Name: Diffondere superfici e Immunostaining di cromosomi del lievito (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 6 s
Description: Impara la diffusione superficiale e l'immunostaining dei cromosomi del lievito per visualizzare proteine cromosomiche. Questa tecnica consente di studiare le interazioni proteiche in biologia cellulare e genetica.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Questo lavoro è stato supportato da sovvenzioni NIH GM50936 a DKB.

NOTA: Alcune fasi del protocollo di seguito richiedono che lavora in una cappa aspirante pulito. Inoltre, il metodo richiede un microscopio di dissezione lievito tetrad dotato di un obiettivo 10X distanza di funzionamento lunga monitorare spheroplasting. Il microscopio dovrebbe essere istituito nel cofano prima del tempo. Rimuovere il braccio micromanipolatore e portatarga dal campo di applicazione e inserire questi elementi in un luogo sicuro, lontano dalla zona di lavoro. 1. Preparazione di sferoplasti <ol><li> Crescere lievito in condizioni desiderate. Uso circa 2 x 10 8 cellule per ogni campione, ad esempio 4 ml di una coltura a OD600 = 1,4 5 x 10 7 cellule / ml. Sebbene trasformazione immediata di campioni può essere preferibile in alcuni casi, per la maggior parte delle applicazioni, aliquote di cellule possono essere conservate in ghiaccio per 8 ore prima di essere elaborato. </li><li> Trasferimento sospensione cellulare in una provetta da centrifuga da 15 ml e di spin in una centrifuga clinica a fissare 5 (2345 giri / 857,5 xg) per 3 minuti per far sedimentare le cellule. </li&gt; <li> Decantare il mezzo facendo attenzione a non perdere le cellule dal pellet. Risospendere delicatamente le cellule in tampone ZK 1 ml e aggiungere 40 ml 1 M ditiotreitolo (DTT). Incubare 2 min con miscelazione delicata. Cellule pellet come prima (vedi punto 1.2). </li><li> Pellet Risospendere nel buffer ZK 1 ml. Aggiungere 5 ml di una soluzione appena preparata di 100T zymolyase che è stato accuratamente miscelati. Incubare per 20-30 minuti a 30 ° C per rimuovere la parete cellulare e produrre sferoplasti. </li><li> Analizzare una goccia 10 ml di sospensione cellulare su un vetrino per microscopio per determinare se spheroplasting è completa. Le cellule viste al microscopio dissezione senza un vetrino. Le cellule devono apparire gonfio e rotondo, piuttosto che un po &#39;allungata e dovrebbero lisare seguito all&#39;aggiunta di 20 ml di acqua. Se le cellule non riescono a lisare, restituire il campione a 30 ° C e ri-test ogni 10 minuti fino a quando l&#39;acqua indotta lisi è facilmente osservabili. Cellule pellet come prima (vedi punto 1.2). </li><li> Risospendere delicatamente e lavare cellule pellet in 2,5 ml freddo MES / tampone sorbitolo. Cellule pellet come prima (vedi punto 1.2). Risospendere delicatamente pellet di cellule in 300-400 ml freddo MES / tampone sorbitolo. Le celle possono essere tenuti in ghiaccio in questa fase per diverse ore. </li></ol> 2. Diffondere Cromosoma NOTA: Le superfici di vetro su cui si diffondono, sia cromosomi diapositive o coprioggetto-dovrebbe essere preparata in anticipo. Ogni diapositiva o coprioggetto devono essere immersi in acqua, poi EtOH, poi lasciato asciugare e lucidato con carta per lenti. Se cromosomi saranno distribuite su vetrini, il vetrino deve essere apposto su un vetrino con nastro adesivo o mastice. Se non diversamente indicato, il resto del protocollo descriverà diffusione sia su un vetrino o coprioggetto <ol><li> Usando una pipetta P20, pipetta 20 ml di sospensione cellulare sulla superficie di un vetrino pulito. </li><li> Utilizzando una pipetta P200, aggiungere 40 ml di PFA / soluzione di saccarosio 3% e mescolare delicatamente la solution da &quot;agitando&quot; il vetrino con la mano fino a quando le linee Schlieren scompaiono. Mettere vetrino sotto il microscopio e confermano che le cellule sono a fuoco. La soluzione PFA deve essere appena preparata nella cappa il giorno di utilizzo. NOTA: Se la proteina di interesse non è stato esaminato con il metodo precedentemente, è consigliabile preparare diapositive utilizzando soluzioni contenenti 2 e 4% PFA per determinare se la ritenzione della proteina è sensibile alle condizioni di fissazione. Una soluzione / di saccarosio 4% PFA viene utilizzato nei casi in cui è auspicabile visualizzare microtubuli di tubulina associati. Lo svantaggio della maggiore concentrazione fissativo è che i cromosomi saranno &quot;underspread,&quot; 2% PFA tende anche a produrre cromosomi &quot;underspread&quot;. </li><li> Usando una pipetta P200, aggiungere 80 ml di 1% Lipsol, agitare come prima per miscelare soluzioni più completamente possibile, avviare un timer. Se Lipsol non è disponibile, 80 microlitri 1% NP40 o 80 ml ​​dH 2 O possono esseresostituito (vedi Rappresentante dei risultati, figura 2). </li><li> Guarda con attenzione e delicatamente le cellule agitare il vetrino ogni 15 secondi. Quando circa l&#39;80% delle cellule ha lisato (scomparsi) fermare il timer, rimuovere immediatamente il vetrino da microscopio, aggiungere 80 ml di PFA / soluzione di saccarosio, e agitare per mescolare. Lysis dovrebbe verificarsi di tra 30 e 90 sec dopo aver avviato il timer. NOTA: Se più diapositive mostrano lisi a circa lo stesso tempo, si può eventualmente omettere monitoraggio microscopico per il resto delle diapositive e semplicemente il tempo accuratamente periodo tra aggiunta di lipsol e l&#39;aggiunta della parte aliquota finale del fissativo. Tuttavia, questa scorciatoia è affidabile soltanto durante la preparazione più diapositive dallo stesso campione. E &#39;meglio monitorare lisi di ciascun campione microscopicamente quando diverse diapositive sono preparati da campioni prelevati in momenti diversi o da culture diverse. </li><li> Posizionare il vetrino su una superficie piana e pulita e diffondere il liquido su tutta la surfac unfrostede della