Name: Analisi miRNA nel tumore alla prostata tessuti cliniche (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 29 s
Description: Scopri un flusso di lavoro semplificato per l'analisi dei miRNA nei tessuti clinici di cancro alla prostata archiviati. Questo metodo utilizza PCR quantitativa in tempo reale e ibridazione in situ per identificare biomarcatori promettenti.

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Ringraziamo il Dr. Roger Erickson per il suo sostegno e assistenza alla preparazione del manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto dal National Cancer Institute presso il National Institutes of Health (Grant Numero RO1CA177984, RO1CA138642), progetto del programma VA sul cancro alla prostata (BX001604).

Campioni freschi cancro alla prostata congelato fissati in formalina, inclusi in paraffina (FFPE) o sono stati ottenuti dalla SFVAMC. Campioni di pazienti con cancro alla prostata sottoposti a prostatectomia radicale a SFVAMC. Consenso informato scritto è stato ottenuto da tutti i pazienti e lo studio è stato approvato dal Comitato UCSF per la ricerca umana. In alternativa, tessuti di cancro alla prostata microarray sono stati acquistati da fonti commerciali e utilizzati per le analisi da miRNA ISH. Informazioni clinicopatologica e follow-up per i pazienti affetti da cancro alla prostata analizzati sono stati raccolti. 1. I campioni di tessuto <ol><li> Tagliare campioni di tessuto del cancro della prostata in 10 sezioni micron utilizzando un microtomo e macchia con H &amp; E seguendo il protocollo del produttore. </li><li> Commenta vetrini colorati per l&#39;identificazione del cancro alla prostata foci così come adiacente normale epitelio ghiandolare. Nota: Una scheda certificata patologo dovrebbe rivedere le diapositive H &amp; E macchiato e mark per tumore e aree normali. Utilizzare le diapositive contrassegnate come guide in successive sezioni per miRNA analisi da tumore vs aree normali. </li></ol> 2. Le analisi di espressione di miRNA Quantitative Real-time PCR Nota: Questo flusso di lavoro prevede le seguenti fasi: cattura microdissezione laser, isolamento di RNA totale (compresi i miRNA e mRNA), il saggio dei miRNA maturi utilizzando i saggi di espressione TaqMan MicroRNA come dettagliato nelle sezioni seguenti. <ol><li> RNA Estrazione <ol><li> Isolamento di miRNA da cancro della prostata FFPE tessuti <ol><li> Microdissezione laser (LCM) Nota: Eseguire i passi 2.1.1.1.1- 2.1.1.1.4 in una cappa. <ol><li> Preparare vetrini di tessuto (10 sezioni micron) per LCM. Deparrafinize sezioni di tessuto di immersione in xilene (2x), per 10 minuti ciascuno, quindi reidratare i tessuti incubando i vetrini per 5 minuti ciascuna in etanolo graduata (100%, 95%, 90%, 80%, 70%) seguita da distillata acqua(5 minuti). </li><li> A seguito di reidratazione, sezioni macchia con ematossilina per 30 secondi seguiti da acqua. </li><li> Inserire tessuti in etanolo graduata (70%, 95% 90%, 80%, 70%) (5 min ciascuna) e xilene (5 min). </li><li> Scivoli asciutti in una cappa aspirante e quindi inserire nello strumento LCM per microdissezione. </li><li> Eseguire microdissections con il sistema LCM conformemente alle istruzioni del produttore 24. Usa patologo marcato diapositive come guide per l&#39;identificazione di cancro alla prostata foci così come il tessuto normale adiacente. Utilizzare il raggio laser ad una 10-20 impulsi diametro micron con una potenza di 70-90 mW. </li><li> Cattura aree di interesse con impulsi laser infrarossi sui tappi LCM. Combina le celle da 2-5 tappi per l&#39;estrazione di miRNA per campione. Per garantire l&#39;integrità di RNA estratto, immediatamente elaborare cellule catturate per l&#39;estrazione