riprendere il programma.

Il robot visualizzerà le restanti 144 pozzetti della piastra e si fermerà nuovamente. A questo punto, mescolare le cellule dal tubo della linea cellulare con un tubo di premiscela appena preparata per la linea cellulare e trasferire il contenuto nel pozzetto numero tre della piastra micropiastre. Quindi riprendere nuovamente il programma, consentendo al robot di seminare i restanti 64 pozzetti della piastra da 384 pozzetti.

Una volta seminato l'ultimo pozzetto, centrifugare le cellule e trasferire le colture co-colturali nell'incubatrice per la polimerizzazione del collagene. Dopo un'ora, caricare lo script del livello di mezzo sul robot e posizionare una scatola di punte da 120 microlitri nella stazione A, un serbatoio di reagenti contenente 31 millilitri di mezzo RPMI 1640 integrato con siero fetale bovino, plasma del paziente e antibiotici nella stazione B e la piastra CED 3 da 84 pozzetti nella stazione E. Quindi eseguire il programma. Il robot trasferirà 81 microlitri di mezzo integrato in ciascun pozzetto.

Una volta terminato il lavoro del robot, riposizionare le cellule nell'incubatore per consentire alla stroma di aderire al substrato durante la notte. Per trattare le cellule seminate con il farmaco di interesse, caricare innanzitutto lo script della piastra del farmaco nel livello del mezzo nell'interfaccia utente del pipettatore robotico. Successivamente, posizionare una scatola di punte per pipetta da 120 microlitri nella stazione A, un serbatoio contenente 21 millilitri di RPMI 1640 integrato con plasma del paziente FPS e antibiotici nella stazione B e una piastra vuota da 84 pozzetti nella stazione E ed eseguire il programma; il pipettatore robotico aggiungerà 30 microlitri di mezzo in tutti i pozzetti.

La piastra da 3 84 pozzetti. Successivamente, seguendo il modello, aggiungere 200 microlitri di farmaco a 20 volte la concentrazione massima in ciascun pozzetto di una piastra microtitolazione per il controllo. Aggiungere nel pozzetto il mezzo integrato con plasma di pazienti FPS e antibiotici.

Quindi posizionare una scatola di punte per pipetta da 120 microlitri nella stazione A, la piastra micropiastre dei farmaci nella stazione B e una piastra da 3 x 84 pozzetti contenente mezzo nella stazione C ed eseguire il programma della piastra dei farmaci. Il pipettatore robotico creerà una diluizione seriale uno a tre come illustrato in questa figura. Ora posizionare una nuova scatola di punte per pipetta da 120 microlitri nella stazione A, la piastra da 3 x 84 pozzetti con il farmaco diluito nella stazione B e la piastra da 3 x 84 pozzetti con le cellule seminate nella stazione C ed eseguire il programma di aggiunta del farmaco.

Il pipettatore robotico trasferirà otto microlitri di farmaco da ogni pozzetto della piastra dei farmaci al pozzetto corrispondente nella piastra cellulare. Dopo aver trattato l'ultimo pozzetto, trasferire immediatamente la piastra cellulare nell'incubatore del microscopio digitale. Per acquisire le immagini delle cellule, pulire l'interno dell'incubatore da banco con una salvietta imbevuta di etanolo e scambiare con attenzione il coperchio della piastra con il coperchio dell'incubatore.

Successivamente, seguire i passaggi del software per aggiungere i punti di riferimento per le regioni di interesse da acquisire in successione durante l'esperimento. Infine, utilizzando un obiettivo con ingrandimento 5x o 10x, mettere a fuoco le cellule fino a quando le cellule di mieloma multiplo appariranno come dischi luminosi circondati da un anello scuro, mentre le cellule stromali saranno appena visibili. In questo esperimento, le cellule vitali di mieloma multiplo sono state colorate artificialmente in verde, con un segnale verde minimo o assente osservato nelle cellule stromali e nelle cellule endoteliali venose ombelicali umane alla fine dell'esperimento, alla concentrazione più elevata del farmaco, quando tutte le cellule di mieloma multiplo erano morte.

Il software del robot è stato quindi utilizzato per avviare la progressiva perdita di vitalità risultante dall'esposizione a diverse concentrazioni di farmaco nel tempo. È importante osservare attentamente tutte le pozzette seminate prima di iniziare il processo di acquisizione delle immagini, poiché artefatti possono indurre in errore il software di analisi delle immagini e portare a risultati falsati. Ad esempio, qui viene mostrato il risultato di una densità eccessiva di cellule stromali o di un tempo troppo lungo tra la tripsinizzazione e la semina, che porta alla formazione di aggregati cellulari come visibile in questa immagine.

Se le linee cellulari vengono seminate a due densità elevate, formeranno colonie durante la replicazione, riducendo l'accuratezza dell'algoritmo di analisi delle immagini digitali poiché diventa sempre più difficile distinguere una cellula dall'altra. Inoltre, un numero troppo scarso di cellule di mieloma multiplo viene seminato quando il numero di cellule di mieloma multiplo ottenute dal prelievo midollare è inferiore a 500.000. È necessario determinare il volume morto del tubo utilizzato prima della semina delle cellule e includere tale volume nei calcoli di diluizione. Una volta acquisita padronanza, questa tecnica può essere eseguita in due o tre ore.

Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di mantenere il mezzo premiscelato contenente il collagene sul ghiaccio per prevenire la polimerizzazione prima che le cellule siano pronte. È stato inoltre utile per esplorare in che modo l'eterogeneità della chemosensibilità del carico tumorale possa determinare la profondità e la durata della risposta del paziente.