slitta con il lato di un pulito monouso pipetta pascolo tenuto sotto del menisco del &quot;pozza&quot;, ma al di sopra della superficie della slitta stessa, cioè. non &quot;rastrello&quot; la superficie del vetrino con la pipetta. Non riutilizzare pipetta su diapositive diverse per evitare la contaminazione dei campioni. </li><li> Lasciare i vetrini ad asciugare durante la notte nella cappa. Componenti nucleari insolubili si depositerà sulla superficie di scorrimento e si legano ad esso. Per grandi esperimenti, pianificare l&#39;uso dello spazio per la fase di asciugatura è importante. </li><li> Una volta essiccato, i risultati migliori si ottengono procedendo alla fase immunocolorazione lo stesso giorno. Tuttavia, la soluzione di saccarosio essiccato incorpora i cromosomi diffusione in un &quot;miele&quot; che permette congelamento dei campioni: vetrini possono essere trasferiti ad una cassa scorrevole plastica e conservati a -20 ° C per anni. </li></ol> 3. Immunostaining <ol><li> Immergere i vetrini in 0,2% Foto-Flo per 30 sec. per rimuovere il miele. Diapositive Lean Onun bordo, con il bordo di riposo su un tovagliolo di carta per rimuovere residui Photo-Flo. </li><li> Immergere i vetrini in 1x TBS per 5 minuti per lavare. Rimuovere il liquido in eccesso appoggiandosi diapositive su uno spigolo, ma non lasciarli asciugare. </li><li> Posare diapositive glassato lato alto, pipetta 300 ml di TBS / BSA sul vetrino attraverso la porzione unfrosted della diapositiva. </li><li> Incubare in una camera umida a temperatura ambiente per 15 min. (Grande contenitore di plastica rivestito con acqua satura di tovaglioli di carta sotto una lastra di metallo o di plastica scivolo box traforata con tovaglioli di carta saturi). </li><li> Drain diapositive appoggiando una breve bordo del vetrino su un tovagliolo di carta e appoggiato la slitta contro un supporto appropriato (ad esempio un tubo cremagliera test). Non lasciare asciugare la superficie. </li><li> Applicare immediatamente 80 ml di tampone TBS / BSA contenente la diluizione appropriata di anticorpo primario. Se l&#39;anticorpo è limitante, utilizzare 40 ml e un coprioggetto mm 22 x 22. Per siero di coniglio greggio, questo è in genere tra una diluizione 1/50 e 1/500. NOTA:Eseguire titolazioni di nuovi preparati di anticorpi. La preparazione più diluita che produce segnale alto sopra sfondo è scelto. Per controllare il livello di colorazione di fondo, i nuclei devono essere preparati dal ceppo mutante di delezione appropriati e / o diapositive duplicati deve essere macchiato con siero pre-immune. </li><li> Posizionare un lucido 22 x 50 mm coprioggetto sul vetrino evitando bolle. A tale scopo, tenendo il vetrino tra il pollice e l&#39;indice sul lato lungo in posizioni vicino a uno lato corto. Tenendo il vetrino a 30 ° rispetto a scivolare, la breve lontano bordo dalle dita si abbassa fino ad appoggiarlo sul vetrino appena all&#39;interno del bordo della &quot;pozza&quot; vicino alla regione smerigliato della diapositiva. Poi abbassare lentamente il vetrino in un movimento fluido fino a quando le dita che reggono il tocco diapositiva in panchina, e poi rilasciarlo. Non tentare di regolare la posizione del vetrino, una volta che atterra. NOTA: Se spread cromosomiche sono stati preparati sucoprioggetto apposti (anziché direttamente sulla superficie di diapositive), questo campione coprioggetto rimarranno apposta sulla slitta durante la procedura di colorazione e lavaggio. Un vetrino supplementare sarà posto sulla parte superiore del vetrino campione per distribuire uniformemente la soluzione di anticorpi durante la colorazione e quindi scartato. </li><li> Posizionare i vetrini in una camera umida sigillata e incubare una notte a 4 ° C. </li><li> Tenendo il trasferimento bordo smerigliato i vetrini in una colorazione rack di vetrino e immergere in una vaschetta di colorazione contenente TBS. </li><li> Immergere delicatamente il vetrino su e giù per rimuovere il vetrino. Cercate di non usare troppa forza per farlo. Lavare le diapositive 2x 10 min immergendo in TBS. Togliere i vetrini dalla rastrelliera e drenare i liquidi in eccesso toccando bordo di un tovagliolo di carta. Non lasciare che la superficie asciutta. </li><li> Lavorando sotto la luce soffusa, aggiungere immediatamente 80 microlitri TBS / BSA contenente un 1 / 1.000 volte diluizione fluorocromo anticorpo secondario coniugato (o 40 ml con un coprioggetto 22 x 22 mm). Annunciod coprioggetto come prima e incubare a 4 ° C per 2 ore nella camera umida al buio. </li><li> Rimuovere coprioggetto come prima, scolare scivoli, e consentire superficie asciugare per 1 a 2 ore al buio. Diapositive Lean On asciugamani di carta come prima. NOTA: se la diffusione è stata eseguita su un vetrino montato, staccare il vetrino dalla diapositiva prima di asciugare. I vetrini vengono poi essiccati come descritto per diapositive nel passaggio precedente. </li><li> Lavorando sotto la luce soffusa, aggiungere circa 30 ml di mezzo contenente DAPI (tre 10 gocce microlitri) di montaggio e poi con attenzione abbassare un vetrino. Se gli spread sono su vetrini, posizionare le gocce di mezzo di montaggio su un vetrino pulito ed abbassare il vetrino, lato cromosoma verso il basso, sul vetrino. </li><li> Sempre sotto la luce soffusa, attendere 2 minuti per vetrino di stabilirsi e sigillare i bordi del coprioggetto con smalto trasparente. Mettere i vetrini in una scatola di guida piatta. NOTA: Per la microscopia STED, montare con Prolong oro. Utilizzare 30 ml di prolungare Orosenza DAPI e permettono di curare tutta la notte. Tenuta con smalto non è necessaria. </li><li> Lettura dei vetrini di epifluorescenza widefield con 40 o un obiettivo 100X utilizzando un set di filtri appropriati per DAPI per mettere a fuoco. Facoltativamente memorizzare il vetrino al buio a 4 ° C per diverse settimane. Non congelare. </li></ol>