miRNA. </li><li> In alternativa, le cellule Lisare nel buffer di estrazione miRNA (secondo il protocollo del produttore) e store lisati a -80 ° C. </li></ol></li><li> miRNA Estrazione e analisi da LCM microdissezione tessuti <ol><li> Estratto RNA totale da tessuti FFPE microdissezione utilizzando un kit commerciale seguendo le istruzioni del produttore. Nota: La resa di RNA da cattura laser miscrodissection è tipicamente basso. Pertanto, l&#39;RNA viene eluito in volumi bassi (20-30 mL) e utilizzato per la profilazione espressione utilizzando Taqman microRNA saggi di espressione seguito le istruzioni del produttore (anche descritto nella sezione 2.2). Ottimizzazione di ingresso dell&#39;RNA per PCR real time il rilevamento dei miRNA maturi suggerisce che 5 ml di RNA eluizione è ottimale per ogni reazione di trascrizione inversa specifici miRNA-. Come un controllo endogeno, è usato RNU48 / RNU24. Per le reazioni di controllo, 2 microlitri del RNA eluito viene utilizzato per la reazione di trascrizione inversa. </li></ol></li></ol></li><li> Isolamento di miRNA da cancro della prostata congelati tessuti <ol><li> Omogenize congelati tessuti della prostata resezione dalla macinazione dei tessuti in azoto liquido con un mortaio e pestello. Trasferire il tessuto omogeneizzato in una provetta con una spatola raffreddato. Mantenere la malta / pestello e spatola alla stessa temperatura per immersione in azoto liquido tessuto omogeneizzato così può essere facilmente trasferiti. </li><li> Aggiungere guanidina isotiocianato-fenolo commerciale reagente (1 ml / 0,1 g di tessuto) al tessuto omogeneizzato ed incubare a temperatura ambiente per 5 min. Nota: i tessuti omogeneizzate della guanidina commerciale isotiocianato-fenolo reagente possono essere conservati a -80 ° C per diversi mesi. </li><li> Aggiungere cloroformio per l&#39;omogeneizzato (0,2 ml di cloroformio / ml) e si agita energicamente per 30 sec. Incubare i campioni a temperatura ambiente per 3-5 min seguita da centrifugazione a 10.000 xg per 20 min a 4 ° C. </li><li> Trasferire la fase acquosa superiore ad una provetta sterile da 1,5 ml fresco RNasi-free. </li><li> Aggiungere un volume uguale di alcool isopropilico. Mescolare e incubare per 10 min a RT seguita da centrifugazione a 12.000 xg per 20 min a 4 ° C per sedimentare il RNA. </li><li> Aspirare il surnatante e lavare il pellet di RNA con 1 ml di etanolo al 70%. Centrifugare a 12,000 xg per 10 minuti a 4 ° C. </li><li> Con attenzione aspirare il surnatante. Pellet di RNA a secco a temperatura ambiente per 5-10 minuti. Sciogliere RNA in 50-100 acqua priva di nucleasi microlitri. </li><li> Eseguire la quantificazione di RNA utilizzando uno spettrofotometro NanoDrop e determinare l&#39;integrità dell&#39;RNA con un bioanalizzatore. Regolare le concentrazioni di RNA a 10 ng / ml. Utilizzare 10-50 ng RNA per miRNA- reazione cDNA specifico seguito da PCR in tempo reale le analisi (paragrafo 2.2). </li></ol></li></ol></li><li> PCR quantitativa in tempo reale per miRNA analisi di espressione Nota: miRNA maturi Assay utilizzando un protocollo RT-PCR in due fasi come descritto sotto. <ol><li> Reverse trascrizione (RT) <ol><li> Reverse trascrivere cDNA da RNA utilizzando un kit di trascrizione inversa miRNA in conformità con le istruzioni del produttore.Utilizzare 10-50 ng di RNA totale con miRNA primer specifico dal kit MicroRNA Assays e RT. Utilizzare RNU48 / RNU24 / RNU6B come controlli. Diluire cDNA 1: 5 a 1:10 (seconda dall&#39;abbondanza del miRNA analizzati) e utilizzare in tempo reale di rilevamento PCR come descritto nel passaggio seguente. </li></ol></li><li> Real-time PCR per il rilevamento di miRNA maturo <ol><li> Amplifica prodotti di PCR