Name: High-throughput screening delle Variazioni riluttanza a lignocellulosica Biomassa: Total lignina, lignina monomeri, e enzimatica Zucchero di uscita (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: Scopri metodi high-throughput per analizzare la riluttanza della biomassa lignocellulosica. Questa tecnica misura la liberazione di zuccheri dopo pretrattamento termochimico e idrolisi enzimatica per identificare i migliori biocarburanti.

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Gli autori desiderano ringraziare la stagista Evelyn Von Neida che ha fornito informazioni fondamentali riguardo alla preparazione di campioni di biomassa per entrambe le pipeline ad alto rendimento discusse in questo manoscritto. Il supporto per lo sviluppo di questo lavoro e del manoscritto è stato fornito dal BioEnergy Science Center. Il BioEnergy Science Center è un centro di ricerca sulla bioenergia del Dipartimento dell'Energia degli Stati Uniti supportato dall'Office of Biological and Environmental Research del DOE Office of Science. Il National Renewable Energy Laboratory (NREL) è un laboratorio nazionale dell'Ufficio per l'efficienza energetica e l'energia rinnovabile del DOE degli Stati Uniti, gestito per il DOE dall'Alliance for Sustainable Energy, LLC. Questo lavoro è stato sostenuto dal Dipartimento dell'Energia degli Stati Uniti nell'ambito del contratto n. DE-AC36-08-GO28308 con il Laboratorio Nazionale per le Energie Rinnovabili.

