High-throughput screening delle Variazioni riluttanza a lignocellulosica Biomassa: Total lignina, lignina monomeri, e enzimatica Zucchero di uscita

L'obiettivo generale di questa procedura è misurare i residui termochimici e di idrolisi enzimatica tra varianti correlate di biomassa. Questo viene ottenuto innanzitutto preparando i campioni di biomassa per l'analisi, mediante riduzione dimensionale ed estrazione di amido e zuccheri solubili. Il secondo passaggio consiste nel distribuire la biomassa con elevata precisione in piastre reattori ad alto rendimento compatibili termochimicamente.

I campioni vengono pretrattati in un reattore a vapore. Successivamente, i campioni vengono digeriti con una cellulasi commerciale standard per tre giorni al fine di idrolizzare la cellulosa e l'emicellulosa. L'ultimo passaggio consiste nella determinazione del glucosio e del xilosio rilasciati durante l'idrolisi enzimatica mediante saggi GO pod e XDH.

In definitiva, la quantificazione ad alto rendimento di glucosio e xilosio viene utilizzata per determinare il rilascio relativo di zuccheri tra i campioni su base grammi di zucchero per grammo di biomassa iniziale. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ad altri metodi su scala da banco, come la pretrattazione e l'idrolisi enzimatica su scala da banco, è che essa può essere eseguita contemporaneamente su centinaia o anche migliaia di campioni. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della conversione della biomassa, ad esempio quali cultivar o varianti siano più favorevoli alla conversione in zuccheri e successivi prodotti.

Le implicazioni di questa tecnica possono quindi essere estese alla comprensione della struttura e della funzione della parete cellulare, poiché le mutazioni che generiamo nel percorso biosintetico della parete cellulare possono essere analizzate alla ricerca di cambiamenti chimici strutturali. Questo metodo può fornire informazioni sui fattori di recalcitranza della parete cellulare vegetale e può essere applicato anche ad altri componenti della conversione della biomassa, come lo studio dell'attività enzimatica e delle sinergie.

Generalmente, le persone nuove rispetto a questo metodo incontreranno difficoltà perché il metodo richiede la manipolazione identica e simultanea di ampi set di campioni di varianti di biomassa su scala milligrammica. Pertanto, è necessario disporre di robotica e attrezzature specializzate. Per iniziare la procedura, trasferire circa 250 milligrammi di biomassa precedentemente macinata da un sacchetto antistatico con codice a barre a un sacchetto filtro numerato, arrotolando con cura il sacchetto filtro e piegando le estremità sopra la biomassa per evitare perdite durante la rimozione dell'amido e l'estrazione. Successivamente, chiudere ciascun sacchetto filtro avvolgendolo con filo di rame rivestito di stagno e registrare il numero del sacchetto filtro per ogni campione con codice a barre.

Aggiungere 500 millilitri di una soluzione enzimatica precedentemente preparata priva di amido a un contenitore di plastica. Successivamente, aggiungere 120 bustine di tè alla soluzione enzimatica tampone per un protocollo di lavorazione a lotti. Dopo l'incubazione in un agitatore, risciacquare e immergere la biomassa in diversi litri di acqua deionizzata per 30 minuti, a seguito di un risciacquo esaustivo della biomassa priva di amido.

Per rimuovere i sali del buffer, inserire i sacchetti da tè in una colonna a calzino per l'estrazione. Impostare il riflusso a calzino utilizzando etanolo al 95% ed estrarre i campioni per 24 ore. Al termine dell'estrazione, srotolare i sacchetti da tè e restituire la biomassa essiccata al barcode originale.

Buste antistatiche Trasferire almeno 50 milligrammi della biomassa essiccata in un contenitore provvisto di codice a barre. Scansionare i codici a barre delle buste antistatiche e del contenitore ricevente per garantire un tracciamento accurato del campione. Dopo aver caricato i contenitori su un robot pesatore automatico, pesare roboticamente cinque milligrammi dei campioni essiccati in acciaio inossidabile resistente agli acidi.

