Un 3D Polmone umano tessuto modello per studi funzionali su Mycobacterium tuberculosis Infezione

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di costruire un modello di tessuto polmonare in vitro per lo studio dell'infezione da M tuberculosis. Ciò si ottiene stratificando prima una matrice di collagene di fibroblasti sul filtro di un inserto di piastra per colture cellulari. Nella seconda fase, le cellule immunitarie ed epiteliali polmonari infette vengono posizionate sullo strato di collagene dei fibroblasti.

Il modello tissutale 3D risultante viene quindi esposto all'aria per facilitare la secrezione di muco e la stratificazione dell'epitelio. Nella fase finale, il tessuto viene raccolto e montato. In definitiva, la microscopia a immunofluorescenza viene utilizzata per analizzare la formazione del granuloma precoce indotto da M tuberculosis.

Il vantaggio principale di questa tecnica o dei metodi esistenti, come il monostrato di cellule in vitro, è che le cellule di questo sistema sono presenti in un microambiente 3D, consentendo la formazione di granulomi in seguito all'infezione con microbatteri virulenti simili alla tubercolosi umana Per preparare i fibroblasti incorporati nel collagene, iniziare trattando le cellule dei fibroblasti polmonari con tripsina per 10 minuti a 37 gradi Celsius quando le cellule si sono staccate, Fermare la reazione con otto millilitri di DMEM completo e poi far girare le cellule. Risospendere i pellet a 230.000 cellule per millilitro in dmm fresco e posizionare le celle sul ghiaccio. Quindi, aggiungi un inserto per pozzetto in un sei.

Impiattare bene ed erogare un millilitro di una miscela di strati cellulari appena preparata in ciascun inserto, assicurandosi che la miscela copra l'intero inserto senza bolle d'aria. Quindi posizionare il piatto in un'incubatrice a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Al termine dell'incubazione, mescolare due millilitri di collagene con 615 microlitri di premiscela in un tubo conico sterile su ghiaccio per neutralizzare il pH del collagene per inserto.

Quindi aggiungere alla miscela di collagene 58 microlitri di dmem completo e 327 microlitri di fibroblasti polmonari per inserto. Pipettare su e giù per distribuire uniformemente le cellule in tutta la miscela. Ora aggiungi rapidamente tre millilitri di strato cellulare lungo il lato di ciascun inserto su ogni strato di collagene acellulare.

Facendo attenzione a evitare bolle d'aria e rimettere la piastra nell'incubatore per colture cellulari per altre due ore. Dopo la polimerizzazione del collagene, aggiungere due millilitri di dmem completo sul fondo di ciascun pozzetto e rimettere la piastra nell'incubatore per altre 24 ore. Il giorno successivo, utilizzare un paio di pinze pulite per sollevare con cautela gli inserti uno alla volta e aspirare il terreno di coltura dal fondo di ciascuno.

Bene, quindi aggiungere due millilitri di DMM completo sul fondo di ciascun pozzetto e due millilitri di DMM completo a ciascun inserto. Cambiando entrambi i volumi di medium ogni due giorni per cinque-sette giorni. Per preparare i macrofagi infetti, iniziare incubando una coltura di macrofagi per quattro ore con M tuberculosis virulenta a una molteplicità di infezioni di 10.

Al termine dell'incubazione, lavare le cellule tre volte con PBS per rimuovere i batteri extracellulari e trattare i macrofagi con due millimolari, A DTA per 10 minuti a 37 gradi Celsius. Quando le cellule si sono staccate, sospenderle in dmm completo privo di antibiotici. Quindi aspirare tutto il terreno dalla piastra della matrice di collagene dei fibroblasti e aggiungere 1,5 millilitri di DMM completo fresco privo di antibiotici nelle camere esterne.

Successivamente, mescolare monociti marcati in fluorescenza con i macrofagi infetti in un rapporto di cinque a uno in 50 microlitri di DM EM completo privo di antibiotici per inserto. Quindi aggiungere 50 microlitri della miscela di macrofagi monociti all'interno di ciascun inserto e rimettere la piastra nell'incubatore. Dopo un'ora, aggiungere lentamente due millilitri di coltura, mediare lungo le pareti degli inserti per evitare di spostare le cellule e incubare le colture per altre 24 ore.