1. Alta-throughput determinazione del glucosio e xilosio rendimenti seguito enzimatica saccarificazione 9,29 <ol><li> Preparazione del campione (macinazione, De-inamidatura, estrazione, pretrattamento) <ol><li> Macinare almeno 300 mg di ciascun campione biomassa utilizzando un mulino Wiley, tale che le particelle passano attraverso una maglia 20 (850 micron) schermo. Trasferimento a zip-top sacchetti antistatici (in genere con codici a barre) e le informazioni sul campione record al database di codici a barre. </li><li> Aggiungere circa 250 mg o più di biomassa terra da sacchetto antistatico di un numerato (con la matita, non utilizzare inchiostro o pennarello) sacchetti da tè, con attenzione arrotolare le bustine di tè, facendo attenzione a piegare le estremità sopra la biomassa per prevenire perdita durante il de-inamidatura ed estrazione. </li><li> Avvolgere la bustina chiusa con filo di rame ricoperto di stagno. Registrare il numero bustina di tè per ogni campione con codice a barre. </li><li> Preparare la soluzione enzimatica de-starching da enzimi commerciali (tipicamente, 0,25% (v / v) glucoamilasi (~ 1.600 AGU / L) e1,5% (v / v) alfa-amilasi (~ 2.900 KNU-S / L) in 0,1 M di acetato di sodio (pH 5,0)). Preparare 16 ml per g di massa biomassa o 500 ml per 120 campioni bustina. Nota: Carichi in grado di rimuovere l&#39;amido di biomassa a terra dovrebbero essere determinati empiricamente da test per l&#39;amido dopo la digestione con una gamma di carichi di enzimi e di rapporti. </li><li> In un contenitore di plastica, aggiungere 16 ml di soluzione di de-starching enzimatica per 1 g di massa biomassa terra. Per un protocollo de-inamidatura batch, aggiungere 120 bustine a 500 ml di soluzione tampone-enzima. </li><li> Incubare in un agitatore a 55 ° C per 24 (± 4) ore, a 120 rpm per rimuovere possibili amido. </li><li> Dopo il de-starching incubazione, risciacquare e immergere la biomassa in diversi litri di acqua deionizzata per 30 minuti. Ripetere questo processo due volte per rimuovere i sali tampone che possono causare urti (formazione di bolle di gas nella soluzione che può portare a un improvviso e violento aumento del livello della soluzione, provocando etanolo liquido caldo a cascatafuori dal recipiente di reazione) durante l&#39;estrazione. </li><li> Dopo il risciacquo completo della biomassa de-inamidato, posizionare le bustine nella colonna di estrazione Soxhlet. Non è richiesta alcuna ditale per questo passo. </li><li> Impostare il reflusso Soxhlet, con il 95% di etanolo ed estrarre i campioni per 24 ore. </li><li> Rimuovere le bustine dal reattore Soxhlet e diffondere in un unico strato su un vassoio piatto. </li><li> Consentire ai campioni di asciugare durante la notte a temperatura ambiente in una cappa aspirante. </li><li> Srotolare le bustine e riportare la biomassa secca di sacchetti antistatici codice a barre originali. Nota: I sacchetti antistatici sono efficienti nel ridurre l&#39;elettricità statica nella biomassa, migliorando le caratteristiche di maneggevolezza. Se vengono utilizzate altre opzioni di archiviazione, ulteriore biomassa può essere necessaria a causa della biomassa aggrapparsi al lato del contenitore di stoccaggio. </li><li> Trasferire almeno 50 mg della biomassa essiccata in una tramoggia di codice a barre (usando più materiale è migliore per un dosaggio accurato). Spossono codici a barre dei sacchetti antistatici e la tramoggia di ricezione al fine di garantire il monitoraggio accurato del campione. </li><li> Tramogge caricare su solidi di peso del robot, prestando molta attenzione all&#39;ordine dei campioni nel rack. Caricare piastre reattore sufficiente per contenere tutti i campioni e selezionare il protocollo di dosaggio in base al numero di lastre utilizzate. </li><li> Pesare robotizzato 5 mg di campioni essiccati (± 0,3 mg) in acciaio inox piastre a 96 pozzetti resistenti agli acidi. Pesare 3 repliche di ciascun campione distribuite intorno alla piastra per ridurre al minimo eventuali variazioni localizzate. </li><li> Includere 8 campioni di controllo di biomassa di un materiale standard di biomassa ben caratterizzato, al fine di monitorare le prestazioni del dosaggio. In caso di più targhe, l&#39;utilizzo di più tramogge biomasse standard di ridurre al minimo la dimensione delle particelle deriva causata dal setacciando nelle tramogge sopra cicli ripetuti di erogazione. Nota: In ogni piatto, non ci dovrebbero essere 24 campioni con 3 repliche, 4 spazi vuoti consistenti di acqua deionizzata e l&#39;enzima, e 8 Controls, utilizzando la biomassa normale precedentemente caratterizzati. Le 3 pozzetti angolo di ciascuno dei 4 angoli della piastra sono riservati per gli standard di zucchero. </li><li> Assegno in bianco e zucchero pozzi standard, per le particelle di biomassa erranti e rimuovere, se presenti. </li><li> Aggiungere 250 ml di acqua deionizzata a ogni bene, e sigillare le piastre con politetrafluoroetilene silicone adesivo-backed (PTFE) Nastro. </li><li> Utilizzando un &quot;suggerimento saldatore 1/8, forare il nastro in PTFE in ciascun porto vapore (117 in totale) per ogni piatto. Utilizzare un piatto vuoto impilati su piastra reattore sigillato come guida e per limitare il