Misurazione TCR-pMHC Binding

In questo video, mostreremo come misurare la cinetica tra il recettore dell'antigene delle cellule T e il complesso maggiore di istocompatibilità peptidico carico, o PMHC, in C due, all'interno della sinapsi immunologica tra una cellula T e un bilayer lipidico supportato planare. Illustreremo brevemente gli aspetti fondamentali della produzione proteica e la verifica dell'integrità funzionale del bilayer lipidico mediante misurazioni del flusso di calcio. Per informazioni più dettagliate su come preparare il bilayer lipidico e su come configurare un microscopio a fluorescenza a singola molecola, si prega di consultare il nostro contributo parallelo nel Journal of Visualized Experiments. Spiegheremo quindi in dettaglio come eseguire e analizzare misurazioni di trasferimento di energia per risonanza di Förster, in bug e a livello di singola molecola.

Per dedurre la cinetica del legame sinaptico tra il recettore per le cellule T e il PMHC, al fine di spiegare la strategia basata sulla risonanza di trasferimento di energia di Förster (FRET) utilizzata nel nostro approccio generale, partiamo dalla struttura cristallina del recettore per le cellule T, o TCR, mostrato in blu, mentre si lega al suo antigene, la molecola MHC carica di peptide, o PMHC, mostrata in giallo e rosso. Introduciamo inoltre un frammento a catena singola dei domini variabili di un anticorpo reattivo verso la catena beta del recettore per le cellule T, denominato age 57. Per effettuare misurazioni quantitative basate sul FRET, è fondamentale etichettare entrambi i componenti in modo specifico per sito: il donatore FRET, nel nostro caso il frammento a catena singola, e l'accettore FRET, il PMHC.

Questo è realizzabile per proteine ricombinanti attraverso l'introduzione di una cisteina non appaiata, che può quindi essere legata covalentemente al fluorocromo coniugato con la mite. Come mostrato, si lega il donatore Alexa Fluor 555 o il lato tre al frammento a catena singola e l'accettore FRET. Alexa Fluor 647 o SI cinque al termine C del peptide legato all'MHC.

La distanza Indy, come mostrata in questa struttura composita, è di circa 41 angström, ancora minore rispetto al primo raggio, ovvero la distanza a cui si verifica il trasferimento di energia massimo al 50% tra i due coloranti. Nei nostri esperimenti, utilizziamo un bilayer lipidico supportato su vetro piano come cellule presentanti l'antigene surrogate. Questi sono funzionalizzati con PMXC, la molecola co-stimolatrice B sette uno e la molecola di adesione I chem uno.

In questo modo, l'acquisizione di immagini può essere eseguita in modalità fluorescenza a riflessione totale interna, che illumina il fluorocromo in prossimità dell'interfaccia, riducendo sostanzialmente il fondo cellulare. Il trasferimento di risonanza energetica (FRET) è rilevabile soltanto quando i frammenti moncatena marcati di TCR si legano alle PM-HCS incorporate nel layer. Ciò ci consente di visualizzare il legame T-C-R-P-M-H-C e quindi di calcolare la cinetica di legame in un complesso di istogeni Tatticamente ripiegato correttamente.

Le porzioni extracellulari di P seven one e I chem one vengono purificate dai supernatanti di colture cellulari di insetti infettate con il corrispondente virus BUC. La purificazione viene eseguita in tre passaggi, iniziando con una cromatografia per affinità al nichel anti aros, seguita da uno scambio ionico e da una cromatografia ad esclusione molecolare. Gli eterodimeri con marcatore istologico del Complesso Maggiore di Istocompatibilità di classe due vengono espressi in e coli come corpi di inclusione e rinaturati in vitro a quattro gradi Celsius e in presenza di un peptide spaziatore, mediante diluizione rapida in un tampone redox.

