Analisi miRNA nel tumore alla prostata tessuti cliniche

L'obiettivo generale di questo video è descrivere un flusso di lavoro semplificato per le analisi di micro RNA in campioni clinici di cancro alla prostata archiviati, utilizzando una combinazione di PCR quantitativa in tempo reale e ibridazione NC a due ibridi, con l'impiego di sonde basate su acido nucleico bloccato (LNA). Questo viene ottenuto isolando innanzitutto il tessuto da sezioni FFPE di cancro alla prostata mediante microdissezione laser assistita, seguito da un'estrazione di micro RNA. Successivamente, una PCR a due passaggi (RT-PCR) viene utilizzata per quantificare il micro RNA nel tessuto e per localizzarlo; l'analisi di ibridazione a due ibridi viene eseguita utilizzando sonde LNA marcate con digossigenina e un anticorpo coniugato con fosfatasi alcalina rivelato mediante BM Purple.

I risultati presentati mostrano l'espressione di un microRNA in tessuti clinici di cancro alla prostata. Utilizzando queste tecniche, di recente i microRNA si sono rivelati biomarcatori alternativi promettenti per il cancro alla prostata. Tuttavia, l'analisi dell'espressione dei microRNA e i campioni clinici di cancro alla prostata risultano spesso difficili a causa di fattori confondenti come l'eterogeneità dei tumori prostatici e contaminazioni stromali.

Operiamo nel campo del microRNA e dell'RNA non codificante da oltre 10 anni. Abbiamo ottimizzato le condizioni per l'espressione del microRNA in diversi stadi del carcinoma prostatico. Riteniamo che l'espressione del microRNA possa essere utilizzata come biomarcatore diagnostico e prognostico poiché correla con l'esito clinico del cancro della prostata.

Si ritiene inoltre che il microRNA possa essere utilizzato per il trattamento del cancro alla prostata mediante l'impiego della tecnologia dei nanoparticelli. Il profilo accurato dell'espressione nel carcinoma prostatico è spesso ostacolato dall'eterogeneità delle lesioni. Tale problema è in parte superato ricorrendo alla microdissezione con laser, o LCM, per raccogliere cellule epiteliali benigne o maligne pure e ridurne la contaminazione con le cellule stromali.

È stato riscontrato che la LCM di tessuti FFP archiviati, seguita dalla profilazione dell'espressione dei microRNA, è una tecnica sensibile, affidabile ed economica, utilizzata come approccio complementare; l'ibridazione in situ ottimizzata consente di visualizzare la localizzazione dell'espressione dei microRNA. Una volta raccolti i tessuti e tagliati in sezioni da 10 micron, rimuovere il paraffino in cappa aspirante, immergere i vetrini nei xileni per 10 minuti due volte, quindi reidratare i tessuti trasferendoli in una serie di bagni di alcol progressivamente più acquosi. Successivamente, applicare una colorazione con ematossilina per 30 secondi e risciacquare i vetrini con acqua.

Ora, dopo la reidratazione, passare i tessuti attraverso un'altra serie alcolica graduale iniziando dal 70%. Quindi immergere le sezioni in xileni per cinque minuti e lasciarle asciugare all'aria. Portare i vetrini asciutti all'apparecchio di microdissezione con cattura laser. Utilizzare i vetrini marcati dal patologo per identificare i foci di carcinoma prostatico e le aree benigne o normali.

Seguire le linee guida del produttore per eseguire la microdissezione laser. Impostare l'ampiezza del fascio su 10-20 micron e applicare impulsi di 70-90 milliwatt. Utilizzare impulsi infrarossi per catturare le aree di interesse su tappi per microdissezione laser.

Per ogni campione, aggiungere il contenuto del cappuccio in una provetta di raccolta ed elaborare immediatamente le cellule per l'estrazione di micro RNA. Estrarre l'RNA totale utilizzando un kit commerciale seguendo le istruzioni del produttore. Eluire l'RNA in 20-30 microlitri di acqua priva di nucleasi e procedere rapidamente.

Successivamente, utilizzare un kit per la reazione di trascrittasi inversa per sintetizzare cDNA usando primer specifici per microRNA. Impostare ogni reazione utilizzando da 10 a 100 nanogrammi di RNA totale. Una volta ottenuto, diluire il cDNA di un fattore compreso tra cinque e dieci per ottenere una concentrazione di circa da uno a 20 nanogrammi.

Ora preparare le reazioni PCR in triplicato a partire dall'acido nucleico complementare utilizzando saggi per microRNA con un mix universale rapido come controllo. Utilizzare RNU 48 come modello per calcolare la variazione relativa dell'espressione genica. Utilizzare il metodo del CT comparativo per iniziare a pretrattare sezioni di tessuto spesse cinque micron.

Fissare i vetrini a 56 gradi Celsius per un'ora. Quindi deparaffinare i vetrini con due bagni di xilene di 15 minuti ciascuno a temperatura ambiente; dopo i trattamenti con xilene, reidratare i tessuti mediante una serie alcolica a gradazione decrescente. Successivamente, immergere i tessuti in acqua per cinque minuti.