movimento di PTFE pellicola. </li><li> Fissare le piastre saldamente con 0,031 &quot;guarnizioni spesse vetroresina PTFE (pre-perforati con fori per i porti di vapore) fra piatti e piatti vuoti sulla parte superiore e inferiore della pila. Pretrattare i campioni utilizzando un reattore a vapore per 180 ° C per 17,5 min, o altre combinazioni di temperatura / tempo in base alla gravità desiderata. </li><li> Piastre reattore Raffreddare a 50 °; C da inondazioni con acqua deionizzata. </li></ol></li><li> Enzimatica Saccarificazione <ol><li> Preparare una soluzione di saccarificazione enzimatica composto dell&#39;8% (v / v) in soluzione enzimatica 1.0 M sodio citrato, pH 5,0. Preparare 5 ml per piastra reattore. Nota: è necessaria la diluizione deve essere determinato sulla base di attività e di proteine ​​della soluzione di riserva enzima specifico. </li><li> Quando le piastre sono fresche, li centrifugare in un rotore secchio oscillante a 1.500 xg per 20 min. Rimuovere la pellicola sigillante. Nota: Queste piastre sono pesanti e le specifiche centrifuga devono essere controllate per la compatibilità. </li><li> Aggiungere 40 ml di soluzione enzimatica magazzino 8% in ogni pozzetto (70 mg enzimatica per g di biomassa). </li><li> Richiudere con il nuovo nastro in PTFE. Mettere piatto sigillato nel morsetto piastra magnetica. </li><li> Mescolare delicatamente i campioni per inversione (almeno 15 volte), e incubare a 50 ° C per 70 ore. </li><li> Quando la saccarificazione ha concluso, mescolare per inversione e centrifugare le piastre a 1.500 xg per 20 min. </li></ol></li><li> Zucchero Assay <ol><li> Preparare una serie di 6 glucosio e xilosio combinato standard di calibrazione a 0.014 tampone M citrato (pH 5,0) va da 0 a 0.750 mg / ml (0, 0,2, 0,3, 0,45, 0,65 e 0,75 mg / ml raccomandato) e da 0 a 0.600 mg / ml (0, 0,1, 0,2, 0,35, 0,45 e 0,6 mg / ml raccomandato) per il glucosio e xilosio, rispettivamente. </li><li> Preparare il glucosio ossidasi / perossidasi (goPod) e xilosio deidrogenasi (XDH) reagenti in base alle istruzioni contenute nel kit. </li><li> Usando una pipetta, rimuovere 200 ml di liquido dai 4 pozzi d&#39;angolo e pozzi bordo adiacente ai pozzetti d&#39;angolo (12 pozzi totali) della piastra reattore. </li><li> Usando una pipetta, dispensare 180 ml di acqua deionizzata a ciascun pozzetto di una piastra di diluizione a fondo piatto di polistirene da 96 pozzetti. Non aggiungere acqua ai pozzi d&#39;angolo standard e 12 di zucchero (rimuovere quei suggerimenti se si utilizza una testina a 96 canali). </li><li> Usando una pipetta, dispensare 180 microlitri goPod di reagente in ogni pozzetto del saggio del glucosio plmangiò. </li><li> Usando una pipetta, dispensare 180 microlitri XDH reagente a ciascun pozzetto della piastra di test xilosio. </li><li> Usando una pipetta, 20 ml aliquote di idrolizzato dalla piastra del reattore a 96 pozzetti per piastra di diluizione. Pipettare dalla sezione superiore dei pozzetti per evitare solidi biomassa e liquido residuo in pozzi angolo. Mescolare triturazione per almeno 10 cicli. </li><li> Usando una pipetta, 110 ml di standard di zucchero, in duplice copia, per i pozzi d&#39;angolo della piastra di diluizione. </li><li> Usando una pipetta, trasferire 20 microlitri aliquote dalla piastra di diluizione alla glucosio e xilosio piastre test. Miscelare triturazione. </li><li> Incubare le piastre di glucosio e xilosio test a temperatura ambiente per 30 min. Rompere con attenzione tutte le bolle di superficie prima della lettura. Una pistola termica brevemente passato sopra la superficie della piastra funziona bene. </li><li> L&#39;utilizzo di un lettore di piastre a 96 pozzetti ultravioletta / visibile, impostare la lunghezza d&#39;onda misurata a 510 nm e registrare l&#39;assorbanza contro un bianco reagente.Questa misura monitora la formazione di quinonimine, che è proporzionale alla concentrazione di glucosio. La concentrazione di glucosio è calcolata dalla curva di calibrazione in base agli standard di taratura preparate al punto 1.3.1. </li><li> L&#39;utilizzo di un lettore di piastre a 96 pozzetti ultravioletta / visibile, impostare la lunghezza d&#39;onda misurata a 340 nm e registrare l&#39;assorbanza. Questa misura monitora la riduzione di NAD + in NADH, che è proporzionale alla concentrazione xilosio. La concentrazione xilosio viene calcolata dalla curva di calibrazione in base agli standard di taratura preparate al punto 1.3.1. </li></ol></li></ol> 2. Alta-throughput Determinazione del totale lignina e lignina Monomerico contenuti utilizzando pyMBMS 28 <ol><li> Preparazione del campione <ol><li> Macinare ed estrarre la biomassa utilizzando i metodi descritti nei passaggi 1.1.1, e 1.1.6-1.1.8. Questo include macinazione e l&#39;estrazione di una serie di standard da utilizzare come controlli sperimentali. Nota: Il measur pyMBMSements non granulometria dipende, quindi se solo utilizzando il protocollo pyMBMS, preparazione biomassa devono essere effettuate per consentire al campione di essere introdotto nel portacampioni, &lt;4 mm. </li><li> Utilizzando una spatolina erogazione circa 4 mg (da 3 a 5 mg preferiti) della biomassa preparato in una tazza di acciaio inossidabile 80 microlitri