Identificazione di batteri patogeni rari da 16S rRNA sequenziamento del gene e MALDI-TOF MS
11 luglio 2016
La spettrometria di massa a tempo di volo con desorbimento/ionizzazione laser assistita da matrice (MALDI-TOF MS) e le tecniche molecolari (sequenziamento genico dell'rRNA 16S) consentono l'identificazione di patogeni batterici rari nella diagnostica di routine. L'obiettivo di questo protocollo risiede nella combinazione di entrambe le tecniche che porta a dati più accurati e affidabili.
L'obiettivo generale di questo protocollo di spettrometria di massa MALDI-TOF è quello di migliorare la tipizzazione di patogeni rari attraverso una procedura rapida ed economica. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della microbiologia diagnostica, consente una rapida edificazione di patogeni batterici rari. Oggi vogliamo parlare dell'odoratimimus e dei batteri del genere Myroides.
Dimostrare il metodo e parlare dell'interpretazione dei risultati. In generale, gli individui che non conoscono questo metodo potrebbero avere difficoltà poiché il trasferimento di batteri, la sovrapposizione con le metriche e l'interpretazione dei risultati richiedono competenze tecniche e competenze microbiologiche. Abbiamo avuto l'idea di utilizzare MALD-TOF MS per lo screening dei batteri rari quando abbiamo avuto un paziente nel nostro ospedale affetto da un'infezione alimentare diabetica causata da myroides odoratimus.
Inizia questo protocollo con l'estrazione del DNA batterico, la PCR del DNA ribosomiale 16S e il sequenziamento Sanger come descritto nel protocollo di testo. Usa uno stuzzicadenti di legno per trasferire una singola colonia batterica in un pozzo di un bersaglio in acciaio a 96 pozzetti. Posizionare un microlitro di acido formico al 70% sopra l'organismo essiccato all'aria sul bersaglio in acciaio e lasciare asciugare per circa due o tre minuti.
Sovrapporre lo spot con un microlitro di soluzione di matrice contenente 50 mg/ml di CHCA in un solvente organico composto da 50% acetonitrile, 2,5 acido trifluoroacetico e 47,5% di acqua. Lascia asciugare all'aria lo striscio e la matrice sovrapposta per circa cinque minuti in una cappa. Per introdurre i campioni, aerare la porta di caricamento del campione dello spettrometro di massa premendo il pulsante in/out dello strumento.
Aprire la porta di caricamento e inserire la piastra di puntamento MALDI-TOF MS con la matrice dello striscio batterico PLUS essiccata. Chiudere il porto ed evacuare nuovamente. Osservare il vuoto e quando raggiunge i 4,5 milioni di millibar iniziare la misurazione.
Aprire il software di analisi MMIS e fare clic sul menu file. Seleziona Nuova classificazione"e dovrebbe aprirsi una nuova finestra chiamata MALDI Biotyper Real Time Classification Wizard". Digita il nome del progetto nel campo Nome progetto" e fai clic su Nuovo, sotto la nuova finestra di dialogo denominata Nuovo progetto, controlla il nome del progetto e procedi facendo clic sul pulsante Va bene".
Nella procedura guidata di classificazione in tempo reale di MALDI Biotyper, osservare la finestra di posizionamento dell'analita. Selezionare le posizioni di destinazione, fare clic con il pulsante destro del mouse su qualsiasi posizione selezionata e selezionare Aggiungi campioni. Nella visualizzazione tabella aperta automaticamente, digitare il nome dell'esempio, l'ID dell'esempio e, facoltativamente, un commento.
Fare clic sul pulsante "per procedere. Quindi, osservare la finestra di selezione dei metodi MALDI Biotyper. Seleziona Tassonomia Bruker"dagli MSP da Alberi della tassonomia e fai clic su Avanti"per continuare.
Quindi, osservare la finestra di riepilogo del progetto. Controllare le voci inserite sopra riportate per il progetto di classificazione vero e proprio. Avviare l'esecuzione della classifica facendo clic sul pulsante "Fine".
