Name: Identificazione di batteri patogeni rari da 16S rRNA sequenziamento del gene e MALDI-TOF MS (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 34 s
Description: Scopri l'identificazione di batteri patogeni rari tramite MALDI-TOF MS e sequenziamento del gene 16S rRNA. Questo metodo rapido ed economico migliora la diagnostica microbiologica clinica con Myroides odoratimimus.

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Gli autori desiderano ringraziare il Prof. Enno Jacobs per il suo continuo supporto.

1. Estrazione del DNA batterico <ol><li> Preparazione della Soluzione PBS <ol><li> Pesare 1,65 g di Na 2 HPO 4 x 2H 2 O, 0,22 g di NaH 2 PO 4 x 2H 2 O e 8,80 g di NaCl in un pallone e riempire con acqua distillata fino ad un volume finale di 1000 ml. Regolare il pH a 7,4. Per l&#39;uso finale filtrare la soluzione attraverso un batterio a prova (0,22 micron) Filtro. </li></ol></li><li> I batteri DNA Estrazione di Gram-negativi <ol><li> Streak il materiale del paziente su terreni di coltura appropriato (ad esempio, Columbia agar sangue), identificare ed isolare potenziali patogeni. </li><li> Preparare coltura pura ed eseguire Gram-colorazione per determinare somatipo e per confermare la purezza e della cultura 49. </li><li> Scegli una singola colonia batterica e trasferirlo con un uso singolo ciclo inoculo 1 ml in una provetta 2,0 ml reazione sterile che contiene 1 ml di soluzione PBS. </li><li> Incubare questa sospensione in un Bimbyer a 95 ° C per 10 min. Dopo l&#39;incubazione, lasciare che l&#39;estratto batterico (contenente il DNA disciolto) raffreddare a temperatura ambiente e utilizzare direttamente per l&#39;amplificazione o conservare a -20 ° C per un ulteriore uso (Figura 1a). </li></ol></li><li> I batteri DNA Estrazione di Gram-positivi <ol><li> Streak il materiale del paziente su terreni di coltura appropriato (ad esempio, Columbia agar sangue), identificare ed isolare potenziali patogeni. Eseguire Gram-colorazione per confermare somatipo della cultura. </li><li> Preparare coltura pura ed eseguire Gram-colorazione per determinare somatipo e per confermare la purezza della cultura. </li><li> Scegli una singola colonia batterica con una sterile 1 ml ciclo inoculazione e sospenderlo in 500 l di PBS soluzione in un tubo di 2,0 ml di reazione. </li><li> Aggiungere 500 microlitri di vetro perline e trasferire il tubo ad un omogeneizzatore oscillante, azionato alla massima frequenza e ampiezza (50 Hz), per 5 min. Utilizzare vetro perle del diametro di 1,0 millimetriperturbare le pareti cellulari batteriche. </li><li> Incubare la provetta per 10 min a 95 ° C e raffreddare a temperatura ambiente. Utilizzare l&#39;estratto direttamente per la reazione PCR o conservare a -20 ° C per un ulteriore uso. </li></ol></li></ol> 2. 16S rDNA PCR <ol><li> Preparazione di primer di amplificazione <ol><li> Utilizzare il TPU1 primer (5&#39;-AGA GTT TGA MTC TGG CTC AG-3 &#39;[M = A / C]) come fondo in avanti e RTU4 (5&#39;-TAC CAG GGT ATC TAA TCC TGT T-3&#39;) come primer reverse 25. Preparare una soluzione di primer magazzino con DNAsi e acqua libera RNAsi, avente una concentrazione di 100 pmol / ml (100 mM) e diluire ulteriormente ad una soluzione di lavoro a 10 pmol / ml. Conservare il magazzino primer e soluzione di lavoro a -20 ° C o utilizzare direttamente. </li></ol></li><li> Preparazione della miscela di reazione PCR <ol><li> Pipettare 1 ml di ciascun primer, 1 ml dNTP-mix (100 mm), 2,5 ml di estratto di DNA, 5 ml 10x PCR tampone (contenente 25 mM MgCl 2), 0,25 ml Taq-polimerasi (5 unità / ml) e 39.25 ml DNAse- e RNasi acqua libera PCR in un tubo da 200 ml reazione sterile. </li></ol></li><li> protocollo di PCR <ol><li> Avviare il programma PCR costruito come segue: In primo luogo, una fase di incubazione iniziale a 95 ° C per 5 min, che è necessaria per attivare la Taq-polimerasi. In secondo luogo, 35 cicli di amplificazione, contenente 1 min. fase di denaturazione a 95 ° C, a 1 min. step Primer annealing a 50 ° C, ed una fase di primer extension 1,5 min a 72 ° C. Terzo, una estensione finale per 10 minuti a 72 ° C. Infine, la reazione PCR viene raffreddata a 4 ° C. NOTA: Staphylococcus aureus e H 2 O servire come controllo positivo e negativo (Figura 1b). </li><li> Collocare la provetta contenente la miscela di reazione PCR nel termociclatore e avviare il programma. </li></ol></li><li> Purificazione del prodotto PCR NOTA: Al fine di purificare il prodotto di PCR, diversi protocolli siapossono essere utilizzati enzimi base o con una matrice di adsorbimento silice. Il single-step PCR pulizia usato qui utilizza due reazioni enzimatiche idrolitici. Mentre esonucleasi I (Exo I) rimuove DNA a singolo filamento, fosfatasi alcalina gamberetti (SAP) idrolizza dNTP prive di personalità giuridica. La seconda procedura è basata su una tecnica di adsorbimento membrana di silice con un sale alta veloce vincolante - lavare - sale basso ciclo di eluizione. <ol><li> Aggiungere 1,5 ml di una miscela enzimatica contenente sia Exo I e SAP a 25 microlitri prodotto di PCR, mescolare bene e versare in un termociclatore applicando un semplice protocollo di primi 15 min a 37 ° C seguito da 15 minuti a 80 ° C. Conservare il prodotto di PCR purificato sia a -20 ° C o utilizzarlo direttamente come bersaglio per l&#39;etichettatura di PCR. </li></ol></li></ol> 3. DNA Gel di Agarosio <ol><li> Preparazione del Tampone per elettroforesi (TBE-buffer) <ol><li> Titolare 54,0 g (445 mM) di base TRIS, 27,5 g (445 mM) di acido borico e 20 ml di una M EDTA 0,5 (10mM) soluzione a pH 8,0 con NaOH in un pallone e riempire con acqua distillata fino ad un volume totale di 1000 ml. Poi diluire questo buffer 5x 1:10 con acqua distillata (0,5x TBE) per elettroforesi. </li></ol></li><li> Preparazione del tampone di caricamento <ol><li> Mescolare 250 mg bromofenolo blu, 250 mg xilene cianolo FF e 15 g di polysucrose (Materials