Name: Etichettatura delle cellule e Targeting con superparamagnetico ossido di ferro nanoparticelle (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Scopri la sintesi di nanoparticelle superparamagnetiche di ossido di ferro per l'etichettatura cellulare e il targeting magnetico. Questo metodo consente il controllo preciso della localizzazione delle cellule in applicazioni biomediche.

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Gli autori desiderano riconoscere il finanziamento del Fondo Europeo di Sviluppo Regionale – FNUSA-CICR (n. CZ.1.05/ 1.1.00/ 02.0123), l'American Heart Association Scientist Development Grant (AHA #06-35185N) e il National Institutes of Health (NIH #T32HL007111).

1. Sintesi di magnetite Gel <ol><li> Lavare la vetreria con acido cloridrico concentrato seguita da acqua deionizzata seguita da alcool etilico. Lasciare asciugare O / N, preferibilmente in un forno di essiccazione. ATTENZIONE! acido cloridrico è dannoso - indossare dispositivi di protezione individuale e lavorare in una cappa aspirante; alcol etilico è dannoso - indossare dispositivi di protezione individuale. </li><li> Utilizzare una bottiglia di Drechsel di de-gas 500 ml di H 2 O deionizzata facendo gorgogliare delicatamente N 2 gas per 30 minuti. </li><li> Set-up l&#39;apparato di sintesi di magnetite all&#39;interno di una cappa. <ol><li> Posizionare un pallone ml a tre colli a fondo tondo da 500 all&#39;interno di un riscaldatore cuffia riscaldante e fissare il collo centro utilizzando una pinza e stand. </li><li> Installare un setto di gomma in uno dei colli laterali del pallone a fondo rotondo e condensatore a riflusso con un setto di gomma nel collo lato rimanente. Continuamente scorrere acqua fredda attraverso il refrigerante a ricadere. </li><li> Puntura °e setto di gomma del pallone a fondo tondo con un ago collegato ad una linea del gas N 2 e forare il setto di gomma del condensatore a riflusso con un ago collegato ad una linea di gas in esecuzione ad un gorgogliatore (cioè, matraccio con acqua) per visualizzare efflusso del gas. </li><li> Installare una pala lama nel centro collo del pallone a fondo tondo tramite un adattatore pagaia. Attaccare albero della pala lama a un agitatore montato su un supporto. </li></ol></li><li> Spurgare il pallone a fondo tondo con N 2 gas e lasciare N 2 gas che scorre ad una velocità bassa ma rilevabile. </li><li> Rimuovere il condensatore a riflusso del pallone a fondo tondo ed aggiungere 1.000 g di ferro (III) cloruro, 0,6125 g di ferro (II) cloruro tetraidrato, e 50 ml di degassati H 2 O. ATTENZIONE! di ferro (III) cloruro e ferro (II) cloruro tetraidrato sono nocivi - indossare dispositivi di protezione individuale. </li><li> Sostituire il condensatore a ricadere e mescolare a 1.000 giri, mentre il riscaldamento a 50° C. Mescolando in queste condizioni produce 10 nm nanoparticelle di magnetite diameter. </li><li> Una volta a 50 ° C, aggiungere 10 ml di soluzione di idrossido di ammonio 28% iniettando attraverso il tappo di gomma nel pallone a fondo tondo pur agitazione. ATTENZIONE! idrossido di ammonio è dannoso - indossare dispositivi di protezione individuale. NOTA: La soluzione di idrossido di ammonio è utilizzato per precipitare magnetite e la soluzione dovrebbe diventare nero. </li><li> Rimuovere il setto di gomma e N 2 linea gas dal pallone a fondo tondo e calore a 90 ° C per evaporare l&#39;ammoniaca gassosa mentre ancora agitazione. NOTA: È facoltativa per mantenere il flusso di N 2 nel pallone a fondo tondo perforando setto di gomma della condensatore a riflusso, tuttavia, l&#39;ossidazione di magnetite per maghemite è trascurabile durante questa fase. </li><li> Una volta a 90 ° C, aggiungere 1 ml di acido oleico nel pallone a fondo tondo pur agitazione. L&#39;acido oleico è utilizzato per rivestire la magnetite nananoparticelle di per formare gel magnetite. ATTENZIONE! acido oleico è dannoso - indossare dispositivi di protezione individuale. </li><li> Sostituire il setto di gomma e N 2 linea del gas sul pallone a fondo tondo e rimuovere il refrigerante a ricadere. </li><li> Spegnere il fuoco e mescolate a 500 rpm per 2 ore. </li><li> Rimuovere il pallone a fondo tondo dal riscaldatore cuffia riscaldante e decantare il liquido in eccesso mentre usando un