Successivamente, fissare i tessuti con PFA al 4% in PBS a temperatura ambiente per 20 minuti. Rimuovere il fissativo con due lavaggi di cinque minuti ciascuno in PBS. Ora aggiungere la proteinasi K potente a 10 microgrammi per millilitro nel buffer per proteinasi K preriscaldato, e incubare i tessuti a 37 gradi Celsius per 10 minuti.

Dopo il trattamento, risciacquare i vetrini con glicina 0,2% in PBS per 30 secondi e lavare i vetrini in PBS a temperatura ambiente per cinque minuti. Successivamente, immergerli nuovamente in PFA 4% per 15 minuti. Ancora una volta, rimuovere il fissativo con due bagni in PBS di cinque minuti ciascuno.

I tessuti sono ora pronti per essere ibridati. Innanzitutto, tracciare un cerchio idrofobo intorno al tessuto utilizzando una penna idrorepellente in modo che la soluzione nei passaggi successivi rimanga sulla sezione di tessuto. Incubare i tessuti nel buffer di pre-ibridazione per tre o quattro ore a 55 gradi Celsius.

Eseguire questo in una camera umidificata con tamponi inumiditi con una soluzione al 50% di formammide e al 50% di soluzione 5X SSC. Preparare ora la sonda digegen e la sonda specifica per microRNA marcata, nonché la sonda di controllo. Prevedere un’aliquota finale compresa tra 20 e 50 nanomolari, ma per prima cosa diluire le sonde con soltanto 25 microlitri di tampone per ibridazione in meno rispetto al volume necessario per la diluizione finale. Successivamente, riscaldare le sonde a 90 gradi Celsius per circa quattro minuti.

Quindi mettere le sonde sul ghiaccio. Infine, diluire ulteriormente le sonde con tampone di ibridazione freddo di ghiaccio fino alle concentrazioni finali di 20-50 nanomolar. Applicare ora 100-400 microlitri di soluzione di sonda su ogni vetrino.

Quindi incubarli per 12-16 ore alla temperatura di ibridazione appropriata. Il giorno successivo, eseguire un lavaggio con soluzione SSC in diversi passaggi dopo i lavaggi. Incubare i vetrini in soluzione bloccante a temperatura ambiente per uno-due ore dopo il bloccaggio.

Immergere i tessuti in una soluzione di anticorpo antigenina coniugato con fosfatasi alcalina 1:100 in PBS. Eseguire l'incubazione da una a quattro ore a temperatura ambiente oppure durante la notte a quattro gradi Celsius. Successivamente, rimuovere l'eccesso di anticorpo eseguendo tre lavaggi in PBS per 10 minuti ciascuno.

Eseguire due lavaggi di cinque minuti ciascuno in un tampone di urina a temperatura ambiente. Quindi incubare i vetrini in BM Purple, substrato per fosfatasi alcalina, al riparo dalla luce a temperatura ambiente per un periodo compreso tra un'ora e 20 ore. Il giorno successivo, rimuovere il BM Purple con un risciacquo in PBS 0,1%.

Quindi lavarli due volte in acqua e montarli con mezzi di montaggio acquosi utilizzando il protocollo descritto di estrazione di microRNA e RT-PCR. Il microRNA 203 è stato esaminato nel cancro alla prostata e nei tessuti adiacenti normali. L'espressione relativa ha mostrato variazioni in una frazione sostanziale di tessuti.

RNU 48 è stato utilizzato come controllo. I tessuti di cancro alla prostata sono stati sottoposti a microdissezione al microscopio oppure a LCM, quindi è stata analizzata l'espressione relativa del microRNA. L'espressione di 3 83 nei tessuti tumorali è stata confrontata con quella dei controlli normali abbinati.

I tessuti preparati con LCM hanno rilevato l'espressione dei microRNA in modo più affidabile. In C, due ibridazioni per il microRNA 203 sono state eseguite su tessuti di cancro alla prostata normali e con metastasi ossee. U sei.

Il rilevamento dell'RNA è stato utilizzato come controllo in base all'intensità della colorazione. L'espressione del microRNA 2 0 3 è stata valutata da uno a quattro nelle cellule di ogni tessuto. L'espressione è risultata pertanto statisticamente più bassa nel tessuto metastatico osseo.

Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come valutare l'espressione dei microRNA in campioni clinici di cancro alla prostata durante l'intero flusso di lavoro. È di fondamentale importanza mantenere un ambiente privo di RNA. Inoltre, lavorare con paraformaldeide e soluzioni saline può essere estremamente pericoloso e si devono sempre adottare precauzioni come operare in una cappa chimica e indossare dispositivi di protezione individuale durante l'esecuzione di questa procedura.

Seguendo questa procedura, eseguiamo un'analisi statistica per valutare se i modelli di espressione delle microespressioni sono correlati alle variabili clinico-patologiche della malattia, il che ci aiuta a rispondere a domande fondamentali, come ad esempio se l'espressione di un particolare microRNA abbia un potenziale prognostico o diagnostico associato. Il nostro protocollo ottimizzato di ibridazione con microRNA in C due può essere applicato a vetrini di tessuto di cancro alla prostata o a microarray di tessuto di cancro alla prostata. Questo protocollo può essere applicato anche ad altri tipi di tessuto con opportune ottimizzazioni.