Table) in un pallone. Poi riempire con tampone 0,5x TBE per un volume totale di 100 ml. Aliquota il colorante di carico di 1 ml porzioni e conservare a -20 ° C per un ulteriore utilizzo. </li></ol></li><li> Casting del gel <ol><li> Pesare 6 g elettroforesi standard di agarosio a 300 ml di tampone 0,5x TBE (vedi paragrafo 3.1.1) in un pallone, per preparare un 2% (w / v) gel. Poi mettere il composto agarosio in un forno a microonde, riscaldare punto quasi di ebollizione fino a quando l&#39;agarosio è completamente sciolto e la soluzione appare chiara. </li><li> Lasciate che i agarosio fuso raffreddare sufficientemente e aggiungere 10 ml di un 1% (w / v) bromuro di etidio magazzino Soluzione. Versare la soluzione in uno stampo e posizionare un pettine gel (consentendo 30 pozzi) nel cast. Rimuovere il pettine quando il gel è completamente solidificato e mettere il gel nella camera di elettroforesi contenente tampone TBE 0.5x. NOTA: il bromuro di etidio è tossico e mutageno. Pertanto, deve essere maneggiato con cautela. Si consiglia di usare guanti di nitrile. Ci sono macchie acidi nucleici intercalante alternativi che possono essere utilizzati come alternativa non tossica. </li></ol></li><li> Gel di Agarosio dei prodotti di PCR NOTA: Al fine di verificare la dimensione corretta degli amplificati PCR e di stimare la concentrazione di DNA prodotto di PCR purificato viene separato su gel di agarosio. <ol><li> Pipettare 2 ml di tampone di caricamento in un tubo di reazione PCR e aggiungere 8 ml di prodotto di PCR. Pipettare questo mix nei pozzetti del gel. Aggiungere 8 ml di un marcatore di formato peso molecolare (ladder DNA) in un pozzo separato per stimare la dimensione del prodotto PCR. </li><li> Applicareuna tensione costante a 10 V / cm e fermare l&#39;elettroforesi appena il bromofenolo indicatore blu ha raggiunto circa ¾ della lunghezza totale del gel. Visualizzare i frammenti di PCR separazione tramite un UV-transilluminatore (lunghezza d&#39;onda 302 nm) e documentare utilizzando un sistema di gel-documentazione. Stimare la quantità di DNA da confronto visivo con la scala del DNA. Utilizzare circa 10 ng come bersaglio per l&#39;etichettatura PCR. </li></ol></li></ol> 4. Il sequenziamento Sanger <ol><li> Cycle Sequencing PCR NOTA: eseguire l&#39;etichettatura PCR in una reazione 10 microlitri utilizzando un kit commerciale (Materials Table). <ol><li> Aggiungere 2 ml di Mastermix reazione 5x, 2 ml di preparazione del DNA, 1,5 ml di soluzione di TPU1 o RTU4 di lavoro (10 pmol / ml) e 4,5 ml di DNAsi e acqua libera RNAsi. </li><li> Metti questa miscela di reazione di sequenziamento in un termociclatore ed eseguire un altro PCR. In totale, 25 cicli di processo costituito da una fase di denaturazione (96 ° C,10 sec), una fase di ricottura (45-60 ° C, 5 sec) ed una fase di estensione (60 ° C, 2 min). Infine, raffreddare la reazione a 4 ° C. </li></ol></li><li> Purificazione della reazione di sequenziamento <ol><li> Purificare il mix di reazione di marcatura utilizzando le colonne di spin commerciali per la PCR purificazione (Materials Table). </li><li> Carico 10 ml di reazione di sequenziamento sulla matrice di gel-filtrazione pre-idratata ed eseguire una fase di centrifugazione a 750 xg per 3 min. NOTA: l&#39;uso di questa procedura terminatori coloranti non incorporate vengono mantenuti nella matrice gel. </li><li> Poi asciugare l&#39;eluato acquosa in un concentratore a vuoto. Centrifugare a 2500 xg per 20 a 30 min a 40 ° C per completare secchezza. </li><li> Aggiungere 10 ml di formammide altamente deionizzata poi denaturare a 90 ° C per 2 minuti e raffreddare la miscela in ghiaccio. Pipettare 10 ml di campioni denaturati su un piatto ben 96 ml. Conservare il prodotto PCR essiccati e puliti a -20 ° C se l&#39;analisi èessere effettuata in un momento successivo. </li></ol></li><li> 16S rRNA sequenziamento del gene e l&#39;analisi della sequenza DNA NOTA: eseguire analisi di sequenza su un sequenziatore automatico (Materials Table). Il sequencer qui utilizzato è un sistema di elettroforesi capillare basato sulla fluorescenza automatizzato che analizza 4 campioni contemporaneamente (matrice 50 cm 4-capillare) con un liquido polimerico 67 (figura 1c). <ol><li> Posizionare la micropiastra nel sequencer. Scrivi un foglio campione (record di targa) come stabilito nella 2, salvare e avviare la sequenza di esecuzione / analisi seguendo la procedura di cui al 1. NOTA: Durata di una corsa sequenza è 2 ore e fornisce dati da 800 a 1000 bp. </li><li> Aprire il software di analisi di sequenziamento (Materials Table). dati della sequenza sono dati come file di testo (.seq) e un file contenente l&#39;elettroferogramma inclusi i valori di qualità (QV) (.ab1). NOTA: la chiamata di base è automaticamente performata dal software di analisi di sequenziamento e l&#39;elettroferogramma sottostante viene controllato visivamente (ad esempio, l&#39;altezza del picco, separazione dei picchi) prima che la sequenza è utilizzato per ulteriori applicazioni. </li><li> Confrontare il file di sequenza del DNA memorizzato l&#39;algoritmo BLAST NCBI database di nr usando (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=Nucleotide). </li></ol></li></ol> 5. MALDI-TOF MS NOTA: Lo spettrometro di massa utilizza 337 nm N 2 laser ed è gestito da uno specifico software di controllo (materiali Tabella). Gli spettri sono registrati in modalità lineare e una serie di massa tra 2.000 a 20.000 Da è coperto. Interpretazione dei dati e l&#39;assegnazione dei punteggi ai campioni viene effettuata in tempo reale da un software di analisi (Materials Table) (Figura 1d). <ol><li> Preparazione di batteri per MALDI-TOF MS Analysis <ol><li> Crescere i batteri di interesse (ad esempio, Myroides odoratimimus) sul Columbia agar sangue contenente sangue di cavallo 5% a 37 ° C per 18 a 24 ore, a seconda del ceppo batterico (Figura 2a). Eseguire