Le piastre a 96 pozzetti pesano tre replicati di ciascun campione distribuiti sulla piastra per minimizzare eventuali variazioni localizzate. Successivamente, aggiungere 250 microlitri di acqua deionizzata in ogni pozzetto e sigillare le piastre con nastro in POLYTETRAFLUOROETILENE o PTFE con supporto adesivo in silicone. Utilizzando una punta di saldatore da un ottavo di pollice, forare il nastro PTFE in corrispondenza di ciascuna presa di vapore.

Per ogni piastra, fissare saldamente le piastre utilizzando guarnizioni in PTFE rinforzato con vetro dello spessore di 0,031 pollici posizionate tra le piastre e piastre vuote nella parte superiore e inferiore della pila. Pretendere i campioni utilizzando un reattore a vapore impostato a 180 gradi Celsius per 17,5 minuti. Al termine, raffreddare le piastre del reattore a 50 gradi Celsius inondandole con acqua deionizzata.

Quando le piastre sono fredde, centrifugarle in un rotore a cestello oscillante a 1700 ×g per 20 minuti. Successivamente, rimuovere il film protettivo superiore.

Aggiungere 40 microlitri della soluzione stock di enzima all'8% precedentemente preparata in ogni pozzetto. Dopo aver sigillato nuovamente con nastro PTFE fresco, posizionare la piastra sigillata in una pinza magnetica per piastre. Mescolare delicatamente i campioni mediante inversione almeno 15 volte e incubare a 50 gradi Celsius per 70 ore. Al termine dell'incubazione, le piastre reattore vengono mescolate e centrifugate.

Successivamente, il robot per la manipolazione di liquidi viene utilizzato per eseguire la quantificazione di glucosio e xilosio mediante saggi colorimetrici enzimatici, xilosio deidrogenasi (XDH) per lo xilosio e glucosio ossidasi, perossidasi (GO-POD) per il glucosio. La piattaforma è allestita con serbatoi del reagente GO-POD e del reagente XDH, nonché con acqua per la diluizione e rack di punte da 200 microlitri a 96 canali per ciascun reagente. Queste punte vengono riutilizzate per più piastre di reattore.

Il deck contiene inoltre punte monouso da 200 microlitri per la rimozione dell'acqua e l'aggiunta degli standard di zucchero, nonché standard di zucchero già pronti. Partendo da fiale HPLC del carosello di conservazione, il robot preleva tre piastre microtitolazione trasparenti, una per effettuare la diluizione della miscela di idrolisi e una ciascuna per i saggi XDH e GoPod. La pinza sposta tutte e quattro le piastre in posizioni sul deck.

Vengono prelevate dal carosello e portate in posizione punte singole da 100 microlitri a 96 canali, da utilizzare per il trasferimento dal reattore alla piastra di diluizione e da questa alle piastre XDH e go pod. Utilizzando la pipetta a otto canali con intervallo variabile, l'acqua aggiunta prima del pretrattamento viene rimossa dalle tre pozzette in ciascun angolo della piastra del reattore per evitare il trasferimento indesiderato alla piastra di diluizione. Poiché queste 12 pozzette sono utilizzate per gli standard di zucchero mediante la testa di pipettaggio a 96 canali.

Dopo aver rimosso le tre punte in ogni angolo, si aggiungono 180 microlitri di acqua nei pozzetti della piastra di diluizione. Dopo aver cambiato le punte, i reagenti XD, H e go pod vengono trasferiti dai rispettivi serbatoi alle rispettive piastre per il saggio, utilizzando la testina di pipettaggio a 96 canali.

Nel frattempo, gli standard di zucchero vengono aggiunti alle tre pozzette di ciascun angolo della piastra di diluizione. Dopo aver sostituito con le punte più piccole, si utilizza la testina di pipettaggio a 96 canali per trasferire 20 microlitri di surnatante di idrolisi nella piastra di diluizione, e la piastra viene mescolata mediante tri. Il campione deve essere aspirato vicino alla superficie del liquido per limitare l'occlusione delle punte da parte delle particelle di biomassa.

Dopo la miscelazione, vengono trasferiti sequenzialmente 20 microlitri. Utilizzando la testina di pipettaggio a 96 canali, si procede alle piastre XDH e go pod. Dopo essere state miscelate mediante trier, le punte di campionamento, il reattore e le piastre di diluizione vengono riposizionate su un rack di scarto nel carosello; le piastre XDH e go pod vengono invece rimosse e posizionate su un rack di carosello separato, dove rimangono in attesa per un'ora prima della lettura nello spettrofotometro, mediante un lettore ultravioletto-visibile per piastre a 96 pozzetti.

