Name: Sottocutanea angiotensina II per infusione con osmotica pompe Induce aortica aneurismi nei topi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 21 s
Description: Scopri come indurre aneurismi aortici nei topi mediante infusione sottocutanea di angiotensina II con pompe osmotiche. Questo metodo permette di studiare i meccanismi patologici della dilatazione aortica.

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Il lavoro di ricerca presentato in questo manoscritto è stato sostenuto da una sovvenzione (HL107319 ad Alan Daugherty e HL107326 a Lisa A. Cassis) dal National Institutes of Health degli Stati Uniti d'America. Il contenuto di questo manoscritto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente le opinioni ufficiali del National Institutes of Health. La pubblicazione di questo manoscritto è stata sponsorizzata da DURECT Corporation.

Etica Dichiarazione: studi del mouse vengono eseguiti con l&#39;approvazione della University of Kentucky Istituzionale Animal Care and Use Committee (IACUC numero di protocollo: 2006-0009). I topi vengono sacrificati a terminazione utilizzando un sovradosaggio cocktail di ketamina (~ 210 mg / kg) e xilazina (~ 30 mg / kg). 1. Calcolo del AngII Importo NOTA: Questo protocollo usa l&#39;esempio di infusione di AngII (1.000 ng / kg / min) per 4 settimane a 4 recettore LDL maschio - / - topi alimentati con una dieta ricca di grassi saturi. <ol><li> Pesare studiare topi prima di calcolare la quantità di AngII necessaria per infusione. </li><li> Utilizzare il modello (Tabella 1) per calcolare la massa AngII necessaria per l&#39;esperimento. Utilizzare il &quot;Mean pompaggio Rate&quot; indicato nella Istruzione di pompe come il &quot;tasso di pompaggio&quot; al punto 4 del modello. Nel modello, registrare i passaggi 1-5 manualmente, e Piazza di 6-10 vengono calcolati automaticamente. <ol><li> Nel modello, supporre chetopi guadagnerà 1 g di peso corporeo durante l&#39;infusione di AngII 1.000 ng / kg / min per 4 settimane. NOTA: Ogni topo può avere molto diverso peso corporeo che dipenderà da molte variabili, come il ceppo di topi e la dieta. Usiamo abitualmente &quot;0&quot; o &quot;1 g&quot; sulla base della nostra esperienza da studi precedenti. </li><li> Calcolare un volume totale di 300 ml di soluzione di AngII per ogni mouse dal momento che ogni pompa richiede circa 250 ml. </li></ol></li></ol> 2. Scioglimento AngII <ol><li> Conservare liofilizzato fiale Angii a -20 ° C. Equilibrare le fiale Angii a RT prima dell&#39;apertura. </li><li> Pesare la massa calcolata AngII (7,3 mg come mostrato in tabella 1) in un tubo di plastica sterile. NOTA: Per Merck Index, non usare tubi di vetro per la dissoluzione da una soluzione acquosa di AngII ha una forte affinità per il legame al vetro. </li><li> Aggiungere il volume calcolato di soluzione fisiologica sterile (1.200 μl) nel tubo di plastica contenente il liofilizzato AngII, berretto, e mescolare bene per inversione fino a quando la soluzione è limpida. </li><li> Numeri del mouse etichetta # 1, # 2, # 3, # 4 e sui singoli tubi di plastica sterili con tappo (0,5 - 1,5 ml). Preparare la soluzione AngII sotto cappa laminare per ogni mouse sulla base del peso corporeo come calcolato nel passo 1.2 e Tabella 1. <ol><li> Per esempio, pipettare 3,6 ml di soluzione salina sterile nella provetta # 1, poi 296,4 ml soluzione AngII, e mescolare bene pipettando su e giù delicatamente. </li></ol></li><li> Numeri del mouse Etichetta su tubi di plastica con tappi (4 ml, sterili). Questi saranno utilizzati per l&#39;incubazione di pompe come descritto nel punto 3.13. </li></ol> 3. La pompa osmotica Riempimento <ol><li> Ottenere pompe in due parti distinte: il corpo principale della pompa e il moderatore flusso (Figura 1). Ogni scatola ha 10 corpi pompa e moderatori di flusso che vengono avvolti singolarmente. Registrare il numero di lotto. NOTA: Indossare sempreguanti perché gli oli trasferiti dalle mani alla carcassa esterna di pompe possano influire negativamente la funzione di pompaggio. Utilizzare guanti sterili, garze, tubi, aghi di riempimento, e pesare le barche per preparare le pompe, per evitare il rischio di infezione dall&#39;impianto. </li><li> Aprire solo il numero di corpi pompa e moderatori flusso necessari per lo studio, in