Name: Misurazione TCR-pMHC Binding In Situ Utilizzando un microscopio saggio basato FRET- (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 19 min 5 s
Description: Scopri come misurare la cinetica di legame TCR-pMHC in situ nel sinapsi immunologica utilizzando microscopia FRET a singola molecola. Questo metodo consente di quantificare affinità e costanti cinetiche in vivo.

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Gli autori dichiarano di non avere alcun interesse finanziario concorrente.

Misurazione interazioni proteina-proteina in situ è altamente auspicabile soprattutto quando si tratta di interazioni a bassa affinità, come TCR-pMHC vincolante 11. Questo perché il on-rate e la stabilità di tali interazioni sono significativamente influenzati dalle circostanze particolari avviene il legame. Approcci di imaging basato FRET-minimamente invasivi sono quindi in linea di principio perfettamente adatto per tali compiti, ma implicano una serie di ostacoli che devono essere superati prima. Il rumore generato da autofluorescenza cellulare limita la sensibilità delle misurazioni e deve pertanto essere mantenuto al minimo. Microscopia TIRF serve questa esigenza molto bene 12 ma richiede la funzionalizzazione di vetro diapositive, idealmente sotto forma di un planare-oggetti sostenuto doppio strato lipidico decorato con proteine ​​di scelta 13-15. Un altro vantaggio di un approccio in parte di ricostituzione è che i partner FRET ricombinante doppio strato-residente può essere molto mORE facilmente etichettati in uno, site-specific modo quantitativo e razionale con fluorofori più piccoli e più brillanti di quanto sarebbe possibile con proteine ​​di superficie espresso cellulari. TCR sono contrassegnati con ricombinante SCF V s, che non influenzano il riconoscimento delle cellule T, come è stato testato in precedenza 2. Inoltre, la composizione proteica della SLB, per esempio la densità pMHCs e la scelta dei fattori accessori può essere regolata alle proprie esigenze specifiche. Abbiamo già effettuato esperimenti con diverse densità di pMHCs stimolanti, ma non abbiamo rilevato differenze significative nella 2D-k off e 2D-K D 2. Finora qui il riconoscimento di molecole MHC di classe II è stato trattato solo, soprattutto a causa della natura della loro cleft legame peptidico, che è aperto alle due estremità ed accoglie pertanto peptidi più grandi compreso un linker per il fissaggio fluoroforo. In alcuni casi tale approccio potrebbe funzionare anche per l&#39;etichettatura MHC class io molecole 16, ma molta cautela da adottare per verificarne l&#39;utilizzo negli esperimenti. La sensibilità di cellule T verso antigeni, che può essere misurata mediante saggi di proliferazione delle cellule T, così come la cinetica di legame pMHC-TCR misurata in vitro mediante risonanza plasmonica di superficie non dovrebbe essere influenzata dall&#39;aggiunta del linker e fluoroforo per il peptide. In alternativa, MHC classe I assumono molecole possono essere etichettate in modo sito-specifico con l&#39;introduzione di una cisteina spaiato all&#39;interno della sequenza della catena pesante (osservazioni non pubblicate). Con l&#39;uso di opportune sonde molecolari alcuna interazione proteina-proteina sinaptica può in linea di principio essere studiato in modo qui descritto. Tali sonde, ad esempio, SCF V s o Progettato Proteine ​​Ankyrin Ripeti (DARPins) 17, dovrebbero essere monovalenti e dovrebbe legare il loro obiettivo in modo stabile senza influenzare l&#39;interazione di interessi. Naturalmente, informatio strutturalen è altamente desiderabile per la progettazione razionale della sonda ma non assolutamente necessario. Quando si stabilisce un nuovo paio di partner FRET, si consiglia di registrare ed analizzare FRET in massa prima. Siti di attaccamento etichette possono essere variate sensibilmente per massimizzare il segnale FRET e anche per verificare che i rendimenti misurati FRET variano in base alla distanza tra colorante. Una volta che il sistema è ottimizzato, singola molecola FRET segnali possono essere registrati limitando l&#39;etichettatura del grande abbondanza FRET partner 10-30% e sbianca la bassa abbondanza FRET compagno fino a quando le singole molecole sono risolvibili nel campo dell&#39;illuminazione. Ultimo ma non meno importante si deve rilevare che SLB ravvicinamento alcuni, ma non tutti gli aspetti di una membrana plasmatica fisiologico. Qualità come membrana curvatura e flessibilità, compartimentazione dominio, riarrangiamenti citoscheletrici e motilità cellulare, nonché una elevata varietà di proteine ​​di membrana di superficie espressi non sono rappresentate da SLB ma possono influenzare tegli elabora sotto inchiesta. Sarà necessario molto sforzo per essere investito per stabilire le modalità di imaging che permette di seguire in interazioni proteina-proteina con una risoluzione di singola molecola nelle sinapsi fisiologici, che sono inaccessibili per l&#39;imaging TIRF.

Una comprensione più fondamentale di come le cellule T riconoscono antigeni richiede guardando al posto giusto, cioè, all&#39;interno della sinapsi immunologica formato tra la cellula T e APC. Qui, cinetica di legame molecolari non solo sono determinate dalle proprietà intrinseche biochimiche dei partner di interazione coinvolti ma dipendono in larga misura parametri cellulari, che includono forze cellulari, architettura membrana e interazioni laterali tra proteine ​​di membrana e vincoli geometrici specifici sinapsi 3. Approcci biochimici sono limitati in potere risolvente quanto richiedono l&#39;interruzione di almeno una delle membrane sinaptiche coinvolte. Per questo motivo una metodologia di imaging basato FRET-è stato sviluppato per monitorare vincolante del TCR di pMHCs antigeniche 2. Qui le cellule T sono decorati con un ricombinante e il sito-specifico etichettati TCRβ-reattiva singola catena frammento di anticorpo (SCF V) e confrontati con il piano<html> ar bistrati di vetro supportato lipidi (SLB), che ospitano MHC di classe II molecole caricate con un peptide antigenico fluorescente, molecole costimolatorie e proteine ​​di adesione. Synaptic vincolante tra dye-marcato TCR e tingere marcati risultati pMHC in FRET, che possono essere monitorati su una massa e livello di singola molecola per fluorescenza a riflessione totale interna (TIRF) microscopia. In questo articolo viene spiegato in dettaglio come utilizzare SLB per saggiare le sinapsi delle cellule T, verificare la loro integrità attraverso un cellule T saggio di calcio-flux funzionale, condotta FRET misurazioni in massa e con sensibilità singola molecola, e analizzare i dati acquisiti. Le raccomandazioni sono offerti per la produzione di proteine ​​adeguatamente conformati necessarie per doppio strato funzionalizzazione. Per informazioni più specifiche per quanto riguarda la formazione di doppio strato e l&#39;installazione di un microscopio TIRF adatto prega di fare riferimento a un accesso pubblico JoVE aggiuntivo