Etichettatura delle cellule e Targeting con superparamagnetico ossido di ferro nanoparticelle

L'obiettivo generale di questa procedura è sintetizzare nanoparticelle di ossido di ferro super paramagnetiche e utilizzare tali particelle per etichettare le cellule per applicazioni di targeting e smistamento magnetico. Ciò si ottiene sintetizzando prima nanoparticelle di magnetite di 10 nanometri di diametro. Il secondo passo consiste nel rivestire le nanoparticelle di magnetite con un guscio spesso 50 nanometri di acido polilattico co glicolico o PLGA.

Successivamente, le nanoparticelle magnetiche vengono lavate e liofilizzate. La fase finale consiste nell'etichettare le cellule con nanoparticelle magnetiche per applicazioni di targeting e smistamento cellulare. In definitiva, la microscopia fluorescente viene utilizzata per mostrare il targeting di cellule marcate con nanoparticelle magnetiche all'interno di campi magnetici.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come il targeting cellulare mediato da anticorpi, è che il targeting cellulare magnetico è altamente specifico e controllabile. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia per una varietà di condizioni mediche perché le cellule terapeutiche possono essere consegnate al sito bersaglio mentre i siti fuori bersaglio vengono risparmiati. In generale, le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché è necessaria un'attenta attenzione ai dettagli per ottenere nanoparticelle pure e di alta qualità.

Volevamo migliorare il targeting e la localizzazione delle cellule viventi all'interno del corpo. Inizia usando una bottiglia di dressel per degassare 500 millilitri di acqua deionizzata facendo gorgogliare delicatamente l'azoto gassoso per 30 minuti. Per installare l'apparato di reazione, posizionare un pallone a fondo tondo a tre colli da 500 millilitri all'interno di un riscaldatore a mantello ISO.

Quindi, coprire un lato del collo con un setto di gomma e installare un condensatore a riflusso nell'altro. Far scorrere continuamente acqua fredda attraverso il condensatore per creare un'atmosfera inerte per la reazione. Per prima cosa, forare il setto di gomma delle fiasche con un ago collegato a una linea di azoto gassoso.

Quindi perforare il setto del condensatore con un ago collegato a un gorgogliatore per visualizzare il deflusso del gas. Quindi, installa un pedale della lama nel manico centrale con un adattatore per pagaia. Per mantenere costante l'agitazione della miscela di reazione, collegare l'albero della lama a un agitatore sopra la testa montato su un supporto.

Spurgare il pallone con azoto gassoso e lasciare che l'azoto fluisca nel pallone a una velocità bassa ma rilevabile. Quindi rimuovere il condensatore a riflusso e aggiungere un grammo di ferro, tre cloruri, 612,5 milligrammi di ferro, due cloruro tetra e 50 millilitri di acqua Degas. Sostituire il condensatore e agitare la reazione a 1000 giri/min mentre si riscalda a 50 gradi Celsius.

Questo produrrà particelle di magnetite di 10 nanometri di diametro. Una volta che la reazione ha raggiunto i 50 gradi Celsius, utilizzare una siringa per iniettare 10 millilitri di idrossido di ammonio al 28% attraverso il setto del pallone. Man mano che la magnetite precipita, la soluzione dovrebbe diventare nera.

Rimuovere il setto di gomma e la linea del gas e riscaldare la reazione a 90 gradi Celsius. Quindi aggiungere un millilitro di acido oleico al pallone per rivestire le nanoparticelle e formare il gel di magnetite. Quindi, sostituire il setto e la linea del gas sul pallone e rimuovere il condensatore.

Spegnete il fuoco e mescolate la reazione a 500 RPM per due ore. Dopo aver mescolato, decantare il liquido in eccesso tenendo le nanoparticelle sul fondo del pallone con un forte magnete. Per iniziare la purificazione, sciogliere prima il gel di magnetite in 40 millilitri di esani.

Versare lentamente questa soluzione in un imbuto separatore contenente 40 millilitri di acqua Degas e far roteare delicatamente l'imbuto per cinque minuti. Dopo aver decantato la frazione acquosa inferiore, lavare la soluzione di magnetite altre due volte con acqua Degas in modo simile. Quindi, trasferire la soluzione di magnetite in un pallone di erlenmeyer.