Il peptide spaziatore verrà successivamente scisso mediante esposizione alla luce UV. I complessi PMHC correttamente ripiegati vengono poi purificati e concentrati insieme al peptide spaziatore. Il peptide viene scisso e sostituito a pH 5,2 con il peptide fluorescente.

Il prodotto finale è stato purificato per dimensione. Il frammento a catena singola viene espresso con una cisteina non appaiata come corpi di inclusione in E. coli, ripiegato in vitro mediante dialisi graduale e purificato per dimensione. Successivamente, viene marcato attraverso la cisteina non appaiata con un colorante coniugato a maleimide e nuovamente purificato per dimensione.

Tutte le proteine ricombinanti vengono infine dializzate contro PBS contenente il 50% di glicerolo, concentrate a un milligrammo di proteina per millilitro e conservate a lungo termine a meno 20 gradi Celsius. Utilizzare il colorante rapportometrico URA due per misurare i livelli intracellulari di calcio nei linfociti T come metodo per verificare la potenza stimolatoria del lipid blay. Caricare il blast linfocitario T con l'estere URA 2:00 AM.

Questo composto entra nelle cellule attraverso il suo gruppo AM, ma viene successivamente trattenuto all'interno grazie all'azione delle esterasi, che rimuovono la parte AM. Aggiungere fira 2:00 AM a circa 3 milioni di cellule T a una concentrazione finale di cinque micromoli per litro. Trasferire le cellule dalla piastra a 24 pozzetti a un nuovo tubo e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti.

Lavare le cellule una volta in tampone di imaging contenente soluzione salina tamponata con Hank, calcio, magnesio e 1% di albumina. Per monitorare il calcio intracellulare, utilizzare un sistema microscopico invertito automatizzato dotato di capacità UV. Avviare il protocollo temporizzato e aggiungere meno di due cellule T caricate al bilayer lipidico funzionalizzato posizionato a fuoco sul palco del microscopio, acquisendo a intervalli di tempo regolari un'immagine DIC e due immagini fluorescenti eccitate con luce UV a 340 e 380 nanometri.

Immediatamente dopo il contatto con il bilayer, le cellule T assumono livelli elevati di calcio, come rilevato dal rapporto URA due a 15 minuti dall'inizio dell'esperimento. Aggiungere un anticorpo bloccante alle cellule che saturi tutti gli antigeni PMHC. Di conseguenza, i livelli intracellulari di calcio diminuiscono fino a quelli dello stato non attivato, che successivamente serviranno come riferimento.

Non appena i livelli dell'anticorpo bloccante diminuiscono fino a un valore che riflette lo stato non attivato, che normalizziamo a uno per le misurazioni FRET, le cellule T devono essere marcate con una sonda FRET costituita da un frammento singolo a catena singola reattivo verso il TCR per ogni esperimento, trasferire circa 1 milione di cellule in una provetta e centrifugarle a 400 ×g. Decantare il mezzo e rimuovere le gocce residue di mezzo. Asciugare le gocce rimaste sulle pareti interne con un tovagliolo di carta. Questo garantisce un volume di incubazione minimo di circa 30 microlitri, come menzionato in precedenza.

Il probe FRET è conservato alla concentrazione di un milligrammo per millilitro e al 50% di glicerolo a meno 20 gradi Celsius. Viene marcato specificamente sul sito con Alexa, fluoro 5, 5 5, anche tre, a un rapporto proteina/anticorpo di uno a 0,3 microlitri del probe rispetto alle cellule. Agitare delicatamente il pellet più volte e incubare le cellule per 20 minuti sul ghiaccio.

Lavare le cellule in tampone di imaging freddo. Ripetere questa procedura di lavaggio una volta. L'incubazione, la centrifugazione e il mantenimento a bassa temperatura garantiscono che le cellule T non internalizzino la sonda fluorescente durante l'esposizione.