di pubblicazione pubblicato back to back 4. tenda &quot;&gt; Natura di SLB SLB Functionalizable possono essere facilmente generati dalle vescicole unilamellari (SUV) che contengono le due lipidi 1-palmitoil-2-oleoyl-sn-gylcero-3-fosfocolina (breve: POPC, 90-99%) e sn 1,2-dioleoyl- - glycero-3 - {[N (5-ammino-1-carbossipentil) iminodiacetico acido] succinil} (breve: DGS NTA-Ni, 1-10%). SUV sparsi su vetrini puliti per formare una contigua planare doppio strato 4. DGS-NTA-Ni serve ad ancorare le proteine ​​polyhistidine-tag tramite complesso-formazione polyhistidine mediata con il sintetico NTA-Ni-gruppo contenente testa (Figura 1A). Per stabile associazione uno tipicamente sostituisce il dominio transmembrana e la coda citoplasmatica nativo della proteina di adesione ICAM-1 e la molecola di costimolazione B7-1 con un tag contenente dodici istidine (ICAM-1-12H, -12H B7-1) (Figura 1B) . La classe II molecola IE k peptide-caricato contiene due catena polipeptidica membrana-embedded (α e β)S. I transmembrana / domini citoplasmatici di entrambe le catene devono essere sostituiti con un tag contenente sei istidine ogni (IE k α β 6H 6H o IE k -2x6H). In alternativa, estendendo la α-catena con dodici istidine e lasciando il dominio extracellulare del β-chain untagged (dando luogo a IE k α β 12H 0H o IE k -12H) dà luogo a risultati soddisfacenti (Figura 1B). Etichettatura site-specific di pMHCs E &#39;importante per etichettare il pMHC stechiometricamente e sito-specifico per essere in grado di convertire i rendimenti misurati FRET in vincolante equilibrio costanti significative. Ciò può essere ottenuto mediante l&#39;etichettatura chimica di un peptide sintetico che viene caricata nella fessura-peptide di legame di istidina-marcato ricombinante MHC di classe II molecole 2,5. Il peptide comprende tutti i residui del epitopo T-cellulare come well come una breve C-terminale linker (GGS), seguita da cisteina (ad esempio nel falena citocromo c (MCC) peptide ANERADLIAYLKQATK- GTECH, il linker è segnato in grassetto). Questo cisteina viene utilizzato per etichettare il peptide stechiometricamente con l&#39;uso di derivati ​​maleimide-dye. A questo punto particolare attenzione dovrebbe essere dedicata alla verifica dye accoppiamento quantitativa al peptide-cisteina contenenti. HPLC-purificazione della addotto peptide-dye è raccomandata e deve essere seguita da spettrometria di massa Elettrospray. Eventuali masse registrate corrispondenti al reagente peptide (senza tintura) riflettono l&#39;etichettatura incompleta. Se questo è vero, il peptide-HPLC purificato deve essere sottoposto a turni consecutivi di colorante etichettatura fino a quando l&#39;etichettatura è considerata quantitativa. Si noti che la spettroscopia di massa MALDI-TOF deve essere evitata in quanto questo metodo comporta la radiazione laser per il campione di ionizzazione. Questo trattamento disintegra fluorofori sensibili collegate prima messa peptide viene letto e quindi underrepre<html> gradi senta di dye-coniugazione. Etichettatura indiretta ma site-specific di TCR cellule legato con l&#39;utilizzo di monovalente singola catena frammenti F V E &#39;ancora difficile da collegare tinture per cellulare proteine ​​di superficie associato di cellule viventi in modo site-specific. Per superare questo ostacolo per TCR-superficie esposta, una versione monovalente singola catena (SCF V) dai geni del TCRβ -reactive anticorpo monoclonale H57-197 2 è stato costruito. La struttura cristallina di questo anticorpo in complesso con il TCR permette di progettare razionalmente una versione, in cui un residuo di serina in prossimità del C-terminale del peptide associato MHC (cui è collegato il corrispondente partner di tintura FRET) è sostituito con un residuo di cisteina. Questo mutante cisteina serve poi come accettore per tinture coniugazione (Figura 2). Metodologie di registrare FRET nt &quot;&gt; valori FRET Bulk sono più adatti a verificare il rapporto tra scelte distanze inter-dye e FRET efficienza misurati in questo TCR-pMHC sistema 2 vincolante. Inoltre, le misure di FRET rinfusa rivelano differenze qualitative e quantitative in sinaptiche affinità TCR-pMHC ( vedere di seguito e la sezione protocollo 3.2). Vari approcci per quantificare l&#39;efficienza FRET sono stati introdotti nella letteratura 6. In questo articolo viene registrata tramite FRET (a) recupero del donatore dopo accettore candeggio, e via (b) sensibilizzati FRET emissione accettante. Il primo metodo (a) richiede l&#39;uso di un accettore FRET facilmente fotodecolorate, e un donatore, che è piuttosto fotostabile. Inoltre, è importante garantire che l&#39;accettore fotodecolorate non è più in grado di tempra fluorescenza del donatore. Come lo stesso canale di rilevamento (donatore) è usato per la quantificazione, senza fattori di correzione di und senza aberrazioni cromatiche devono essere considerati, che rende questa metodologia semplice ed affidabile. Tuttavia, le misure quantitative non possono essere ripetuti nello stesso punto del campione e le variazioni di FRET non possono essere registrati nel corso del tempo. Per evitare effetti causati dalla diffusione molecolare o motilità cellulare un passo sbiancamento veloce dovrebbe mirare per, che riduce al minimo il tempo che passa tra il primo donatore FRET (prima accettore sbiancamento) e la seconda acquisizione immagine FRET donatore (dopo FRET accettore candeggio). Si raccomanda di utilizzare una potente fonte di luce laser del FRET accettore di eccitazione lunghezza d&#39;onda al fine di minimizzare illuminazione e sbiancanti volte. Al contrario, nel metodo di misura sensibilizzata emissione FRET (b) il donatore FRET è eccitato e l&#39;emissione del accettore FRET è osservata nel canale FRET accettore. Le variazioni di segnale accettore FRET possono essere registrate nel tempo, ma di emissione del donatore FRET nel canale accettore rosso-spostato (termed bleedthrough) e FRET accettore cross-eccitazione tramite eccitazione del donatore devono essere determinati con precisione e sottratto dal canale accettore FRET registrato. Per questo i corrispondenti FRET donatore e ti agiti immagini accettore devono essere spazialmente allineati. Rilevamento di singola molecola (sm) FRET eventi Con l&#39;uso di laser come sorgente di eccitazione, una macchina fotografica sensibile e microscopia TIRF rumore attenuato la fluorescenza di fluorofori singoli sia facilmente rintracciabile nel tempo. Simile è vero per la rilevazione di eventi smFRET intermolecolari. Tuttavia, le complicanze possono essere causati da bleedthrough donatore FRET e cross-eccitazione del accettore FRET, e, quindi, grande attenzione deve essere presa durante la regolazione delle densità fluoroforo nell&#39;esperimento smFRET. Nel protocollo di seguito (sezione del protocollo 4) il TCR è stato scelto come FRET donatore in alta abbondanza e pMHC come accettore FRET in condizioni di scarsa abbondanza. Per attenuare FRET donatore bleedthrough