di campioni di cDNA utilizzando i saggi MicroRNA con una master mix universale veloce secondo le istruzioni del produttore. Normalizzare campioni a RNU48 / RNU24 / controllo RNU6B. Utilizzare il metodo comparativo Ct (ciclo soglia) per calcolare le relative variazioni nell&#39;espressione genica su Fast Real Time PCR sistema. Analizzare ogni campione in triplicato. </li></ol></li></ol></li></ol> Analisi 3. miRNA Espressione di ibridazione in situ (ISH) <ol><li> Pre-trattamento dei tessuti <ol><li> Tagliare 5 sezioni micron da blocchi di tessuto di cancro alla prostata FFPE utilizzando un microtomo. </li><li&gt; Fix sezioni di tessuto incubando i campioni a 56 ° C per 1 ora. Nota: Le diapositive possono essere conservati a temperatura ambiente per diverse settimane per miRNA analisi. </li><li> Deparrafinize tessuti immergendo i vetrini con xilene (2x), per 15 minuti ciascuno. </li><li> Reidratare i tessuti incubando i vetrini per 5 minuti ciascuna in etanolo graduata (100% (2x), 95%, 90%, 80%, 70%) seguito da acqua distillata (5 min). </li><li> Fissare i vetrini con 4% paraformaldeide in PBS a temperatura ambiente per 20 min. </li><li> Lavare i vetrini con PBS (2x) a temperatura ambiente per 5 minuti ciascuna. </li><li> Trattare i vetrini con 10 ug / ml proteinasi K a 37 ° C per 10 min in proteinasi pre-riscaldato tampone K (5 mM Tris-HCL pH 7,4, 1 mM EDTA, 1 mM NaCl). </li><li> Dopo il trattamento proteinasi-K, sciacquare i vetrini con lo 0,2% glicina in PBS per 30 sec. </li><li> Lavare i vetrini in PBS (1x) a temperatura ambiente per 5 min. </li><li> Fissare i vetrini con 4% paraformaldeide in PBS per 15 min. </li><li> Sciacquare i vetrini conPBS per 5 min. </li></ol></li><li> Ibridazione <ol><li> Pre-ibridare i vetrini con soluzione pre-ibridazione per 3-4 ore a 55 ° C in una camera umidificata. Utilizzare tessuto salviettine imbevute di laboratorio nel 50% formammide / 50% 5x SSC per mantenere la camera umidificata. </li><li> Utilizzare 5 &#39;sonde marcate con digossigenina ad una concentrazione di 20-50 nM in tampone di ibridazione. Diluire sonda specifica per miRNA (20-50 nM) e una piccola sonda di controllo U6 RNA nucleare (20 nM), calore a 90 ° C per 4 minuti, posizionarlo su ghiaccio, e aggiungere al ghiaccio tampone di ibridazione freddo (2-4 ng / ml ). </li><li> Rimuovere la soluzione pre-ibridazione, aggiungere soluzione di ibridazione (sonda + tampone di ibridazione, 100 ml per vetrino), incubare per 12-16 ore a temperatura di ibridazione specifica sonda (temperatura di ibridazione = sonda-Tm 21 ° C). Eseguire ibridazioni in una camera umidificata (50% formammide / 50% 5x SSC). </li></ol></li><li> Lavaggio Steps <ol><li> Lavare i vetrini con 2x SSC per 10 minuti a 45 ° C. </li><li> Lavare tscivola con 1,5x SSC per 10 minuti a 45 ° C. </li><li> Lavare i vetrini con 0.2x SSC (2x) a 37 ° C per 20 minuti ciascuno. </li><li> Incubare i vetrini con la soluzione 1x di blocco per 1-2 ore a temperatura ambiente </li></ol></li><li> Rilevamento <ol><li> Incubare i vetrini con 1: 100 PBS diluito anticorpo anti-digossigenina AP-coniugato per 1-4 ore o una notte a 4 ° C. </li><li> Lavare i vetrini con PBS (3x) a temperatura ambiente per 10 minuti ciascuno. </li><li> Lavare le diapositive (2x) con fosfatasi alcalina tampone (100 mM Tris pH 9,5, 50 mM MgCl 2, 100 mM NaCl, 0.1% Tween-20) a temperatura ambiente per 5 minuti ciascuna. </li><li> Incubare i vetrini in substrato BM Viola AP al buio a temperatura ambiente per 1-20 ore. </li><li> Risciacquare i vetrini con PBS contenente 0,1% di Tween-20 e lavaggio (2x) in acqua. </li><li> Montare le diapositive utilizzando un mezzo di montaggio acquoso ed esaminare al microscopio. </li></ol></li></ol>