magnete forte tenuto contro il fondo del pallone di trattenere il gel magnetite. ATTENZIONE! gestire il forte magnete con estrema cura per evitare danni o lesioni. </li><li> Lasciare che il gel di magnetite asciugare O / N (facoltativo). </li></ol> 2. Purificazione di magnetite Gel <ol><li> Aggiungere 40 ml di esano nel pallone a fondo tondo di sciogliere il gel magnetite ATTENZIONE! esano è dannoso - indossare dispositivi di protezione individuale e lavorare in una cappa aspirante. </li><li> Utilizzare un imbuto separatore con 40 ml di de-gasati H 2 O per rimuovere residui di H 2 O from la soluzione magnetite. <ol><li> Versare lentamente la soluzione di magnetite sul H 2 O nel imbuto separatore e miscelare delicatamente il liquido in due fasi per 5 minuti. </li><li> Scolare fuori e scartare la frazione acquoso inferiore. </li><li> Aggiungere lentamente 40 ml di degassati H 2 O a imbuto separatore tale che si deposita sotto la soluzione magnetite e miscelare delicatamente e scaricare come prima. </li><li> Ripetere per lavare per la terza volta. </li></ol></li><li> Trasferire la soluzione di magnetite di una beuta, aggiungere un paio di spatole per un valore di solfato di sodio anidro e agitare per rimuovere ogni residuo H 2 O residua dalla soluzione di magnetite. </li><li> Filtrare la soluzione attraverso carta da filtro magnetite 1 micron in un imbuto filtro per rimuovere il solfato di sodio e residua H 2 O. NOTA: è consigliabile farsi accompagnare vuoto. </li><li> Trasferire la soluzione magnetite ad un pallone di evaporazione 50 ml e utilizzare un evaporatore rotante per evaporare l&#39;esano per2 h con le seguenti condizioni: velocità di rotazione moderate, vuoto applicato, evaporando pallone in un bagno a 50 ° C di acqua, e 24 ° C l&#39;acqua che circola attraverso il condensatore. NOTA: In alternativa, conservare il gel di magnetite prima del rivestimento con PLGA. </li></ol> 3. Rivestimento di magnetite di nanoparticelle con PLGA Shell <ol><li> Sciogliere 3,60 g di PLGA (75/25 blend) in 240 ml di acetato di etile per creare un (m / v) di 1,5%. ATTENZIONE: acetato di etile è dannoso - indossare dispositivi di protezione individuale e lavorare in una cappa aspirante. </li><li> Sciogliere 25.00 g di Pluronic F-127 in 500 ml di degassati H 2 O con un agitatore magnetico per creare un (m / v) 5,0%. NOTA: Pluronic F-127 è un copolimero a blocchi anfifilo non ionico che agisce come un tensioattivo biocompatibile. Aiuta a stabilizzare l&#39;emulsione olio-in-acqua nel passo 3.3.2. </li><li> Utilizzando un microspatula, raccogliere il gel di magnetite in sei 0,040 g aliquote all&#39;interno fiale di vetro ponderati. Perform il seguente processo di rivestimento e lavaggio per ciascuna aliquota. NOTA: Le aliquote sono necessari per garantire una gestione efficiente e decantazione magnetico, che consentirà di massimizzare purezza e resa, riducendo al minimo la degradazione prima di liofilizzazione al punto 4. <ol><li> Aggiungere a 0,040 g di gel un&#39;aliquota magnetite e 40 ml della soluzione di PLGA in un beaker di plastica e sonicare in ultrasuoni per 10 minuti. </li><li> Aggiungere 80 ml della soluzione Pluronic nel becher di plastica ed emulsionare immediatamente con un miscelatore da laboratorio al valore massimo per 7 minuti per formare il rivestimento PLGA sulle nanoparticelle di magnetite come una emulsione olio-in-acqua. </li><li> Diluire immediatamente la soluzione Spion in 1 L di H 2 O deionizzata e ultrasuoni per 1 h in una cappa per evaporare l&#39;acetato di etile. </li><li> Posizionare un forte magnete accanto alla soluzione Spion e mescolare delicatamente per raccogliere SPIONs brunastre al magnete. NOTA: potrebbe essere necessario mescolare ad intermittenza per diverse ores prima che la soluzione diventa biancastra indicando che la maggior parte dei SPIONs sono stati raccolti. </li><li> Decantare la soluzione acquosa, pur mantenendo le SPIONs nel bicchiere con il magnete. </li><li> Lavare i SPIONs tre volte di seguito. <ol><li> Sospendere le SPIONs in 1 L di deionizzata H 2 O. </li><li> Sonicare la soluzione Spion per 20 minuti. </li><li> Posizionare un forte magnete accanto alla soluzione Spion e mescolare delicatamente per raccogliere SPIONs brunastre al magnete. Potrebbe essere necessario agitare