<ol><li>Loidl, J., Nairz, K., Klein, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiotic+chromosome+synapsis+in+a+haploid+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">Meiotic chromosome synapsis in a haploid yeast.</a> Chromosoma. 100 (4), 221-228 (1991).</li>
<li>Loidl, J., Klein, F., Engebrecht, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+morphological+approaches+for+the+analysis+of+meiotic+chromosomes+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Genetic and morphological approaches for the analysis of meiotic chromosomes in yeast.</a> Methods in cell biology. 53, 257-285 (1998).</li>
<li>Lydall, D., Nikolsky, Y., Bishop, D. K., Weinert, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+meiotic+recombination+checkpoint+controlled+by+mitotic+checkpoint+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A meiotic recombination checkpoint controlled by mitotic checkpoint genes.</a> Nature. 383 (6603), 840-843 (1996).</li>
<li>Bishop, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RecA+homologs+Dmc1+and+Rad51+interact+to+form+multiple+nuclear+complexes+prior+to+meiotic+chromosome+synapsis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">RecA homologs Dmc1 and Rad51 interact to form multiple nuclear complexes prior to meiotic chromosome synapsis.</a> Cell. 79, 1081-1092 (1994).</li>
<li>Rabitsch, K. P., Galova, M., Schleiffer, A., Buonomo, S. B., Nasmyth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+genomics+identifies+Monopolin%3A+a+kinetochore+protein+required+for+segregation+of+homologs+during+meiosis+I%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Functional genomics identifies Monopolin: a kinetochore protein required for segregation of homologs during meiosis I.</a> Cell. 103 (7), 1155-1168 (2000).</li>
<li>Gasior, S. L., Olivares, H., Ear, U., Hari, D. M., Weichselbaum, R., Bishop, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+RecA-like+recombinases%3A+Distinct+roles+for+mediator+proteins+in+mitosis+and+meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Assembly of RecA-like recombinases: Distinct roles for mediator proteins in mitosis and meiosis.</a> PNAS. 98 (15), 8411-8418 (2001).</li>
<li>Biggins, S., Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+budding+yeast+protein+kinase+Ipl1%2FAurora+allows+the+absence+of+tension+to+activate+the+spindle+checkpoint%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">The budding yeast protein kinase Ipl1/Aurora allows the absence of tension to activate the spindle checkpoint.</a> Genes & Development. 15 (23), 3118-3129 (2001).</li>
<li>Dresser, M. E., Giroux, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiotic+chromosome+behavior+in+spread+preparations+of+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Meiotic chromosome behavior in spread preparations of yeast.</a> The Journal of Cell Biology. , (1988).</li>
<li>Lao, J. P., Cloud, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiotic+crossover+control+by+concerted+action+of+Rad51-Dmc1+in+homolog+template+bias+and+robust+homeostatic+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Meiotic crossover control by concerted action of Rad51-Dmc1 in homolog template bias and robust homeostatic regulation.</a> PLOS Genetics. 9 (12), e1003978-e1003978 (2013).</li>
<li>Vonesch, C., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fast+thresholded+landweber+algorithm+for+wavelet-regularized+multidimensional+deconvolution.+IEEE+transactions+on+image+processing+%3A+a+publication+of+the%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Signal+Processing+Society%22%5BJournal%5D)">A fast thresholded landweber algorithm for wavelet-regularized multidimensional deconvolution. IEEE transactions on image processing : a publication of the.</a> IEEE Signal Processing Society. 17 (4), 539-549 (2008).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