Gram-colorazione per verificare la morfotipo dell&#39;organismo in esame e la purezza della cultura. </li><li> Usare uno stuzzicadenti di legno per il trasferimento di una singola colonia batterica ad un pozzo di un obiettivo di acciaio a 96 pozzetti (Figura 2b e 2c). Spot 1 ml di acido formico al 70% sulla parte superiore dell&#39;organismo secca dell&#39;aria sul bersaglio in acciaio e lasciare asciugare per circa 2-3 minuti. </li><li> Poi, sovrapporre la macchia con soluzione di matrice 1 ml, contenente 50 mg / ml CHCA (α-ciano-4-idrossicinnamico acid) in un solvente organico (50% acetonitrile, acido trifluoroacetico 2,5%, 47,5% H 2 O). NOTA: Il metodo overlay acido (sul metodo di preparazione plate) può essere utilizzata per migliorare la qualità degli spettri di massa. E &#39;stato dimostrato che per i batteri Gram-positivi, un &quot;attacco acido&quot; aumenta il punteggio values degli spettri misurati 45. NOTA: in alternativa un sistema di preparazione automatizzata dei campioni (Materials Table) può essere usato in cui i punti di contatto libero di 1 ml 70% soluzione di acido formico e, dopo un primo ciclo di asciugatura, soluzione matrice 1 ml, sono applicati in striscio batterico. I campioni vengono poi essiccati in condizioni standardizzate al 60% di umidità relativa e sono pronti per l&#39;uso per l&#39;analisi. </li><li> Lasciare lo striscio con una matrice sovrapposti asciugare ancora per circa 5 minuti in una cappa. Questo striscio batterico con la matrice applicata è ora stabile per molte ore. NOTA: sbavature batteriche senza matrice potrebbe non essere stabile a causa di degradazione delle proteine. </li></ol></li><li> Esecuzione della MALDI-TOF MS Analysis <ol><li> Introduzione dei campioni <ol><li> Aprire il software di controllo dei nostri MMIS (Materiali tabella). </li><li> Aerare il porto caricamento del campione dello spettrometro di massa premendo il tasto IN / OUT dello strumento. </li><li> Aprire la porta di carico dopo un clic e inserire la piastra segnale MALDI-TOF MS con lo striscio batterico secca, più di matrice. </li><li> Chiudere la porta ed evacuare di nuovo. Osservare vuoto e quando raggiunge 4,5 x 10 -6 mbar avviare la misurazione. </li></ol></li><li> Analisi dei campioni <ol><li> Aprire il software di analisi dei nostri MMIS (Materiali tavolo) e fare clic sul menu &quot;File&quot;. Selezionare &quot;nuova classificazione&quot; e un nuovo &quot;wizard di classificazione in tempo reale MALDI biotyper&quot; finestra si apre. Digitare il nome del progetto, ad esempio &quot;Progetto_1 misura Myroides, nel campo&quot; Nome del progetto &quot;e premere il pulsante&quot; Nuovo &quot;. Sotto la nuova finestra di dialogo denominata&quot; Nuovo progetto &quot;nome del progetto di controllo e procedere premendo il tasto&quot; OK &quot;. </li><li> Nella &quot;mago di classificazione in tempo reale MALDI biotyper&quot; osservare la finestra &quot;posizionamento Analita&quot; aperto. Selezionare le posizioni di destinazione (ad esempio, A1, A2, A3 ...), fare click qualsiasi posizione selezionata (indicata da un quadrato blu) e selezionare &quot;Aggiungi campioni&quot;. Nella tabella visualizzazione tipo aperto automaticamente nome del campione, ID campione e opzionalmente un commento. Fare clic sul pulsante &quot;Avanti&quot; per procedere. </li><li> Nella &quot;mago di classificazione in tempo reale MALDI biotyper&quot; osservare la finestra &quot;Selezione di MALDI metodi biotyper&quot; aperto. Selezionare &quot;Bruker Tassonomia&quot; da &quot;MSP da alberi tassonomia&quot; e fare clic su &quot;Avanti&quot; per continuare. </li><li> Nella &quot;mago di classificazione in tempo reale MALDI biotyper&quot; osservare la finestra &quot;Sintesi del progetto&quot; aperto. Controllare le voci inserite sopra indicate per il progetto di classificazione attuale. Avviare la classificazione eseguire premendo il pulsante &quot;Fine&quot; (Figura 2d - f). Misurazione avvia automaticamente quando viene raggiunto il vuoto appropriata. </li><li> Seguire il percorso di classificazione fino a quando la misura è completata con successo. Visualizzare la tabella dei risultati in tegli &quot;MALDI Biotyper tempo reale classificazione dei progetti Myroides misura Progetto_1&quot; aprire il menu &quot;Visualizza&quot; e fare clic su &quot;Risultati&quot;. </li><li> Visualizzare l&#39;argomento &quot;Bruker Daltonics MALDI Biotyper classificazione Risultati&quot; come file HTML nel browser Web predefinito. Stampare e salvare i risultati. </li></ol></li><li> Misurare uno standard di prova ogni giorno prima di campione di analisi per calibrare lo strumento ed effettuare strumento settimanale convalida (strumento di auto-test). NOTA: Durante la misurazione MALDI-TOF spettri sono analizzati in tempo reale dal software di analisi (materiali Tabella). Un elenco delle dieci specie con i rispettivi punteggi è dato ed è alimentato nel sistema di informazioni di laboratorio (LIS) per la segnalazione. </li><li> Valutare criticamente i risultati MALDI-TOF MS (vedere i risultati rappresentativi) e, se del caso, sono gli altri test, come i profili biochemical- e antibiotici suscettibilità o 16S rRNA sequenziamento del gene e, se necessario, Gram-colorazione perl&#39;assegnazione di una specie batterica alla relazione microbiologica. </li></ol></li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Entrambi MALDI-TOF MS e 16S rRNA gene sequenziamento offrono la possibilità di individuare un gran numero di batteri diversi. MALDI-TOF MS è un metodo veloce ed economico, che è facile da maneggiare e grandi database di spettri di massa batterica sono disponibili. Per questo motivo, MALDI-TOF MS è un metodo efficace e affidabile rapida costo per condurre studi di screening focalizzati in rare batteri patogeni 17,20,39,51. In uno studio prospettico confrontando MALDI-TOF MS con altri metodi di identificazione ...