quanto questi non possono essere memorizzati una volta aperti. Se sono necessari più di 10 pompe, in modo che i numeri di lotto delle pompe sono gli stessi per uno studio, dal momento che le pompe di lotti differenti hanno differenti volume di riempimento medio e pompa Rate. </li><li> Pesare ogni pompa (che comprende sia il corpo principale e il flusso moderatore), e prendere nota del peso di 4 cifre decimali (ad esempio, 1,1443 g di mouse # 1). Questo peso, denominato &quot;Pump Peso vuoto&quot; nel modello (Tabella 1), viene utilizzato per calcolare il rapporto pieno. </li><li> Applicare l&#39;ago di riempimento pompa per un 1 cc siringa sterile e compilare accuratamente la siringa con la soluzione AngII dal modo appropriatonumerato tubo di plastica. È importante evitare aspirando aria nella siringa. </li><li> Rimuovere tutte le bolle d&#39;aria con attenzione dalla siringa mentre l&#39;ago è posizionato verso il basso. Tenere l&#39;ago / siringa in questa posizione per impedire l&#39;introduzione di bolle nella pompa. </li><li> Inserire delicatamente l&#39;ago riempimento nel corpo della pompa. Fare avanzare la punta dell&#39;ago nella pompa. Non appoggiare la punta dell&#39;ago saldamente sul fondo della pompa. </li><li> Spingere lo stantuffo della siringa lentamente per riempire la pompa con la soluzione AngII. Un&#39;ombra scura all&#39;interno della pompa indica il livello di riempimento. Il volume di riempimento è di circa 246 ml, secondo le istruzioni. </li><li> Arrestare riempimento della pompa ed eliminare accuratamente l&#39;ago non appena una goccia di liquido aumenta dalla pompa. </li><li> Inserire flusso moderatore nella pompa attraverso il foro sulla parte superiore del corpo della pompa fino a quando non si vede gap tra la testa del moderatore flusso e la parte superiore del corpo pompa (Figura 1). </li><li> Inserimento di moderato nel corpo pompa porta a qualche liquido fuoriuscito dall&#39;apertura del moderatore flusso. Cancella accuratamente tutto il liquido in più che avrebbe potuto trapelato durante il posizionamento di moderatori. </li><li> Pesare pompa riempita. Registrare il peso sotto &quot;Pump Peso riempito&quot; nel modello. </li><li> Calcolare il grado di riempimento (%) = (Pump peso &quot;pieno&quot; - &quot;vuoto&quot;) x 1.000 / dire volume di riempimento x 100. <ol><li> Calcolare riempimento Rapporto come indicato nella tabella 1. Idealmente, il grado di riempimento deve essere uguale o superiore a 100%. Pompa refill se il rapporto di riempimento è &lt;95% (comportando un bolle d&#39;aria che può essere presente in pompa). </li></ol></li><li> Mettere pompa riempita nel etichettato 4 ml di tubo (passo 2.5) con la testa rivolta verso l&#39;alto moderatore. Aggiungere un volume sufficiente di soluzione salina sterile per coprire la pompa. Tenere la pompa in tubo di soluzione fisiologica fino impianto. </li><li> Porre le provette in un incubatore 37 ° C. Pompe Incubare O / N (almeno 12 ore) per consentire priming parziali, e poi impiantare in topi. Pompazione di AngII inizia circa 24 ore dopo l&#39;impianto, che consente ai topi per recuperare da un intervento chirurgico prima di qualsiasi stress potenziale derivante durante AngII infusione. </li></ol> 4. Preparazione per Pompa impianto <ol><li> Autoclave (modalità gravità, ciclo di asciugatura, 15 min) garze, tamponi di cotone e strumenti chirurgici, tra cui forbici, emostatico, forcipe, punti metallici e spillatrice almeno 1 giorno prima dell&#39;intervento. </li><li> In una stanza procedura, preparare vaporizzatore per l&#39;anestesia con isoflurano. Aprire teli sterili in una cappa a flusso laminare, e posizionare ogiva per l&#39;anestesia isoflurano. Mettere betadine, il 70% di etanolo, acqua sterile, perlina sterilizzatore, frizione delle mani antisettico, tamponi, garze, e le pompe riempiti in una cappa laminare. </li><li> Don una maschera e abito, quindi aprire un drappo esterna in una cappa laminare con le mani pulite. Indossare guanti sterili e aprire la confezione interna sterile. </li></ol> 5. Procedura chirurgica di pompa impianto <ol><li> Posto del mouse in un cham ad induzioneber con afflusso di isoflurano ad un flusso di 1.5 - 2%. Monitorare il mouse per altri 2-3 minuti dopo decubito. Shave un&#39;area delle dimensioni di un