La comparsa di nuclei diffusi dipende in modo critico dall'equilibrio tra fissazione e lisi/trattamento detergente. Come discusso in precedenza, la conservazione di strutture cellulari variabili richiede l'uso di diverse concentrazioni di PFA. Per la maggior parte delle proteine, il 3% di PFA è ottimale. Tuttavia, la conservazione dei fusi richiede l'uso di PFA al 4%. Anche con un singolo set di reagenti, anche la tempistica della lisi rispetto alla fissazione può influenzare la qualità dei nuclei diffusi. Per ottener...

Il lievito Saccharomyces cerevisiae in erba offre numerosi vantaggi per gli studi di meccanismi molecolari di processi biologici, tra cui lo studio delle proteine ​​che controllano la funzione cromosoma. Anche se ci sono vantaggi ben noti di gemmazione di lievito per gli studi genetici, molecolari e biochimici, gli studi citologici della distribuzione delle proteine ​​nel nucleo della cellula è complicata dalla sua piccola dimensione. Il tipico nucleo lievito ha un diametro inferiore a un micron, che è solo circa 5 volte il limite di risoluzione di luce visibile. Pertanto, la quantità di informazioni sulla distribuzione delle proteine ​​nucleari che possono essere ottenuti da immunostaining convenzionale o utilizzando i tag proteine ​​fluorescenti come la proteina fluorescente verde (GFP), è limitata. Un approccio utile per caratterizzare la distribuzione subnucleare delle proteine ​​è superficiale cromosoma diffusione. Questo approccio comporta la rimozione della parete cellulare, interrompendo cellule e membrane nucleari, ellowing il contenuto insolubili del nucleo di stabilirsi sulla superficie di un vetrino da microscopio. Questi componenti insolubili includono matrice nucleare e cromosomi. Oltre a consentire la rimozione del contenuto nucleari solubili, che aumenta la capacità di rilevare le proteine ​​legate alla cromatina, il cromosoma diffusione metodo comporta sostanziale decompressione dei cromosomi tale che i nuclei diffusione hanno diametri di circa 3 a 5 micron (per nuclei meiotica diploidi) e 2-3 micron per nuclei mitotico diploidi. Questo permette di individuare la decompressione di sottostruttura nucleare che è relativamente difficile o impossibile da risolvere nei nuclei intatti. Un difetto evidente al cromosoma diffusione è la possibilità che la procedura di diffusione può parzialmente o completamente distruggere la struttura di interesse. Di particolare interesse è che un particolare cromosoma vincolato proteina potrebbe essere perso come conseguenza della procedura diffusione. Questo potenziale shou complicazioneld essere tenuto presente quando si interpretano i dati. Un esempio di una proteina che è sensibile alla procedura di diffusione è la beta-tubulina. In alcune condizioni, il mandrino, che è composto principalmente di tubulina, viene preservata durante lo spandimento 3. Visualizzazione del mandrino è spesso utile per mettere in scena i nuclei di interesse. Tuttavia, visualizzando tubulina richiede un trattamento con un fissatore alta concentrazione; mandrini sono persi nelle condizioni standard descritte di seguito. Questo esempio dimostra che, quando si analizza la distribuzione di una proteina precedenza uncharacterized, è importante variare la concentrazione di fissativo per determinare la sensibilità del proteina è a tale variazione. Nonostante la preoccupazione per l&#39;impatto delle condizioni di diffusione sulla struttura cromosomica, l&#39;utilità e la potenza del metodo di diffusione è stata dimostrata in molti contesti e ha un ampio programma di utilità nella caratterizzazione di mitotico e, in particolare le cellule meiotiche 4-7. Two metodi di diffusione sono stati ampiamente utilizzati. Il primo di questi metodi, sviluppato da Dresser and Giroux 8, evita l&#39;uso di detergenti e può produrre preparati diffusione che sembrano avere relativamente ben conservato morfologia dei cromosomi durante la colorazione per lo specifico DNA colorante DAPI. Tuttavia, questo metodo è relativamente difficile da perfezionare e la qualità dei nuclei spread varia drammaticamente, quando una regione di una diapositiva viene confrontato con altre regioni. Questo problema può complicare approcci quantitativi che coinvolgono l&#39;imaging molti nuclei non selezionati da una diapositiva per evitare distorsioni dei dati di acquisizione. Il secondo cromosoma metodo di diffusione, sviluppato da Loidl e Klein 1, comporta bilanciamento fissazione con paraformaldeide, con lisi e decompressione cromatina promosso da una soluzione detergente. Se correttamente eseguita, questo metodo dà risultati molto riproducibili con meno variazioni da regione a regione, rispetto al metodo Dresser and Giroux. Questa presentazione si concentra su un modified versione del metodo di Loidl e Klein, a causa della sua affidabilità e semplicità. Cromosoma diffusione non è complicato o che richiede tempo; fino a 100 vetrini possono essere preparate per immunocolorazione in un solo giorno. Inoltre, i preparativi di diffusione possono essere conservati in congelatore per gli anni precedenti al immunoistochimica, e quindi i laboratori in grado di sviluppare un archivio degli spread cromosomiche congelati che può essere utilizzato quando nuove questioni biologiche sorgono o nuovi reagenti di colorazione diventano disponibili. Il metodo cromosoma diffusione è più comunemente usato in combinazione con immunocolorazione e microscopia a fluorescenza widefield, ma è anche possibile preparare vetrini per super-risoluzione leggeri metodi microscopici quali l&#39;esaurimento emissione stimolata (STED) microscopia.