l&#39;identificazione sicura dei patogeni rari nella diagnostica di routine è ostacolata dal fatto che i metodi culturali e biochimici classici sono ingombranti e talvolta discutibili. Inoltre, un laboratorio di microbiologia diagnostica deve elaborare un gran numero di agenti patogeni, che vanno da poche centinaia a diverse migliaia, giornaliero, che richiede l&#39;uso di sistemi automatizzati. Oltre alla gestione di una elevata produttività giornaliera, è necessaria la precisa identificazione di specie batteriche. Questo è giustificato dal momento che si differenziano per il loro modello di sensibilità agli antibiotici e, pertanto, la corretta identificazione fornisce al clinico informazioni essenziali per scegliere antibiotici appropriati (per esempio, Enterococcus spp., Acinetobacter spp.) 12,43. sistemi di identificazione microbici automatizzati (AMIS) si applicano insiemi standard di reazioni enzimatiche per caratterizzare le proprietà metaboliche di isolati batterici <sup&gt; 13,15,16,26,27. Sebbene le cartucce utilizzate in questi sistemi utilizzano un gran numero di diverse reazioni biochimiche, ad esempio, 47 nella scheda GN del AMIS utilizzato in questo studio 52, questo permette strategia identificazione sicura solo per un numero limitato di batteri. Inoltre, la banca dati, un sistema esperto avanzata, è chiaramente focalizzata sulla rilevazione di batteri pertinenti e altamente rilevanti di importanza medica 13,15,16,36. Due ulteriori sistemi, ampiamente utilizzati nei laboratori, si applicano anche questo approccio biochimico per l&#39;identificazione batterica. Recenti studi dimostrano una precisione di identificazione comparabili tra Amis utilizzati in questo studio e uno dei concorrenti (93,7% e 93,0%, rispettivamente), mentre il 3 ° AMIS ha una precisione di identificazione del solo 82,4% sulle specie di livello 35. Tali discrepanze possono essere spiegate dalla qualità dei riferimenti ai dati di identificazione sottostanti, le versioni di kit e software, differenze di metaboLISM e la competenza del personale tecnico 35,36. Due sistemi MALDI-TOF MS automatizzati (sistema di identificazione microbica MALDI-TOF, MMI) sono usati principalmente. Questi sistemi consentono il rilevamento di un gran numero di specie batteriche sulla base della loro proteina spettri di massa di impronte digitali. Ad esempio, il database delle MMIS utilizzati contiene 6.000 spettri di riferimento. Sistemi di identificazione basati sulla spettrometria di massa offrono il rilevamento veloce e affidabile di una grande varietà di microrganismi patogeni tra cui rari 11,48,51. Fino ad oggi solo pochi confronti diretti sono disponibili tra i MMI utilizzati in questo studio e il suo concorrente 19,33. Secondo dæk et al. Entrambi i sistemi forniscono un alto tasso di accuratezza analoga identificazione, ma le MMI utilizzati in questo studio sembra essere più affidabile nell&#39;identificazione delle specie 19. Allo stesso modo, le tecniche molecolari indirizzamento ben conservato, ma anche geni distinti ( <em&gt; ad esempio, 16S rDNA o rpoB) permettono una chiara identificazione delle specie 3,22,61. Tra questi, il 16S rDNA è il gene housekeeping più utilizzato per la sua presenza in tutti i batteri 34. La sua funzione rimane invariato e, infine, con circa 1500 bp, è abbastanza lungo per essere adatto per bioinformatica 14,34. Molti ricercatori considerano l&#39;analisi del gene 16S rRNA come il &quot;gold standard&quot; per l&#39;identificazione batterica 21. Ciò è dovuto al fatto che alcuni laboratori utilizzano tecniche di ibridazione DNA-DNA alla data di identificazione di rare o nuovi batteri 14,34. Inoltre, sempre più banche dati sono disponibili che possono essere utilizzati per 16S rRNA analisi del gene 50. Tuttavia, si deve tenere conto che i sistemi di rilevamento basati 16S rDNA hanno una sensibilità limitata rispetto ai protocolli PCR standard. Inoltre, l&#39;approccio molecolare è sofisticato, tempo e richiede personale altamente qualificato estrutture di laboratorio dedicate e, quindi, non facilmente implementato in diagnostica di routine 55. Inoltre, è stato dimostrato che la combinazione di almeno due diversi metodi di identificazione batterica conduce ad altamente accurata identificazione del ceppo. La combinazione di MALDI-TOF MS e sequenziamento del 16S rDNA consente l&#39;identificazione di un gran numero di differenti specie batteriche con elevata precisione. Recentemente la combinazione di analisi del gene MALDI-TOF MS e 16S rRNA è stata presentata per l&#39;identificazione batterica studiare domande epidemiologici e agenti patogeni rari 56.