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Gli autori non hanno divulgazioni finanziarie.

In questo articolo, si descrive un flusso di lavoro semplificato per miRNA profilatura in FFPE archiviati o cancro alla prostata congelato tessuti clinici freschi. Nel cancro della prostata, diversi studi suggeriscono un ruolo importante dei microRNA nel cancro alla prostata iniziazione, la progressione e la metastasi. Tuttavia, risultati contrastanti sono spesso ottenuti su uno specifico miRNA 22 in quanto l&#39;estrazione miRNA e analisi metodi differiscono ampiamente. In considerazione degli elementi di pr...

Il cancro della prostata è un tumore maligno maschio comunemente diagnosticato che è una delle principali cause di mortalità per cancro correlati tra gli uomini. Negli Stati Uniti, si stima che 220,800 nuovi casi e 27.540 decessi saranno presentate nel 2015 1. Il cancro della prostata è una malattia eterogenea con malattia molto variabile corso- tumori possono essere indolenti o molto aggressivo. Una sfida importante nel cancro della prostata gestione clinica è rappresentata dal inadeguatezza dei metodi attualmente in uso / biomarcatori per lo screening della malattia, la diagnosi, la prognosi e il trattamento 2. Metodi di screening attuali includono l&#39;antigene prostatico specifico (PSA) e un esame rettale digitale (DRE) seguito da biopsie prostatiche 3. Antigene prostatico specifico (PSA) è il biomarcatore cancro alla prostata più diffuso che ha rivoluzionato in modo significativo la gestione clinica e miglioramento dei tassi di sopravvivenza 4. Tuttavia, a causa dei limiti intrinseci di PSA compreso lack di specificità, screening di PSA-ha causato oltre diagnosi e sopra il trattamento della malattia. In considerazione di ciò, intensi sforzi sono orientati verso la ricerca di alternative biomarcatori del cancro alla prostata, in particolare quelli che possono prevedere l&#39;aggressività della malattia e guidare le decisioni terapeutiche migliori 4,5. Nel corso degli ultimi anni, microRNA (miRNA) sono emersi come promettenti alternative biomarcatori del cancro alla prostata. I microRNA (miRNA) costituiscono una classe evolutivamente conservata di piccoli RNA non codificanti che sopprimono l&#39;espressione genica livello post-trascrizionale tramite interazioni sequenza-specifiche con le regioni 3&#39;non tradotte (UTR) del target mRNA affini. Si stima che il&gt; 60% di mRNA sono conservate bersagli di miRNA 6. geni miRNA sono localizzati nelle regioni intergeniche o all&#39;interno introni o esoni di proteine ​​/ non-codificanti proteine ​​geni 7. Questi geni sono preferenzialmente trascritti dalla RNA polimerasi II in primamiRNA ry (pri-miRNA, lunga diversi kilobasi) che ad anello a forma di gambo strutture secondarie forma a gomito. Questi pri-miRNA vengono trasformati in miRNA precursori (pre-miRNA, lungo 60-75 nucleotidi) che vengono esportati al citoplasma e successivamente trattati in miRNA maturi (lunghi 18-25 nucleotidi) 8-10. miRNA regolano processi cellulari chiave, tra cui la proliferazione, lo sviluppo, la differenziazione e l&#39;apoptosi 11. Gli studi suggeriscono una disregolazione diffuso di profili di espressione dei miRNA in diversi tumori umani tra cui il cancro alla prostata 12-15. Sono stati riportati i profili di espressione di miRNA ad essere ampiamente disregolazione nel cancro della prostata primari e metastatici. MiRNA Altered sono stati collegati con la progressione del cancro alla prostata, l&#39;aggressività e la ricorrenza mettendo in evidenza il potenziale prognostico di miRNA 12,14,16-19. Un crescente corpo di evidenze indicano che i miRNA svolgono ruoli importanti meccanicistici nell&#39;iniziazione cancro alla prostata, lo sviluppo, il progressoioni e metastasi. Nel complesso, miRNA stanno emergendo come biomarcatori alternativi promettenti per la diagnosi del cancro alla prostata e la prognosi in grado di distinguere tra tessuti e gli aiuti normali e tumorali nella stratificazione di tumori della prostata 12. Inoltre, miRNA sono obiettivi importanti per lo sviluppo di terapie efficaci contro il cancro alla prostata 20. A causa delle loro piccole dimensioni e la resistenza all&#39;attività RNasi endogena, miRNA sono biomarcatori stabili che possono essere facilmente rilevati nei tessuti fissati in formalina 21 e 22 biopsie prostatiche. Inoltre, i profili di espressione di miRNA sono stati confrontati in tessuti congelati e fissati in formalina e sono stati trovati per essere fortemente correlato 21. Tuttavia, miRNA profiling in cancro alla prostata tessuti clinici è spesso difficile a causa della eterogeneità del tumore, gli errori di campionamento, contaminazione stromale ecc Lo sviluppo dei miRNA come biomarcatori efficaci per il cancro alla prostata pesantemente relies sul loro rilevamento accurato nei tessuti clinici. Qui si descrive un flusso di lavoro semplificato utilizzato nel nostro laboratorio per miRNA profilatura in FFPE archiviati o cancro alla prostata congelato campioni clinici freschi. Ci avvaliamo di una combinazione di quantitativa real-time PCR e ibridizzazione in situ per miRNA le analisi di campioni clinici, con l&#39;ex producendo maggiori informazioni quantitative e la seconda per visualizzare l&#39;espressione differenziale delle potenziali biomarcatori miRNA in una vasta gamma di tessuti. All&#39;interno di questo flusso di lavoro, ottimizziamo le metodologie esistenti per l&#39;estrazione miRNA da FFPE e tessuti della prostata congelati, espressione analizza da Taqman-sonda basato miRNA RT-PCR e miRNA in situ tecnica di ibridazione con acido nucleico bloccato (LNA) -based sonde 23. Sonde basato LNA-offrono una maggiore sensibilità e specificità rispetto al DNA o RNA sonde based e consente il rilevamento affidabile di tutte le sequenze di miRNA, indipendentemente dal loro contenuto GC e permettono anche discriminazione delle famiglie miRNA. Il nostro protocollo miRNA ISH ottimizzato può essere applicato alle diapositive di cancro alla prostata di tessuto o microarray di tessuti di cancro alla prostata (TMA), con quest&#39;ultimo che offre il potenziale di accelerare miRNA biomarcatore scoperta.