<table><tbody><tr><td>Zymolyase</td><td>US Biological&nbsp;</td><td>Z1004</td><td>Preparare una soluzione di 20 mg/mL in 50 mM Tris pH 7,5 addizionato con glucosio al 2%. Prepara fresco ogni esperimento e conservalo a 4 gradi; C fino al momento dell'uso.</td></tr><tr><td>Lipsol&nbsp;</td><td>L.I.P. Ltd&nbsp;</td><td>non più disponibile in commercio</td><td>Preparare una soluzione all'1% (v/v) in acqua. Conservare con ghiaccio.</td></tr><tr><td>NP-40</td><td>USB</td><td>19628</td><td>Preparare una soluzione all'1% (v/v) in acqua. Conservare con ghiaccio.</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P2287</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini</td><td>Corning</td><td>2948-75x25</td><td></td></tr><tr><td>Vetrino coprioggetti standard</td><td>Fisher</td><td>12-544-E o 12-540-B</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini coprioggetti ad alta risoluzione</td><td>Fisher</td><td>12-542-B</td><td></td></tr><tr><td>Photo-Flo 200 soluzione</td><td>Kodak</td><td>P-7417</td><td>Preparare la soluzione allo 0,2% (v/v) in acqua.</td></tr><tr><td>TBS</td><td></td><td></td><td>137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 24,7 mM Tris, pH 8</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td>Preparare una soluzione all'1% (p/v) in TBS. Conservare a 4 gradi C per un massimo di un mese.</td></tr><tr><td>Anticorpo</td><td></td><td></td><td></td>primario</tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit</td><td>Invitrogen</td><td>A-21206</td><td></td></tr><tr><td>IgG (H+L) Anticorpo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vectashield supporti di montaggio con DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold</td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>Scatola di vetrini in plastica</td><td>Fisher</td><td>03-448-1</td><td>Conservare i vetrini contenenti creme spalmabili essiccate in fessure a -20°C. Inoltre, utilizzare come camera umida.</td></tr><tr><td>Scatola di cartone per vetrini</td><td>Fisher</td><td>12-587-10</td><td>Utilizzare per trasportare comodamente vetrini macchiati/sigillati o per conservarli a 4 gradi.</td></tr><tr><td>Barattolo Coplin</td><td>Fisher</td><td>08-816</td><td>Utilizzabile come lavabo per scivoli.</td></tr></tbody></table>

diffondere superfici e immunostaining di cromosomi del lievito

Surface Spreading and Immunostaining of Yeast Chromosomes

Le piccole dimensioni dei nuclei del lievito Saccharomyces cerevisiae limitano l'utilità della microscopia ottica per l'analisi della distribuzione subnucleare delle proteine legate alla cromatina. La diffusione superficiale dei nuclei di lievito provoca l'espansione della cromatina senza perdita di proteine legate. Un metodo per la diffusione superficiale bilancia la fissazione delle proteine legate al DNA con il trattamento detergente. Il metodo dimostrato è leggermente modificato da quello descritto da Josef Loidl e Franz Klein1,2. Il metodo è stato utilizzato per caratterizzare la localizzazione di molte proteine legate alla cromatina in vari stadi del ciclo cellulare mitotico, ma è particolarmente utile per lo studio delle strutture cromosomiche meiotiche come i ricombinosomi meiotici e il complesso sinaptonemale. Descriviamo anche una modifica che non richiede l'uso di Lipsol, un detergente proprietario, che era richiesto nella procedura originale, ma non più disponibile in commercio. Viene inoltre descritto un protocollo di immunocolorazione compatibile con il metodo di diffusione cromosomica.

La comparsa di nuclei di diffusione dipende in modo critico sul bilanciamento tra cromosomi fissazione e de-compattazione. Anche quando i reagenti sono correttamente bilanciati, variazione del grado del cromosoma de-compattazione può verificarsi in diverse regioni della stessa diapositiva e / o tra diverse diapositive. Pertanto, la qualità di spread in una data regione di un vetrino deve essere valutato prima immagini vengono interpretati. Gli effetti della &quot;invadendo&quot; e &quot;unde...

Viene presentato un metodo per la diffusione superficiale dei cromosomi dal lievito in gemmazione. Questo metodo è derivato da un metodo precedentemente descritto da Loidl e Klein. Inoltre, dimostriamo una procedura per l'immunocolorazione dei cromosomi diffusi.

Diffondere superfici e Immunostaining di cromosomi del lievito

The small size of nuclei of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae limits the utility of light microscopy for analysis of the subnuclear distribution ...