progettato per l&#39;auto-campionatore. </li><li> Assicurarsi che almeno il 10% dei campioni analizzati sono in fase di norme di controllo, come quelli disponibili presso il National Institute of Standards and Technology (canna da zucchero bagassa-8491, pioppo-8492; pino-8493, o paglia di grano-8494). Lo standard può anche essere qualsiasi specie analoghe ai campioni da analizzare che sono già stati caratterizzati utilizzando metodi standard. </li><li> Caricare in modo casuale i campioni nelle tazze di auto-campionatore con una pinzetta per evitare distorsioni a causa di possibili derive spettrometro nel corso del tempo. Nota: Un tipico randomizzazione dei campioni dovrebbe includere la misurazione di tutti i campioni una volta, seguita da una ri-randomizzazionedell&#39;ordine dei campioni per la misurazione duplicato. Programmi di randomizzazione sono disponibili online. </li><li> Usando un hole-pugno di serie, produrre manualmente dischi filtranti di vetro dal tipo fogli A / D in fibra di vetro, senza legante. Tenere il filtro in fibra di vetro rotondo con pinzette, centrare la tazza campione e spingere nel campione con una chiave a brugola da 3,5 mm per confinare il materiale in ogni tazza durante l&#39;esperimento. </li></ol></li><li> Protocollo strumentale <ol><li> Calibrare lo spettrometro di massa utilizzando uno standard noto che ha intensità dei picchi sull&#39;intera gamma di composti che possono esistere per i campioni sperimentali. Per i campioni tipici di biomassa, utilizzare perfluorotributilammina (PFTBA). </li><li> Impostare la portata del gas di trasporto elio a 0,9 L / min usando un misuratore di flusso del gas. </li><li> Impostare il forno autocampionatore ad una temperatura di pirolisi di 500 ° C e la temperatura di interfaccia a 350 ° C utilizzando il software autocampionatore. Nota: riscaldata A &quot;in acciaio inox 08/01linea di trasferimento di calore avvolto in nastro che collega l&#39;autocampionatore al spettrometro di massa viene controllata tramite un regolatore di calore a 250 ° C. </li><li> Inizia acquisizione dati sulla spettrometro di massa e attendere almeno 60 secondi per ottenere dati sufficienti per la raccolta sfondo spettri. </li><li> Avviare il metodo di auto-campionatore automatico con le specifiche da 2.2.2. Nota: L&#39;autocampionatore gocce ogni campione singolarmente nella fornace autocampionatore. Il tempo totale di acquisizione dei dati è di circa 1,5 minuti; tuttavia, pirolisi di un tipico campione 4 mg è completa dopo 30 sec. </li><li> Record tenore totale di ioni (TIC) di ogni campione utilizzando software spettrometro di massa a velocità di scansione di 0,5 sec. Record intensità tra m / z 30-450. Nota: composti biomassa tipiche usano ionizzazione morbido a 17 eV. Lo strumento può registrare grandi intervalli di m / z 1 a 1.000; tuttavia, velocità di scansione sarà limitata dalla potenza della CPU del computer. </li><li> Rimuovere sfondo dagli spettri utilizzando la manuale migliorare funzione del software. Nota: Una porzione 60 di scansione della linea di base all&#39;inizio di raccolta dati vengono usati per calcolare un valore medio di sfondo. Questo spettri medi sfondo viene rimossa dal campione sperimentale spettri automaticamente nel software spettrometro di massa. </li><li> Importare il file di testo unico colonna creata dal software spettrometro di massa contenente i dati spettrali per ciascun campione, in un programma di database e combinare tutti i campioni in un database. Aggiungere qualsiasi metadati applicabile al foglio di calcolo. Importare i dati formattati (foglio elettronico di file / CSV) in un pacchetto software statistico e significa normalizzare gli spettri per tenere conto di variazioni nelle masse campione pirolizzati. </li><li> Utilizzare un pacchetto software statistico per eseguire una analisi delle componenti principali (PCA) utilizzando i dati spettrali per analizzare raggruppamento dei campioni standard replicati utilizzati nelle valutazioni, nonché per valutare quali picchi solidali alla classificazione di chimicacomposti nelle carichi tramano 28. Nota: i gruppi PCA campioni basati sulla somiglianza dei loro spettri, e permette un controllo degli standard per misurare errore sperimentale derivante da strumenti deriva durante la corsa. </li><li> Per calcolare il syringyl lignina (S) / guaiacyl (G) rapporto, sommare le aree dei picchi S (m / z = 154, 167, 168, 182, 194, 208, e 210) e dividere per la somma dei picchi G a 124, 137, 138, 150, 164, e 178. </li><li> Per calcolare il contenuto totale di lignina, sommare i picchi lignina con m / z = 120, 124, 137, 138, 150, 152, 154, 164, 167, 178, 180, 182, 194, e 210. </li><li> Calcolare un fattore di correzione per la misura di scala pyMBMS ad un metodo standard per la stima lignina totale, come Klason lignina. Dividere il valore di lignina Klason dello standard individuale per il tenore totale lignina misurato per il campione standard utilizzando pyMBMS. </li><li> Applicare questo fattore di correzione per tutte come specie nel set di dati. Ripetere per ogni tipo di biomassa analizzato. Nota: Il fattore di correzione può variare notevolmente in base al S / G della biomassa analizzato. </li></ol></li></ol>