intermittenza per diverse ore prima la soluzione diventa chiara indicando che la maggior parte dei SPIONs sono stati raccolti. </li><li> Decantare la soluzione acquosa, pur mantenendo le SPIONs nel bicchiere con il magnete. </li></ol></li></ol></li><li> Raccogliere le SPIONs sintetizzati da ciascuna delle sei aliquote gel magnetite in una singola fiala di vetro ponderata in sospensione acquosa. Opzionalmente decantare l&#39;acqua in eccesso magneticamente, se necessario. </li></ol> 4. Fermo-Essiccazione di SPIONs <ol><li> Congelare la soluzione spion. </li><li> Liofilizzare la soluzione Spion O / N in un liofilizzatore. </li><li> Pesare i SPIONs liofilizzati. SPIONs liofilizzati possono essere conservati a -20 ° C fino al momento per l&#39;etichettatura delle cellule. NOTA: Conservare a -20 ° C riduce drammaticamente cinetica di degradazione e aumenta la durata di conservazione. </li></ol> 5. Etichettatura di Celle con SPIONs <ol><li> Sospendere una aliquota di SPIONs in tampone fosfato salino (PBS) ad una concentrazione di 40 mg / ml e con ultrasuoni per 30 minuti. </li><li> Aggiungere la soluzione in un pallone Spion quasi confluenti di cellule ad una concentrazione di 5 microlitri / ml di mezzo di coltura cellulare. Garantire una distribuzione uniforme agitandola lentamente il pallone. </li><li> Incubare le cellule per 16 ore a 37 ° C. </li><li> Aspirare delicatamente terreno di coltura e lavare le cellule due volte con PBS. </li><li> Raccogliere le cellule magneticamente marcate e utilizzare per gli esperimenti. </li><li> Soluzione spion non utilizzata può essere conservato a 4 ° C e dovrebbe essere noicato nel giro di pochi mesi. Con ultrasuoni per 30 minuti prima di ogni utilizzo. </li></ol>

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<li>Landazuri, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+targeting+of+human+mesenchymal+stem+cells+with+internalized+superparamagnetic+iron+oxide+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Magnetic targeting of human mesenchymal stem cells with internalized superparamagnetic iron oxide nanoparticles.</a> Small. 9 (23), 4017-4026 (2013).</li>
<li>Sun, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+labeling+of+endothelial+progenitor+cells+isolated+from+peripheral+blood+with+superparamagnetic+iron+oxide+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Med+Rep%22%5BJournal%5D)">In vitro labeling of endothelial progenitor cells isolated from peripheral blood with superparamagnetic iron oxide nanoparticles.</a> Mol Med Rep. 6 (2), 282-286 (2012).</li>
<li>Zhang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+viability+of+transplanted+beta+cells+labeled+with+a+novel+contrast+agent+-+polyvinylpyrrolidone-coated+superparamagnetic+iron+oxide+nanoparticles+by+magnetic+resonance+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Contrast+Media+Mol+Imaging%22%5BJournal%5D)">Detection of viability of transplanted beta cells labeled with a novel contrast agent - polyvinylpyrrolidone-coated superparamagnetic iron oxide nanoparticles by magnetic resonance imaging.</a> Contrast Media Mol Imaging. 7 (1), 35-44 (2012).</li>
<li>Song, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labeling+efficacy+of+superparamagnetic+iron+oxide+nanoparticles+to+human+neural+stem+cells%3A+comparison+of+ferumoxides%2C+monocrystalline+iron+oxide%2C+cross-linked+iron+oxide+%28CLIO%29-NH2+and+tat-CLIO%5BTitle%5D)+AND+%22Korean+J+Radiol%22%5BJournal%5D)">Labeling efficacy of superparamagnetic iron oxide nanoparticles to human neural stem cells: comparison of ferumoxides, monocrystalline iron oxide, cross-linked iron oxide (CLIO)-NH2 and tat-CLIO.</a> Korean J Radiol. 8 (5), 365-371 (2007).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Come con qualsiasi protocollo di sintesi di nanoparticelle, la purezza dei reagenti chimici è fondamentale per ottenere SPIONs alta qualità che avranno effetti citotossici minimi. È quindi importante per l&#39;acquisto reagenti molto puri compreso l&#39;acido oleico (≥99%), ferro (II) tetraidrato Cloruro (≥99.99%), ferro (III) cloruro (≥99.99%), acetato di etile (grado HPLC, ≥99.9% ), esano (grado HPLC, ≥97.0%), idrossido di ammonio (≥99.99%) e solfato di sodio (≥99.0%). È di particolare importanza per l&#39;acquisto mo...