sufficientemente, decorare 10-30% dei TCR con SCF fluorescenti V e 90-70% dei TCR con SCF non fluorescente V. Qui il canale accettore FRET è stato scelto come canale di singola molecola, perché è confocale con la singola molecola FRET canale. Questo aiuta ad allineare eventi smFRET con singola molecola FRET accettori, che è alla base della convalida smFRET. Estrazione off-tariffe sinaptiche attraverso misure smFRET Photobleaching sia FRET donatore e accettore FRET devono essere contabilizzate quando si estrae l&#39;emivita di interazioni di singola molecola FRET tracce. Il numero di FRET-segnali osservabili all&#39;inizio del loro aspetto come singola coppia donatore-accettore N (0) si riduce nel tempo sia unbinding del photobleaching complesso e del recettore-ligando. Il numero di sopravvivere complessi in un dato momento N (t) può essere matematicamente espresso come segue: Nel termine photobleaching exp (-t / τ candeggina) il tempo t è descritta dal prodotto del numero di osservazioni n e il tempo t illuminazione malato a causa della, modalità di osservazione discreta non continuo (cioè, sbiancamento si verifica solo durante illuminazione ). All&#39;interno exp- cinetica termine (t / τ off) il tempo t è il prodotto del numero di osservazioni e n t ritardo per una singola osservazione FRET (cioè, unbinding cinetica accade continuamente). Equazione 1 può essere espresso come: <img alt="Equazione 2" src="/files/ftp_upload/53157/53157eq2.jpg" /> Il τ termine candeggina / τ ill describes il numero di osservazioni finché non si verifica sbianca ed è definito come il valore atteso &lt;n candeggiare&gt; della sua funzione esponenziale. Equazione 2 può essere semplificata come segue: <img alt="Equazione 3" src="/files/ftp_upload/53157/53157eq3.jpg" /> Il valore di aspettazione &lt;n (t ritardo)&gt; il numero di frame N (t) con osservabili FRET-eventi dopo il tempo t è determinata direttamente dall&#39;esperimento. Dipende dal tempo impostabile tra osservazioni (t lag) scelti per l&#39;esperimento ei valori sconosciute per τ off (l&#39;inverso del off-rate k off) e &lt;n candeggiare&gt;, il valore di aspettazione di numero di osservazioni prima che si verifichi lo sbiancamento . Pertanto, il calcolo del valore atteso &lt;n (t lag)&gt; per almeno due valori di t <sub&gt; ritardo permette la determinazione sperimentale di &lt;n candeggina&gt; e T si spegne. Estrazione valori sinaptici 2D-K D attraverso misurazioni basate FRET- Misurazione TCR occupazione una, vale a dire il rapporto tra TCR legati e TCR totale, è fondamentale per la determinazione dei valori sinaptiche 2D-K D. Secondo l&#39;equazione 4 questo termine è direttamente proporzionale alla misurata FRET cedere finché TCR serve come donatori FRET e pMHCs come accettori FRET. <img alt="Equazione 4" src="/files/ftp_upload/53157/53157eq4.jpg" /> con una capienza = TCR, C = fattore di conversione C è una costante che dipende dal sistema FRET e fluorofori utilizzati. Può essere determinato sperimentalmente come mostrato di seguito. A può essere convertito in un 2D-K D secondo l&#39;equazione 5 quando ildensità iniziale di ligandi TCR prima dell&#39;aggiunta di cellule T a doppio strato è noto. Questo è a causa della elevata mobilità delle proteine ​​SLB iscritti e anche perché SLB fornire un serbatoio quasi inesauribile di ligandi 2. <img alt="Equazione 5" src="/files/ftp_upload/53157/53157eq5.jpg" /> con [iniziale pMHC] = densità iniziale pMHC prima dell&#39;aggiunta di cellule T Con le equazioni 4 e 5 si può ora facilmente determinare il sinaptica 2D-K D tra TCR e pMHC. Questo è più affidabile fatto con le misure di FRET basati sul recupero dei donatori dopo accettore sbiancamento (vedi paragrafo 3.1 del protocollo). Tuttavia, per misurare C il rapporto tra l&#39;intensità FRET I Fret (corretto per lo sfondo, bleedthrough donatore FRET e FRET accettore cross-eccitazione) e TCR occupazione una deve essere determinato. Per questo, unoha bisogno di conoscere il rapporto R tra l&#39;intensità media di fluorescenza di fluorofori singoli TCR-associati FRET donatore (ad esempio Cy3 o AF555) sm Mi struggo donatore e l&#39;intensità media di singola molecola Fret eventi sm I tasto. R dipende dal sistema FRET in questione, e filtri di emissione telecamera utilizzato per il rilevamento della fluorescenza. Il TCR occupazione a può poi essere determinata direttamente secondo l&#39;equazione 6. <img alt="Equazione 6" src="/files/ftp_upload/53157/53157eq6.jpg" /> R = sm Mi struggo donatore / sm I Fret R è stato determinato come 1,45 per il sistema H57 scFv- Cy3 / pMHC-Cy5 porta a: a = massa Mi struggo / bulk I TCR-Cy3 • 1.45 Il rapporto tra l&#39;occupazione e TCR un rendimento FRET può essere determinata FRET donatore recuperarey dopo accettore sbiancamento. Per questo entrambi i parametri sono tracciati uno contro l&#39;altro per un numero TCR microcluster come mostrato nella Figura 4A .La pendenza della regressione lineare indica il fattore di conversione C (dall&#39;equazione 4). Come mostrato nella Figura 4A, C equivale per (a) V H57 scf - Cy3 / Cy5 pMHC-sistema FRET e (b) la configurazione del sistema microscopio applicato a 1.995. Il TCR occupazione a può essere facilmente dedurre come segue: Occupazione TCR a = FRET cedere • 1.995

<table><tbody><tr><td>LB-media</td><td>Fisher Scientific</td><td>10000713</td><td>l'espressione batterica</td></tr><tr><td>Sf900 II</td><td>Life Technologies</td><td>10227402</td><td>terreni cellulari di insetti per la produzione di virus baculo</td></tr><tr><td>Insect-XPRESS con L-glutammina (Lonza)</td><td>Fisher Scientific</td><td>10564038</td><td>terreni cellulari di insetti per l'espressione del virus baculo</td></tr><tr><td>cellule Sf9</td><td>Life Technologies</td><td>11496-015</td><td>cellule per virus produzione ed espansione</td></tr><tr><td>High Five Cells</td><td>Life Technologies</td> Cellule <td>B855-02</td><td>per l'espressione della poteina</td></tr><tr><td>LB-media</td><td>Fisher Scientific 10000713</td><td></td><td>l'espressione batterica</td></tr><tr><td>Sistema Centramato</td><td>Concentrazione proteica Pall</td><td></td><td></td> da grandi volumi</tr><tr><td>Cutoff Cassetta Centramato 10kDa Centraggio</td> Concentrazione proteica <td>Pall</td><td>OS010T12</td><td>da grandi volumi</td></tr><tr><td>Unità filtranti centrifughe Amicon Ultra-15</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC900308</td><td>concentrazione proteica</td></tr><tr><td>Unità filtranti centrifughe Amicon Ultra-4 EMD</td><td>Millipore</td><td>UFC800308</td><td>concentrazione proteica</td></tr><tr><td>Modello di cella di ultrafiltrazione agitata Amicon 200 mL</td><td>EMD Millipore</td><td>5123</td><td>concentrazione proteica</td></tr><tr><td>&Auml; kta puro 25L</td><td>GE Healthcare</td><td>29-0182-24</td><td>purificazione delle proteine</td></tr><tr><td>Superdex 200 10/300 GL</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5175-01</td><td>purificazione delle proteine</td></tr><tr><td>Superdex 