<table><tbody><tr><td>CHROMASOLV, acqua per HPLC, 1 L</td><td>Sigma-Aldrich Chemie, M&uuml; nchen, Germania</td><td>270733</td><td></td></tr><tr><td>Lyser tissutale LT</td><td>Qiagen, Hilden, Germania</td><td>85600</td><td>Omogeneizzatore oscillante</td></tr><tr><td>Perle di vetro 1,0 mm</td><td>VWR International, Darmstadt, Germania</td><td>412-2917</td><td></td></tr><tr><td>Termomiscelatore 5436</td><td>Eppendorf, Amburgo, Germania</td><td>2050-100-05</td><td></td></tr><tr><td>Kit QIAamp DNA Mini (250)</td><td>Qiagen, Hilden, Germania</td><td>51306</td><td></td></tr><tr><td>Kit di base Taq PCR (1.000 U)</td><td>Qiagen, Hilden, Germania</td><td>201225</td><td></td></tr><tr><td>Forward Primer TPU1 (5&acute;-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3')</td><td>biomers.net, Ulm, Germania&nbsp;</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Primer inverso RTU4 (5&acuto;-TAC CAG GGT ATC TAA TCC TGT T-3&acute;)</td><td>biomers.net, Ulm, Germania&nbsp;</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Mastercycler&nbsp;</td><td>Eppendorf, Amburgo, Germania</td><td>-&nbsp;</td><td>Termocilcero</td></tr><tr><td>Provetta di reazione 1,5 ml</td><td>SARSTEDT, N&uuml; mbrecht, Germania</td><td>72.692</td><td></td></tr><tr><td>Provetta di reazione 2 ml</td><td>SARSTEDT, N&uuml; mbrecht, Germania</td><td>72.693.005</td><td></td></tr><tr><td>PCR 8er-CapStrips</td><td>Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germania</td><td>711040X</td><td></td></tr><tr><td>PCR 8er-SoftStrips</td><td>Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germania</td><td>711030X</td><td></td></tr><tr><td>Sharp R-ZV11&nbsp;</td><td>Sharp Electronics, Amburgo,</td> <td>Germania-Microonde</td><td></td></tr> <tr><td>Titriplex III (EDTA Na2-sale disidratato; 1 kg)</td><td>Merck, Darmstadt, Germania</td><td>1084211000</td><td></td></tr><tr><td>SeaKem LE Agarose</td><td>Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germania</td><td>849006</td><td></td></tr><tr><td>SmartLadder SF - da 100 a 1.000 bp</td><td>Eurogentec, L&uuml; ttich, Belgio</td><td>MW-1800-04</td><td></td></tr><tr><td>Blu di bromofenolo (25 g)</td><td>Sigma-Aldrich Chemie, M&uuml; nchen, Germania</td><td>B0126</td><td></td></tr><tr><td>Xilene cianolo FF (10 g)</td><td>Sigma-Aldrich Chemie, M&uuml; nchen, Germania</td><td>X4126</td><td></td></tr><tr><td>ComPhor L Maxi&nbsp;</td><td>Biozym, Hessisch Oldendorf,</td> <td>Germania-Soluzione</td><td></td></tr> di <tr><td>bromuro di etidio 1% (10 ml)</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Germania</td><td>2218.1</td><td></td></tr><tr><td>Gel Doc 2000</td><td>Bio-Rad Laboratories, M&uuml; nchen,</td> <td>Germania-Sistema</td> <td>di documentazione in gel&nbsp;</td></tr><tr><td>ExoSAP-IT (500 reazioni)</td><td>Affymetrix UK, Wooburn Green, High Wycombe, Regno Unito</td><td>78201</td><td></td></tr><tr><td>Tampone (10x) con EDTA&nbsp;</td><td>Life Technologies, Darmstadt, Germania</td><td>402824</td><td></td></tr><tr><td>BigDye Terminator Kit v1.1</td><td>Life Technologies, Darmstadt, Germania</td><td>4337450</td><td></td></tr><tr><td>Hi-Di formamide (25 ml)</td><td>Life Technologies, Darmstadt, Germania</td><td>4311320</td><td></td></tr><tr><td>DyeEx 2.0 Spin Kit (250)</td><td>Qiagen, Hilden, Germania</td><td>63206</td><td></td></tr><tr><td>3130 Analizzatore genetico</td><td>Life Technologies, Darmstadt, Germania</td><td>-</td><td>Sequenziatore</td></tr><tr><td>MicroAmp piastra di reazione ottica a 96 pozzetti con codice a barre</td><td>Life Technologies, Darmstadt, Germania</td><td>4306737</td><td></td></tr><tr><td>3130 Genetic Analyzer, base su piastra a 96 pozzetti</td><td>Life Technologies, Darmstadt, Germania</td><td>4317237</td><td></td></tr><tr><td>3130 Genetic Analyzer, fermo per piastre a 96 pozzetti</td><td>Life Technologies, Darmstadt, Germania</td><td>4317241</td><td></td></tr><tr><td>3130 Genetic Analyzer, pozzetto septa a piastre</td><td>Life Technologies, Darmstadt, Germania</td><td>4315933</td><td></td></tr><tr><td>Analizzatore genetico 3130, polimero POP-7, 7 ml</td><td>Life Technologies, Darmstadt, Germania</td><td>4352759</td> Analizzatore genetico 3130<td></td></tr><tr><td>, array a 4 capillari, 50 cm</td><td>Life Technologies, Darmstadt, Germania</td><td>4333466</td> Software di analisi del sequenziamento 5.4 <td></td></tr><tr><td></td><td>Life Technologies, Darmstadt, Germania</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>microflex</td><td>Bruker Daltonik, Brema,</td> <td>Germania-Il</td> <td>nostro mMIS</td></tr><tr><td>VITEK MS</td><td>bioM&eacute; rieux, N&uuml; rtingen, Germania&nbsp;</td><td></td><td>2nd mMIS</td></tr><tr><td>flexControl 3.4</td><td>Bruker Daltonik, Brema,</td> <td>Germania-Software</td> <td>di controllo dei dispositivi</td></tr><tr><td>Biotyper Realtime Classification 3.1 (RTC)</td><td>Bruker Daltonik, Brema,</td> <td>Germania-Software</td> <td>di analisi</td></tr><tr><td>&alpha;-acido ciano-4-idrossicinnamico, HCCA, 1&nbsp; g</td><td>Bruker Daltonik, Brema, Germania</td><td>201344</td><td></td></tr><tr><td>Peptide Calibration Standard II</td><td>Bruker Daltonik, Brema, Germania</td><td>222570</td><td></td></tr><tr><td>MSP 96 target acciaio lucido</td><td>Bruker Daltonik, Brema, Germania</td><td>8224989</td><td></td></tr><tr><td>peqGREEN</td><td>peqlab&nbsp;</td><td>37-5010</td><td></td></tr><tr><td>MALDI Biotyper Galaxy&nbsp;</td><td>Bruker Daltonik, Brema, Germania</td><td>Codice 1836007&nbsp;</td><td>Sistema automatizzato di preparazione dei campioni</td></tr><tr><td>Vitek 2&nbsp;</td><td>bioM&eacute; rieux, N&uuml; rtingen, Germania&nbsp;</td><td></td><td>Il nostro aMIS</td></tr><tr><td>MicroScan&nbsp;</td><td>Beckman Coulter, Krefeld, Germania</td><td></td><td>2nd aMIS</td></tr><tr><td>BD Phoenix&trade; Sistema di microbiologia automatizzato</td><td>BD, Heidelberg, Germania</td><td></td><td>3rd aMIS</td></tr><tr><td>Staphylococcus aureus&nbsp;subsp.&nbsp; aureus&nbsp; Rosenbach (ATCC&reg; &nbsp; 25923&commercio;)</td><td>American Type Culture Collection (ATCC), LGC Standards, Molsheim, Francia</td><td></td><td>Controllo positivo per PCR&nbsp;</td></tr></tbody></table>