<table><tbody><tr><td>Microtomo</td><td>Leica Biosystems&nbsp;</td><td>RM2255</td><td></td></tr><tr><td>Arcturus Autopix per LCM</td><td>Arcturus/ Life Technologies</td><td>LCM1621/LCM1110</td><td>In alternativa, è possibile utilizzare il sistema Arcutus Xt di Life Technolgies.</td></tr><tr><td>CapSure Macro LCM Caps</td><td>Life Technologies</td><td>LCM0211</td><td></td></tr><tr><td>kit miRNeasy FFPE&nbsp;</td><td>Sistema di</td> PCR in tempo reale veloce <td>Qiagen 217504</td><td></td></tr><tr><td>7500&nbsp;</td><td>Applied Biosystems/ Life Technologies</td><td>4351106</td><td></td></tr><tr><td>Kit di trascrizione inversa Taqman MicroRNA&nbsp;</td><td>Biosistemi applicati/ Tecnologie per la vita</td><td>4366596</td><td></td></tr><tr><td>Taqman Fast Universal PCR master mix&nbsp;</td><td>Applied Biosystems/ Life Technologies</td><td>4352042</td><td></td></tr><tr><td>Sonda LNA marcata DIG per U6</td><td>Exiqon</td><td>99002-01</td><td></td></tr><tr><td>BM Purple AP substrato</td><td>Roche</td><td>11442074001</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di pre-ibridazione&nbsp;</td><td>Biochain</td><td><a href="http://www.biochain.com/coa/K21910XXCA.pdf">K2191050-1</a></td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di ibridazione&nbsp;</td><td>Biochain</td><td><a href="http://www.biochain.com/coa/K21910XXCA.pdf">K2191050-2</a></td><td></td></tr><tr><td>Soluzione bloccante&nbsp;</td><td>Biochain</td><td><a href="http://www.biochain.com/coa/K21910XXCA.pdf">K2191050-8</a></td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-digossigenina coniugato AP</td><td>Biochain</td><td><a href="http://www.biochain.com/coa/K21910XXCA.pdf">K2191050-7</a></td><td></td></tr><tr><td>Mezzi di montaggio acquosi&nbsp;</td><td>Laboratori Vettoriali&nbsp;</td><td>H-5501&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Trizol (reagente isotiocianato di guanidina-fenolo)&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td><a href="https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15596018">15596-018</a></td><td></td></tr><tr><td>Harris ematossilina</td><td>Statlab</td><td>SL200</td><td></td></tr><tr><td>Eosin&nbsp;</td><td>Statlab</td><td>SL201&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