75 10/300 GL</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5174-01</td><td>purificazione delle proteine</td></tr><tr><td>Mono Q 5/50GL</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5166-01</td><td>purificazione delle proteine</td></tr><tr><td>Ni Sepharose 6 Fast Flow</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5318-01</td><td>purificazione di proteine</td></tr><tr><td>Colonna Tricorn 10/20 GE</td><td>Healthcare</td><td>28-4064-13</td><td>Purificazione di proteine</td></tr><tr><td>Sistema Gilson HPLC</td><td>Purificazione Gilson</td><td></td><td>di peptidi accoppiati a fluorocromo</td></tr><tr><td>Pursuit XRs C18, 5 e micro; dimensione delle particelle m, dimensione della colonna 21,2*250 mm</td><td>Purificazione A6000250X212 Agilent</td><td></td> dei <td>peptidi accoppiati al fluorocromo</td></tr><tr><td>Pursuit XRs C18, 5 e micro; m dimensione delle particelle, 21,2*50 mm dimensione della colonna</td><td>Agilent</td><td>A6000050G212</td><td>purificazione dei peptidi accoppiati al fluorocromo</td></tr><tr><td>Colonna Tricorn 10/20&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>28-4064-13</td><td>purificazione delle proteine</td></tr><tr><td>Sistema HPLC Gilson</td> Purificazione <td>Gilson</td><td></td><td>di peptidi accoppiati a fluorocromo</td></tr><tr><td>Pursuit XRs C18, 5 e micro; dimensione delle particelle m, dimensione della colonna 21,2*250 mm</td><td>Purificazione A6000250X212 Agilent</td><td></td> dei <td>peptidi accoppiati al fluorocromo</td></tr><tr><td>Pursuit XRs C18, 5 e micro; dimensione delle particelle m, dimensione della colonna 21,2*50 mm</td><td>Purificazione A6000050G212 Agilent</td><td></td> di <td>peptidi accoppiati a fluorocromo</td></tr><tr><td>Cy3 maleimmide</td><td>GE Healthcare</td><td>PA23031</td><td>marcatura di proteine sito-specifiche tramite cisteine mutanti non spaiate</td></tr><tr><td>Cy5 maleimmide</td><td>GE Healthcare</td><td>PA25031</td><td>marcatura di proteine sito-specifiche tramite cisteine mutanti spaiate</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 C2 Maleimide</td><td>Life Technologies</td><td>A-20346</td><td>marcatura di proteine sito-specifiche tramite cisteine mutanti spaiate</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 C2 Maleimide</td><td>Life Technologies</td><td>A-20347</td><td>marcatura di proteine sito-specifiche tramite cisteine mutanti spaiate</td></tr><tr><td>Fura-2, AM, colorante cellulare Life</td><td>Technologies</td><td>F-1221</td><td>colorante sensibile al calcio per la marcatura cellulare</td></tr><tr><td>dimetilsolfossido</td><td>Sigma Aldrich</td><td>151874</td><td>per la dissoluzione di fura-2 am</td></tr><tr><td>Soluzione salina bilanciata di Hank più tampone per imaging di calcio/magnesio</td><td>Fisher Scientific</td><td>10225362</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-136</td><td></td></tr><tr><td>Siero bovino Albumina in polvere liofilizzata</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2153</td><td>integratore per tampone per imaging</td></tr><tr><td>14-4-4S anticorpo</td><td>affimetrix eBioscience</td><td>14-5980-81</td><td>anticorpo bloccante per H2-I-Ek (riconosciuto da 5c.c7, 2B4 e AND TCR)</td></tr><tr><td>5 ml di provetta in polipropilene a fondo tondo</td><td>Becton Dickinson</td><td>FALCON 352063</td><td></td></tr><tr><td>0,22 &mu; m Unità di filtraggio centrifugo Ultrafree-MC</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC30GV0S</td><td></td></tr><tr><td>Filtro per siringa 0,2&micro; m</td><td>Microsfere Millipore</td><td>GVWP04700</td><td></td></tr><tr><td>TetraSpeck, 0,1 & micro; m, fluorescente blu/verde/arancione/rosso scuro</td><td>Life technologies</td><td>T-7279</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio per misure di calcio basate su fura-2&nbsp;</td><td>Microscopio LEICA</td><td>DMI4000B</td><td></td></tr><tr><td>per misure FRET (a singola molecola)</td><td>LEICA/ZEISS/NIKON/OLYMPUS</td><td>per i dettagli si prega di fare riferimento al contributo parallelo di JoVE di Axmann et al.</td><td></td></tr><tr>bistrati <td></td><td>lipidici supportati planari</td><td>per i dettagli si prega di fare riferimento al contributo parallelo di JoVE di Axmann et al.</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640, con L-Glutammina</td><td>Life Technologies</td><td>11554416</td> Acido non essenziale <td>per terreni con cellule T</td></tr><tr><td>100X</td><td>Hyclone</td><td>SH30238.01</td><td>Integratore per terreni con cellule T</td></tr><tr><td>penicillina/streptomicina/L-glutammina 100x</td><td>Life Technologies</td><td>12000226</td><td>Integratore per terreni con cellule T</td></tr><tr><td>2-mercaptoetanolo Sigma</td><td>Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>proteina ricombinante dell'interleuchina-2 di topo</td><td>BPS Bioscience</td><td>90185-B</td><td>Integratore di terreni di cellule T</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino di grado di ricerca</td><td>Hyclone</td><td>SV30160.03</td><td>Integratore di terreni di cellule</td></tr><tr><td>T Origine (programma di analisi)</td><td>OrigenLab</td><td>http://www.originlab.com/</td> <td>adattamento non lineare di due parametri (tauoff, [ntlag])</td></tr></tbody></table>

misurazione tcr-pmhc binding<em&gt; in situ</em&gt; utilizzando un microscopio saggio basato fret-

Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay

Le cellule T sono notevolmente specifiche ed efficaci quando riconoscono gli antigeni sotto forma di peptidi incorporati nelle molecole MHC (pMHC) sulla superficie delle cellule presentanti l'antigene (APC). Questo nonostante i recettori dell'antigene delle cellule T (TCR) esercitino solitamente un'affinità moderata (intervallo μM) per l'antigene quando il legame viene misurato in vitro1. In considerazione dei parametri molecolari e cellulari che contribuiscono alla sensibilità all'antigene delle cellule T, è stata sviluppata una metodologia basata sulla microscopia come mezzo per monitorare il legame TCR-pMHC in situ, poiché avviene all'interno della sinapsi di una cellula T viva e di un doppio strato lipidico planare (SLB) artificiale e funzionalizzato supportato da vetro, che imita la membrana cellulare di una cellula presentante l'antigene (APC) 2. Le misurazioni si basano sul trasferimento di energia di risonanza di Förster (FRET) tra un colorante fluorescente spostato verso il blu e il rosso attaccato al TCR e al pMHC. Poiché l'efficienza di FRET è inversamente proporzionale alla sesta potenza della distanza tra i coloranti, è possibile utilizzare i segnali FRET per visualizzare il legame sinaptico TCR-pMHC. La sensibilità dell'approccio microscopico supporta il rilevamento di eventi FRET a singola molecola. Ciò consente di determinare l'affinità e l'off-rate delle interazioni sinaptiche TCR-pMHC e, a sua volta, di interpolare l'on-rate di legame. Saggi analoghi potrebbero essere applicati per misurare altre interazioni recettore-ligando nel loro ambiente nativo.