L'obiettivo generale di questa procedura è visualizzare le proteine legate ai cromosomi mediante microscopia a fluorescenza. Questo viene ottenuto rimuovendo innanzitutto la parete cellulare mediante trattamento con enzimi. I'm olis.Il secondo passaggio consiste nel lisiare la cellula attraverso le membrane nucleari mediante shock osmotico, solitamente con l'aiuto di un detergente. Questo viene effettuato in presenza di una bassa concentrazione di fissativo per preservare la struttura delle proteine. Dopo la lisi della cellula, la concentrazione di fissativo viene aumentata per stabilizzare ulteriormente le strutture proteiche.Le cellule lisate vengono quindi depositate su un vetrino da microscopio e i nuclei vengono lasciati sedimentare sulla superficie del vetrino. L'ultimo passaggio consiste nell'immunomarcare i campioni. Il metodo di immunomarcatura indiretta qui dimostrato utilizza un anticorpo primario che si lega alla proteina di interesse e un anticorpo secondario marcato con un fluorocromo che si lega all'anticorpo primario.Infine, la microscopia a fluorescenza immunoistochimica viene utilizzata per esaminare la distribuzione delle proteine legate ai cromosomi. Queste immagini rappresentative mostrano un nucleo mitotico sparso, marcato mediante immunofluorescenza per le proteine della ricombinazione DMC1 e RAD51. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto all'altro metodo comunemente usato, introdotto da Mike Dresser e Craig Deru, è che la maggior parte della superficie del vetrino conterrà nuclei ottimamente dispersi, facilitando l'acquisizione di immagini di un elevato numero di nuclei sparso da un singolo vetrino.Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali nello studio delle strutture subnucleari, ad esempio se due proteine co-localizzano oppure se la formazione di una particolare sottostruttura nucleare dipende dalla funzione di un determinato gene di interesse. Sottolineiamo che questo metodo è stato originariamente sviluppato da Franz Klein e Yosef Lole. Speriamo che questo video aiuti altre persone a padroneggiare la nostra versione della tecnica.Le gocce vengono preparate a partire da cellule di lievito coltivate nelle condizioni desiderate. Utilizzare circa due volte 10 alla otto cellule per ogni campione. Trasferire la sospensione cellulare in provette da centrifuga da 15 millilitri.Centrifugare i tubi in una centrifuga clinica a un'impostazione di cinque per tre minuti per ottenere il pellet cellulare. Decantare il mezzo, avendo cura di non perdere le cellule dal pellet. Risospendere delicatamente le cellule in un millilitro di tampone ZK e quindi aggiungere 40 microlitri di dihi a una molarità di uno. Tre etol incubano per due minuti a temperatura ambiente con un leggero mescolamento. Raccogliere le cellule come in precedenza dopo averle risospese. Sospendere ogni pellet in un millilitro di tampone ZK.Aggiungere cinque microlitri di una soluzione appena preparata di zy liasi 100 T che sia stata mescolata accuratamente. Incubare a 30 gradi Celsius per 20-30 minuti per rimuovere la parete cellulare e produrre sferoplasti. Analizzare 10 microlitri della sospensione cellulare al microscopio per determinare se la sferoplastizzazione è completa.Prima della rimozione della parete cellulare, le cellule di lievito appaiono leggermente ovali; le cellule sferoplaste devono apparire rigonfie e rotonde. Dopo l'aggiunta di acqua, le cellule sferoplaste devono essere delicatamente risospese; quindi, lavare il pellet cellulare in 2,5 millilitri di tampone MES freddo orbitale. Dopo la centrifugazione, risospendere nuovamente delicatamente il pellet cellulare in 300-400 microlitri di tampone MES freddo orbitale; a questo punto, le cellule possono essere mantenute sul ghiaccio per diverse ore.Questa procedura richiede un microscopio per la dissezione tetra di lievito dotato di un obiettivo con lunga distanza di lavoro 10x, configurato all'interno della cappa, e l'ago per microdissezione deve essere rimosso. La superficie di vetro su cui verranno distribuiti i cromosomi dovrebbe essere preparata in anticipo: utilizzando una pipetta P20, depositare 20 microlitri della sospensione cellulare sulla superficie di un vetrino pulito; con una pipetta P200 aggiungere 40 microlitri di una soluzione appena preparata di paraformaldeide al 3% e saccarosio al 3,4% e mescolare delicatamente la soluzione ruotando il vetrino con la mano fino alla scomparsa delle linee di schlein. Posizionare il vetrino sotto il microscopio e verificare che le cellule siano a fuoco.Utilizzando una pipetta P200, aggiungere 80 microlitri di Lip Sal al 1% e ruotare delicatamente come in precedenza per mescolare le soluzioni in modo più completo possibile e avviare un cronometro. Se il Lip Sal non è disponibile, si può usare lo stesso volume di MP40 all'1% o acqua distillata. In alternativa, osservare attentamente le cellule e ruotare delicatamente il vetrino ogni 15 secondi.Questo filmato mostra ciò che si dovrebbe osservare quando circa l'80-90% delle cellule è andato incontro a lisi. Arrestare il cronometro e rimuovere immediatamente la preparazione dal microscopio. La lisi dovrebbe verificarsi tra i 30 e i 90 secondi.Dopo aver avviato il cronometro, aggiungere 80 microlitri della soluzione di paraformaldeide-saccarosio e mescolare delicatamente con movimenti rotatori. Posizionare il vetrino su una superficie pulita e piana. Utilizzare il lato di una pipetta Pasteur monouso pulita, tenuta al di sotto del menisco della goccia ma al di sopra della superficie del vetrino, per distribuire il liquido su tutta la superficie non satinata del vetrino.Non raschiare la superficie del vetrino con la pipetta. Utilizzare una pipetta nuova per ogni vetrino per evitare contaminazioni tra i campioni. Lasciare i vetrini ad asciugare durante la notte nell'armadio aspirante; le componenti nucleari insolubili, inclusi i cromosomi, si depositeranno sulla