quarto, sulla spalla sinistra oa destra. </li><li> Posizionare il mouse in una cappa laminare, con il naso a filo con un cono collegato a deflusso isoflurano (Figura 2A). Posizionare la testa del topo verso mano dominante del chirurgo. Usare pomata veterinario sugli occhi del mouse per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia. Assicurarsi che il mouse ha alcuna risposta alla stimolazione del dolore prima dell&#39;intervento. Ad esempio, la risposta del pedale è un buon indicatore per il dolore. </li><li> Tampone e pulire zona rasata con betadine seguita da tre salviette con il 70% di etanolo. Don o cambiare i guanti sterili. </li><li> Utilizzare un bisturi chirurgico per effettuare una ~ 1 cm un&#39;incisione dietro l&#39;orecchio sopra la scapola della gamba anteriore. Questa incisione dovrebbe essere perpendicolare alla coda. Prestare attenzione per tagliare i tessuti solo la pelle e non sottostante. </li><li> Tenere forceps in una mano per aprire incisione, e utilizzare l&#39;altra mano per fare un tunnel sottocutaneo sotto la pelle utilizzando un emostatico (Figura 2B). </li><li> Anticipo punta emostatico verso la coda, e creare una tasca per la pompa. Questo si ottiene aprendo attentamente le ganasce della pinza emostatica sotto la pelle per aprire un sacchetto. Ritirare il hemostat da incisione. </li><li> Inserire la pompa nella incisione con la testa moderatore posizionata verso la parte posteriore del mouse (Figura 2C). Spingere delicatamente la pompa completamente in tasca. Ci dovrebbe essere spazio sufficiente per chiudere la ferita senza tensione o stiramento della pelle. </li><li> Una volta che una pompa è stata inserita, pizzicare saldamente entrambi i lati dell&#39;incisione, raddrizzando modo che i bordi si incontrano, e inserire 1 o 2 clip ferita per chiudere (Figura 2D). Controllare il sito di incisione per garantire che non vi è completa chiusura della ferita, e che la pompa non è premendo direttamente sul sito. </li><li> Applicare la crema lidocaina topica(4% in peso / peso) con un mouse di cotone swab.Remove pulita dal cono di naso, e posizionarlo su una piastra elettrica fino a quando non riprende conoscenza. Dopo il recupero, il mouse viene riportata alla sua gabbia. </li><li> Mettere strumenti chirurgici in uno sterilizzatore tallone per 10 secondi tra i topi. Lasciare strumenti raffreddare prima dell&#39;uso. Guanti puliti con frizione con prodotto antisettico tra i topi. Monitorare tutti i mouse fino a raggiungere il pieno recupero. </li><li> Monitorare topi da vicino dopo l&#39;intervento chirurgico. Iniettare un bolo di soluzione fisiologica sterile (0,2 - 0,3 ml) per via sottocutanea se un topo mostra segni di sofferenza, disidratazione o perdita di peso apparente. Osservare topi almeno due volte al giorno per i primi 10 giorni, e almeno una volta al giorno successivamente. Eseguire immediatamente una necroscopia se eventuali topi muoiono durante AngII infusione. Rimuovere clip ferita tra 7 - 14 giorni dopo l&#39;intervento chirurgico. </li></ol> 6. Fare la raccolta, Riparazione, secco, e imaging di aorte <ol><li> Tagliare aprire il torace del mouse e cavità addominale ventrale, taglio open atrio destro, defluire in con soluzione fisiologica attraverso ventricolo sinistro del cuore per rimuovere il sangue nell&#39;aorta, e quindi raccogliere l&#39;aorta 27. </li><li> Mettere aorte raccolte in provette di plastica contenenti almeno 3 ml di paraformaldeide al 4% o al 10% di formalina neutra tamponata per 24-48 ore 27. </li><li> Rimuovere accuratamente i tessuti avventiziali. Aorta perno su cera nera con degli spilli. Acquisire immagini aortica con lo stesso ingrandimento. Include un righello in ciascuna immagine per la calibrazione, come mostrato nella figura 3. </li></ol> 7. En face Imaging di aortas <ol><li> Tagliare dell&#39;aorta aperta longitudinalmente attraverso la curvatura esterna ed interna di arco aortico, e tagliare rami principali aperte, tra cui anonima, sinistra carotide e succlavia sinistra. Pin dell&#39;aorta appartamento con avventiziale esterno posa accanto alla cera nera. </li><li> Acquisire it quadro volto della superficie intimale dell&#39;aorta allo stesso ingrandimento. Includere un righello in ogni immagine per la calibrazione, come spettacolon in figura 4. </li></ol>