La registrazione di calcio intracellulare attraverso il fura-2 calcio colorante nonché l&#39;analisi cellulare successiva per verificare la potenza stimolatorio e quindi la funzionalità di SLB sono mostrati in Figura 4. Come risulta evidente, i livelli di calcio aumentano in cellule T (espressa come normalizzata fura-2 340nm / 380nm rapporto con basale essere 1) immediatamente non appena si sistemano sulle SLB stimolanti. I livelli di calcio ritornano ai livelli basali poco dopo l&#39;aggiunta di un anticorpo che blocca pMHCs da TCR impegno e che termina l&#39;attivazione delle cellule T. Figura 6 illustra un tipico esperimento coinvolge recupero donatore accettore FRET dopo candeggio, che viene impiegato per misurare la resa FRET e che serve per calcolare i valori 2D-K D (mostrato in Figura 4). Si prega di notare l&#39;aumento di intensità dei donatori FRET, che rappresenta TCR etichettato via AF555, dopo una rapida e completa ablazione della FRET unSpecie cceptor (qui: AF647 associato con pMHCs). Inoltre è evidente il forte riduzione canale FRET, cioè, il canale FRET-accettore FRET sotto eccitazione donatore, dopo FRET accettore candeggio. Il segnale restante appena visibile corrisponde a preoccuparsi bleedthrough donatore. I rendimenti FRET all&#39;interno dei singoli microcluster TCR o intere sinapsi sono calcolati sulla base dei valori di intensità misurati indicati (Figura 6B). La figura 7 illustra una traiettoria e lasso di tempo di una singola molecola FRET evento visibili in due tempi. Come indicato sopra nell&#39;introduzione tale comportamento è causato da entrambi decadimento sinaptica TCR-pMHC vincolanti e photobleaching. Per discriminare tra questi due contributi, i tempi di acquisizione sperimentali devono essere variato in durata: mentre fotoscolorimento rimane costante, le variazioni di lunghezza FRET traiettoria evento sono causati solo dalla cinetica di legame. Una quantificazione di tracelengths, w<html> hich costituisce la base per il calcolo di fuori dei prezzi e candeggio mostrati nella Figura 7, sono forniti nelle tabelle da 1 a 3. Determinazione del 2D-K D s richiede la registrazione di massa FRET rendimenti per FRET-donatori TCR etichettati. Con l&#39;uso della costante C sperimentalmente dedotta (figura 4), ​​una resa FRET misurato per un microcluster TCR o un&#39;intera sinapsi può essere convertito nel TCR occupazione a, cioè il rapporto di TCR pMHC-impegnati e totali (Figura 4C) . Con note densità pMHC presenti sul SLB prima dell&#39;aggiunta della cellula T, a valori possono essere utilizzati per determinare i valori 2D-K D (Figura 4D sinaptiche). On-tassi possono essere calcolate con la legge di azione di massa (2D-k on = 2D-k off / 2D-K D) dal sinaptica determinato off-rate e valori 2D-KD. 1 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 53157 / 53157fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1. schema schematica del sistema piano-oggetti sostenuto doppio strato lipidico (SLB). (A) SLB sono composte da POPC (90-99%) e il lipide sintetico DGS Ni-NTA (1-10%) e si formano spontaneamente quando le superfici di vetro pulito pagano con piccole vescicole unilamellari (SUV) costituito da lipidi corrispondenti. (B) Una volta formato, tali SLB possono essere funzionalizzati con solubili porzioni polyhistidine-tagged extracellulari derivati ​​da pMHCs, costimolatorie B7-1 proteine ​​e ICAM-1 proteine ​​di adesione, per servire da APC per le cellule T. Per ulteriori informazioni sulla preparazione SLB fare riferimento a Axmann et al. 4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53157/53157fig2.jpg" /> Figu<html> re 2. Förster Resonance Energy Transfer basato test per quantificare TCR-pMHC binding in situ. (A) Struttura composita di un TCR complessata con un frammento di catena singola H57 impegnare un pMHC illustra l&#39;approccio basato FRET-descritto. Si noti la breve distanza di circa 41 bis che separa i due fluorofori corrispondenti sottoposti FRET. Siti accettori per fluoroforo maleimmidi sono indicate in verde e rosso. (B) Il principio di rilevare interazioni TCR-pMHC in situ è illustrata. Solo SCF V -decorated TCR e pMHCs (qui k IE), che formano complessi specifici, dar luogo ad un segnale FRET misurabile. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig2large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> &quot;/&gt; Figura 3. cromatogrammi della finale fase di filtrazione gel dando luogo a monomeriche SCF V s e peptide-caricato IE k -2x6H molecole. Assi X rappresentano il volume di ritenzione in ml, assi Y indicano assorbanza a 280 nm in unità arbitrarie (AU) . (A) H57 SCF V sito-specifico marcato con Alexa Fluor 555 maleimmide è stato sottoposto a cromatografia S75 separare colorante non reagito dalla proteina (fase 1.2.5). Frazioni corrispondenti a intervallo di ritenzione 14 a15 ml (linee tratteggiate) rappresentano etichettati monomero H57 SCF V. (B) IE k molecole -2x6H complessati con il titolare ANP-spazio peptide UV-cleavable era stato-UV irradiati, incubate con il sito-specifico Alex 647 maleimmide peptide marcato ed infine sottoposto a cromatografia S200 per separare le proteine ​​peptide libero (passo 1.1.2.4). L&#39;intervallo tra le linee tratteggiate contiene opportunamente piegato e pMHCs monomeriche. (A, B) </sTrong&gt; 0,7 ml campione è stato applicato alla colonna all&#39;inizio del rum (0 ml punto). Frazioni raccolte sono state concentrate. Il rapporto proteine-to-dye è stata determinata photospectrometry prima dialisi contro PBS / 50% glicerolo (per la conservazione a -20 °). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53157/53157fig4.jpg" /> Figura 4. Determinazione 2D-K D s e 2D-k a s. (A) La correlazione tra il rendimento FRET sulla base del recupero dopo donatore accettore candeggio e occupazione TCR è stata misurata sperimentalmente. Occupazione TCR può essere determinato per le singole microcluster TCR come spiegato nel paragrafo 4.2. Una misura lineare di visualizzazione dei dati dalla linea, la pendenza che è uguale al rapporto tra C TCRoccupazione e la resa FRET. C è una costante specifica per il sistema FRET e fluorofori (Cy3 e Cy5 qui) impiegati. In questo esempio ha prodotto 1.988. (B) FRET dati di rendimento sono stati determinati per le singole microcluster TCR (N = 187, temperatura = 24 ° C) attraverso il recupero donatore accettore sbiancamento. Numeri inferiori barre dell&#39;istogramma indicano il limite superiore all&#39;interno dell&#39;intervallo. (C) Conversione dei dati mostrati in (B) moltiplicando misurata FRET rese con la costante C determinato in (A). Numeri sotto barre indicano il limite superiore entro l&#39;intervallo. (D) Istogramma (semi-logaritmica, base = 4) raffigurante la distribuzione di 2D-K D s misurato per i singoli microcluster TCR. La mediana 2D-K D è indicato in blu. Numeri sotto barre indicano il limite superiore all&#39;interno dell&#39;intervallo. (E) L&#39;istogramma mostrato in (D) è stato convertito intoa 2D-k su -histogram (semi-logaritmica, base = 4) che impiega il k sinaptica off per 24 ° C (0,41 s -1). La mediana determinato 2D-k sul valore è indicato in blu. I dati sono stati originariamente pubblicati in Huppa et al. 2 e sono visualizzati qui in un nuovo formato. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig4large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/53157/53157fig5.jpg" /> Figura 5. validazione funzionale di SLB impiegato per la stimolazione delle cellule T e di imaging. (A) TCR-transgenici esplosioni cellule T caricate con fura-2 sono stati confrontati con stimolante SLB ospitare pMHCs antigeniche, ICAM-1 e B-7. Cellular emissione fura-2 eccitato a 340 nm e 380 nm così come le immagini sono state registrate DIC. Come indicato, i valori del rapporto di intensità di emissione eccitate a 340 e 380 nm sono mostrati nel pannello di destra. L&#39;aggiunta di pMHC anticorpi bloccanti 14 min nel periodo sperimentale si conclude con una diminuzione dei livelli intracellulari di calcio paragonabile a quella delle cellule T a riposo. (B) Un profilo tipico temporale di rapporti medi Fura-2 in T-cellule contatto SLB stimolazione è caratterizzata da un primo aumento del calcio intracellulare, che è da 2 a 4 volte superiore rispetto a quella delle cellule T non attivati ​​o T-cellule prive dell&#39;antigene dopo blocco mediata da anticorpi. Cerchi verdi indicano i punti temporali illustrati in (A). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig5large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/53157/53157fig6.jpg" /> Figura 6. Bulk FRET rendimenti, come misurato attraverso il recupero dei donatori FRET dopo FRET accettatore sbiancamento. <strong&gt; (A) si riporta un esempio di una tipica FRET misurazione sinaptica. Come è indicato sulla sinistra e sulla sommità di una serie di immagini è stato acquisito con l&#39;uso di un divisore di fascio di emissione dando origine ad un donatore FRET e un canale FRET accettore (per informazioni più dettagliate sul beam splitter riferiscono Axmann et al 4). La linea mostrata nell&#39;immagine DIC sinistra indica il limite della sinapsi T-cellule. Si noti la perdita di intensità all&#39;interno del canale accettore FRET così è l&#39;aumento di intensità nel canale donatore FRET dopo FRET accettore sbianca (fase 4). (B) FRET efficienza può essere quantificato come indicato per singole regioni sinaptici o per interi sinapsi. Per l&#39;ispezione, le immagini prima e dopo FRET accettatore di sbiancamento sono riportati con l&#39;uso di due tabelle di ricerca (LUT, verde e fisica). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig6large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> </p&gt; <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/53157/53157fig7.jpg" /> Figura 7. singola molecola FRET eventi appaiono e scompaiono passi insingle e sono perfettamente allineati con un unico fluoroforo accettore FRET. Viene mostrato il lasso di tempo di singola molecola evento FRET. Immagini sono state acquisite utilizzando una fotocamera retroilluminato EMCCD. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig7large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/53157/53157fig8.jpg" /> Figura 8. Determinazione τ off = 1 / k off da traiettorie smFRET misurati. (A) Le somme cumulative normalizzati di segnali FRET osservabili (derivati ​​da H57 SCF V -AF555 decorate 5c.c7 TCR esplosioni transgenici cellule T che riconosce IE &lt;sup&gt; k / K3-AF647 a 24 ° C) per quattro differenti ritardi temporali (42 msec, 490 msec, 1.007 msec, 1,989 msec) sono stati tracciati in funzione del numero totale di osservazioni. Funzioni in forma mono-esponenziale danno luogo a corrispondenti l&#39;inverso negativo dei valori di aspettativa &lt;n (t ritardo)&gt;. (B) valori di aspettazione sono stati tracciati contro i ritardi t lag e montati utilizzando l&#39;equazione &lt;n (t ritardo)&gt; = τ off / {(t off / &lt;n candeggina&gt;) + t lag} cedere τ off e &lt;n candeggina&gt;. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig8large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

Questo manoscritto descrive come condurre saggi basati su (singola molecola) basati sul trasferimento di energia di risonanza di Förster (FRET) per misurare le dinamiche di legame tra il recettore dell'antigene delle cellule T (TCR) e le molecole MHC caricate con peptidi antigenici mentre si verificano all'interno della sinapsi immunologica di una cellula T a contatto con un doppio strato lipidico supportato planare funzionalizzato.

Misurazione TCR-pMHC Binding<em&gt; In Situ</em&gt; Utilizzando un microscopio saggio basato FRET-

T-cells are remarkably specific and effective when recognizing antigens in the form of peptides embedded in MHC molecules (pMHC) on the surface of Antigen ...

In questo video, mostreremo come misurare la cinetica tra il recettore dell'antigene delle cellule T e il complesso maggiore di istocompatibilità peptidico carico, o PMHC, in C due, all'interno della sinapsi immunologica tra una cellula T e un bilayer lipidico supportato planare. Illustreremo brevemente gli aspetti fondamentali della produzione proteica e la verifica dell'integrità funzionale del bilayer lipidico mediante misurazioni del flusso di calcio. Per informazioni più dettagliate su come preparare il bilayer lipidico e su come configurare un microscopio a fluorescenza a singola molecola, si prega di consultare il nostro contributo parallelo nel Journal of Visualized Experiments. Spiegheremo quindi in dettaglio come eseguire e analizzare misurazioni di trasferimento di energia per risonanza di Förster, in bug e a livello di singola molecola.Per dedurre la cinetica del legame sinaptico tra il recettore per le cellule T e il PMHC, al fine di spiegare la strategia basata sulla risonanza di trasferimento di energia di Förster (FRET) utilizzata nel nostro approccio generale, partiamo dalla struttura cristallina del recettore per le cellule T, o TCR, mostrato in blu, mentre si lega al suo antigene, la molecola MHC carica di peptide, o PMHC, mostrata in giallo e rosso. Introduciamo inoltre un frammento a catena singola dei domini variabili di un anticorpo reattivo verso la catena beta del recettore per le cellule T, denominato age 57. Per effettuare misurazioni quantitative basate sul FRET, è fondamentale etichettare entrambi i componenti in modo specifico per sito: il donatore FRET, nel nostro caso il frammento a catena singola, e l'accettore FRET, il PMHC.Questo è realizzabile per proteine ricombinanti attraverso l'introduzione di una cisteina non appaiata, che può quindi essere legata covalentemente al fluorocromo coniugato con la mite. Come mostrato, si lega il donatore Alexa Fluor 555 o il lato tre al frammento a catena singola e l'accettore FRET. Alexa Fluor 647 o SI cinque al termine C del peptide legato all'MHC.La distanza Indy, come mostrata in questa struttura composita, è di circa 41 angström, ancora minore rispetto al primo raggio, ovvero la distanza a cui si verifica il trasferimento di energia massimo al 50% tra i due coloranti. Nei nostri esperimenti, utilizziamo un bilayer lipidico supportato su vetro piano come cellule presentanti l'antigene surrogate. Questi sono funzionalizzati con PMXC, la molecola co-stimolatrice B sette uno e la molecola di adesione I chem uno.In questo modo, l'acquisizione di immagini può essere eseguita in modalità fluorescenza a riflessione totale interna, che illumina il fluorocromo in prossimità dell'interfaccia, riducendo sostanzialmente il fondo cellulare. Il trasferimento di risonanza energetica (FRET) è rilevabile soltanto quando i frammenti moncatena marcati di TCR si legano alle PM-HCS incorporate nel layer. Ciò ci consente di visualizzare il legame T-C-R-P-M-H-C e quindi di calcolare la cinetica di legame in un complesso di istogeni Tatticamente ripiegato correttamente.Le porzioni extracellulari di P seven one e I chem one vengono purificate dai supernatanti di colture cellulari di insetti infettate con il corrispondente virus BUC. La purificazione viene eseguita in tre passaggi, iniziando con una cromatografia per affinità al nichel anti aros, seguita da uno scambio ionico e da una cromatografia ad esclusione molecolare. Gli eterodimeri con marcatore istologico del Complesso Maggiore di Istocompatibilità di classe due vengono espressi in e coli come corpi di inclusione e rinaturati in vitro a quattro gradi Celsius e in presenza di un peptide spaziatore, mediante diluizione