Questo comporterebbe un aumento della fluorescenza di fondo. Inoltre, le cellule T non perdono la sonda al freddo durante il lavaggio e il successivo stoccaggio, prima di posizionare la camera con bicella sullo scambiatore del palchetto del microscopio. Sostituire il PBS in successione con il buffer di imaging, evitando a tutti i costi l'esposizione della bicella all'aria, poiché ciò la distruggerebbe.

Per ridurre il fondo cellulare, utilizziamo l'illuminazione in modalità TIRF. A tale scopo, posizioniamo il fascio di eccitazione a un angolo critico in corrispondenza del quale avviene la riflessione totale interna. Spegnere l'eccitazione, accendere la luce in campo chiaro e aggiungere la cellula T alla camera ltec, lasciandola aderire al bilayer lipidico.

Accendere l'eccitazione e mettere a fuoco una illuminazione non in campo chiaro. La membrana cellulare viene osservata come un anello lungo l'asse ottico in ogni piano focale; nel campo chiaro, solo la membrana basale a contatto con il doppio strato è osservabile. I piani focali superiori non sono più eccitati e quindi non visibili.

Il protocollo di temporizzazione inizia con gli impulsi di eccitazione rosso e verde per l'acquisizione di immagini di PMHC e TCR, seguiti da un impulso di sbiancamento rosso per eliminare l'accettore P-M-H-C-F. Un impulso verde per acquisire l'immagine del TCR dopo lo sbiancamento dell'accettore F fat, e un impulso rosso per verificare l'ablazione dell'accettore F vengono eseguiti su scala temporale sub-secondaria, con il ritardo più breve possibile tra il primo e il secondo impulso verde. Opzionalmente, un'immagine DIC può essere acquisita all'inizio; la separazione dell'immagine a due colori permette la rilevazione simultanea del donatore eccitato e del canale dell'accettore eccitato.

L'eccitazione dell'accettore alimentato mostra l'accumulo di pMHC nella sinapsi delle cellule T. Questa immagine pre-bleaching verifica la presenza di pMCS e indica un legame già mediato dal TCR. Eccitazione. Il donatore alimentato genera immagini in entrambi i canali.

Il segnale del canale donatore eccitato viene in parte ridotto in intensità a causa del trasferimento di energia nel canale accettore F. Il segnale del canale accettore FRET è composto dal passaggio diretto del donatore eccitato nel canale accettore FRET e dall'eccitazione incrociata dell'accettore FRET. In ogni caso, questa immagine non verrà utilizzata per l'analisi.

Nel protocollo attuale, una rapida operazione di sbiancamento segue ed elimina tutti i fluorocromi accettori F. L'intensità dell'immagine del donatore F dopo lo sbiancamento accettabile del fret viene ora recuperata a livelli più elevati senza perdita di intensità nel canale fre.

La seguente aspettativa dell'accettore FRET verifica lo sbiancamento completo dell'accettore F fat. Ingrandiamo la sinapsi per quantificare il recupero del donatore alimentato. Determinare l'intensità media dello sfondo come una costante indipendentemente dall'accettore fre.

Bleccia fotochemica, quindi determinare l'intensità media della sinapsi e quella di un aggregato rappresentativo di TCR. Il rendimento FRET viene quindi calcolato normalizzando la differenza prima e dopo l'ablazione dell'accettore F. Nel nostro esempio, misuriamo il 16% FRET per l'intera sinapsi e il 26% FRET per l'aggregato rappresentativo.

I rendimenti di FRET degli aggregati di TCR saranno successivamente convertiti in occupazioni del TCR, che permettono di ottenere dati a livello di singola molecola sulla costante di dissociazione sinaptica bidimensionale. Ci consentono di dedurre la cinetica dell'interazione sinaptica tra TCR e peptidi associati a MHC negli esperimenti di FRET a singola molecola. Utilizziamo gli stessi reagenti e la stessa strategia sperimentale adottata in precedenza.