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</ol>

La pubblicazione di questo articolo è sponsorizzato da Alzet.

Pompe osmotiche offrendo AngII sottocutanea è un approccio di routine per indurre aneurismi aortici nei topi. Sulla base dei dati provenienti da molti laboratori, ci sono state scoperte coerenti che questo è un metodo affidabile e riproducibile per studiare sia AAAs 3,4 e TAA 22-26 nei topi. Pertanto, questo modello di topo è considerato un modello che riassume molte caratteristiche di aneurismi aortici umani e fornisce approfondimenti meccanicistici in queste malattie devastanti. Mentre l&#39;invecchiamento è un fattore di rischio per AAA negli esseri umani, non è stato sistematicamente studiata per AAA AngII-indotta nei topi. Tuttavia, sembra incidenza e la gravità di AAA AngII-indotti sono simili nei topi all&#39;età di 8 - 48 settimane 4,5,7. Attualmente, ci sono solo pochi studi che riportano TAA AngII-indotta nei topi all&#39;età di 8 - 24 settimane 22-26, che non presentavano differenze correlati all&#39;età sulla formazione TAA. Topi di sesso femminile hanno una molto più bassa incidenza di AAA di topi maschi infuso con AngII 4,28. Vale anche la pena notare che l&#39;incidenza di AngII indotta AAA è molto più alto rispetto ai topi in iper normo-cholesterolemic, che è oltre il 50% rispetto a meno del 30%, rispettivamente. Inoltre, la rottura aortica è frequente (circa 10 - 30%) sia in topi normo- e ipercolesterolemici durante AngII infusione. L&#39;infusione di AngII ad una velocità di 1.000 ng / kg / min in topi ipercolesterolemici, come recettore LDL - / - mice nutriti con una dieta occidentale o apolipoproteina (apoE) - / - mice nutriti con una dieta normale o occidentale, ha effetti massimi su AAA sviluppo 3,4,29. Questa velocità di infusione è ottimale per uno studio in cui la manipolazione di un gene di interesse nei topi ipercolesterolemici si prevede di ridurre AAA. Se una manipolazione nei topi ipercolesterolemici dovrebbe aumentare AAA, si raccomanda di infusione AngII ad una velocità di 500 ng / kg / min o inferiore 30. In contrasto AAAs, non c&#39;è demonstrated associazione tra genere maschile o ipercolesterolemia e AngII indotta TAA 25. Tuttavia, analogamente a AAA, se la manipolazione di un gene di interesse è previsto per aumentare TAA, si consiglia una velocità di infusione inferiore a 1.000 ng / kg / min per AngII infusione. E &#39;anche importante sapere che incidenza e la gravità degli aneurismi dell&#39;aorta AngII-indotti variano tra i singoli topi e tra gli studi. Se i topi non sviluppano aneurismi aortici, una potenziale possibilità è che AngII potrebbe non essere stato consegnato con successo in topi. Per la convalida di infusione ad una velocità elevata di AngII, ad esempio 1.000 ng / kg / min, la misurazione della pressione sanguigna è raccomandato prima e durante l&#39;infusione AngII utilizzando un metodo tail-polsino non invasivo 31. AngII infusione ad una velocità di 1,000 ng / kg / min aumenta la pressione sanguigna sistolica nei topi. Inoltre, le concentrazioni plasmatiche possono essere renina misurati durante AngII infusione o in cessazione dal AngII ha un feedback negativo su rsecrezione enin. Pertanto, AngII infusione porta ad una diminuzione della concentrazione di renina nel plasma. Se un mouse infuso con AngII non ha patologie apparenti aortici, nessun aumento della pressione sanguigna, e nessuna diminuzione della concentrazione della renina plasmatica, indicherebbe che AngII non è stato consegnato in modo efficiente attraverso il mini-pompa osmotica impiantato. Consigliamo di rimuovere questo mouse dallo studio. E &#39;anche importante notare che alcuni topi non sviluppano aneurismi aortici, nonostante un aumento della pressione sanguigna sistolica e una diminuzione della concentrazione plasmatici di renina. Questi topi devono rimanere nello studio. In sintesi, AngII infusione si ottiene impianto sottocutaneo utilizzando pompe osmotiche per indurre aneurismi aortici nei topi. Questo metodo offre AngII costantemente ad un tasso definito per durate designati che vengono utilizzati per studiare sia AAA e TAA.

Aneurismi aortici mostrano espansione luminale permanente dell&#39;aorta che fa presagire la rottura e di solito porta alla morte. Questa malattia si verifica in entrambe le regioni dell&#39;aorta addominale e toracica, che sono definiti come aneurismi dell&#39;aorta addominale (AAA) e aneurismi dell&#39;aorta toracica (TAA), rispettivamente. A causa di una comprensione incompleta dei meccanismi molecolari e processi patofisiologici, non esiste una terapia medica provata che può impedire l&#39;espansione o la rottura di entrambi i tipi di aneurismi aortici. Poiché è difficile acquisire campioni ed effettuare esperimenti in esseri umani direttamente, ricerca incentrata sulla definizione di meccanismi AAAs è stato frequentemente estrapolata da modelli animali. Un modello animale comunemente usato è l&#39;infusione sottocutanea di angiotensina II (AngII) in topi. Rispetto ad altri approcci chirurgici per indurre AAA nei topi, come intra-aortica perfusione elastase o applicazione peri-aortici di cloruro di calcio che richiedono laparotomia 1,2, questo metod non richiede l&#39;immissione nella cavità del corpo e richiede competenze chirurgica minima 3,4. Infusione sottocutanea di AngII attraverso pompe osmotiche per indurre AAA è stato inizialmente segnalato in bassa densità-lipoproteine ​​(LDL) del recettore - / - topi nutriti un grasso arricchito dieta satura 3, e successivamente in apoE - / - mice nutriti con una dieta normale di laboratorio 4. Molti studi recenti hanno inoltre dimostrato che AngII induce AAA nei topi normolipidemici 5-7. L&#39;approccio di infondere AngII è stato applicato per indurre AAA ed esplorare meccanismi molecolari, nonché lo sviluppo di potenziali strategie terapeutiche (ad esempio, 5-15), in quanto questo modello riassume molte caratteristiche osservate in AAA umani. Ad esempio, i fattori di rischio di AAA umane quali il fumo, l&#39;invecchiamento, e il sesso maschile anche aumentano AAA AngII-indotta nei topi 16,17. L&#39;associazione di ipercolesterolemia con AAA negli esseri umani richiede un chiarimento. Tuttavia, ha essereit coerente che ipercolesterolemia aumenta AngII-indotta nei topi AAA 18. Patologie di AAA AngII indotte nei topi sono molto eterogenea e sono caratterizzati da una profonda infiltrazione di macrofagi, degradazione del collagene, la formazione trombotica e la risoluzione, e neovascolarizzazione 19-21. In contrasto con la posizione aortica infrarenale più comune di AAAs nell&#39;uomo, AngII indotta nei topi AAAs verificano nella regione aortica surrenale. Un&#39;altra caratteristica onnipresente di AngII indotta AAA è la rottura mediale transmurale, che porta alla trombosi transmurale. Non è chiaro se la rottura transmurale elastina si verifica negli esseri umani in quanto lo sviluppo patologico di AAA negli esseri umani non è stato studiato esclusivamente per mancanza di tessuti aneurismatiche da fasi precedenti. AngII infusione in topi porta anche ad una profonda espansione della regione aortica toracica, che è prevalentemente limitato alla aorta ascendente, che è la regione più comune per TAA nell&#39;uomo <sup&gt; 19,22-26. Simile a AAA AngII-indotta, TAA indotto durante AngII infusione anche ricapitolare molte caratteristiche di umana TAA 25. Tuttavia, a differenza di AAA AngII-indotta, TAA AngII-indotta non sono associati con ipercolesterolemia e non hanno differenze di genere. L&#39;obiettivo generale di infusione sottocutanea AngII in topi è quello di studiare le caratteristiche patologiche e meccanismi molecolari di AAA e TAA.