analisi mirna nel tumore alla prostata tessuti cliniche

miRNA Expression Analyses in Prostate Cancer Clinical Tissues

Una sfida importante nel cancro della prostata (PCa) gestione clinica è rappresentata dal inadeguatezza di biomarcatori attualmente utilizzati per lo screening delle malattie, la diagnosi, la prognosi e il trattamento. Negli ultimi anni, microRNA (miRNA) sono emersi come biomarcatori alternativi promettenti per la diagnosi del cancro alla prostata e la prognosi. Tuttavia, lo sviluppo di miRNA come biomarcatori efficaci per il cancro alla prostata si basa molto sul loro rilevamento accurato nei tessuti clinici. miRNA analisi nel cancro alla prostata campioni clinici è spesso difficile a causa della eterogeneità del tumore, gli errori di campionamento, contaminazione stromale ecc L&#39;obiettivo di questo articolo è quello di descrivere un flusso di lavoro semplificato per miRNA analizza FFPE archiviati o cancro alla prostata congelato campioni clinici freschi utilizzando una combinazione di quantitativa real-time PCR (RT-PCR) e ibridazione in situ (ISH). All&#39;interno di questo flusso di lavoro, ottimizziamo le metodologie esistenti per l&#39;estrazione miRNA da FFPE e congelato tissu prostataes e espressione analisi da Taqman-sonda basato miRNA RT-PCR. Inoltre, si descrive un metodo ottimizzato per ISH analizza il rilevamento formiRNA in tessuti prostatici con acido nucleico bloccato (LNA) - sonde based. Il nostro protocollo miRNA ISH ottimizzato può essere applicato alle diapositive di cancro alla prostata di tessuto o microarray di tessuti di cancro alla prostata (TMA).

Profilo di espressione di miR-203 nel cancro della prostata primario LCM campioni clinici mediante RT-PCR analisi (Figura 1) RT-PCR analisi di espressione relativa miR-203 in LCM prostata primaria tessuti tumorali e le regioni adiacenti normali appaiati è stata effettuata come descritto in Saini et al. 15 RNU48 è stato utilizzato come controllo. La tabella seguente riassume l&#39;espressione relativa miR-203 nei tessuti tumorali del cancro alla prostata r...

Qui descriviamo un protocollo semplificato per l'analisi dell'espressione di microRNA (miRNA) in tessuti clinici archiviati Fissati in formalina, inclusi in paraffina (FFPE) o in tessuti clinici freschi congelati per il cancro alla prostata (PCa) che impiegano la PCR quantitativa in tempo reale (RT-PCR) e l'ibridazione in situ (ISH).

Analisi miRNA nel tumore alla prostata tessuti cliniche

A critical challenge in prostate cancer (PCa) clinical management is posed by the inadequacy of currently used biomarkers for disease screening, ...