Tuttavia, per assicurare che stiamo effettivamente osservando l'interazione tra un singolo TCR e un singolo peptide MHC, scegliamo di soddisfare il seguente criterio. Un evento candidato per un singolo fre molecolare deve coincidere colloquialmente con la singola molecola accettore fre o donatore fre. Qui impieghiamo un singolo PMHC come molecola accettore fre per verificare la natura monoclonale dell'evento fre osservato, ma con il ragionamento opposto.

L'utilizzo di accettori alimentati in pulsanti superiori e donatori Fred in pulsanti inferiori è certamente un'opzione. Di solito esponiamo le cellule T a contatto con un lipide stimolatorio blay con eccitazione a 514 e 647 nanometri; un'eccitazione sequenziale e ripetuta del donatore e dell'accettore, con un ritardo minimo di un millisecondo, è seguita da un tempo di attesa che può essere variato in base alle esigenze dell'esperimento.

Per ottenere un segnale fluorescente sufficientemente intenso da rilevare singoli die entro millisecondi dall'eccitazione, è necessario applicare densità di potenza di eccitazione elevate, comprese tra uno e cinque chilowatt per centimetro quadrato. A causa del fotoblesamento, il numero di molecole di accettore PMHC FRET visibili diminuisce rapidamente fino a un livello in cui il singolo fluorocromo accettore FRET diventa distinguibile in un bilayer contenente 30 o più PMCS marcati per micrometro quadrato. Qui viene mostrato un esempio con un ritardo temporale complessivo di 42 millisecondi.

Un singolo evento di FRET, indicato con un cerchio rosso, diventa visibile nel secondo e nel terzo punto temporale. Esso co-localizza con una singola molecola di S5, indicata con un cerchio verde. In questo esempio, l'evento di FRET osservabile ha una durata di due tracce; raccogliere ulteriori tracce di FRET a singola molecola come mostrato nella tabella in un totale di 128 tracce.

Successivamente, calcolare la somma cumulativa complementare delle tracce come mostrato dai numeri verdi e normalizzarle come mostrato nel grafico dei valori normalizzati, quindi adattarle con una funzione esponenziale mono-esponenziale. Il valore atteso è leggermente superiore a 1,5 intervalli temporali. Questo valore dipende dal peptide del TCR, dal legame con il MHC e dal fotoblesamento; per poter discriminare tra questi due contributi, il valore atteso deve essere calcolato per almeno tre intervalli temporali diversi.

I ritardi rappresentano ora tutti i valori attesi in funzione dei rispettivi intervalli temporali e adattano i punti dati alla funzione mostrata, che include qui il tempo di vita di 2,12 secondi e il valore atteso per la FOTOBLEACHING f Fred. Il recupero del donatore dopo la fotobleaching di F Fred, accettabile come mostrato qui e in maggiore dettaglio in precedenza, può essere utilizzato per determinare in pochi passaggi le costanti di dissociazione bidimensionali così come sono efficaci all'interno della sinapsi immunologica.

Qui concentriamo la nostra analisi sull'interazione del TCR e sui cluster di TCR in cui il legame T-C-R-P-M-H-C è più evidente. Come risulta evidente dalle misurazioni mostrate, i valori di F FRED variano notevolmente per singoli cluster di TCR.

Moltiplicare F fred per il fattore di proporzionalità C porta all'occupazione del TCR, un termine che descrive il rapporto tra il numero di TCR legati al pMHC e il loro numero totale. C deve essere determinato una volta per un insieme specifico di coppie fre e per il sistema FRE utilizzato. Verso la fine di questa presentazione, spiegheremo in maggiore dettaglio come determinare C, ad esempio, il che implica l'uso di SI tre e SI cinque posizionati specificamente sul frammento di anticorpo monocatenario reattivo verso il TCR e sul termine C del peptide legato all'MHC. Ciò corrisponde a circa due sinaptici; le costanti di dissociazione bidimensionali possono essere calcolate a partire dall'occupazione del TCR denominata A e dalla densità iniziale di pMHC presente sul bilayer lipidico.

