Un metodo computerizzato riproducibile per la quantificazione della densità capillare con letto ungueale Capillaroscopia

L'obiettivo generale di questa procedura è quantificare il numero di capillari per millimetro quadrato nell'area della pelle situata direttamente al di sotto della cuticola ungueale. Questo viene ottenuto innanzitutto acquisendo un'immagine in bianco e nero del letto ungueale situato al di sotto della cuticola. Il secondo passaggio consiste nell'importare l'immagine in un programma informatico per l'elaborazione delle immagini.

Successivamente, le immagini vengono elaborate al fine di visualizzare meglio i capillari; l'ultimo passaggio consiste nell'identificare e contare tutti i capillari presenti all'interno di un millimetro quadrato. In definitiva, l'elaborazione delle immagini viene utilizzata per mostrare la quantità e la morfologia dei capillari di un individuo. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo cardiovascolare, ad esempio in che modo l'ipertensione, il diabete e altre malattie possano influire sulla microcircolazione.

Utilizzando una fotocamera digitale monocromatica, acquisire le immagini dei capillari come descritto in precedenza. Successivamente, acquisire immagini di calibrazione di un righello con marcature millimetriche utilizzando la stessa fotocamera e le stesse condizioni di ingrandimento impiegate per ottenere le immagini dei capillari. Importare l'immagine del righello nel programma di elaborazione delle immagini e misurare il numero di pixel corrispondenti a una linea di un millimetro sulla fotografia del righello.

Scrivere questo numero e calcolare il numero di pixel presenti in una regione di un millimetro per un millimetro. Successivamente, aprire una delle immagini dei capillari, scurire i capillari e schiarire lo sfondo regolando l'immagine mediante un istogramma di migliore adattamento. Quindi utilizzare il comando Crea ROI nel menu a discesa per creare una regione di interesse di un millimetro per un millimetro nella parte superiore dello schermo.

Trascini e posizioni la regione di interesse nel punto con i capillari più nitidi. Assicurarsi che la regione di interesse sia posizionata in modo che l'apice dei capillari si trovi esattamente nella parte superiore della regione. La chiave per la riproducibilità e la standardizzazione di questo passaggio del protocollo è il corretto posizionamento del riquadro della regione di interesse di un millimetro quadrato.

Una buona norma pratica per mantenere la standardizzazione consiste nel posizionare la casella all'apice o all'estremità dei loop capillari dell'immagine. Una volta posizionata correttamente, fare clic sull'area di interesse (ROI) e quindi selezionare "ritaglia" dal menu a tendina che appare; successivamente, appiattire l'immagine in modo che tutte le successive regolazioni vengano applicate uniformemente. In seguito, aumentare il contrasto dell'immagine a 75 in modo che i capillari risultino massimamente visibili.

Applicare inoltre una funzione di despeckle per rendere più uniformi i bordi dei capillari. Definire il contrasto dell'immagine regolando l'istogramma sul modello migliore, in modo che i capillari risultino neri e lo sfondo bianco. Su ciascuna immagine, selezionare manualmente un tratto di capillare ben definito utilizzando la funzione di oggetto bersaglio, in modo che venga riconosciuto come oggetto da conteggiare da parte del programma.

Quindi selezionare una piccola parte dello sfondo utilizzando la funzione di sfondo come riferimento per le aree che devono essere ignorate dall'algoritmo di conteggio. Impostare il diametro minimo degli oggetti da contare a cinque pixel per evitare di conteggiare il rumore di fondo come capillari. Successivamente, utilizzare la funzione di conteggio per contare istantaneamente tutti i capillari nell'immagine per ogni singolo individuo.

Calcolare la media di tre o quattro immagini per ottenere una valutazione più affidabile. Per risparmiare tempo, creare una macro per eseguire automaticamente una sequenza specifica di processi su una o più immagini, selezionando innanzitutto l'opzione "registra macro" e assegnando alla macro un nome in base ai passaggi e ai processi eseguiti e descritti in questo video. Successivamente, eseguire i passaggi di manipolazione dell'immagine mentre la macro è in fase di registrazione.

Quando si utilizza la macro su immagini future, è sufficiente fare clic su "esegui macro" e il programma applicherà automaticamente i miglioramenti registrati alle immagini desiderate. L'unico passaggio che richiede l'intervento dell'utente è la scelta del punto in cui ritagliare l'immagine. Un'immagine ottimamente elaborata può essere analizzata in 30 secondi e permette di distinguere chiaramente i capillari dallo sfondo, nonché i singoli capillari tra loro.

L'immagine finale migliorata è mostrata qui. Il conteggio totale determinato per questa immagine è stato di 54 capillari per millimetro quadrato. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere utilizzata per quantificare e manipolare 12 immagini entro 20 minuti.