L'obiettivo generale di questo video è descrivere un flusso di lavoro semplificato per le analisi di micro RNA in campioni clinici di cancro alla prostata archiviati, utilizzando una combinazione di PCR quantitativa in tempo reale e ibridazione NC a due ibridi, con l'impiego di sonde basate su acido nucleico bloccato (LNA). Questo viene ottenuto isolando innanzitutto il tessuto da sezioni FFPE di cancro alla prostata mediante microdissezione laser assistita, seguito da un'estrazione di micro RNA. Successivamente, una PCR a due passaggi (RT-PCR) viene utilizzata per quantificare il micro RNA nel tessuto e per localizzarlo; l'analisi di ibridazione a due ibridi viene eseguita utilizzando sonde LNA marcate con digossigenina e un anticorpo coniugato con fosfatasi alcalina rivelato mediante BM Purple.I risultati presentati mostrano l'espressione di un microRNA in tessuti clinici di cancro alla prostata. Utilizzando queste tecniche, di recente i microRNA si sono rivelati biomarcatori alternativi promettenti per il cancro alla prostata. Tuttavia, l'analisi dell'espressione dei microRNA e i campioni clinici di cancro alla prostata risultano spesso difficili a causa di fattori confondenti come l'eterogeneità dei tumori prostatici e contaminazioni stromali.Operiamo nel campo del microRNA e dell'RNA non codificante da oltre 10 anni. Abbiamo ottimizzato le condizioni per l'espressione del microRNA in diversi stadi del carcinoma prostatico. Riteniamo che l'espressione del microRNA possa essere utilizzata come biomarcatore diagnostico e prognostico poiché correla con l'esito clinico del cancro della prostata.Si ritiene inoltre che il microRNA possa essere utilizzato per il trattamento del cancro alla prostata mediante l'impiego della tecnologia dei nanoparticelli. Il profilo accurato dell'espressione nel carcinoma prostatico è spesso ostacolato dall'eterogeneità delle lesioni. Tale problema è in parte superato ricorrendo alla microdissezione con laser, o LCM, per raccogliere cellule epiteliali benigne o maligne pure e ridurne la contaminazione con le cellule stromali.È stato riscontrato che la LCM di tessuti FFP archiviati, seguita dalla profilazione dell'espressione dei microRNA, è una tecnica sensibile, affidabile ed economica, utilizzata come approccio complementare; l'ibridazione in situ ottimizzata consente di visualizzare la localizzazione dell'espressione dei microRNA. Una volta raccolti i tessuti e tagliati in sezioni da 10 micron, rimuovere il paraffino in cappa aspirante, immergere i vetrini nei xileni per 10 minuti due volte, quindi reidratare i tessuti trasferendoli in una serie di bagni di alcol progressivamente più acquosi. Successivamente, applicare una colorazione con ematossilina per 30 secondi e risciacquare i vetrini con acqua.Ora, dopo la reidratazione, passare i tessuti attraverso un'altra serie alcolica graduale iniziando dal 70%. Quindi immergere le sezioni in xileni per cinque minuti e lasciarle asciugare all'aria. Portare i vetrini asciutti all'apparecchio di microdissezione con cattura laser. Utilizzare i vetrini marcati dal patologo per identificare i foci di carcinoma prostatico e le aree benigne o normali.Seguire le linee guida del produttore per eseguire la microdissezione laser. Impostare l'ampiezza del fascio su 10-20 micron e applicare impulsi di 70-90 milliwatt. Utilizzare impulsi infrarossi per catturare le aree di interesse su tappi per microdissezione laser.Per ogni campione, aggiungere il contenuto del cappuccio in una provetta di raccolta ed elaborare immediatamente le cellule per l'estrazione di micro RNA. Estrarre l'RNA totale utilizzando un kit commerciale seguendo le istruzioni del produttore. Eluire l'RNA in 20-30 microlitri di acqua priva di nucleasi e procedere rapidamente.Successivamente, utilizzare un kit per la reazione di trascrittasi inversa per sintetizzare cDNA usando primer specifici per microRNA. Impostare ogni reazione utilizzando da 10 a 100 nanogrammi di RNA totale. Una volta ottenuto, diluire il cDNA di un fattore compreso tra cinque e dieci per ottenere una concentrazione di circa da uno a 20 nanogrammi.Ora preparare le reazioni PCR in triplicato a partire dall'acido nucleico complementare utilizzando saggi per microRNA con un mix universale rapido come controllo. Utilizzare RNU 48 come modello per calcolare la variazione relativa dell'espressione genica. Utilizzare il metodo del CT comparativo per iniziare a pretrattare sezioni di tessuto spesse cinque micron.Fissare i vetrini a 56 gradi Celsius per un'ora. Quindi deparaffinare i vetrini con due bagni di xilene di 15 minuti ciascuno a temperatura ambiente; dopo i trattamenti con xilene, reidratare i tessuti mediante una serie alcolica a gradazione decrescente. Successivamente, immergere i tessuti in acqua per cinque minuti.Successivamente, fissare i tessuti con PFA al 4% in PBS a temperatura ambiente per 20 minuti. Rimuovere il fissativo con due lavaggi di cinque minuti ciascuno in PBS. Ora aggiungere la proteinasi K potente a 10 microgrammi per millilitro nel buffer per proteinasi K preriscaldato, e incubare i tessuti a 37 gradi Celsius per 10 minuti.Dopo il trattamento, risciacquare i vetrini con glicina 0,2% in PBS per 30 secondi e lavare i vetrini in PBS a temperatura ambiente per cinque minuti. Successivamente, immergerli nuovamente in PFA 4% per 15 minuti. Ancora una volta, rimuovere il fissativo con due bagni in PBS di cinque minuti ciascuno.I tessuti sono ora pronti per essere ibridati. Innanzitutto, tracciare un cerchio idrofobo intorno