identificazione di batteri patogeni rari da 16s rrna sequenziamento del gene e maldi-tof ms

Identification of Rare Bacterial Pathogens by 16S rRNA Gene Sequencing and MALDI-TOF MS

Ci sono un certo numero di batteri patogeni rare e, quindi, non sufficientemente descritto che sono riportati per causare infezioni gravi specialmente nei pazienti immunocompromessi. Nella maggior parte dei casi solo pochi dati, per lo più pubblicati come case report, sono disponibili che indagare il ruolo di tali agenti patogeni come un agente infettivo. Pertanto, al fine di chiarire il carattere patogeno di tali microrganismi, è necessario condurre studi epidemiologici che comprendono un gran numero di questi batteri. I metodi utilizzati in uno studio tale sorveglianza devono soddisfare i seguenti criteri: l&#39;identificazione dei ceppi deve essere accurata secondo la nomenclatura valida, dovrebbero essere facili da maneggiare (robustezza), economico nella diagnostica di routine e devono generare comparabili risultati tra i diversi laboratori. In generale, ci sono tre strategie per l&#39;identificazione di ceppi batterici in un ambiente di routine: 1) Identificazione fenotipica che caratterizza la BioChemicaL e metaboliche proprietà dei batteri, 2) tecniche di biologia molecolare, come 16S rRNA sequenziamento del gene e 3) spettrometria di massa come un approccio basato romanzo proteoma. Poiché spettrometria di massa e approcci molecolari sono gli strumenti più promettenti per identificare una grande varietà di specie batteriche, sono descritti questi due metodi. I progressi, limitazioni e potenziali problemi quando si utilizzano queste tecniche sono discusse.

MALDI-TOF MS è un romanzo, metodo veloce ed economico per la diagnostica di routine microbiologici. Batterica identificazione della specie da MALDI-TOF MS produce spettri principalmente composto da proteine ​​ribosomali, ma anche altri &quot;proteine ​​molto conservato con funzioni di house-keeping colpite in misura minima dalle condizioni ambientali&quot; 17 banca dati .La di questa MMIS contiene un grande insieme di spettri di riferimento e anche i batteri, che raramente si ...