La consegna e la cattura mirate di cellule in siti specifici all'interno del corpo sono desiderabili per una varietà di applicazioni biomediche. La somministrazione di cellule staminali neurali al cervello mediante ultrasuoni focalizzati guidati dalla risonanza magnetica è stata proposta come possibile opzione di trattamento per le malattie neurodegenerative, le lesioni cerebrali traumatiche e l'ictus1. Le cellule staminali mesenchimali sono oggetto di studio per la loro capacità di somministrare farmaci antitumorali ai tumori grazie alle loro naturali proprietà tumorali-tropiche2,3. Le cellule staminali cardiache sono state somministrate al cuore come possibile trattamento per l'infarto del miocardio4,5. Gli stent vascolari sono stati sviluppati con anticorpi CD34 per catturare le cellule progenitrici circolanti6. Sebbene promettenti, questi approcci di targeting cellulare presentano inconvenienti, tra cui la mancanza di specificità cellulare, la ritenzione cellulare incoerente e la consegna di cellule fuori bersaglio.
L'obiettivo generale del metodo attuale è quello di consentire il targeting diretto magneticamente delle cellule per una varietà di applicazioni di consegna e smistamento delle cellule. Il puntamento magnetico consente la consegna controllata di cellule specifiche in un sito bersaglio specifico con effetti fuori bersaglio minimi7. I campi magnetici possono essere generati da dispositivi impiantati o esterni per dirigere in modo sicuro il movimento delle cellule marcate magneticamente all'interno del corpo8. Numerosi sforzi di ricerca si sono concentrati sul targeting diretto magneticamente delle cellule staminali su tessuti danneggiati come il cuore9-14, la retina15, il polmone16, la pelle17, il midollo spinale18,19, l'osso20, il fegato21 e il muscolo22,23 al fine di migliorare i risultati della rigenerazione.
Anche il targeting magnetico delle cellule è stato ampiamente studiato come mezzo per endotelizzare dispositivi cardiovascolari impiantabili. Un endotelio uniforme e completo fornisce una barriera tra il dispositivo e gli elementi del sangue circolanti per mitigare la trombosi e l'infiammazione. Le cellule endoteliali possono essere inviate al dispositivo prima dell'impianto o attraverso il sistema vascolare dopo l'impianto. In entrambi i casi, i campi magnetici vengono utilizzati per catturare le cellule sulla superficie del dispositivo e trattenere le cellule quando sottoposte allo stress di taglio generato dal sangue circolante. A tale scopo sono stati realizzati e testati gli stent vascolarimagnetici 24-27 e gli innesti vascolari28.
Il targeting delle celle magnetiche richiede una strategia per etichettare le cellule con particelle portatrici magnetiche. Queste particelle possono essere legate alla superficie delle cellule tramite anticorpi o coppie ligando/recettore oppure possono essere endocitose nelle cellule. Le nanoparticelle di ossido di ferro superparamagnetiche (SPION) sono biodegradabili, biocompatibili e facilmente endocitose da una varietà di tipi di cellule29. Queste particelle rendono efficacemente una cellula reattiva ai campi magnetici e si degradano naturalmente nel tempo. Gli SPION forniscono un mezzo semplice e sicuro per marcare magneticamente le cellule in coltura per una varietà di applicazioni di targeting e smistamento magnetico. Viene fornito un metodo per sintetizzare gli SPION con un nucleo in magnetite (Fe3O4) e un guscio in acido poli(lattico-co-glicolico) (PLGA). Inoltre, viene fornito un metodo per marcare le cellule in coltura con SPION.