<table><tbody><tr><td>Angiotensina II</td><td>Bachem</td><td>H-1705</td><td>composto utilizzato per indurre aneurismi aortici Alzet</td></tr><tr><td>Osmotic Pumps</td><td>DURECT Corporation</td><td>Alzet Modello 2004</td><td>fattibile per infusione di 28 giorni in topi di peso > 20 g</td></tr><tr><td>Dieta arricchita di grassi saturi</td><td>Harlan Teklad</td><td>TD.88137</td><td>42% calorie/calorie per stimolare l'ipercolesterolemia nei topi -/- del recettore LDL</td></tr></tbody></table>

sottocutanea angiotensina ii per infusione con osmotica pompe induce aortica aneurismi nei topi

Subcutaneous Angiotensin II Infusion using Osmotic Pumps Induces Aortic Aneurysms in Mice

Le pompe osmotiche erogano continuamente composti a un ritmo costante in piccoli animali. Questo articolo introduce un protocollo standard utilizzato per indurre aneurismi aortici tramite infusione sottocutanea di angiotensina II (AngII) da pompe osmotiche impiantate. Questo protocollo include il calcolo della quantità e della dissoluzione di AngII, il riempimento della pompa osmotica, l'impianto di pompe osmotiche per via sottocutanea, l'osservazione dopo l'impianto della pompa e il prelievo di aorte per visualizzare gli aneurismi aortici nei topi. L'infusione sottocutanea di AngII attraverso pompe osmotiche seguendo questo protocollo è una tecnica affidabile e riproducibile per indurre aneurismi dell'aorta addominale e toracica nei topi. La durata dell'infusione varia da pochi giorni a diversi mesi in base allo scopo dello studio. AngII 1.000 ng/kg/min è sufficiente per fornire i massimi effetti sulla formazione di aneurisma dell'aorta addominale in modelli murini maschi ipercolesterolemici come topi con deficit di apolipoproteina E o con deficit di recettore delle lipoproteine a bassa densità. L'incidenza di aneurismi dell'aorta addominale indotti dall'infusione di AngII tramite pompe osmotiche è da 5 a 10 volte inferiore nelle femmine di topo ipercolesterolemico e anche inferiore in entrambi i sessi dei topi normocolesterolemici. Al contrario, gli aneurismi dell'aorta toracica indotti da AngII nei topi non sono ipercolesterolemia o dipendenti dal genere. È importante sottolineare che molteplici caratteristiche di questo modello murino ricapitolano quelle degli aneurismi dell'aorta umana.