superficie del vetrino e vi si legheranno una volta che i vetrini saranno asciutti.Si ottengono risultati ottimali procedendo con la colorazione immuno nello stesso giorno. Immergere i vetrini in Photo flow al 0,2% per 30 secondi. Per rimuovere la soluzione di saccarosio secca, appoggiare i vetrini su un bordo, con il bordo a contatto con un tovagliolo di carta, per eliminare il residuo di photo flow.Immergere i vetrini in un XTBS per cinque minuti per lavarli. Rimuovere il liquido in eccesso appoggiando i vetrini su un bordo, ma fare attenzione a non farli asciugare. Successivamente, posizionare i vetrini con la parte opaca rivolta verso l'alto e pipettare 300 microlitri di T-B-S-B-S-A su ciascun vetrino, distribuendoli sulla porzione non opaca del vetrino.Incubare i vetrini in una camera umida a temperatura ambiente per 15 minuti. Trascorsi 15 minuti, asciugare i vetrini appoggiando un bordo corto di ciascun vetrino su un tovagliolo di carta e appoggiando il vetrino contro un supporto adeguato, come un portaprovette. Non permettere alla superficie di asciugarsi immediatamente.Applicare 80 microlitri di tampone T-B-S-B-S-A contenente la diluizione appropriata dell'anticorpo primario per siero di coniglio grezzo. Questa è tipicamente compresa tra una diluizione da uno a 50 e da uno a 500. Posizionare un'ampolla levigata di 22 per 50 millimetri sul vetrino evitando bolle d'aria.Fare ciò tenendo il coprioggetto tra il pollice e l'indice lungo il bordo lungo, in prossimità di uno dei bordi corti. Tenendo il coprioggetto a un angolo di 30 gradi rispetto al vetrino, abbassare il bordo corto più lontano dalle dita finché non poggia sul vetrino appena all'interno del bordo della goccia più vicina alla zona opaca del vetrino.Abbassare lentamente il coprioggetto con un movimento uniforme finché le dita non toccano il vetrino, quindi rilasciarlo. Non tentare di regolare la posizione del coprioggetto una volta che è a contatto. Posizionare i vetrini in una camera umida sigillata e incubare tutta la notte a quattro gradi Celsius il giorno successivo, tenendo i vetrini per il bordo smerigliato. Immergere ciascuno in un barattolo per colorazione contenente TBS.Spostare delicatamente le vetturelle immerse su e gi&ugrave; per rimuovere il coprioggetto. Evitare di usare troppa forza durante questa operazione. Lavare le vetturelle immergendole due volte in TBS, per 10 minuti ciascuna volta.Sostituire il tampone dopo il primo lavaggio. Rimuovere i vetrini dalla staffa e rimuovere il liquido in eccesso toccando i bordi con fazzoletti di carta. Non far asciugare immediatamente la superficie.Aggiungere su ogni vetrino 80 microlitri di T-B-S-B-S-A contenente un'anticorpo secondario coniugato con fluorocromo diluito da 1 a 1000 volte. Aggiungere il coprioggetto come in precedenza e incubare nella camera umida a quattro gradi Celsius per due ore al buio. Dopo due ore, rimuovere i coprioggetti, lavare come in precedenza e asciugare i vetrini.Appoggiarli su carta assorbente. Lasciare asciugare all'aria la superficie per uno o due ore al buio, lavorando con luce attenuata, utilizzando circa 30 microlitri di mezzo di montaggio contenente dbi. Quindi abbassare con attenzione un coprioggetto.Attendere due minuti ancora in luce attenuata affinché il coprioggetto si assesti, quindi sigillare i bordi del coprioggetto con smalto trasparente per unghie. Posizionare i vetrini in una scatola per vetrini piana. I vetrini possono essere conservati al buio a quattro gradi Celsius fino al momento dell'osservazione.Non congelare. I vetrini mostrati in questo passaggio sono due esempi di nuclei mitotici ottimamente distesi, sottoposti a doppia immunomarcatura per le due proteine eucariotiche di scambio del filamento RAD51 e DMC1 e controcolorazione per il DNA con DPI. Per cellule diploidi, i nuclei mitotici ottimamente distesi hanno un diametro di circa cinque micron. In un nucleo poco disteso, si risolvono meno foci di RAD51 e DMC1 e non tutte le strutture possono essere osservate in un singolo piano focale poiché il campione non è sufficientemente piatto; nei nuclei eccessivamente distesi, ciò non avviene.Restano meno foci di RAD51 e DMC1 a causa di una fissazione insufficiente e/o di un eccesso di detergente. Sono stati inoltre condotti esperimenti di trattamento in cui lip-sal, non più disponibile in commercio, è stato sostituito con MP-40, ottenendo risultati soddisfacenti, come mostrato nella colorazione dello sperone nucleare miotico per RAD51 e Zip1, un componente della regione centrale del complesso sinaptinale. La sostituzione di lip-sal con acqua distillata ha anch'essa prodotto risultati soddisfacenti.In entrambi i casi, la compattazione del cromosoma che si verifica quando le cellule passano dalla NEA leptinica alla PAA è stata in gran parte preservata. Questo metodo di diffusione è adatto all'uso con metodi di microscopia di super-risoluzione. In questa immagine del Complesso Sinaptonemico, il nucleo Paki INE è stato mantenuto per zip uno e rosso uno.Componenti del complesso sinaptinemico di Neal osservati mediante microscopia a deplezione stimolata dell'emissione. Si noti che l'anticorpo zip one utilizzato qui, mostrato in verde, si lega vicino agli elementi laterali, come dimostrato dal pattern di colorazione lineare parallelo. Gli elementi laterali distano circa 100 nanometri l'uno dall'altro e non possono essere risolti mediante microscopia convenzionale.Una volta acquisita padronanza, l'intero processo di piastramento e distribuzione può essere eseguito in due-quattro ore, a seconda del numero di campioni; con la pratica, è possibile preparare fino a 100 vetrini con questo metodo. È consigliabile preparare uno o più vetrini duplicati per ogni campione. I duplicati possono essere conservati per utilizzi futuri a meno 20 gradi Celsius dopo il passaggio di essiccazione notturna.I vetrini di solito si conservano per anni se conservati in questo modo.