Per seminare le colture con cellule epiteliali polmonari, aggiungere 4 milioni di cellule epiteliali per millilitro in 50 microlitri di dmm completo sopra le matrici di collagene dei fibroblasti delle cellule immunitarie. Incubare le cellule per due minuti a temperatura ambiente, seguiti da un'ora a 37 gradi Celsius. Quindi aggiungere delicatamente due millilitri di DMM completo privo di antibiotici agli inserti, come appena dimostrato, e coltivare le cellule per altri tre giorni.

Cinque giorni dopo la semina, i macrofagi infetti aspirano tutto il terreno di coltura dalla piastra e aggiungono 1,8 millilitri di DMM completo privo di antibiotici nelle camere esterne. Quindi, l'aria ha esposto i modelli di tessuto 3D nell'incubatore per due giorni senza aggiungere terreno all'inserto il settimo giorno. Dopo la semina.

Rimuovere completamente il terreno dalla piastra e mescolare i modelli di tessuto con il 4% di paraldeide per 30 minuti a temperatura ambiente al buio. Quindi, utilizzando un bisturi, separare le membrane dagli inserti del pozzetto. Quindi, usa un bisturi pulito per rimuovere con cura i lati dei modelli di tessuto e taglia ogni tessuto in quattro pezzi quadrati di dimensioni approssimativamente uguali.

Trasferite i pezzi su dei vetrini super frost e lasciateli asciugare per cinque minuti. Quindi, utilizzando un supporto fluorescente, contenente anti sbiadimento e dpi, montare i tessuti e coprirli con vetrini. Lasciare i vetrini a temperatura ambiente al buio fino a quando non sono asciutti, quindi sigillare i bordi del vetrino coprioggetti con lo smalto per unghie.

Quando la vernice è asciutta, immergere i vetrini in etanolo al 70% per un trasferimento fuori dalla struttura BSL three. Per visualizzare i tessuti, è possibile acquisire immagini 3D di 5-10 campi diversi che coprono l'intero pezzo di tessuto con una risoluzione di 512 x 512 con Zack che copre a uno spessore minimo di 20 micron con una separazione da uno a 1,5 micron tra le pile su un microscopio confocale fluorescente per la quantificazione 3D dei cluster cellulari. Apri il software di elaborazione delle immagini 3D e carica l'immagine di interesse.

Successivamente, utilizzando lo strumento di regolazione dello schermo, regola ciascun canale per l'immagine, il contrasto, la luminosità e l'opacità della fusione per ottimizzare il rendering del volume e ridurre al minimo l'interferenza del rumore. Quindi, per visualizzare la superficie del tessuto, selezionare il canale dei monociti rossi e impostare le soglie appropriate utilizzando i filtri per limitare la selezione dei monociti rossi o per escludere lo sfondo, se necessario. Infine, esporta i dati nel programma di fogli di calcolo appropriato per ulteriori analisi a valle.

Il settimo giorno, la microscopia confocale con semina cellulare infetta post tubercolosi M rivela un raggruppamento di monociti rossi nel sito di infezione, come notato dalla presenza di batteri verdi che imitano le lesioni della tubercolosi umana note come granuloma 3D. La visualizzazione offre la flessibilità di interagire, esaminare e quantificare diverse caratteristiche. Un'immagine 3D, ad esempio, in queste immagini raffigura un gruppo di monociti nel sito della tubercolosi em.

La disposizione spaziale dei batteri verdi e dei cluster di monociti rossi può essere osservata dalle viste apicale, rotazionale e laterale. Come previsto, questi cluster non sono stati osservati nei tessuti non infetti. La quantificazione delle dimensioni e del numero di monociti, gruppi cellulari e tessuti infetti da M tuberculosis ha rivelato che la dimensione dei cluster cellulari è aumentata mentre il numero di singoli monociti è diminuito rispetto ai modelli di tessuto non infetto.

I potenziali utenti di questo modello di tessuto polmonare includono uno studio del ruolo di diverse cellule immunitarie e dell'immunità tissutale nella tubercolosi, lo studio dei fenotipi dei micobatteri e la sperimentazione di candidati farmaci che uccidono i micobatteri all'interno del granuloma.