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<li>Lupoi, J. S., Smith, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+woody+and+herbaceous+biomasses+lignin+composition+with+1064+nm+dispersive+multichannel+Raman+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Spectro%22%5BJournal%5D)">Characterization of woody and herbaceous biomasses lignin composition with 1064 nm dispersive multichannel Raman spectroscopy.</a> Appl. Spectro. 66 (8), 903-910 (2012).</li>
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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Le fasi di preparazione del campione chiave per ottenere dati accurati e riproducibili per lo svolgimento di esperimenti di screening high-throughput sono i seguenti: Zucchero saggio di rilascio: In generale, i campioni sono preparati in lotti che vanno da poche decine a diverse migliaia per volta. Ogni punto importante è tipicamente effettuata per tutti i campioni prima di andare avanti al fine di minimizzare le variazioni in preparazione tra i campioni. De-inam...

Mentre l&#39;offerta mondiale di combustibili non rinnovabili e loro prodotti associati declino, gli scienziati sono stati messi in discussione per creare carburanti e sostanze chimiche simili da fonti di origine vegetale 1. Un aspetto chiave di questo lavoro è determinare quali specie di piante possono essere adatti per la produzione di biocarburanti e biomateriali 2,3. Tipicamente, queste materie prime vengono valutati per la lignina, cellulosa, emicellulosa e contenuti; nonché la loro suscettibilità alla destrutturazione (recalcitrance) attraverso pretrattamento termico, meccanico e / o chimico con o senza successiva saccarificazione enzimatica. Analisi più dettagliate sono utilizzati per determinare la composizione specifica della lignina ed emicellulosa frazioni nonché attività ottimali enzima necessario. Modificazioni transgeniche di piante che non possiedono intrinsecamente caratteristiche ideali per la conversione biochimica o termochimica di merci desiderati hanno fornito ai ricercatori una fonte notevolmente ampliato di pentolaprefe- materie prime 4. I metodi di analisi standard per quantificare le caratteristiche chimiche di un impianto, mentre molto utile per piccole serie di campioni, sono inadatti per lo screening rapido di centinaia o migliaia di campioni 5-7. I metodi qui descritti HTP sono stati sviluppati per valutare rapidamente ed efficacemente un gran numero di varianti di biomassa per i cambiamenti nella parete cellulare recalcitrance al degrado termochimico e / o enzimatico. E &#39;fondamentale capire che i test di screening HTP qui descritti non sono state progettate per massimizzare la conversione o la resa. L&#39;obiettivo è quello di determinare differenze relative recalcitrance intrinseca dei campioni relativa alla biomassa. Come risultato, molte delle fasi di analisi differiscono dai saggi &quot;tipici&quot; di conversione di biomassa, in cui l&#39;obiettivo è di ottenere massima velocità di conversione o portata. Ad esempio, inferiori gravità pretrattamento e tempi di idrolisi enzimatica più brevi sono usati per massimizzare differirerenze tra i campioni. Nella maggior parte dei casi, carichi relativamente elevati enzimi sono utilizzati per ridurre le differenze dovute a variazioni sperimentali dell&#39;attività enzimatica, che potrebbero falsare i risultati in modo significativo. Tecniche rapide per determinare la composizione delle pareti cellulari delle piante e gli zuccheri monomerici liberato dopo saccarificazione enzimatica includono la robotica, personalizzati, piastre a 96 pozzetti termochimico compatibili, e modifiche di metodi di laboratorio standard 8-11 e protocolli strumentali, come la spettroscopia vibrazionale (infrarosso (IR), nel vicino infrarosso (NIR), o Raman) e la risonanza magnetica nucleare (NMR) 12-17. Queste metodologie sono fondamentali per isolare le materie prime ad alto o basso contenuto di cellulosa lignina, o quelli previsti per garantire la massima glucosio, xilosio, etanolo, ecc Questi metodi hanno permesso analisi rimpiccioliti che utilizzano minori quantità di biomassa e di consumo, con conseguente riduzione della sperimentazione spesa 18 </sup&gt;. Un&#39;altra caratteristica di questo approccio metodologico è che varie condizioni sperimentali possono essere rapidamente, e in alcuni casi contemporaneamente, valutata. Ad esempio, una varietà di differenti strategie di pretrattamento o cocktail di enzimi può essere testato, permettendo parametri sperimentali più ottimali per essere rapidamente identificati e impiegati. Materie prime popolari, come paglia del mais 9, pioppo 8,10, canna da zucchero canna da zucchero 8, e il panico verga 8 sono state valutate con successo con questi metodi HTP. Lignina totale e composizione monomerica lignina sono anche comunemente quantificati tratti biomassa. La riduzione del contenuto di lignina hanno dimostrato di aumentare la digeribilità enzimatica di polisaccaridi 19,20. Il ruolo che il rapporto monomerica lignina (spesso riportato come syringyl / guaiacyl (S / G) contenuto) gioca nella decostruzione della parete cellulare vegetale è ancora sotto inchiesta. Alcuni report hanno indicato che riduzioni della S / Grapporto ha portato a un incremento delle rese di glucosio successiva all&#39;idrolisi 21, mentre altri studi svelano la tendenza opposta 19,22. Metodi High Throughput per la valutazione lignina e dei suoi monomeri comprendono spettroscopia vibrazionale (IR, NIR, Raman e 23-26) accoppiata con analisi multivariata, e pirolisi spettrometria di massa a fascio molecolare (pyMBMS) 27,28. Quando lo sviluppo di metodi di screening per HTP biomassa, diverse considerazioni integrali devono essere tenuti in considerazione. Un aspetto fondamentale è la complessità del metodo. Qual è il livello di abilità richiesto per la tecnica? Analisi chemometric, per esempio, richiedono competenze specifiche per la costruzione, la valutazione, e il mantenimento di modelli predittivi. I metodi standard presentano indesiderati fasi di analisi preparatoria o dati o utilizzano reagenti tossici. Sviluppo dei modelli è un processo continuo in cui i nuovi dati vengono incorporati nel modello nel tempo per aumentare la robustezza del modello. Un&#39;altra considperazione è il risparmio di costi e una diminuzione tempi di analisi sperimentale dei metodi high-throughput proposti. Se il metodo è abbastanza rapida, ma molto costosa, non può essere una tecnica praticabile per molti laboratori di adottare. I metodi illustrati in questo manoscritto sono varianti di tecniche standardizzate, modificate per amplificare le capacità di throughput. Questi protocolli quantitativamente misurano i tratti di biomassa di interesse senza richiedere lo sviluppo di modelli predittivi. Questa è una caratteristica fondamentale di queste tecniche, poiché metodi predittivi, mentre esibendo forti correlazioni con l&#39;analisi standard utilizzata per sviluppare i modelli, non sono precisi come effettivamente misurare la quantità di interesse per i campioni. Considerando che i metodi utilizzati sono sostanzialmente ridimensionato le versioni di metodi analitici standard di bench-scala, accuratezza e precisione sono negoziati per la velocità e il throughput. Per lo più, questo risultato è dovuto ad errori più elevati in piccolo pipettaggio volume e di peso; così come una maggiore sampia eterogeneità dimensione del campione è diminuita. Mentre le grandi serie di campioni possono essere esaminati e confrontati, grande attenzione deve essere esercitata quando si effettua il confronto tra campagne distinte e ai risultati panca scala. La maggior parte delle fasi dispendiose comportano la manipolazione fisica della biomassa. Campioni di rettifica può richiedere diversi minuti per campione, compresa la pulizia fuori del mulino tra i campioni. Caricamento manuale, scarico, e tramogge di pulizia e riempimento e svuotamento bustine di tè e sacchetti di campionamento è anche molto alta intensità di lavoro. Mentre ogni passaggio potrebbe richiedere un minuto o più, fare migliaia di campioni possono richiedere molte ore o persino giorni. I robot possono caricare un piatto tipico reattore con biomassa in circa 3 a 4 ore o 6 per 8 piastre giorno -1 robot -1. Questa situazione dipende dai parametri di precisione utilizzati nonché il tipo e la quantità di biomassa da testare. Riempimento reattore piastre con acqua, acido diluito, o enzima viene rapidamente fatta usando un robot manipolatore liquido. Pritrattamento di una piastra pila (da 1 a 20 piastre reattore) dura tra 1 e 3 ore durante il montaggio, raffreddare e smontaggio è inclusa. Idrolisi enzimatica dura 3 giorni e l&#39;analisi zucchero richiede circa 1 ora di tempo di preparazione, più 10 minuti per piastra reattore per completare il test e leggere i risultati. Un programma settimanale di set di pretrattamento e di analisi giorni ospita un programma di lavoro ragionevole, riducendo al minimo dispari ore e week-end sforzi per la componente umana del test e consentono l&#39;elaborazione ~ 800 a 1.000 campioni settimana su base continuativa. La velocità massima dipende da diversi fattori, soprattutto la quantità di hardware (robot, reattori piatti, etc.) e la quantità di &quot;software&quot; (vale a dire, il personale) sono a disposizione per fare il lavoro manuale. Il limite superiore è pratico 2.500 a 3.000 campioni / settimana; tuttavia, che la produzione richiede operazione 7 giorni a settimana e più stagisti e tecnici degli studenti. In confronto, 3.000 campioni mediante HPLC richiederebbe circa 125 giorni di samanalisi ple più del lavoro aggiuntivo di pesare manualmente i campioni in reattori e campioni di filtraggio prima dell&#39;analisi.