<table><tbody><tr><td>Soluzione di idrossido di ammonio, 28% NH3 in H2O, &ge; 99,99% di tracce di metallo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>338818-100ML&nbsp;</td><td>Reagente nocivo: indossare dispositivi di protezione individuale</td></tr><tr><td>Flacone Dreschel, 500 ml</td><td>Ace Glass</td><td>5516-16</td><td></td></tr><tr><td>Acetato di etile, CHROMASOLVR Plus, per HPLC, 99,9%&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>650528-1L</td><td>Reagente nocivo - indossare dispositivi di protezione individuale e lavorare nella cappa aspirante</td></tr><tr><td>Alcool etilico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td>Reagente nocivo - indossare dispositivi di protezione individuale</td></tr><tr><td>Pallone di evaporazione, 50 ml, giunto 24/40</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z515558</td><td>Per l'uso con rotoevaporatore</td></tr><tr><td>Carta da filtro, diametro 3 cm, grado 1</td><td>Fisher</td><td>09-805P</td><td>Da utilizzare con l'imbuto filtrante in vetro</td></tr><tr><td>Becher in vetro, 1 L</td><td>Fisher</td><td>FB-101-1000</td><td>Per il lavaggio SPIONs</td></tr><tr><td>Imbuto filtrante in vetro, adattatore per tubo di aspirazione, adatto 24/40, 30 mL</td><td>Fisher</td><td>K954100-0344&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tappi per fiale di vetro</td><td>Fisher</td><td>03-391-46</td><td>Per l'uso con fiale di vetro Fiale</td></tr> di <tr><td>vetro, 2 ml</td><td>Fisher</td><td>03-391-44</td><td>Per la raccolta di gel di magnetite e SPIONs</td></tr><tr><td>Hesane, CHROMASOLVR, per HPLC, &ge; 97,0% (GC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34859-1L&nbsp;</td><td>Reagente nocivo: indossare dispositivi di protezione individuale e lavorare nella cappa aspirante</td></tr><tr><td>Acido cloridrico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1758</td><td>Reagente nocivo - indossare dispositivi di protezione individuale e lavorare in cappa aspirante</td></tr><tr><td>Cloruro di ferro (II) tetraidrato, &ge; 99,99% di metalli in tracce&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>380024-5G</td><td>Reagente nocivo - indossare dispositivi di protezione individuale</td></tr><tr><td>Cloruro di ferro (III) anidro, polvere, &ge; 99,99% di metalli in tracce</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>451649-1G</td><td>Reagente nocivo - indossare dispositivi di protezione individuale</td></tr><tr><td>Riscaldatore Isomantle, 500 mL</td><td>Voight Global</td><td>EM0500/CEX1</td><td></td></tr><tr><td>Miscelatore da laboratorio</td><td>Silverson</td><td>L5M-A</td><td></td></tr><tr><td>Liofilizzatore</td><td>Labconco</td><td>7670520</td><td></td></tr><tr><td>Microspatole</td><td>Fisher</td><td>21-401-25A</td><td>Per il trasferimento di magnetite magnete</td></tr><tr><td>NdFeB in gel, 1 in x 1 in x 1 in</td><td>magneti sorprendenti</td><td>C1000H-M</td><td>Magnete molto forte, maneggiare con cura</td></tr><tr><td>acido oleico, &ge; 99% (GC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O1008-5G&nbsp;</td><td>Conservare in congelatore; Reagente nocivo - indossare dispositivi di protezione individuale</td></tr><tr><td>Agitatore ad asta</td><td>IKA</td><td>2572201</td><td></td></tr><tr><td>Morsetto per agitatore ad asta</td><td>IKA</td><td>2664000</td><td>Per l'uso con agitatore ad asta</td></tr><tr><td>Agitatore ad asta H-stand</td><td>IKA</td><td>1412000</td><td>Per l'uso con agitatore ad asta</td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Becher in plastica, 250 ml</td><td>Fisher</td><td>02-591-28</td><td></td></tr><tr><td>PLGA PURASORB PDLG (miscela 75/25)</td><td>Purac</td><td>PDLG 7502</td><td>PDLG 7502A può essere utilizzato pure; Conservare in</td></tr><tr><td>congelatore Pluronic F-127 in polvere, BioReagent, adatto per colture cellulari</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2443-250G&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Paletta a pale espandibili in PTFE, diametro 8 mm</td> Adattatore per recipiente in PTFE <td>SciQuip</td><td>SP4018</td><td></td></tr><tr><td>, adatta a paletta 24/40, diametro 8 mm</td><td>Adattatore per</td><td>recipiente in PTFE Monmouth Scientific A480</td><td>Per l'uso con paletta a pale espandibili in PTFE</td></tr><tr><td>Refrigeratore a ricircolo</td><td>Clarkson</td><td>696613</td><td>Per l'uso con</td></tr> condensatore a riflusso rotoevaporatore<tr><td>, adatto a 24/40, 250 mm</td><td>Ace Glass</td><td>5997-133</td><td></td></tr><tr><td>Rotoevaporatore</td><td>Clarkson</td><td>216949</td><td></td></tr><tr><td>Setti in gomma, adatto a 24/40</td><td>Ace Glass</td><td>9096-56</td><td></td></tr><tr><td>Imbuto separatore con tappo, 250 ml</td><td>Fisher</td><td>10-438E</td><td></td></tr><tr><td>Solfato di sodio ACS reagente, &ge; 99,0%, anidro, granulare</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>239313-500G&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Pallone a fondo tondo a tre colli, angolato, snodi 24/40, 500 ml</td><td>Ace Glass</td><td>6948-16</td><td></td></tr><tr><td>Pulitore ad ultrasuoni piatto forato</td><td>Fisher</td><td>15-335-20A</td><td>Per l'uso con il pulitore ad ultrasuoni</td></tr><tr><td>Pulitore ad ultrasuoni, 2,8 L</td><td>Fisher</td><td>15-335-20</td><td></td></tr><tr><td>Regolatore del vuoto</td><td>Clarkson</td><td>216639</td><td>Per l'uso con il rotoevaporatore (opzionale)</td></tr><tr><td>Vuoto pompa</td><td>Clarkson</td><td>219959</td><td>Per l'uso con rotoevaporatore</td></tr></tbody></table>

etichettatura delle cellule e targeting con superparamagnetico ossido di ferro nanoparticelle

Cell Labeling and Targeting with Superparamagnetic Iron Oxide Nanoparticles

Somministrazione mirata di cellule e agenti terapeutici a favore di un&#39;ampia gamma di applicazioni biomediche concentrando l&#39;effetto terapeutico al sito bersaglio, riducendo al minimo gli effetti deleteri a siti fuori bersaglio. Il targeting cellule magnetica è una tecnica di consegna efficiente, sicuro, e diretto. Nanoparticelle di ossido di ferro (superparamagnetic spion) sono biodegradabili, biocompatibili, e possono essere endocitosi in cellule di renderli sensibili ai campi magnetici. Il processo di sintesi prevede la creazione di magnetite (Fe 3 O 4) nanoparticelle seguita da emulsificazione ad alta velocità per formare una poli (lattico-co-glicolico) (PLGA) rivestimento. Le SPIONs PLGA-magnetite sono circa 120 nm di diametro compreso nucleo diametro magnetite circa 10 nm. Quando posto in terreno di coltura, SPIONs sono naturalmente endocitosi dalle cellule e memorizzati come piccoli cluster all&#39;interno di endosomi citoplasmatici. Queste particelle impartiscono massa magnetica sufficiente per le celluleper consentire il targeting entro campi magnetici. Numerosi separazione delle cellule e applicazioni destinate sono attivati ​​per rendere vari tipi di cellule sensibili ai campi magnetici. SPIONs hanno una varietà di altre applicazioni biomediche e compreso l&#39;uso come agente di contrasto imaging medico, farmaco o gene somministrazione mirata, saggi diagnostici, e la generazione di ipertermia locale per la terapia tumorale o saldatura del tessuto.

Nanoparticelle di magnetite sono circa 10 nm di diametro a seguito di agitazione una soluzione acquosa di ferro (III) cloruro e ferro (II) cloruro tetraidrato a 50 ° C e 1.000 rpm (Figura 1). Questi risultati dimostrano riuscita sintesi di nanoparticelle di magnetite. È importante verificare la dimensione e la forma delle nanoparticelle di magnetite prelevati da un piccolo campione di batch quando si tenta la sintesi per la prima volta. Microscopia elettronica a trasmissione (TEM) è il metodo preferito ...

La somministrazione mirata di cellule è utile in una varietà di applicazioni biomediche. L'obiettivo di questo protocollo è quello di utilizzare nanoparticelle di ossido di ferro superparamagnetiche (SPION) per marcare le cellule e quindi consentire approcci di targeting cellulare magnetico per un alto grado di controllo sulla consegna e la localizzazione delle cellule.