rapida in un tampone redox.Il peptide spaziatore verrà successivamente scisso mediante esposizione alla luce UV. I complessi PMHC correttamente ripiegati vengono poi purificati e concentrati insieme al peptide spaziatore. Il peptide viene scisso e sostituito a pH 5,2 con il peptide fluorescente.Il prodotto finale è stato purificato per dimensione. Il frammento a catena singola viene espresso con una cisteina non appaiata come corpi di inclusione in E. coli, ripiegato in vitro mediante dialisi graduale e purificato per dimensione. Successivamente, viene marcato attraverso la cisteina non appaiata con un colorante coniugato a maleimide e nuovamente purificato per dimensione.Tutte le proteine ricombinanti vengono infine dializzate contro PBS contenente il 50% di glicerolo, concentrate a un milligrammo di proteina per millilitro e conservate a lungo termine a meno 20 gradi Celsius. Utilizzare il colorante rapportometrico URA due per misurare i livelli intracellulari di calcio nei linfociti T come metodo per verificare la potenza stimolatoria del lipid blay. Caricare il blast linfocitario T con l'estere URA 2:00 AM.Questo composto entra nelle cellule attraverso il suo gruppo AM, ma viene successivamente trattenuto all'interno grazie all'azione delle esterasi, che rimuovono la parte AM. Aggiungere fira 2:00 AM a circa 3 milioni di cellule T a una concentrazione finale di cinque micromoli per litro. Trasferire le cellule dalla piastra a 24 pozzetti a un nuovo tubo e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti.Lavare le cellule una volta in tampone di imaging contenente soluzione salina tamponata con Hank, calcio, magnesio e 1% di albumina. Per monitorare il calcio intracellulare, utilizzare un sistema microscopico invertito automatizzato dotato di capacità UV. Avviare il protocollo temporizzato e aggiungere meno di due cellule T caricate al bilayer lipidico funzionalizzato posizionato a fuoco sul palco del microscopio, acquisendo a intervalli di tempo regolari un'immagine DIC e due immagini fluorescenti eccitate con luce UV a 340 e 380 nanometri.Immediatamente dopo il contatto con il bilayer, le cellule T assumono livelli elevati di calcio, come rilevato dal rapporto URA due a 15 minuti dall'inizio dell'esperimento. Aggiungere un anticorpo bloccante alle cellule che saturi tutti gli antigeni PMHC. Di conseguenza, i livelli intracellulari di calcio diminuiscono fino a quelli dello stato non attivato, che successivamente serviranno come riferimento.Non appena i livelli dell'anticorpo bloccante diminuiscono fino a un valore che riflette lo stato non attivato, che normalizziamo a uno per le misurazioni FRET, le cellule T devono essere marcate con una sonda FRET costituita da un frammento singolo a catena singola reattivo verso il TCR per ogni esperimento, trasferire circa 1 milione di cellule in una provetta e centrifugarle a 400 ×g. Decantare il mezzo e rimuovere le gocce residue di mezzo. Asciugare le gocce rimaste sulle pareti interne con un tovagliolo di carta. Questo garantisce un volume di incubazione minimo di circa 30 microlitri, come menzionato in precedenza.Il probe FRET è conservato alla concentrazione di un milligrammo per millilitro e al 50% di glicerolo a meno 20 gradi Celsius. Viene marcato specificamente sul sito con Alexa, fluoro 5, 5 5, anche tre, a un rapporto proteina/anticorpo di uno a 0,3 microlitri del probe rispetto alle cellule. Agitare delicatamente il pellet più volte e incubare le cellule per 20 minuti sul ghiaccio.Lavare le cellule in tampone di imaging freddo. Ripetere questa procedura di lavaggio una volta. L'incubazione, la centrifugazione e il mantenimento a bassa temperatura garantiscono che le cellule T non internalizzino la sonda fluorescente durante l'esposizione.Questo comporterebbe un aumento della fluorescenza di fondo. Inoltre, le cellule T non perdono la sonda al freddo durante il lavaggio e il successivo stoccaggio, prima di posizionare la camera con bicella sullo scambiatore del palchetto del microscopio. Sostituire il PBS in successione con il buffer di imaging, evitando a tutti i costi l'esposizione della bicella all'aria, poiché ciò la distruggerebbe.Per ridurre il fondo cellulare, utilizziamo l'illuminazione in modalità TIRF. A tale scopo, posizioniamo il fascio di eccitazione a un angolo critico in corrispondenza del quale avviene la riflessione totale interna. Spegnere l'eccitazione, accendere la luce in campo chiaro e aggiungere la cellula T alla camera ltec, lasciandola aderire al bilayer lipidico.Accendere l'eccitazione e mettere a fuoco una illuminazione non in campo chiaro. La membrana cellulare viene osservata come un anello lungo l'asse ottico in ogni piano focale; nel campo chiaro, solo la membrana basale a contatto con il doppio strato è osservabile. I piani focali superiori non sono più eccitati e quindi non visibili.Il protocollo di temporizzazione inizia con gli impulsi di eccitazione rosso e verde per l'acquisizione di immagini di PMHC e TCR, seguiti da un impulso di sbiancamento rosso per eliminare l'accettore P-M-H-C-F. Un impulso verde per acquisire l'immagine del TCR dopo lo sbiancamento dell'accettore F fat, e un impulso rosso per verificare l'ablazione dell'accettore F vengono eseguiti su scala temporale sub-secondaria, con il ritardo più breve possibile tra il primo e il secondo impulso verde. Opzionalmente, un'immagine DIC può essere acquisita all'inizio; la separazione dell'immagine a due colori permette la rilevazione simultanea del donatore eccitato e del canale dell'accettore eccitato.L'eccitazione dell'accettore alimentato mostra l'accumulo di pMHC nella sinapsi delle cellule T. Questa immagine pre-bleaching verifica la presenza di pMCS e indica un legame già mediato dal TCR. Eccitazione. Il donatore alimentato genera immagini in entrambi i canali.Il segnale del canale donatore eccitato viene in parte ridotto in intensità a causa del trasferimento di energia nel canale accettore F. Il segnale del canale accettore FRET è composto dal passaggio diretto del donatore eccitato nel canale accettore FRET e dall'eccitazione incrociata dell'accettore FRET. In ogni caso, questa immagine non verrà utilizzata per l'analisi.Nel protocollo attuale, una rapida operazione di sbiancamento segue ed elimina tutti i fluorocromi accettori F. L'intensità dell'immagine del donatore F dopo lo sbiancamento accettabile del fret viene ora recuperata a livelli più elevati senza perdita di intensità nel canale fre.La seguente aspettativa dell'accettore FRET verifica lo sbiancamento completo dell'accettore F fat. Ingrandiamo la sinapsi per quantificare il recupero del donatore alimentato. Determinare l'intensità media dello sfondo come una costante indipendentemente dall'accettore fre.Bleccia fotochemica, quindi determinare l'intensità media della sinapsi e quella di un aggregato rappresentativo di TCR. Il rendimento FRET viene quindi calcolato normalizzando la differenza prima e dopo l'ablazione dell'accettore F. Nel nostro esempio, misuriamo il 16% FRET per l'intera sinapsi e il 26% FRET per l'aggregato rappresentativo.I rendimenti di FRET degli aggregati di TCR saranno successivamente convertiti in occupazioni del TCR, che permettono di ottenere dati a livello di singola molecola sulla costante di dissociazione sinaptica bidimensionale. Ci consentono di dedurre la cinetica dell'interazione sinaptica tra TCR e peptidi associati a MHC negli esperimenti di FRET a singola molecola. Utilizziamo gli stessi reagenti e la stessa strategia sperimentale adottata in precedenza.Tuttavia, per assicurare che stiamo effettivamente osservando l'interazione tra un singolo TCR e un singolo peptide MHC, scegliamo di soddisfare il seguente criterio. Un evento candidato per un