<table><tbody><tr><td>Biomek FX Stazione di lavoro automatizzata</td><td>Coltro Beckman Coltro</td><td>Biomek FX</td><td>Manipolatore di liquidi automatizzato</td></tr><tr><td>Wiley mill</td><td>Thomas Scientific</td><td>3375E15 (Modello 4) o 3383L20 (Mini-mill)</td><td></td></tr> <tr><td>sacchetti antistatici</td><td>Minigrip*</td><td>MGST4P02503</td><td>2,5x3", più fornitori disponibili</td></tr><tr><td>filo di rame stagnato</td><td>McMaster-Carr</td><td>8871K84</td><td>0,016" di diametro, bustine di tè in filo di piegatura e soggiorno</td></tr><tr><td></td><td>Herbco</td><td>press n' brew bustine</td><td>di tè 3,5x5 pollici</td></tr><tr><td>gluco-amilasi</td><td>Novozymes</td><td>Spirizyme Fuel</td><td></td></tr><tr><td>alfa-amilasi</td><td>Novozymes</td><td>Liquozyme SC DS</td><td></td></tr><tr><td>acetato di sodio triidrato</td><td>qualsiasi fornitore di</td><td></td> sostanze chimiche <td>grado di reagente</td></tr><tr><td>acido acetico</td><td>qualsiasi fornitore</td><td></td> di sostanze chimiche <td>grado reagente</td></tr><tr><td>grado 190 proof (95%) etanolo</td><td>qualsiasi fornitore</td><td></td> di sostanze chimiche <td>grado di reagente</td></tr><tr><td>tramogge</td><td>Freeslate</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96- bene C-276 Piastre Hastelloy Aspen</td><td>Machining (Lafayette, Colorado)</td> <td>N / A (costruito su misura)</td><td></td></tr> <tr><td>Punta del saldatore da 1/8 "</td>Nastro in teflon con supporto adesivo <td>siliconico Sears</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>3M</td><td>5180</td><td>3" di larghezza (rotoli da 36 iarde)</td></tr> <tr><td>soluzione enzimatica</td><td>Novozymes</td><td></td><td>Cellic CTec2</td></tr><tr><td>acido citrico monoidrato</td><td>qualsiasi fornitore</td><td></td> di prodotti chimici<td></td></tr><tr><td>citrato trisodico diidrato</td><td>qualsiasi fornitore</td><td></td><td></td>di prodotti chimici</tr><tr><td>monouso, piastre in polistirene a 96 pozzetti</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655101</td><td>o equivalente; più fornitori disponibili</td></tr><tr><td>glucosio ossidasi/perossidasi&nbsp;</td><td>Megazyme</td><td>K-Gluc</td><td>Kit per il dosaggio del D-glucosio Megazyme</td></tr><tr><td>xilosio deidrogenasi</td><td>Megazyme</td><td>K-Xilosio</td><td>Megazyme Kit per il dosaggio del D-xilosio</td></tr><tr><td>soluzione standard</td><td>Megazyme</td><td>K-Gluc</td><td>Megazyme Kit per il dosaggio del D-glucosio</td></tr><tr><td>soluzione standard per lo xilosio</td><td>Megazyme</td><td>K-Xilosio</td><td>Megazyme Kit per il dosaggio del D-xilosio</td></tr><tr><td>in acciaio inossidabile</td><td>Frontier Laboratories</td> Fogli in fibra di vetro <td>PY1-EC80F</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Pall</td><td>66227</td><td>fogli 8x10"; cerchi perforati con perforatore standard</td></tr><tr><td>Bagassa di canna da zucchero Biomassa intera Materia prima</td><td>NIST</td><td>8491</td><td></td></tr><tr><td>Pioppo orientale (pioppo) Biomassa intera Materia prima</td><td>NIST</td><td>8492</td><td></td></tr><tr><td>Pino di Monterey Biomassa intera Materia prima</td><td>NIST</td><td>8493</td><td></td></tr><tr><td>Grano Paglia Biomassa intera Materia prima NIST</td><td></td><td>8494</td><td></td></tr></tbody></table>