La spettrometria di massa a tempo di volo con desorbimento/ionizzazione laser assistita da matrice (MALDI-TOF MS) e le tecniche molecolari (sequenziamento genico dell'rRNA 16S) consentono l'identificazione di patogeni batterici rari nella diagnostica di routine. L'obiettivo di questo protocollo risiede nella combinazione di entrambe le tecniche che porta a dati più accurati e affidabili.

Identificazione di batteri patogeni rari da 16S rRNA sequenziamento del gene e MALDI-TOF MS

There are a number of rare and, therefore, insufficiently described bacterial pathogens which are reported to cause severe infections especially in ...

L'obiettivo generale di questo protocollo di spettrometria di massa MALDI-TOF è migliorare il tipaggio di patogeni rari attraverso una procedura rapida ed economica. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della microbiologia diagnostica, consentendo l'identificazione rapida di patogeni batterici rari. Oggi vogliamo parlare di *odoratimimus* e di batteri del genere *Myroides*.Per dimostrare il metodo e discutere l'interpretazione dei risultati. In generale, le persone alle prime armi con questa tecnica potrebbero incontrare difficoltà, poiché il trasferimento dei batteri, la sovrapposizione con i metodi analitici e l'interpretazione dei risultati richiedono competenze tecniche ed esperienza in microbiologia. Abbiamo avuto per la prima volta l'idea di utilizzare la spettrometria di massa MALDI-TOF per lo screening di batteri rari quando un paziente nel nostro ospedale ha sviluppato un'infezione del piede diabetico causata da *Myroides odoratimus*.Iniziare questo protocollo con l'estrazione del DNA batterico, la PCR del DNA ribosomiale 16S e il sequenziamento Sanger come descritto nel protocollo testuale. Utilizzare uno stuzzicadenti di legno per trasferire una singola colonia batterica in una pozzetta di una piastra in acciaio da 96 pozzette. Applicare un microlitro di acido formico al 70% sulla parte superiore dell'organismo essiccato all'aria sulla piastra in acciaio e lasciare essiccare per circa due o tre minuti.Coprire il punto con un microlitro di soluzione di matrice contenente 50 mg/ml di CHCA in un solvente organico composto da 50% acetonitrile, 2,5% acido trifluoroacetico e 47,5% acqua. Lasciare asciugare all'aria lo striscio e la matrice sovrapposta per circa cinque minuti in una cappa. Per introdurre i campioni, aerare il portello di caricamento del campione dello spettrometro di massa premendo il pulsante in/out dello strumento.Aprire la porta di carico e inserire la piastra target del MALDI-TOF MS con lo strato batterico essiccato più la matrice. Chiudere la porta e procedere nuovamente con la messa sotto vuoto. Monitorare il vuoto e, quando raggiunge 4,5 milioni di millibar, avviare la misurazione.Aprire il software di analisi MMIS e fare clic sul menu file. Selezionare "Nuova classificazione", quindi si aprirà una nuova finestra denominata "Procedura guidata classificazione in tempo reale MALDI Biotyper". Digitare il nome del progetto nel campo "Nome progetto" e fare clic su "Nuovo"; nella nuova finestra di dialogo denominata "Nuovo progetto", verificare il nome del progetto e procedere facendo clic sul pulsante "OK".Nella procedura guidata di classificazione in tempo reale del MALDI Biotyper, osservare la finestra di posizionamento dell'analita. Selezionare le posizioni target, fare clic con il tasto destro su una qualsiasi posizione selezionata e scegliere Aggiungi campioni. Nella vista tabellare aperta automaticamente, inserire il nome del campione, l'ID del campione e, facoltativamente, un commento.Fare clic sul pulsante Avanti per procedere. Successivamente, osservare la finestra di selezione dei metodi MALDI Biotyper. Selezionare Bruker Taxonomy dalle MSP provenienti dagli alberi tassonomici e fare clic su Avanti per continuare.Quindi, osservare la finestra di riepilogo del progetto. Verificare le voci inserite indicate sopra per il progetto di classificazione attuale. Avviare l'esecuzione della classificazione facendo clic sul pulsante "Finish".Le misurazioni iniziano automaticamente quando viene raggiunto il vuoto appropriato. Seguire l'esecuzione della classificazione fino al completamento riuscito della misurazione. Al termine della misurazione, aprire il menu "Visualizza" e fare clic su "Risultati" per visualizzare la tabella dei risultati nel progetto di classificazione in tempo reale MALDI Biotyper Project One.Visualizzare i risultati di classificazione del Bruker-Daltonik MALDI Biotyper come file html nel browser web predefinito. Stampare e salvare i risultati. Qui mostrati ci sono spettri ottenuti mediante MALDI-TOF MS che vengono misurati e classificati in tempo reale.Gli spettri vengono assegnati a un nome di specie e a un valore di punteggio che riflette la qualità della misurazione. Punteggi superiori a 2.300 indicano un'identificazione della specie altamente probabile. Un punteggio compreso tra 2.000 e 2.300 indica un'identificazione sicura della specie.Un punteggio inferiore a 1,700 e 2,000 indica un'identificazione probabile della specie. Un punteggio inferiore a 1,700 non è affidabile. L'identificazione di patogeni batterici coltivati in coltura pura su un mezzo solido richiede da due a tre minuti.È importante ricordare che i patogeni batterici rari possono essere identificati mediante spettrometria MALDI-TOF MS solo quando gli strumenti contengono in modo affidabile gli spettri appropriati. In caso contrario, è necessario ampliarli integrando spettri MaSDA ottenuti da ceppi tipizzati dei loro isolati caratterizzati. Quando i risultati del punteggio non portano a un'identificazione inequivocabile del ceppo, possono essere applicati ulteriori metodi, come il profilo biochimico o il sequenziamento del rDNA 16S.Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla rilevazione dei batteri, può essere applicato anche ad altri microrganismi come funghi o anaerobi. Inoltre, è possibile misurare la resistenza batterica. Non dimenticare di lavorare con una matrice che è una sostanza pericolosa: indossare guanti, occhiali protettivi e operare sotto cappa.Inoltre, è assolutamente necessario asciugare bene la matrice e stendere uniformemente per evitare schizzi nella camera di analisi.