Impostare la lunghezza d'onda misurata a 510 nanometri e registrare l'assorbanza rispetto a un bianco del reagente. Successivamente, impostare la lunghezza d'onda misurata sul lettore di piastre a 340 nanometri e registrare l'assorbanza utilizzando una spatola piccola. Dispensare circa quattro milligrammi della biomassa preparata in un contenitore in acciaio inossidabile da 80 microlitri progettato per l'auto-campionatore dello spettrometro di massa.

Utilizzando una perforatrice standard, produrre manualmente dischi filtranti di vetro da fogli di fibra di vetro di tipo ad senza legante; caricare i campioni sui rack del campionatore automatico usando pinzette; caricare i campioni in modo casuale nelle coppette per evitare bias dovuti alla deriva dello spettrometro nel tempo. Dopo aver eseguito la calibrazione e inserito i parametri appropriati nello spettrometro di massa, avviare l'acquisizione dei dati e attendere almeno 60 secondi per ottenere dati sufficienti per la raccolta degli spettri di fondo. Infine, avviare il metodo del campionatore automatico utilizzando un flusso di gas carrier di elio pari a 0,9 litri al minuto.

Un esempio di tendenze è rappresentato da un'analisi di recalcitranza condotta su 755 varianti naturali di pioppo campionate nel Pacifico nord-occidentale. I risultati indicano che all'aumentare del rapporto tra siringilolo e guaiacolo, la recalcitranza diminuisce fino a raggiungere un rapporto di circa due, oltre il quale il miglioramento della recalcitranza si stabilizza. In questo caso si possono osservare alcuni valori anomali in cui il gene PT4CL1 è stato downregolato.

Nel pioppo, diversi dei cento cultivar analizzati mostrano chiaramente un aumento dei composti recalcitranti, come evidenziato dalla ridotta liberazione di zuccheri. Diverse varietà di paglia di grano coltivate in diversi siti e raccolte dopo variazioni delle condizioni di crescita hanno prodotto 20 popolazioni distinte, basate sulle combinazioni delle variabili sopra indicate. Questi insiemi di campioni sono facilmente distinguibili e indicano variabili positive e negative.

Per la pirolisi di materiali recalcitranti, la spettrometria di massa con fascio molecolare può essere utilizzata per valutare i cambiamenti nella composizione della parete cellulare. I frammenti spettrali di massa sono attribuiti a diversi monomeri della lignina. Confrontando un campione con alto contenuto di lignina rispetto a uno con alto contenuto di carboidrati, le differenze nei dati spettrali risultano evidenti.

L'uso dei dati di spettrometria di massa, abbinati a un'analisi delle componenti principali, è illustrato qui. Il grafico dei pesi delle componenti principali può aiutare a identificare quali caratteristiche chimiche vengono spiegate nel grafico di classificazione dei punteggi, oltre a chiarire quali caratteristiche cambiano tra i gruppi di campioni. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere utilizzata per analizzare migliaia di campioni alla settimana se eseguita correttamente. Durante l'esecuzione di questa procedura, è fondamentale essere il più possibile coerenti e confrontare soltanto campioni appartenenti a un insieme correlato.

Pertanto, dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ad altri ricercatori per lavorare su metodi di screening ad alto rendimento e altre aree relative alla recalcitranza della parete cellulare vegetale, utilizzando ad esempio liquidi ionici e pretrattamenti alcalini. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come preparare, manipolare e analizzare correttamente ampi set di campioni di biomassa su scala microscopica per evidenziare differenze nella recalcitranza, mediante riduzione dimensionale ed estrazione, pretrattamento termochimico e idrolisi enzimatica. Si ricordi che lavorare con alta pressione, vapore e apparecchiature automatizzate è estremamente pericoloso e che tutte le precauzioni di sicurezza devono essere adottate, come indossare dispositivi di protezione individuale e dotare tutte le apparecchiature di sistemi di sicurezza interbloccati durante l'esecuzione di queste procedure.