high-throughput screening delle variazioni riluttanza a lignocellulosica biomassa: total lignina, lignina monomeri, e enzimatica zucchero di uscita

High-throughput Screening of Recalcitrance Variations in Lignocellulosic Biomass: Total Lignin, Lignin Monomers, and Enzymatic Sugar Release

La conversione della biomassa lignocellulosica in combustibili, prodotti chimici e altre materie prime è stata esplorata come un possibile percorso verso la riduzione dell'uso di fonti energetiche non rinnovabili. Al fine di identificare quali piante, all'interno di un pool diversificato, hanno i tratti chimici desiderati per le applicazioni a valle, è necessario confrontare attributi come il contenuto di cellulosa e lignina o il rilascio di zucchero monomerico a seguito di una saccarificazione enzimatica. I protocolli sperimentali e di analisi dei dati dei metodi di analisi standard possono richiedere molto tempo, limitando così il numero di campioni che possono essere misurati. I metodi ad alto rendimento (HTP) alleviano le carenze dei metodi standard e consentono lo screening rapido dei campioni disponibili per isolare quelli che possiedono i tratti desiderati. Questo studio illustra le tubazioni per il rilascio di zucchero HTP e la spettrometria di massa a fascio molecolare di pirolisi impiegate presso il National Renewable Energy Lab. Queste condutture hanno consentito la valutazione efficiente di migliaia di impianti, riducendo al contempo i tempi e i costi sperimentali grazie alla riduzione della manodopera e dei materiali di consumo.

L&#39;effetto combinato del pretrattamento termochimica e successiva saccarificazione enzimatica è misurata in funzione della massa di glucosio e xilosio rilasciato alla fine del test. I risultati sono riportati in termini di milligrammi di glucosio e xilosio rilasciato per grammo di biomassa. Ciò è in netto contrasto con i dati riportati da saggi di bench-scala, che di solito è riportato come percentuale rendimento teorico basato sull&#39;analisi compositiva del materiale di partenza. Poiché non è ancora pratico per ef...

La struttura della parete cellulare vegetale e i tratti chimici vengono valutati per identificare le materie prime ideali per i biocarburanti e i biomateriali. I metodi standard presentano limitazioni quando vengono applicati a set di dati di grandi dimensioni. Questi metodi di pretrattamento ad alto rendimento, saccarificazione enzimatica e spettrometria di massa a fascio molecolare di pirolisi confrontano un gran numero di campioni di biomassa con tempi e costi sperimentali ridotti.

High-throughput screening delle Variazioni riluttanza a lignocellulosica Biomassa: Total lignina, lignina monomeri, e enzimatica Zucchero di uscita

The conversion of lignocellulosic biomass to fuels, chemicals, and other commodities has been explored as one possible pathway toward reductions in the ...

L'obiettivo generale di questa procedura è misurare i residui termochimici e di idrolisi enzimatica tra varianti correlate di biomassa. Questo viene ottenuto innanzitutto preparando i campioni di biomassa per l'analisi, mediante riduzione dimensionale ed estrazione di amido e zuccheri solubili. Il secondo passaggio consiste nel distribuire la biomassa con elevata precisione in piastre reattori ad alto rendimento compatibili termochimicamente.I campioni vengono pretrattati in un reattore a vapore. Successivamente, i campioni vengono digeriti con una cellulasi commerciale standard per tre giorni al fine di idrolizzare la cellulosa e l'emicellulosa. L'ultimo passaggio consiste nella determinazione del glucosio e del xilosio rilasciati durante l'idrolisi enzimatica mediante saggi GO pod e XDH.In definitiva, la quantificazione ad alto rendimento di glucosio e xilosio viene utilizzata per determinare il rilascio relativo di zuccheri tra i campioni su base grammi di zucchero per grammo di biomassa iniziale. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ad altri metodi su scala da banco, come la pretrattazione e l'idrolisi enzimatica su scala da banco, è che essa può essere eseguita c

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Biomassa vegetale è uno dei principali carbon-neutral risorsa rinnovabile che potrebbero essere utilizzati per la produzione di biocarburanti. Biomassa vegetale è costituita principalmente delle pareti delle cellule, un materiale composito chiamato strutturalmente complesso legnocellulosa. Qui si descrive un protocollo per un'analisi completa del contenuto e la composizione della lignina polifenoliche.