Etichettatura delle cellule e Targeting con superparamagnetico ossido di ferro nanoparticelle

Targeted delivery of cells and therapeutic agents would benefit a wide range of biomedical applications by concentrating the therapeutic effect at the ...

L'obiettivo generale di questa procedura è sintetizzare nanoparticelle di ossido di ferro superparamagnetiche e utilizzare tali particelle per etichettare cellule a fini di indirizzamento e separazione magnetica. Questo viene ottenuto innanzitutto sintetizzando nanoparticelle di magnetite con un diametro di 10 nanometri. Il secondo passaggio consiste nel rivestire le nanoparticelle di magnetite con uno strato spesso 50 nanometri di acido polilattico-co-glicolico o PLGA.Successivamente, le nanoparticelle magnetiche vengono lavate e liofilizzate. L'ultimo passaggio consiste nell'etichettare le cellule con nanoparticelle magnetiche per applicazioni di targeting e di separazione cellulare. Infine, la microscopia fluorescente viene utilizzata per dimostrare il targeting delle cellule marcate con nanoparticelle magnetiche all'interno di campi magnetici.Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come il targeting cellulare mediato da anticorpi, è che il targeting cellulare magnetico è altamente specifico e controllabile. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia di diverse condizioni mediche, poiché le cellule terapeutiche possono essere consegnate al sito bersaglio risparmiando i siti fuori bersaglio. In generale, le persone nuove rispetto a questo metodo incontreranno difficoltà perché è necessaria un'attenzione particolare ai dettagli per ottenere nanoparticelle pure e di alta qualità.Volevamo migliorare il targeting e la localizzazione delle cellule vive all'interno del corpo. Iniziare utilizzando una bottiglia di Dressel per disgasare 500 millilitri di acqua deionizzata, facendo gorgogliare delicatamente gas azoto per 30 minuti. Per allestire l'apparato di reazione, posizionare un pallone a fondo rotondo da 500 millilitri con tre collo in un riscaldatore a mantello ISO.Successivamente, coprire un foro laterale del pallone con un settimo di gomma e installare un refrigerante a riflusso nell'altro. Far scorrere continuamente acqua fredda attraverso il refrigerante per creare un'atmosfera inerte per la reazione. Per prima cosa, perforare il settimo di gomma del pallone con un ago collegato a una linea di azoto gassoso.Poi perforare il settimo del condensatore con un ago collegato a un boccaglio per visualizzare il flusso di gas in uscita. Successivamente, inserire un pedale a lama nel collo centrale utilizzando un adattatore a pala. Per mantenere un'agitazione costante della miscela di reazione, collegare l'albero della lama a un agitatore meccanico montato su un treppiede.Svuotare il pallone con gas azoto e lasciare fluire l'azoto nel pallone a un regime basso ma rilevabile. Rimuovere quindi il refrigerante a riflusso e aggiungere un grammo di cloruro ferrico, 612,5 milligrammi di cloruro ferroso tetraidrato e 50 millilitri di acqua disgassata. Riposizionare il refrigerante e agitare la reazione a 1000 giri al minuto, riscaldando a 50 gradi Celsius.Questo produrrà particelle di magnetite con un diametro di 10 nanometri. Una volta che la reazione avrà raggiunto i 50 gradi Celsius, utilizzare una siringa per iniettare 10 millilitri di idrossido di ammonio al 28% attraverso il settum del pallone. Mentre la magnetite precipita, la soluzione dovrebbe diventare nera.Rimuovere il settimo di gomma e la linea del gas, quindi riscaldare la reazione a 90 gradi Celsius. Successivamente, aggiungere un millilitro di acido oleico al pallone per rivestire le nanoparticelle e formare il gel di magnetite. Poi, sostituire il settimo e la linea del gas sul pallone ed eliminare il condensatore.Spegnere il riscaldamento e agitare la reazione a 500 giri/min per due ore. Dopo l'agitazione, decantare il liquido in eccesso tenendo le nanoparticelle sul fondo del pallone con un magnete potente. Per iniziare la purificazione, sciogliere innanzitutto il gel di magnetite in 40 millilitri di esani.Versare lentamente questa soluzione in un imbuto separatore contenente 40 millilitri di acqua disgassata e agitare dolcemente l'imbuto per cinque minuti. Dopo l'agitazione, decantare la frazione acquosa inferiore e lavare la soluzione di magnetite altre due volte con acqua disgassata in modo analogo. Successivamente, trasferire la soluzione di magnetite