L'approccio del mouse Round-finestra per ototossico Delivery Agent: Una rapida e tecnica affidabile per indurre la degenerazione delle cellule Cochlear

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di stabilire un modello di lesione dell'orecchio interno somministrando in modo mirato agenti ototossici direttamente alla nicchia della finestra rotonda della coclea del topo. Questo viene ottenuto innanzitutto dissezionando lo strato di tessuto adiposo sottocutaneo ed estraendo delicatamente il corpo muscolare per esporre il peristio della bulla timpanica. Il secondo passaggio consiste nell'aprire la bulla rimuovendo gradualmente frammenti ossei fino a esporre la nicchia della finestra rotonda.

Successivamente, il liquido visibile dell'orecchio medio e della nicchia della finestra rotonda viene asciugato completamente, consentendo una visualizzazione ottimale della nicchia della finestra rotonda. L'ultimo passaggio consiste nel riempire la nicchia della finestra rotonda con l'agente ototossico selezionato senza alterare l'arteria peduncolata della STA, seguito da ripetizioni appropriate in base alle specifiche dell'agente. Infine, vengono utilizzate procedure funzionali, tra cui la risposta uditiva del tronco encefalico e la valutazione morfologica, per dimostrare la preservazione selettiva o la degenerazione della microarchitettura cocleare.

Il principale vantaggio di questa tecnica, la nostra misura esistente, è che questa procedura consente un'eccellente esposizione della nicchia della finestra errata e della memoria, permettendo l'applicazione diretta di un invecchiamento tossico selettivo. I vantaggi di questa tecnica includono la preservazione dell'orecchio interno e della microarchitettura, l'evitamento di tossicità sistemica, un rapido insorgere dell'effetto, la degenerazione selettiva di determinati tipi cellulari cocleari e risultati riproducibili. Questa tecnica può essere applicata con poche modifiche tra altre specie di roditori, inclusi ratti, criceti e gerbilli.

Ora illustrerò la procedura nel mio laboratorio. Tutti gli aspetti della ricerca sugli animali sono stati condotti in conformità con le linee guida del comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali. Tutte le procedure sperimentali sulle vertebre descritte in questo documento sono state approvate secondo le linee guida del comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali della Medical University of South Carolina.

Dopo aver anestetizzato l'animale secondo le procedure approvate, somministrare un analgesico preoperatorio di 0,1 milligrammi per chilogrammo. In questo caso si utilizza buprenorfina. Verificare che l'animale abbia raggiunto un piano chirurgico di anestesia.

Non dovrebbe esserci alcuna risposta alla compressione delle dita dei piedi e il riflesso di scrittura dovrebbe essere assente nei topi, come mostrato qui. Aspirare 0,2 millilitri di una soluzione acquosa contenente l'agente ototossico selezionato in una siringa tubercolinica da un millilitro munita di un ago smussato da 28 gauge e mezzo pollice, ed espellere qualsiasi aria presente nella siringa poiché le bolle possono impedire l'applicazione corretta dell'agente. Utilizzare un rasoio elettrico per rimuovere il pelo nell'area che si estende dal solco interdigitale fino al cingolo scapolare, procedendo in senso rostrale.

Estendere la rimozione dei peli dalla linea mediana sagittale dorsale fino all'angolo mandibolare lateralmente. Utilizzare un rasoio monouso per garantire una preparazione accuratamente rasata. Sterilizzare la pelle dell'area preparata secondo i protocolli istituzionali.

Qui il Betadine viene alternato con etanolo e applicato topicamente in modo circolare per due minuti. Posizionare un piccolo tappetino riscaldante sotto il corpo per mantenere la temperatura corporea dell'animale. A 36-38 gradi Celsius, fissare la testa dell'animale mediante un apparato di fissaggio della testa.

Serrare delicatamente una piccola pinza sul dorso del muso dell'animale per mantenerlo fermo. Verificare che il sostegno per la testa sia rigidamente collegato al centro di un braccio articolato a forma di U. Fissare un'asta larga un centimetro al braccio sinistro della U, da utilizzare come appoggio laterale sinistro della testa, in modo da consentire l'accesso al lato destro.

Una volta fissato saldamente nel supporto per la testa, ruotare il mouse in posizione laterale decubito sinistro. Posizionare attentamente il corpo su una superficie operatoria piana per garantire stabilità durante tutta la procedura ed evitare eccessive sollecitazioni torsionali sulle vertebre cervicali. Posizionare un microscopio operatorio dotato di ingrandimento 10x e 20x sopra il campo chirurgico.

Verificare che il microscopio possa mantenere la propria posizione in modo autonomo, in modo da poter utilizzare entrambe le mani per l'intervento chirurgico durante il lavoro sotto ingrandimento microscopico. Utilizzare forbici affilate o una lama di bisturi per praticare un'incisione postauricolare lunga da uno a 1,5 centimetri, approssimativamente a sei-otto millimetri dal solco cefalico auricolare. Evitare di tagliare in profondità per preservare le strutture vascolari sottostanti.

Dissezionare in modo netto attraverso lo strato di grasso sottocutaneo. Se si procede in direzione ventrale verso mediale, prestare attenzione ad evitare la vena giugulare esterna. In caso di sanguinamento, utilizzare gelatina assorbibile, spugnette o tamponi di cotone per arrestare il flusso.