surface-spreading-and-immunostaining-of-yeast-chromosomes

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

Delezione del gene e l'iperespressione delle proteine ​​sono metodi comuni per lo studio delle funzioni delle proteine. In questo articolo, descriviamo un protocollo per l'analisi del fenotipo di sviluppo in funzione della concentrazione di proteine ​​a popolazione e monocellulari...

Analisi dello sviluppo di un fenotipo morfologico come funzione della concentrazione di proteine ​​in lievito

Un metodo per l'integrazione di colonie di lievito che permette di sezionamento per la microscopia ottica ed elettronica. Questo protocollo consente di determinare la distribuzione delle cellule sporigeni e cellule pseudohyphal all'interno di colonie disposizione un nuovo strumento per comprendere l'organizzazione di tipi di cellule all'interno di una comunità fungine.

Lievito Colony metodo di inserimento

In questo protocollo, l'espressione genica nel lievito...

Microarray analisi per Saccharomyces cerevisiae</em

Questo protocollo descrive una procedura sperimentale per eseguire...

Visualizzazione e l&#39;analisi di molecole di mRNA mediante fluorescenza<em&gt; In Situ</em&gt; Ibridazione in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Forniamo un metodo di base riproducibile per la microscopia a lungo termine del ciclo di vita sessuale del lievito di fissione. Con i piccoli aggiustamenti descritti, il protocollo presentato consente di concentrare la ricerca su diverse fasi del processo riproduttivo.

Microscopia di lievito di fissione del ciclo di vita sessuale

Qui, presentiamo l'imaging a cellule vive che è un metodo di microscopia non tossico che consente ai ricercatori di studiare il comportamento delle proteine e la dinamica nucleare nelle cellule di lievito di fissione viventi durante la mitosi e la meiosi.

Esame della dinamica nucleare del lievito di fissione mitotico e meiotico da fluorescenza microscopia a celle vive

Lo scopo di questo protocollo è quello di visualizzare Candida albicans forma cellulare e localizzazione nel tratto gastrointestinale dei mammiferi.

Visualizzazione degli albicani Candida nel tratto gastrointestinale Murine utilizzando l'ibridazione fluorescente in Situ

La microscopia time-lapse è uno strumento prezioso per studiare la meiosi nel lievito in erba. Questo protocollo descrive un metodo che combina la sincronizzazione del ciclo cellulare, la microscopia time-lapse e l'esaurimento condizionale di una proteina bersaglio per dimostrare come studiare la funzione di una proteina specifica durante la segregazione cromosomica meiotica.

Uso della microscopia time-lapse e della deplezione nucleare stadio-specifica delle proteine per studiare la meiosi in S. cerevisiae

Il lievito di fissione viene utilizzato qui come ospite eterologo per esprimere proteine citoscheletriche batteriche come FtsZ e MreB come proteine di fusione traduzionali con GFP per visualizzare la loro polimerizzazione. Inoltre, i composti che influenzano la polimerizzazione vengono identificati mediante imaging utilizzando un microscopio a fluorescenza.

Il lievito di fissione come piattaforma per lo screening di farmaci antibatterici mirati alle proteine del citoscheletro batterico

Questo protocollo descrive in dettaglio due metodi di arresto del ciclo cellulare di lievito e rilascio opzionale, ed elabora l'uso della microscopia a fluorescenza per studiare i processi dipendenti dal ciclo cellulare in S. cerevisiae.

Manipolazione e analisi dei processi dipendenti dal ciclo cellulare nel lievito in gemmazione

Impara la diffusione superficiale e l'immunostaining dei cromosomi del lievito per visualizzare proteine cromosomiche. Questa tecnica consente di studiare le interazioni proteiche in biologia cellulare e genetica.

Diffondere superfici e Immunostaining di cromosomi del lievito

Esplora altri video