Le misurazioni si avviano automaticamente quando viene raggiunto il vuoto appropriato. Seguire l'esecuzione della classificazione fino a quando la misurazione non è stata completata con successo. Una volta completata la misurazione, aprire il menu Visualizza"e fare clic su Risultati" per visualizzare la tabella dei risultati nel MALDI Biotyper Real Time Classification Project One.
Visualizza i risultati della classificazione Bruker-Daltonik MALDI Biotyper come file html nel browser web predefinito. Stampa e salva i risultati. Qui sono mostrati gli spettri ottenuti da MALDI-TOF MS che vengono misurati e classificati in tempo reale.
Agli spettri viene assegnato un nome di specie e un valore di punteggio che riflette la qualità della misurazione. Punteggi superiori a 2.300 rappresentano un'identificazione di specie altamente probabile. Un punteggio compreso tra 2.000 e 2.300 indica un'identificazione sicura della specie.
Un punteggio inferiore a 1.700 e 2.000 designa una probabile identificazione della specie. E un punteggio inferiore a 1.700 non è affidabile. L'identificazione di agenti patogeni batterici cresciuti su una coltura pura su un terreno solido richiede da due a tre minuti.
È importante ricordare che i batteri patogeni rari possono essere trovati con MALDI-TOF MS solo quando lo strumento contiene in modo affidabile gli spettri appropriati. In caso contrario, deve essere eliminato integrando spettri MaSDA da ceppi tipizzati dei loro isolati caratterizzati. Nel caso in cui i risultati del punteggio non portino a un'identificazione univoca del ceppo, possono essere applicati ulteriori metodi, come la profilazione biochimica o il sequenziamento dell'rDNA 16S.
Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla rilevazione batterica, può essere applicato anche ad altri microrganismi come funghi o anaerobi. Inoltre, è possibile misurare la resistenza ai batteri. Non dimenticare di lavorare con una matrice che è una sostanza pericolosa, indossare guanti, occhiali protettivi e lavorare sotto un cappuccio.
Inoltre, è assolutamente necessario asciugare la matrice e spalmare accuratamente per evitare schizzi nella camera di analisi.
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Panoramica
Questo protocollo descrive l'uso della spettrometria di massa MALDI-TOF per migliorare l'identificazione di patogeni batterici rari. Integrando questo metodo con tecniche molecolari, i ricercatori possono ottenere diagnosi più accurate in microbiologia.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Microbiologia
- Tecniche diagnostiche
- Identificazione dei patogeni
Sfondo
- La spettrometria di massa MALDI-TOF è uno strumento potente per il tipaggio dei patogeni.
- I patogeni batterici rari pongono sfide nella diagnostica di routine.
- Comprendere i limiti dei metodi tradizionali è fondamentale.
- Sono richieste competenze tecniche per un'implementazione efficace.
Scopo dello studio
- Migliorare l'identificazione di patogeni rari.
- Fornire una procedura diagnostica rapida ed economicamente vantaggiosa.
- Illustrare il metodo utilizzando esempi specifici di batteri.
Metodi Utilizzati
- Spettrometria di massa MALDI-TOF per lo screening di agenti patogeni.
- Sequenziamento del gene dell'rRNA 16S per l'identificazione molecolare.
- Procedure tecniche per il trasferimento e il rivestimento batterico.
- Interpretazione dei risultati della spettrometria di massa.
Risultati principali
- Corretta identificazione di Myroides odoratimimus.
- Dimostrazione diagnostica rapida per patogeni rari.
- Evidenziata l'importanza dell'esperienza tecnica.
- Forniti spunti sull'applicabilità del metodo in ambito clinico.
Conclusioni
- MALDI-TOF MS combinata con tecniche molecolari migliora la diagnostica.
- La formazione è essenziale per un uso efficace del metodo.
- Applicazioni future potrebbero ampliare il campo di identificazione dei patogeni.
Domande Frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
L'identificazione accurata di patogeni batterici rari è fondamentale per la microbiologia diagnostica nella ricerca e sviluppo biotecnologica, in particolare per popolazioni di pazienti immunocompromessi. L'integrazione della spettrometria di massa MALDI-TOF con il sequenziamento dell'RNA 16S consente un'identificazione rapida ed economicamente vantaggiosa a livello di specie, supportando la riduzione del rischio meccanicistica nella validazione di bersagli antimicrobici. Questo approccio combinato migliora la sicurezza predittiva nei modelli preclinici riducendo i falsi negativi nel rilevamento dei patogeni.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Prima Fase della Scoperta e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche confermando l'identità di patogeni rari in modelli di infezione.