Dopo aver correttamente diviso lo strato adiposo, esporre la muscolatura cervicale. Un punto di riferimento importante è un piccolo ramo nervoso del nervo cranico 11 che si avvolge attorno al margine posteriore del processo mastoideo del CTO. Per estendere la dissezione in direzione rostrale verso il padiglione auricolare, utilizzare un retraore auto-tenente per retrarre delicatamente il corpo muscolare del CTO mastoidite in direzione posteriore.

Dividere delicatamente la fascia trasparente che avvolge il corpo muscolare. Ritirare anche con delicatezza la parotide e la vena giugulare esterna in direzione opposta. Con una buona retrazione del corpo muscolare del muscolo CTO Masto, si rende visibile la cupola lucente del periostio della bulla timpanica nella regione coddle della bulla, sede di inserzione di un muscolo cervicale più profondo.

La mastoidite dello sterzo sarà visibile. Posizionare un retractor auto-tenente per mantenere separato il mastoide CTO utilizzando una tecnica a due mani; usare delicatamente la diatermia bipolare per dividere il periosteo del bullo ed esporre l'osso sottostante. Successivamente, utilizzare pinze o un curetto otologico per sollevare delicatamente e spingere il periosteo in direzione periferica, esponendo completamente la volta del bullo.

Ora utilizzare un trapano dentale a flessibile con una punta conica da uno o due millimetri per praticare con attenzione un foro guida di due millimetri attraverso l'osso della bulla. Eseguire la foratura tra il margine coddle della cupola e la linea visibilmente opaca che si estende lungo l'aspetto rostrale della bulla. Successivamente, praticare con attenzione un secondo foro guida nelle vicinanze per facilitare la rimozione della copertura dell'osso della bulla; utilizzando una pinzetta a punta da orafo, aprire l'osso della bulla in direzione dorsale e coddle.

Attenzione a non perforare l'arteria EDL che si trova direttamente sotto il cappuccio del bovino. Rimuovere la quantità minima di osso per evitare un eccessivo afflusso di liquido nell'orecchio medio prima dell'applicazione dell'agente. Utilizzare uno stecco di carta per rimuovere tutto il liquido visibile nell'orecchio medio e nella nicchia della finestra rotonda fino a quando non sia visibile l'osso asciutto.

Questo passaggio è cruciale per il successo del protocollo. Mentre si osserva l'area con l'ingrandimento massimo, utilizzare un ago sottile collegato a una siringa tubercolinica da un millilitro per applicare una goccia di agente ototossico direttamente nella nicchia della finestra rotonda, riempiendola completamente. Lasciare l'agente in posa nella nicchia della finestra rotonda per 10 minuti.

Nelle fasi iniziali, osservare attentamente la sostituzione di un piccolo riflesso luminoso alla base della nicchia secca con un menisco opaco e torbido. Questo indica che la nicchia si sta riempiendo correttamente. Trascorsi completamente 10 minuti, asciugare completamente l'agente e sostituirlo con una nuova applicazione dello stesso agente.

Il numero di applicazioni dipende dall'agente utilizzato. Il tempo di esposizione varia tipicamente tra 30 e 60 minuti. Dopo l'applicazione finale, lasciare il bullone scoperto e utilizzare la pinza per chiudere il tessuto molle sulla sede chirurgica.

Utilizzare una suturetta monofilamento non riassorbibile da quattro-0 per chiudere la cute sopra la sede chirurgica. Lasciare l'animale riprendere dallo stato anestetico in una gabbia domestica pulita, che deve essere dotata di lettiera e cibo morbido. Monitorare gli animali quotidianamente fino al sacrificio e al prelievo del tessuto cocleare da adulti C-B-A-C-A-J.

Topi di entrambi i sessi sono stati esposti all'agente ototossico Hept ethanol. La diffusione attraverso la finestra rotonda. Aumenti significativi delle soglie del potenziale evocato del tronco encefalico sono stati osservati nei topi trattati con Hept dal primo al quattordicesimo giorno postoperatorio, rispetto agli animali di controllo sottoposti a intervento fittizio con somministrazione di soluzione salina al posto di Hept.

L'etanolo non ha dimostrato spostamenti significativi della soglia a nessuna frequenza testata. La colorazione immunoistochimica contro un canale del potassio rettificante entrante mostrata in verde è servita come metodo indiretto per visualizzare i danni e il recupero delle strutture cocleari. L'intensità della colorazione è risultata notevolmente ridotta all'interno delle teria vais.

Nel primo giorno successivo all'intervento, si osservava anche un'alterazione dell'integrità nucleare e una condensazione cromosomica, tipiche dell'apoptosi cellulare, evidenziate dalla colorazione di contrasto nucleare mostrata in rosso. Quando l'intensità della colorazione dei canali del potassio è stata quantificata nelle aree del strato trattato, si è osservato un calo iniziale seguito da un significativo ritorno verso l'intensità del controllo sette giorni dopo l'esposizione a hept, con un recupero che prosegue successivamente. Una volta padroneggiata, questa procedura può essere eseguita in 30-60 minuti se effettuata correttamente.

È importante ricordare che un'esposizione aggiuntiva o un rinnovo possono contribuire a evitare l'indesiderata diluizione dell'agente auto-tossico causata dalla concentrazione ematica o dal fluido interstiziale. Tuttavia, occorre prestare cautela con questo approccio poiché tende ad aumentare il rischio di lesioni involontarie dell'arteria cedale o di introduzione di fluido interstiziale nella nicchia della finestra rotonda. Questa tecnica minimamente invasiva permette lo studio dettagliato di delicati processi biochimici ed è stata fondamentale per promuovere la nostra ricerca volta a comprendere il potenziale rigenerativo cocleare in vivo.