Le 4 del recettore LDL maschio - / - mice descritti nella sezione protocollo sono stati sacrificati dopo 4 settimane di AngII infusione. Aorte sono state raccolte, pulite, e ripreso visualizzare dilatazioni aortiche. Come mostrato in figura 3, aorte hanno diverse caratteristiche diverse tra cui l&#39;espansione della regione surrenale (AAA, Figura 3A), l&#39;espansione della regione ascendente (TAA; Figura 3B), o l&#39;espansione di entrambe le regioni (presenza di entrambi AAA e TAA; Figura 3C), mentre la morfologia di un mouse sono abbondantemente normale (Figura 3D). Dilatazione dell&#39;aorta addominale viene quantificato misurando la larghezza massima ex vivo della regione surrenale, come illustrato dalla linea rossa nella Figura 3A. Per misurare la dilatazione dell&#39;aorta ascendente, aorte veniva aperto e riposte, come mostrato nella Figura 4. Superficie intimale è stata misurata nella regione aortica ascendente (zona circondata da thlinee rosse e nella Figura 4A) per quantificare TAA. Un righello è stato incluso in ogni immagine di standardizzare le misurazioni, come mostrato in entrambe le figure 3 e 4. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53191/53191fig1.jpg" /> . Figura 1. Immagine rappresentativa della pompa osmotica pieno Ogni pompa contiene due parti separate: un corpo principale e un moderatore di flusso. Dopo aver riempito il corpo pompa con AngII, il moderatore portata è inserito per sigillare la pompa. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53191/53191fig2.jpg" /> Figura 2. Processo di chirurgia pompa impianto (A) del mouse viene posizionato in una cappa laminare con un cono che è continuamente rilasciando isoflurano e ossigeno.; (B) un emostatico diritta viene inserito nella incisione cutanea per fare un tunnel sottocutaneo; (C) La pompa è inserito attraverso la<html> incisione cutanea delicatamente; (D) L&#39;incisione cutanea viene pinzato dopo l&#39;inserimento della pompa. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53191/53191fig3.jpg" /> Figura 3. immagini aortica (ex vivo) da topi infusi con AngII AngII 1.000 ng / kg / min è stato infuso in recettore LDL maschio -. / - Mice per 28 giorni. (A) AAA accompagnata da trombosi; Linea rossa (2.05 mm) mostra la misura della larghezza massima aortica nella regione surrenale. (B) Ascendente dilatazione aortica (TAA) con grossolanamente normale dell&#39;aorta addominale; (C) dilatazioni profonde sia ascendente e surrenali regioni aortici (TAA e AAAS); (D) dell&#39;aorta grossolanamente normale senza dilatazione apparente di crescente o soprarenale regione aortica. 4.jpg &quot;/&gt; Figura 4. En immagini di volti di regioni dell&#39;aorta toracica da topi infusi con AngII Angii 1.000 ng / kg / min è stato infuso in recettore LDL maschio -. / - Topi per 28 giorni. Superficie delineata da una linea rossa rappresenta la regione aortica ascendente compreso parte dell&#39;arco aortico. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> 1 </td><td colspan="2"> Dose richiesta </td><td></td><td> 1.000 </td><td colspan="2"> ng / kg / min </td><td></td></tr><tr><td> 2 </td><td colspan="3"> Inizia il peso corporeo (il più grande del mouse) </td><td> 24.8 </td><td> g </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 3 </td><td colspan="3"> Totale stimato del peso corporeo </td><td> 1 </td><td> g </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 4 </td><td> Tasso di pompaggio </td><td></td><td></td><td> 0.25 </td><td> pl / h </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 5 </td><td colspan="2"> Number di topi </td><td></td><td> 4 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 6 </td><td colspan="2"> Dose per ora per animali </td><td></td><td> 1518 </td><td> ng </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 7 </td><td> Conc necessario </td><td></td><td></td><td> 6072 </td><td> ng / ml </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 8 </td><td colspan="2"> Per 300 la soluzione ul </td><td></td><td> 1.82 </td><td colspan="2"> mg / 300 ml </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="2"> SOLUZIONE NECESSARIO </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 9 </td><td colspan="2"> Totale AngII (mg) </td><td></td><td> 7.3 </td><td> mg </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 10 </td><td colspan="2"> Disciolto in soluzione salina &amp;# 160; </td><td></td><td> 1.200 </td><td> pl </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td colspan="2"></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Topo </td><td> Peso corporeo </td><td> Fattore di diluizione </td><td colspan="2"> Volume (ml) </td><td colspan="2"> Pompa Peso (g) </td><td> Rapporto Riempito </td></tr><tr><td> # </td><td> (g) </td><td></td><td> AngII </td><td> Salino </td><td> Vuoto </td><td> Pieno </td><td> (%) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 24.5 </td><td> 1.0 </td><td> 296,4 </td><td> 3.6 </td><td> 1,1443 </td><td> 1,3877 </td><td> 99 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 23.0 </td><td> 0.9 </td><td> 278.2 </td><td> 21.8 </td><td> 1,1677 </td><td> 1,4145 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 24.8 </td><td> 1.0 </td><td> 300.0 </td><td> 0.0 </td><td> 1,1438 </td><td> 1,3904 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 21.8 </td><td> 0.9 </td><td> 263,7 </td><td> 36.3 </td><td> 1,1438 </td><td> 1,3904 </td><td> 100 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="7"> Fattore di diluizione = peso corporeo del peso del mouse / corpo del grande topo </td><td></td></tr></tbody></table><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Topo </td><td> Peso corporeo </td><td> Fattore di diluizione </td><td colspan="2"> Volume (ml) </td><td colspan="2"> Pompa Peso (g) </td><td> Rapporto Riempito </td></tr><tr><td> # </td><td> (g) </td><td></td><td> AngII </td><td> Salino </td><td> Vuoto </td><td> Pieno </td><td> (%) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 24.5 </td><td> 1.0 </td><td> 296,4 </td><td> 3.6 </td><td> 1,1443 </td><td> 1,3877 </td><td> 99 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 23.0 </td><td> 0.9 </td><td> 278.2 </td><td> 21.8 </td><td> 1,1677 </td><td> 1,4145 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 24.8 </td><td> 1.0 </td><td> 300.0 </td><td> 0.0 </td><td> 1,1438 </td><td> 1,3904 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 21.8 </td><td> 0.9 </td><td> 263,7 </td><td> 36.3 </td><td> 1,1438 </td><td> 1,3904 </td><td> 100 </td></tr></tbody></table> Tabella 1: Calcolo per 28 giorni infusione tramite pompe osmotiche.

Impianto sottocutaneo di pompe osmotiche fornisce un modo conveniente per la consegna prolungata e costante di composti. Questo approccio è stato ampiamente utilizzato per lo studio sia aneurismi dell&#39;aorta addominale e toracica nei topi.

Sottocutanea angiotensina II per infusione con osmotica pompe Induce aortica aneurismi nei topi

Osmotic pumps continuously deliver compounds at a constant rate into small animals.  This article introduces a standard protocol used to induce aortic ...