La relazione mostrata deriva dalla legge dell'azione di massa ed è spiegata in maggiore dettaglio nell'articolo associato a questo filmato. Nel nostro esempio, la densità iniziale di pmcs ammonta a 30 molecole per micron quadrato. Si ottiene una distribuzione di kd 2D, efficaci nella sinapsi delle cellule T, con un valore mediano di circa 34 molecole per micron quadrato.

La distribuzione della velocità di associazione può essere calcolata a partire dalla distribuzione del KD 2D sinaptico e dalla corrispondente velocità di dissociazione, qui pari a 0,41 al secondo, determinata mediante l'analisi delle tracce di FRET a singola molecola a 24 gradi Celsius. Il valore mediano è di circa 0,01 micron quadrati per molecola al secondo. In sintesi, le misurazioni di FRET tra TCR e peptidi MHC permettono un'analisi completa di tutti i parametri cinetici che descrivono la dinamica della reazione nel compartimento C due.

Questa metodologia può in linea di principio essere generalizzata all'analisi di altre interazioni tra recettori e ligandi, poiché potrebbero essere fondamentali per il riconoscimento tra cellula e cellula. Ultimo ma non meno importante, discutiamo come derivare sperimentalmente la costante C, necessaria per convertire i rendimenti di grasso in occupazioni del TCR. Questa procedura deve essere eseguita una sola volta.

La costante determinata C può quindi essere utilizzata per tutti i successivi esperimenti in cui lo stesso sistema fret con gli stessi fluorofori viene applicato. In questa procedura, abbiamo essenzialmente correlato i rendimenti fret misurati nei singoli cluster di TCR, attraverso il recupero del donatore dopo il fotoblesamento dell'accettore, ai corrispondenti valori di intensità rilevati nel canale fret sensibilizzato. Come discusso in precedenza, il rendimento fret viene determinato a partire dalle immagini del canale donatore fret corrette per il fondo, acquisite prima e dopo l'ablazione del donatore fret.

Il canale FRET sensibilizzato deve essere allineato con il canale del donatore F e corretto per le componenti X e Y e per il fondo. Come mostrato qui, vanno corretti la fuoriuscita del donatore Fred e l'eccitazione incrociata dell'accettore Fred. Una descrizione dettagliata di come correggere la fuoriuscita del donatore Fred e l'eccitazione incrociata dell'accettore Fred è fornita nell'articolo.

In corrispondenza di questo video, calcolare ora per ciascun cluster di TCR il rapporto tra il segnale del bug dell'immagine FRET corretta e l'immagine corrispondente del donatore FRET corretta. Determinare il segnale medio corretto per singoli donatori FRET e per eventi FRET a singola molecola e calcolare il rapporto. L'occupazione del TCR viene quindi ottenuta moltiplicando i due rapporti.

Ora, riportare in grafico i rendimenti FRET determinati per singoli cluster di TCR in funzione del loro grado di occupazione dei TCR. Il valore di C viene quindi determinato mediante regressione lineare, come mostrato qui. Nel nostro esempio, esso corrisponde approssimativamente a due.

Dopo aver visto questo video, si dovrebbe essere in grado di utilizzare un bilayer lipidico funzionalizzato con proteine in combinazione con la microscopia a fluorescenza a singola molecola per misurare la cinetica di legame sinaptico tra PMHC e TCR. Sono stati illustrati tutti i passaggi necessari, inclusa la produzione delle proteine, l'etichettatura dei linfociti T e le misurazioni finali di FRET. Inoltre, è stata mostrata in dettaglio l'analisi delle immagini, che permette di ottenere curve di attivazione dei linfociti T e valori di FRET.

Infine, è stata illustrata la metodologia alla base della determinazione delle velocità cinetiche di associazione e dissociazione. Un approccio analogo può in linea di principio essere utilizzato per determinare altre interazioni tra recettori sinaptici e ligandi, anche se potrebbero rendersi necessarie opportune modifiche.