Completa l&#39;analisi della composizione delle pareti cellulari delle piante (biomassa lignocellulosica) Parte I: lignina

Un metodo basato sulla microscopia confocale Raman è presentato che offre etichetta senza visualizzazione di lignina nelle pareti delle cellule vegetali e il confronto di lignificazione nei diversi tessuti, campioni o specie.

Senza etichetta In situ</emImaging> di lignificazione in pareti delle cellule vegetali

Questo protocollo descrive uno schermo ad alta velocità per l'attività cellulosolitici da una libreria metagenomica espressa in Escherichia coli. Lo schermo è soluzione basata e altamente automatizzata, ed utilizza una pentola chimica nel 384 micropiastre bene con la lettura finale come una misura di assorbanza.

Una schermata di High Throughput per Biomining attività Cellulase da librerie metagenomiche

Descriviamo un basso costo, metodo elevato throughput per lo screening per l'attività endoglucanase fungine...

Throughput Screening elevati di attività Endoglucanase fungine in Escherichia coli</em

Un metodo semplice e rapido per determinare il potenziale saccarificazione di un gran numero di campioni di biomassa vegetale è descritto. La piattaforma automatizzata per questa analisi comporta la preparazione della biomassa vegetale per l'analisi in 96 pozzetti e le prestazioni successive di pretrattamento, l'idrolisi e la quantificazione degli zuccheri rilasciato.

High-throughput per l&#39;analisi Saccarificazione materiali lignocellulosici

Un doppio filamento di RNA interference (dsRNAi) tecnica viene impiegata per down-regolare il coenzima mais cinnamoil A reduttasi (ZmCCR1) gene a basso contenuto di lignina pianta. La lignina down-regulation dalla parete cellulare viene visualizzato mediante analisi al microscopio e quantificato con il metodo Klason. Cambiamenti di composizione in emicellulosa e cellulosa cristallina vengono analizzati.

La lignina down-regulation dei<em&gt; Zea mays</em&gt; Via dsRNAi e Klason lignina analisi

Tecniche di evoluzione e di isolamento Adaptive sono descritti e hanno dimostrato di produrre derivati di tensione Scheffersomyces stipitis NRRL Y-7124 che sono in grado di consumare rapidamente esosi e zuccheri misti pentosi in enzima saccarificato idrolizzati undetoxified e di accumulare più di 40 g / L di etanolo.

Tecniche per l&#39;evoluzione della robusta lievito Pentoso-fermentazione per bioconversione della lignocellulosa a etanolo

Viene descritto un test ad alto rendimento per lo screening enzimatico. Questo kit di saggi multiplexato e pronto all'uso comprende substrati prescelti diC hromogenic Polymer Hydrogel (CPH) e substrati di C insolubileC iomogenico Biomass (ICB). Gli enzimi bersaglio sono gli endoenzimi che degradano i polisaccaridi e le proteasi.

High-throughput screening degli enzimi carboidrati di degradazione Utilizzando Novel insolubile Chromogenic Substrate Assay Kit

OrganoCat è un metodo per il pretrattamento e il frazionamento della lignocellulosa in condizioni lievi in lignina, zuccheri fermentabili e polpa di cellulosa. In un sistema di solventi biogenici e bifasici di acqua e 2-metiltetraidrofurano con acido 2,5-furarbossilico come catalizzatore, i prodotti OrganoCat vengono separati in situ per un semplice recupero del prodotto.

Frazionamento della Biomassa Lignocellulosica mediante il Processo OrganoCat

Il pretrattamento a base di solvente eutettico profondo, assistito da microonde, è un processo verde, veloce ed efficiente per il frazionamento lignocellulosico e il recupero della lignina ad alta purezza.

Estrazione ultraveloce di Lignin da residui lignocellulosici mediterranei insoliti

Questo protocollo presenta un flusso di lavoro standard ad alta produttività per lo screening dei microrganismi industriali. Consiste nella costruzione di una libreria mutante tramite mutagenesi ARTP, nell'esecuzione di screening positivo delle gocce con microfluidica automatizzata, e successivamente nella verifica dei risultati. L'affidabilità del flusso di lavoro è stata convalidata tramite lo screening di ceppi ad alta resa di B. coagulans .

Screening ad alta produttività dei mutanti di Bacillo coagulante iperproduttore di acido lattico L-lattico utilizzando una piattaforma microfluidica automatica a gocce

Scopri metodi high-throughput per analizzare la riluttanza della biomassa lignocellulosica. Questa tecnica misura la liberazione di zuccheri dopo pretrattamento termochimico e idrolisi enzimatica per identificare i migliori biocarburanti.

High-throughput screening delle Variazioni riluttanza a lignocellulosica Biomassa: Total lignina, lignina monomeri, e enzimatica Zucchero di uscita (Video) | JoVE Journal

High-throughput screening delle Variazioni riluttanza a lignocellulosica Biomassa: Total lignina, lignina monomeri, e enzimatica Zucchero di uscita

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