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Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

L'applicazione di desorbimento laser assistita da matrice tempo / ionizzazione di volo (MALDI-TOF) spettrometria di massa (MS) direttamente emocoltura brodo velocizza l'identificazione dei batteri. Il metodo proposto è un metodo rapido e affidabile per l'identificazione dei batteri Gram negativi direttamente dalla cultura sangue brodo.

Rapida identificazione dei batteri Gram-negativi dal sangue brodo di coltura Uso MALDI-TOF

Questo lavoro descrive in dettaglio le procedure per l'identificazione rapida dei batteri utilizzando MALDI-TOF MS. Le procedure di identificazione includono l'acquisizione dello spettro, la costruzione di database e le analisi di follow-up. Vengono presentati due metodi di identificazione, quelli basati sul coefficiente di somiglianza e quelli basati sui biomarcatori.

L&#39;uso di MALDI-TOF spettrometria di massa e un database personalizzato per caratterizzare batteri indigeni ad un unico ambiente di Cave (Kartchner Caverns, AZ, USA)

Massa phyloproteomics spettrometria-based (MSPP) è stato utilizzato per digitare una collezione di Campylobacter jejuni ssp. Doylei isolati a livello di sforzo rispetto a tipizzazione sequenza multilocus (MLST).

sottotipizzazione di<em&gt; Jejuni Campylobacter</em&gt; Ssp.<em&gt; doylei</em&gt; Isolati Utilizzando PhyloProteomics Spettrometria di Massa-based (MSPP)

Questo manoscritto descrive un dettagliato protocollo standardizzato di alta-16S rRNA-amplicone sequenziamento. Il protocollo introduce un protocollo integrato, in uniforme, fattibile ed economico a partire dalla raccolta del campione fecale attraverso l'analisi dei dati. Questo protocollo consente l'analisi di un gran numero di campioni con rigorosi standard e diversi controlli.

Protocollo guidata per caratterizzazione microbica fecale mediante sequenziamento del 16S rRNA-amplicone

IDBac è una pipeline di bioinformatica a base di spettrometria di massa open source che integra dati provenienti da proteine intatte e spettri di metaboliti specializzati, raccolti su materiale cellulare raschiato da colonie batteriche. La conduttura consente ai ricercatori di organizzare rapidamente centinaia di migliaia di colonie batteriche in gruppi tassonomici putativi e di differenziarle ulteriormente in base alla produzione specializzata di metaboliti.

Utilizzo della pipeline OPEN-Source MALDI TOF-MS IDBac per l'analisi dei dati sulle proteine microbiche e sui metaboliti specializzati

Di seguito è descritta una procedura operativa standard semplificata per la profilazione del microbioma che utilizza il sequenziamento e l'analisi metagenomica del rRNA 16S utilizzando strumenti liberamente disponibili. Questo protocollo aiuterà i ricercatori che non hanno familiarità con il campo del microbioma e quelli che richiedono aggiornamenti sui metodi per ottenere una profilazione batterica a una risoluzione più elevata.

Analisi microbiota utilizzando PCR in due fasi e sequenziamento genico rRNA 16S di nuova generazione

Qui presentiamo un protocollo per la rapida identificazione di proteine prodotte da batteri patogeni sequenziati genomicamente utilizzando la spettrometria di massa tandem MALDI-TOF-TOF e l'analisi proteomica top-down con software sviluppato internamente. Gli ioni proteici metastabili si frammentano a causa dell'effetto dell'acido aspartico e questa specificità viene sfruttata per l'identificazione delle proteine.

Identificazione di proteine immunitarie antibatteriche in Escherichia coli utilizzando MALDI-TOF-TOF-MS/MS e analisi proteomica top-down

Questo protocollo consente una valutazione rapida ed economica della composizione microbica nei prodotti lattiero-caseari combinando la culturromica con MALDI-TOF MS. Fornisce risultati di tassonomia paragonabili al sequenziamento dell'rRNA 16S con un tempo di risposta più breve rispetto ai metodi di coltura tradizionali.

Valutazione della Sicurezza Microbica dei Caseifici mediante Profilazione Proteomica Batterica tramite Approccio MALDI

Un metodo semplice per l'identificazione di batteri patogeni priorità è quella di utilizzare fago giornalista geneticamente modificato. Queste fago reporter, che sono specifici per la loro specie ospite particolare, sono in grado di trasduzione rapidamente una risposta bioluminescente segnale alle cellule ospite. Qui, descriviamo l'uso del fago giornalista per la rilevazione...

Phage &#39;Bioluminescent&#39; Reporter per il rilevamento di batteri patogeni di categoria A

Embrioni di zebrafish trasparente si sono dimostrati padroni di casa modello utile per la visualizzazione e lo studio delle interazioni funzionali tra cellule immunitarie innate e batteri patogeni intracellulari, come ad...

L&#39;infezione di embrioni di zebrafish con batteri patogeni intracellulari

Scopri l'identificazione di batteri patogeni rari tramite MALDI-TOF MS e sequenziamento del gene 16S rRNA. Questo metodo rapido ed economico migliora la diagnostica microbiologica clinica con Myroides odoratimimus.

Identificazione di batteri patogeni rari da 16S rRNA sequenziamento del gene e MALDI-TOF MS

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