Asciugare la soluzione aggiungendo diverse spatole di solfato di sodio e agitando il composto. Quindi aspirare. Filtrare il composto attraverso un micrometro di carta da filtro.

Impostare la temperatura del bagno d'acqua di un evaporatore rotante a 50 gradi Celsius con 24 gradi Celsius di acqua che circola attraverso il condensatore. Quindi trasferire il filtrato in un pallone di evaporazione da 50 millilitri e far evaporare gli esani per due ore a una velocità di rotazione moderata sotto vuoto. In fiale di vetro, raccogliere il gel di magnetite in sei aliquote da 40 milligrammi e il lavaggio sarà effettuato su ciascuna aliquota separatamente, aggiungere un'aliquota di gel insieme a 40 millilitri di PLGA in acetato di etile in un becher di plastica e sonicare la miscela per 10 minuti.

Successivamente, aggiungere 80 millilitri di onic F1 27 al becher ed emulsionare immediatamente con un mixer ad alta temperatura per sette minuti. Queste nanoparticelle sono ora nanoparticelle di ossido di ferro super paramagnetiche o spia, diluire la soluzione con un litro di acqua deionizzata e sonicare in una cappa aspirante per un'ora. Quindi posiziona un potente magnete accanto alla soluzione e mescola delicatamente la soluzione per raccogliere la spia sul magnete.

Decantare la soluzione acquosa trattenendo le marze S nel becher. Lavare le marze tre volte con acqua fornicatrice ogni volta. Dopo che tutte e sei le aliquote sono state rivestite e lavate.

Raccogli le marze S in un'unica fiala di vetro. Liofilizzare la soluzione spia durante la notte in un liofilizzatore per prepararsi alla marcatura cellulare. Per prima cosa sospendere il pyon in PBS a una concentrazione di 40 milligrammi per millilitro e sonicarli per 30 minuti.

Quindi, aggiungere la soluzione a un pallone di cellule quasi a confluenza a una concentrazione di cinque microlitri per millilitro di coltura cellulare. Medio. Scuotere il pallone per distribuire uniformemente la Sion. Incubare le cellule per 16 ore.

A 37 gradi Celsius. Aspirare delicatamente il terreno di coltura e quindi lavare le cellule due volte. Con PBS, le celle marcate magneticamente possono ora essere utilizzate per esperimenti.

Le nanoparticelle di magnetite con un diametro di 10 nanometri possono essere prodotte in modo coerente mescolando una soluzione acquosa di ferro tre cloruro e ferro due cloruro tetra idrato a 50 gradi Celsius e 1000 giri/min la microscopia elettronica a trasmissione o TEM è il metodo preferito per determinare la dimensione delle particelle che rivestono le nanoparticelle di magnetite con PLGA utilizzando un emulsionatore ad alta velocità che si traduce in modo riproducibile in PLGA, per visualizzare queste particelle viene utilizzata la magnetite S con un diametro di 120 nanometri, la microscopia elettronica a scansione o SEM. L'incubazione delle cellule endoteliali di crescita del sangue con pyon per 16 ore provoca l'endocitosi delle nanoparticelle utilizzando TEM. Le nanoparticelle di magnetite PLGA possono essere visualizzate nella cellula o sono conservate all'interno di endosomi citoplasmatici.

Il carico di ferro nelle cellule è sufficientemente elevato da ottenere la cattura magnetica di cellule vitali in dispositivi medici impiantabili ferromagnetici. Le cellule endoteliali marcate magneticamente sono attratte da uno stent ferromagnetico a una velocità maggiore rispetto a uno stent non magnetico. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di lavare accuratamente tutta la vetreria e le attrezzature per massimizzare la purezza e la sicurezza delle nanoparticelle Seguendo questa procedura.

Altri metodi, come il targeting cellulare magnetico, possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande, come ad esempio quali terapie mediche possono beneficiare di una somministrazione specifica e controllata di cellule. Questa tecnologia di puntamento magnetico consentirà lo sviluppo di una veicolazione cellulare focalizzata per una varietà di applicazioni biomediche. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come sintetizzare nanoparticelle di ossido di ferro super paramagnetiche e utilizzare tali particelle per etichettare le cellule per applicazioni di targeting magnetico.