L'obiettivo generale di questa procedura è studiare le caratteristiche patologiche e i meccanismi molecolari degli aneurismi aortici nei topi. Questo viene ottenuto preparando innanzitutto una pompa osmotica con soluzione di angiotensina due. Viene quindi creata una tasca nella pelle della schiena dell'animale, all'interno della quale viene inserita la pompa.In definitiva, la dilatazione dell'aorta nelle regioni aortiche toracica e addominale può essere valutata mediante imaging ex vivo. Abbiamo quindi implementato per primi questa tecnica perché desideravamo definire il ruolo della pressione sanguigna durante l'infusione di angiotensina per indurre lo sviluppo dell'aterosclerosi. A dimostrare la procedura saranno Deborah Hart e Angio banan, entrambi membri del Soha Cardiovascular Research Center, per il riempimento delle pompe osmotiche.Iniziare registrando il numero di lotto delle pompe e dei moderatori di flusso inclusi con la parte principale della pompa e del flusso. Indossare guanti per evitare di trasferire oli della pelle sulla carcassa esterna della pompa. Successivamente, aprire solo il numero di pompe e moderatori di flusso necessari per lo studio.Quindi pesare ogni pompa, comprensibile del corpo principale e del moderatore di flusso, annotando il peso con quattro cifre decimali. Questo peso, denominato peso della pompa vuota nel modello, verrà utilizzato per calcolare il rapporto di riempimento una volta pesate tutte le pompe. Applicare l'ago di riempimento della pompa a una siringa sterile da un cc e riempire con attenzione la siringa con soluzione di angiotensina due appena preparata dal tubo di plastica opportunamente numerato.Rimuovere con attenzione tutte le bolle d'aria dalla siringa con l'ago posizionato verso il basso. Mantenere quindi la siringa in questa posizione per evitare l'introduzione di bolle nella pompa. Inserire delicatamente l'ago di riempimento nel corpo della pompa.Quando l'ago è in posizione, avanzare la punta all'interno della pompa fino a quando non tocca leggermente il fondo della pompa. Quindi premere lentamente lo stantuffo per erogare circa 246 microlitri della soluzione. L'ombra scura all'interno della pompa può essere utilizzata per monitorare il livello di riempimento.La pompa è piena. Quando una goccia di fluido fuoriesce dalla pompa, rimuovere con attenzione l'ago e inserire il moderatore di flusso nella pompa attraverso il foro sulla sommità del corpo della pompa, fino a quando non si vede alcuno spazio tra la testa del moderatore di flusso e la parte superiore del corpo della pompa. Asciugare delicatamente qualsiasi fuoriuscita di fluido in eccesso causata dall'inserimento.Quindi pesare la pompa riempita e registrare il peso nella relativa cella "peso pompa riempita" nel modello. Il rapporto di riempimento può quindi essere calcolato utilizzando la formula indicata, e questi dati possono essere inseriti nella cella "rapporto di riempimento" del modello. Idealmente, il rapporto di riempimento dovrebbe essere pari o superiore al 95%. Una volta riempita la pompa, posizionarla in un'apposita provetta sterile di plastica da quattro millilitri, con la testa del moderatore rivolta verso l'alto, e aggiungere un volume sufficiente di soluzione salina sterile per coprire completamente la pompa.Successivamente, quando tutte le pompe sono state conservate, posizionare i tubi in un incubatore a 37 gradi Celsius per almeno 12 ore per consentire un parziale condizionamento delle pompe nel giorno dell'implantazione. Indossando camice, mascherina e guanti, rasare un'area delle dimensioni di un quarto di cerchio sulla spalla di un topo anestetizzato e trasferire l'animale in una cappa a flusso laminare. Dopo aver applicato un unguento sugli occhi dell'animale e aver verificato l'assenza di risposta alla pressione sulle dita dei piedi, pulire e strofinare l'area rasata con Betadine, seguito da tre passaggi con etanolo al 70%.Successivamente, utilizzare un bisturi chirurgico sterilizzato in autoclave per praticare un'incisione di un centimetro nella pelle perpendicolarmente alla coda e dietro l'orecchio, sopra la spalla dell'arto anteriore. Quindi, con una pinza in una mano, aprire l'incisione utilizzando un emostatico. Con l'altra mano, creare un tunnel sottocutaneo sotto la pelle avanzando con la punta dell'emostatico verso la coda.Aprire con attenzione le ganasce dell'emostato per creare una tasca per la pompa. Successivamente, sostituire l'emostato con la pompa corrispondente appropriata, posizionando la testa del moderatore nella parte posteriore del topo, e spingere delicatamente la pompa completamente all'interno della tasca. Deve esserci spazio sufficiente per chiudere la ferita senza tensione o stiramento della pelle.Una volta posizionata la pompa, pizzicare saldamente e raddrizzare entrambi i lati dell'incisione in modo che i margini si incontrino e chiudere la cute con uno o due fermi per ferite. Ispezionare il sito dell'incisione per assicurarsi che la chiusura della ferita sia completa e che la pompa non prema direttamente sull'incisione. Successivamente, utilizzare un bastoncino di cotone pulito per applicare una crema topicale di lidocaina sulla zona.Infine, trasferire il topo su un tappetino riscaldante fino al recupero della coscienza, quindi restituire l'animale alla sua gabbia. In questo esperimento, dopo quattro settimane di infusione di angiotensina mediante pompe impiantate come appena dimostrato, queste aorte sono state prelevate da topi knock-out per il recettore delle lipoproteine a bassa densità al fine di visualizzare le dilatazioni aortiche. Come osservato nelle immagini, le aorte hanno mostrato diverse caratteristiche differenti, tra cui l'espansione della regione soprarenale, l'espansione della regione ascendente, oppure l'espansione di entrambe le regioni, con un topo che presentava una morfologia grossolanamente normale.La dilatazione dell'aorta addominale è stata quindi quantificata misurando la larghezza massima della regione senale ex vivo, come illustrato dalla linea rossa utilizzata per misurare la dilatazione dell'aorta ascendente. L'aorta è stata quindi aperta e fissata come mostrato. L'area superficiale intima è stata misurata nella regione dell'aorta ascendente utilizzando i righelli in ciascuna di queste immagini e in quelle successive, inclusi per garantire la standardizzazione delle misurazioni, una volta acquisita padronanza della tecnica.Questa procedura non dovrebbe richiedere più di cinque minuti per ogni massa.