- Valore operativo: Fornisce un'identificazione robusta dei ceppi conforme alla nomenclatura, essenziale per la riduzione del rischio sui bersagli in modo riproducibile.
- Valore predittivo: Supporta la selezione del portafoglio attraverso una caratterizzazione accurata dei patogeni in sistemi rilevanti per la malattia.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera output quantitativi di punteggio (ad esempio, >2.300 per un'identificazione altamente probabile) che consentono una conferma standardizzata dei risultati positivi nei test antimicrobici.
- Valore operativo: Favorisce la prontezza del saggio mediante l'identificazione rapida (<3 min) da colture pure, migliorando la produttività e la scalabilità del processo di screening.
- Valore di riproducibilità: Garantisce la comparabilità tra diversi laboratori grazie all'allineamento spettrale standardizzato e all'utilizzo di database validati.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Collega la scoperta alla continuità preclinica mediante la validazione di patogeni rari in modelli di infezione clinicamente rilevanti.
- Valore operativo: Consente decisioni di avanzamento proporzionate al rischio quando le soglie del punteggio (2.000–2.300) confermano l'identificazione sicura della specie.
- Continuità traslazionale: Favorisce l'allineamento dei biomarcatori quando la presenza del patogeno si correla con la risposta dell'ospite in modelli immunocompromessi.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla validazione del bersaglio alla valutazione preclinica, in cui l'identificazione accurata dell'agente patogeno orienta gli studi meccanicistici e la valutazione del composto promettente.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi confermando agenti batterici rari in modelli di infezione, riducendo l'ambiguità meccanicistica.
- Screening: Fornisce sistemi biologici validati e pronti per il saggio con output quantitativi per una valutazione affidabile dei composti.
- Analisi: Fornisce letture basate su punteggi (ad esempio, classificazione MALDI Biotyper) che consentono il confronto oggettivo delle condizioni e la validazione dei risultati positivi.
- Ricerca traslazionale: Si collega alla continuità preclinica attraverso la validazione del patogeno in sistemi pertinenti alla malattia, solo quando supportata dal materiale di origine.
- Riutilizzo aziendale: Funziona come capacità diagnostica riutilizzabile in diversi progetti su patogeni rari, riducendo gli sforzi ridondanti di validazione.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Affidabilità predittiva nella validazione degli target, riduzione degli assegnamenti errati ai patogeni e riduzione del rischio meccanicistico.
- Valore operativo: Standardizzazione, riproducibilità e scalabilità nell'identificazione dei patogeni tra diversi laboratori.
- Valore strategico: Miglioramento delle decisioni di avanzamento o interruzione nei programmi antimicrobici, efficienza del capitale grazie a diagnosi rapide e riduzione del rischio biologico in fasi avanzate.
- Impatto sul portafoglio: Prioritizzazione basata sul rischio dei candidati antimicrobici mediante identità confermate dei patogeni in modelli preclinici.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze microbiologiche per il trasferimento batterico, l'applicazione del film di matrice e l'interpretazione dei risultati.
- Dipende da strumentazione MALDI-TOF MS dotata di database tassonomici aggiornati (ad esempio, Bruker Taxonomy) per un corretto abbinamento degli spettri.
- Necessita di protocolli standardizzati di preparazione del campione per garantire un film di matrice e un'imbibizione asciutti, prevenendo la contaminazione dell'analizzatore.
- Richiede il ricorso al sequenziamento del gene 16S rRNA o al profilo biochimico qualora i punteggi MALDI-TOF scendano al di sotto di 1.700, valore al di sotto del quale l'identificazione non è affidabile.
- Comporta l'adozione di protocolli di sicurezza per la manipolazione di soluzioni di matrice pericolose (ad esempio, acido formico, acetonitrile) sotto cappa aspirante e con dispositivi di protezione individuale (PPE).