singolo fre molecolare deve coincidere colloquialmente con la singola molecola accettore fre o donatore fre. Qui impieghiamo un singolo PMHC come molecola accettore fre per verificare la natura monoclonale dell'evento fre osservato, ma con il ragionamento opposto.L'utilizzo di accettori alimentati in pulsanti superiori e donatori Fred in pulsanti inferiori è certamente un'opzione. Di solito esponiamo le cellule T a contatto con un lipide stimolatorio blay con eccitazione a 514 e 647 nanometri; un'eccitazione sequenziale e ripetuta del donatore e dell'accettore, con un ritardo minimo di un millisecondo, è seguita da un tempo di attesa che può essere variato in base alle esigenze dell'esperimento.Per ottenere un segnale fluorescente sufficientemente intenso da rilevare singoli die entro millisecondi dall'eccitazione, è necessario applicare densità di potenza di eccitazione elevate, comprese tra uno e cinque chilowatt per centimetro quadrato. A causa del fotoblesamento, il numero di molecole di accettore PMHC FRET visibili diminuisce rapidamente fino a un livello in cui il singolo fluorocromo accettore FRET diventa distinguibile in un bilayer contenente 30 o più PMCS marcati per micrometro quadrato. Qui viene mostrato un esempio con un ritardo temporale complessivo di 42 millisecondi.Un singolo evento di FRET, indicato con un cerchio rosso, diventa visibile nel secondo e nel terzo punto temporale. Esso co-localizza con una singola molecola di S5, indicata con un cerchio verde. In questo esempio, l'evento di FRET osservabile ha una durata di due tracce; raccogliere ulteriori tracce di FRET a singola molecola come mostrato nella tabella in un totale di 128 tracce.Successivamente, calcolare la somma cumulativa complementare delle tracce come mostrato dai numeri verdi e normalizzarle come mostrato nel grafico dei valori normalizzati, quindi adattarle con una funzione esponenziale mono-esponenziale. Il valore atteso è leggermente superiore a 1,5 intervalli temporali. Questo valore dipende dal peptide del TCR, dal legame con il MHC e dal fotoblesamento; per poter discriminare tra questi due contributi, il valore atteso deve essere calcolato per almeno tre intervalli temporali diversi.I ritardi rappresentano ora tutti i valori attesi in funzione dei rispettivi intervalli temporali e adattano i punti dati alla funzione mostrata, che include qui il tempo di vita di 2,12 secondi e il valore atteso per la FOTOBLEACHING f Fred. Il recupero del donatore dopo la fotobleaching di F Fred, accettabile come mostrato qui e in maggiore dettaglio in precedenza, può essere utilizzato per determinare in pochi passaggi le costanti di dissociazione bidimensionali così come sono efficaci all'interno della sinapsi immunologica.Qui concentriamo la nostra analisi sull'interazione del TCR e sui cluster di TCR in cui il legame T-C-R-P-M-H-C è più evidente. Come risulta evidente dalle misurazioni mostrate, i valori di F FRED variano notevolmente per singoli cluster di TCR.Moltiplicare F fred per il fattore di proporzionalità C porta all'occupazione del TCR, un termine che descrive il rapporto tra il numero di TCR legati al pMHC e il loro numero totale. C deve essere determinato una volta per un insieme specifico di coppie fre e per il sistema FRE utilizzato. Verso la fine di questa presentazione, spiegheremo in maggiore dettaglio come determinare C, ad esempio, il che implica l'uso di SI tre e SI cinque posizionati specificamente sul frammento di anticorpo monocatenario reattivo verso il TCR e sul termine C del peptide legato all'MHC. Ciò corrisponde a circa due sinaptici; le costanti di dissociazione bidimensionali possono essere calcolate a partire dall'occupazione del TCR denominata A e dalla densità iniziale di pMHC presente sul bilayer lipidico.La relazione mostrata deriva dalla legge dell'azione di massa ed è spiegata in maggiore dettaglio nell'articolo associato a questo filmato. Nel nostro esempio, la densità iniziale di pmcs ammonta a 30 molecole per micron quadrato. Si ottiene una distribuzione di kd 2D, efficaci nella sinapsi delle cellule T, con un valore mediano di circa 34 molecole per micron quadrato.La distribuzione della velocità di associazione può essere calcolata a partire dalla distribuzione del KD 2D sinaptico e dalla corrispondente velocità di dissociazione, qui pari a 0,41 al secondo, determinata mediante l'analisi delle tracce di FRET a singola molecola a 24 gradi Celsius. Il valore mediano è di circa 0,01 micron quadrati per molecola al secondo. In sintesi, le misurazioni di FRET tra TCR e peptidi MHC permettono un'analisi completa di tutti i parametri cinetici che descrivono la dinamica della reazione nel compartimento C due.Questa metodologia può in linea di principio essere generalizzata all'analisi di altre interazioni tra recettori e ligandi, poiché potrebbero essere fondamentali per il riconoscimento tra cellula e cellula. Ultimo ma non meno importante, discutiamo come derivare sperimentalmente la costante C, necessaria per convertire i rendimenti di grasso in occupazioni del TCR. Questa procedura deve essere eseguita una sola volta.La costante determinata C può quindi essere utilizzata per tutti i successivi esperimenti in cui lo stesso sistema fret con gli stessi fluorofori viene applicato. In questa procedura, abbiamo essenzialmente correlato i rendimenti fret misurati nei singoli cluster di TCR, attraverso il recupero del donatore dopo il fotoblesamento dell'accettore, ai corrispondenti valori di intensità rilevati nel canale fret sensibilizzato. Come discusso in precedenza, il rendimento fret viene determinato a partire dalle immagini del canale donatore fret corrette per il fondo, acquisite prima e dopo l'ablazione del donatore fret.Il canale FRET sensibilizzato deve essere allineato con il canale del donatore F e corretto per le componenti X e Y e per il fondo. Come mostrato qui, vanno corretti la fuoriuscita del donatore Fred e l'eccitazione incrociata dell'accettore Fred. Una descrizione dettagliata di come correggere la fuoriuscita del donatore Fred e l'eccitazione incrociata dell'accettore Fred è fornita nell'articolo.In corrispondenza di questo video, calcolare ora per ciascun cluster di TCR il rapporto tra il segnale del bug dell'immagine FRET corretta e l'immagine corrispondente del donatore FRET corretta. Determinare il segnale medio corretto per singoli donatori FRET e per eventi FRET a singola molecola e calcolare il rapporto. L'occupazione del TCR viene quindi ottenuta moltiplicando i due rapporti.Ora, riportare in grafico i rendimenti FRET determinati per singoli cluster di TCR in funzione del loro grado di occupazione dei TCR. Il valore di C viene quindi determinato mediante regressione lineare, come mostrato qui. Nel nostro esempio, esso corrisponde approssimativamente a due.Dopo aver visto questo video, si dovrebbe essere in grado di utilizzare un bilayer lipidico funzionalizzato con proteine in combinazione con la microscopia a fluorescenza a singola molecola per misurare la cinetica di legame sinaptico tra PMHC e TCR. Sono stati illustrati tutti i passaggi necessari, inclusa la produzione delle proteine, l'etichettatura dei linfociti T e le misurazioni finali di FRET. Inoltre, è stata mostrata in dettaglio l'analisi delle immagini, che permette di ottenere curve di attivazione dei linfociti T e valori di FRET.Infine, è stata illustrata la metodologia alla base della determinazione delle velocità cinetiche di associazione e dissociazione. Un approccio analogo può in linea di principio essere utilizzato per determinare altre interazioni tra recettori sinaptici e ligandi, anche se potrebbero rendersi necessarie opportune modifiche.

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