in un matraccio conico.Asciugare la soluzione aggiungendo diversi spatolati di solfato di sodio e agitando delicatamente la miscela. Successivamente, effettuare la filtrazione sotto vuoto. Filtrare la miscela attraverso una carta filtrante da un micrometro.Impostare la temperatura del bagno d'acqua di un evaporatore rotante a 50 gradi Celsius con acqua a 24 gradi Celsius che circola attraverso il condensatore. Trasferire quindi il filtrato in un pallone evaporatore da 50 millilitri ed evaporare gli esa ni per due ore a velocità di rotazione moderata sotto vuoto. In vial di vetro, raccogliere il gel di magnetite in sei aliquote da 40 milligrammi; il rivestimento e il lavaggio verranno eseguiti separatamente su ciascuna aliquota; aggiungere un’aliquota di gel insieme a 40 millilitri di PLGA in acetato di etile in un becher di plastica e sottoporre la miscela a sonificazione per 10 minuti.Successivamente, aggiungere 80 millilitri di onic F1 27 nel becher ed emulsionare immediatamente con un miscelatore ad alta velocità per sette minuti. Queste nanoparticelle sono ora nanoparticelle superparamagnetiche di ossido di ferro o spy; diluire la soluzione con un litro di acqua deionizzata e sottoporre a sonificazione in una cappa per un'ora. Quindi posizionare un magnete potente accanto alla soluzione e mescolare delicatamente per raccogliere le spy sul magnete.Decantare la soluzione acquosa mantenendo i polloni di S nel becher. Lavare i polloni di S tre volte con acqua, effettuando ogni volta una fornicazione. Dopo che tutti e sei gli aliquote sono stati rivestiti e lavati.Raccogliere i polloni di S in un singolo vial di vetro. Liofilizzare la soluzione di spy durante la notte in un liofilizzatore per prepararla all'etichettatura cellulare. Sospendere innanzitutto il pyon in PBS a una concentrazione di 40 milligrammi per millilitro e sottoporlo a sonificazione per 30 minuti.Successivamente, aggiungere la soluzione a un flacone di cellule quasi confluenti a una concentrazione di cinque microlitri per millilitro di mezzo di coltura. Agitare dolcemente il flacone per distribuire uniformemente la soluzione. Incubare le cellule per 16 ore.A 37 gradi Celsius. Aspirare delicatamente il mezzo di coltura e quindi lavare le cellule due volte. Con PBS, le cellule marcate magneticamente possono ora essere utilizzate per esperimenti.Nanoparticelle di magnetite con un diametro di 10 nanometri possono essere prodotte in modo riproducibile agitando una soluzione acquosa di cloruro ferrico e cloruro ferroso tetraidrato a 50 gradi Celsius e 1000 giri al minuto. La microscopia elettronica a trasmissione, o TEM, è il metodo preferito per determinare la dimensione delle particelle. Rivestire le nanoparticelle di magnetite con PLGA utilizzando un emulsionatore ad alta velocità porta in modo riproducibile a scagioni di PLGA e magnetite con un diametro di 120 nanometri. La microscopia elettronica a scansione, o SEM, viene utilizzata per visualizzare queste particelle. L'incubazione di cellule endoteliali progenitrici del sangue con pyon per 16 ore determina l'endocitosi delle nanoparticelle, come osservato mediante TEM. Le nanoparticelle di PLGA e magnetite possono essere visualizzate all'interno della cellula, dove vengono immagazzinate all'interno di endosomi citoplasmatici.Il caricamento di ferro all'interno delle cellule è sufficientemente elevato da consentire il catturamento magnetico di cellule vitali su dispositivi medici impiantabili ferromagnetici. Le cellule endoteliali marcate magneticamente vengono attratte da uno stent ferromagnetico a un ritmo maggiore rispetto a uno stent non magnetico. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di lavare accuratamente tutta la vetreria e l'attrezzatura per massimizzare la purezza e la sicurezza delle nanoparticelle dopo questa procedura.Altri metodi, come il targeting magnetico cellulare, possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande, ad esempio quali terapie mediche possono trarre vantaggio da un rilascio specifico e controllato di cellule. Questa tecnologia di targeting magnetico permetterà lo sviluppo di un rilascio cellulare mirato per diverse applicazioni biomediche. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come sintetizzare nanoparticelle di ossido di ferro superparamagnetiche e utilizzare tali particelle per etichettare cellule in applicazioni di targeting magnetico.

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