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Formazione immagine di ultrasuono è diventata una modalità comune per determinare le dimensioni luminale degli aneurismi dell'aorta toracici ed addominale in topi. Questo protocollo descrive la procedura per acquisire immagini affidabili e riproducibili ecografia bidimensionale dell'aorta ascendente ed addominale in topi.

Formazione immagine di ultrasuono dell'Aorta toracica ed addominale in topi per determinare le dimensioni di Aneurysm

Descriviamo un protocollo chirurgico per indurre costantemente robusti aneurismi aortici discendenti nei topi. La procedura prevede la toracotomia sinistra, l'esposizione all'aorta toracica e il posizionamento di una spugna imbevuta di elastasi pancreatica porcina sulla parete aortica.

Modello chirurgico murine dell'elastasi topica indotta decrescente all'aneurtica toracica

Questo nuovo modello crea robusti aneurismi aortici infrarossi nei suini utilizzando una combinazione di angioplastica a palloncino, perfusione di elastasi/collagesi, applicazione di elastasi topica e somministrazione orali composto di ammisofino, che interferisce con il cross-linking di collagene.

Modello porcinario dell'aneurisma aortico addominale a infrarosso

Il presente protocollo descrive un metodo chirurgico standardizzato per il modello AAA indotto da elastasi attraverso l'applicazione diretta di elastasi all'avventizia dell'aorta addominale infrarenale nei topi.

Modello di aneurisma dell'aorta addominale del topo indotto dall'applicazione perivascolare dell'elastasi

Questo protocollo descrive l'impianto consecutivo di una pompa osmotica per indurre l'aneurisma dell'aorta addominale mediante rilascio di angiotensina II in topi carenti di apolipoproteina E (ApoE) e di una porta di accesso vascolare con catetere della vena giugulare per il trattamento farmacologico ripetuto. Il monitoraggio dello sviluppo dell'aneurisma mediante ecografia 3D viene condotto efficacemente nonostante gli impianti dorsali.

Trattamento farmacologico mediante catetere venoso centrale in un modello murino di aneurisma dell'aorta addominale indotto da angiotensina II e monitoraggio mediante ecografia 3D

Questo protocollo descrive un modello murino di aneurisma dell'aorta addominale indotto da fosfato di calcio (AAA) per studiare le caratteristiche patologiche e i meccanismi molecolari delle AAA.

Un modello di aneurisma dell'aorta addominale del topo indotto da fosfato di calcio

Questo manoscritto presenta un protocollo per stabilire un modello murino di aneurisma dell'aorta addominale utilizzando cloruro di calcio ed elastasi, combinando i vantaggi dei precedenti metodi di modellazione. Questo modello può essere utilizzato per studiare i meccanismi fisiopatologici alla base degli aneurismi dell'aorta addominale.

Un modello murino di aneurisma dell'aorta addominale mediante cloruro di calcio periavventiziale e infiltrazione di elastasi

Questo protocollo descrive un approccio chirurgico metodico per modellare gli aneurismi dell'aorta addominale avanzata nei topi mediante una combinazione di applicazione diretta di elastasi all'aorta infrarenale e somministrazione di ß-aminopropionitrile attraverso l'acqua potabile.

Modellazione avanzata dell'aneurisma dell'aorta addominale nei topi mediante combinazione di elastasi topica e ß-aminopropionitrile orale

Questo protocollo fornisce una procedura dettagliata e passo-passo per l'induzione della dissezione dell'aorta toracica nei topi. In particolare, include il calcolo preciso delle dosi richieste di β-aminopropionitrile e angiotensina II, la procedura per il riempimento della pompa osmotica e la tecnica di impianto della pompa osmotica.

Modello murino di dissezione dell'aorta toracica indotta da β-aminopropionitrile orale e infusione sottocutanea di angiotensina II

Questo protocollo fornisce un metodo ripetibile e affidabile per indurre aneurismi aortici addominali (AAA) nei topi C57BL/6 utilizzando sensibilizzazione con elastina e applicazione di elastasi perivascolare, come modello AAA che incorpora una componente di immunosensibilizzazione.

Creazione affidabile di un modello di aneurisma aortico addominale murino utilizzando sensibilizzazione con elastina ed elastasi perivascolare

Scopri come indurre aneurismi aortici nei topi mediante infusione sottocutanea di angiotensina II con pompe osmotiche. Questo metodo permette di studiare i meccanismi patologici della dilatazione aortica.

Sottocutanea angiotensina II per infusione con osmotica pompe Induce aortica aneurismi nei topi

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