al tessuto utilizzando una penna idrorepellente in modo che la soluzione nei passaggi successivi rimanga sulla sezione di tessuto. Incubare i tessuti nel buffer di pre-ibridazione per tre o quattro ore a 55 gradi Celsius.Eseguire questo in una camera umidificata con tamponi inumiditi con una soluzione al 50% di formammide e al 50% di soluzione 5X SSC. Preparare ora la sonda digegen e la sonda specifica per microRNA marcata, nonché la sonda di controllo. Prevedere un’aliquota finale compresa tra 20 e 50 nanomolari, ma per prima cosa diluire le sonde con soltanto 25 microlitri di tampone per ibridazione in meno rispetto al volume necessario per la diluizione finale. Successivamente, riscaldare le sonde a 90 gradi Celsius per circa quattro minuti.Quindi mettere le sonde sul ghiaccio. Infine, diluire ulteriormente le sonde con tampone di ibridazione freddo di ghiaccio fino alle concentrazioni finali di 20-50 nanomolar. Applicare ora 100-400 microlitri di soluzione di sonda su ogni vetrino.Quindi incubarli per 12-16 ore alla temperatura di ibridazione appropriata. Il giorno successivo, eseguire un lavaggio con soluzione SSC in diversi passaggi dopo i lavaggi. Incubare i vetrini in soluzione bloccante a temperatura ambiente per uno-due ore dopo il bloccaggio.Immergere i tessuti in una soluzione di anticorpo antigenina coniugato con fosfatasi alcalina 1:100 in PBS. Eseguire l'incubazione da una a quattro ore a temperatura ambiente oppure durante la notte a quattro gradi Celsius. Successivamente, rimuovere l'eccesso di anticorpo eseguendo tre lavaggi in PBS per 10 minuti ciascuno.Eseguire due lavaggi di cinque minuti ciascuno in un tampone di urina a temperatura ambiente. Quindi incubare i vetrini in BM Purple, substrato per fosfatasi alcalina, al riparo dalla luce a temperatura ambiente per un periodo compreso tra un'ora e 20 ore. Il giorno successivo, rimuovere il BM Purple con un risciacquo in PBS 0,1%.Quindi lavarli due volte in acqua e montarli con mezzi di montaggio acquosi utilizzando il protocollo descritto di estrazione di microRNA e RT-PCR. Il microRNA 203 &egrave; stato esaminato nel cancro alla prostata e nei tessuti adiacenti normali. L'espressione relativa ha mostrato variazioni in una frazione sostanziale di tessuti.RNU 48 è stato utilizzato come controllo. I tessuti di cancro alla prostata sono stati sottoposti a microdissezione al microscopio oppure a LCM, quindi è stata analizzata l'espressione relativa del microRNA. L'espressione di 3 83 nei tessuti tumorali è stata confrontata con quella dei controlli normali abbinati.I tessuti preparati con LCM hanno rilevato l'espressione dei microRNA in modo più affidabile. In C, due ibridazioni per il microRNA 203 sono state eseguite su tessuti di cancro alla prostata normali e con metastasi ossee. U sei.Il rilevamento dell'RNA è stato utilizzato come controllo in base all'intensità della colorazione. L'espressione del microRNA 2 0 3 è stata valutata da uno a quattro nelle cellule di ogni tessuto. L'espressione è risultata pertanto statisticamente più bassa nel tessuto metastatico osseo.Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come valutare l'espressione dei microRNA in campioni clinici di cancro alla prostata durante l'intero flusso di lavoro. È di fondamentale importanza mantenere un ambiente privo di RNA. Inoltre, lavorare con paraformaldeide e soluzioni saline può essere estremamente pericoloso e si devono sempre adottare precauzioni come operare in una cappa chimica e indossare dispositivi di protezione individuale durante l'esecuzione di questa procedura.Seguendo questa procedura, eseguiamo un'analisi statistica per valutare se i modelli di espressione delle microespressioni sono correlati alle variabili clinico-patologiche della malattia, il che ci aiuta a rispondere a domande fondamentali, come ad esempio se l'espressione di un particolare microRNA abbia un potenziale prognostico o diagnostico associato. Il nostro protocollo ottimizzato di ibridazione con microRNA in C due può essere applicato a vetrini di tessuto di cancro alla prostata o a microarray di tessuto di cancro alla prostata. Questo protocollo può essere applicato anche ad altri tipi di tessuto con opportune ottimizzazioni.

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Rilevamento MicroRNA in tumori della prostata dal Quantitative Real-time PCR (qPCR)

Retrovirus endogeni umani (HERV), che occupano l'8% del genoma umano, mantengono la capacità di codifica scarse, ma centinaia di migliaia di lunga ripetizioni terminali (litri). Un microarray Affymetrix personalizzato è stato progettato per identificare l'espressione individuale HERV locus ed è stato utilizzato su tessuti di carcinoma della prostata come un proof of concept per i futuri studi clinici.

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Molecular segnalazione sia attraverso gli estrogeni e microRNA sono fondamentali nello sviluppo del cancro al seno e la crescita. Estrogeni attiva i recettori degli estrogeni, che sono fattori di trascrizione. Molti fattori di trascrizione in grado di regolare l'espressione dei microRNA, e microRNA regolati dagli estrogeni possono essere profilato utilizzando diverse tecniche su larga scala.

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L'obiettivo di questo protocollo è utilizzare la micro-dissezione a cattura laser come metodo efficace per isolare popolazioni pure di tipi cellulari da tessuti prostatici eterogenei per l'analisi dell'RNA a valle.

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