Name: In Vitro Generazione di Murine plasmacitoidi dendritiche Cellule dal comune linfoide Progenitori utilizzando lAC-6 Alimentatore Sistema (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-23T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 18 s
Description: Scopri un metodo efficiente per generare cellule dendritiche plasmacitoidi da progenitori linfoidi comuni utilizzando il sistema di alimentazione AC-6. Questa tecnica consente di produrre grandi quantità di pDC partendo da pochi progenitori.

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Siamo grati a Drs. Markus Manz e Irving Weissman per la fornitura di reagenti. Riconosciamo inoltre il servizio fornito dal citometria a flusso di analisi e cellulare ordinamento Nucleo Struttura del Primo e del Secondo Nucleo Laboratory presso la National Taiwan University College of Medicine e NTU ospedale, rispettivamente. Questo lavoro è stato sostenuto dal Ministero della Scienza e della Tecnologia, Taiwan (MOST 102-2320-B-002-030-MY3) e il National Institutes Health Research, Taiwan (NHRI-EX102-10256SI e NHRI-EX103-10256SI).

C57BL / 6 topi wild-type sono stati acquistati dal National Laboratory Animal Center (NLAC), Taiwan. Tutti i topi sono stati allevati e tenuti in condizioni esenti da organismi patogeni specifici. Protocolli e le procedure di utilizzo degli animali sono stati esaminati e approvati dal Comitato di cura e l&#39;uso degli animali istituzionale della National Taiwan University College of Medicine (Permesso Numero: 20.120.075). Inoltre, i ricercatori fatto ogni sforzo per ridurre il potenziale di dolore, la sofferenza, l&#39;angoscia negli animali durante l&#39;esecuzione di esperimenti. Tutte le procedure descritte sono state effettuate a temperatura ambiente con i guanti. 1. Preparazione di 6-AC cellule feeder Nota: L&#39;AC-6.21 (AC-6 in breve) linea di cellule stromali 18 (fornito da I. Weissman, della Stanford University) deve essere mantenuta in RPMI integrato con siero fetale bovino inattivato al calore del 15% (FBS). Per servire come cellule di alimentazione, AC-6 celle sono γ-irradiati con 3000 rad (30Gy) un giorno prima della co-coltura per evitare la loro proliferazione. Nota thAC-6 celle tendono a perdere la loro capacità differenziazione sostenere se lasciato sovraffollate durante la manutenzione, o se il loro numero passaggio è superiore a 20. <ol><li> Lavare AC-6 celle una volta con 1 ml di Dulbecco Phosphate-Buffered Saline (DPBS) e rimuovere DPBS per aspirazione. Trattare AC-6 cellule con 0,8 ml di soluzione di tripsina (0,05% tripsina e EDTA 0,5 mM in DPBS) per 3-5 minuti a 37 ° C, 5% CO 2 e quindi arrestare la reazione diluendo con 10 volumi di mezzo di coltura a fare sospensione singola cellula. </li><li> Seme AC-6 celle a 5.9x10 4 cellule / pozzetto in piastre da 12 pozzetti e incubare a 37 ° C, 5% di CO 2 O / N. Nota: La densità di AC-6 celle è molto importante in quanto una densità inferiore favorirà generazione CDC. Semina ad una densità di 5.9x10 4 cellule / pozzetto permetteranno AC-6 per raggiungere confluenza entro il giorno successivo, che è ottimale per la derivazione di pDCs da CLPS. </li><li> Irradiare AC-6 celle a 3000 rad (30 Gy) con γ-irradiatore. Nota: La dose utilizzata per irradiare AC-6 è ottimizzato per evitare che le cellule proliferazione e tuttavia mantenerli vitali sufficientemente lungo da assicurare le citochine e contatto cellula-cellula necessari per la differenziazione delle DC da CLPS. </li><li> Aspirare media e sostituirlo con 1 ml RPMI completo (RPMI con 10% di calore inattivato FBS, 50 mg / ml di gentamicina e 50 micron β-mercaptoetanolo). </li></ol> 2. Isolare BM cellule da topi <ol><li> Sacrifica topi di CO 2 asfissia e dislocazione cervicale. Posizionare i topi su un vassoio dissezione e sterilizzare con il 70% di etanolo. Fare un&#39;incisione a metà addome e rimuovere la pelle dalla parte distale del mouse compresa la pelle che copre le estremità inferiori. </li><li> Sezionare topi in una cappa semi-sterile. Per rilasciare il femore e tibia, femore agganciare sopra e tibie sotto del ginocchio. Staccare i muscoli dalle ossa con le forbici e posto le ossa in una capsula di Petri 6 centimetri contenente 5 ml RPMI completare. </li><li> Spostarsi in una cappa di coltura sterile. Riempire una siringa da 3 ml collegata ad un ago 27G con RPMI completo. Tagliare entrambe le estremità delle ossa con le forbici, e inserire l&#39;ago 27G per irrigare il midollo dalle ossa iniettando delicatamente RPMI completo una volta da ogni estremità. </li><li> Preparare una singola sospensione cellulare delicatamente pipettando le cellule su e giù per 3-5 volte in piatto cultura con la siringa senza ago. </li><li> Centrifugare le cellule per 5 minuti a 500 xg e decantare il surnatante. </li><li> Lisare globuli rossi con 1 ml di tampone di ACK (150 mm NH 4 Cl, 10 KHCO mm 3, 0,1 mM EDTA) incubazione per 1 min e fermare la reazione diluendo con 10 volumi di RPMI completo. Consentono alle cellule riposare per 5 min per pellet giù grumi di cellule morte e detriti di tessuto per gravità. Nota: non stare in piedi più di 5 min come questo si tradurrà in una perdita di cellule a causa della sedimentazione di cellule vitali. </li><li> Lentamente decantare il surnatante cellulare contenente un nuovo tubo lasciando detritidietro nel tubo originale. </li><li> Centrifugare per 5 minuti a 500 xg per far sedimentare le cellule, quindi rimuovere e scartare il surnatante. </li><li> Risospendere le cellule totali BM (tipicamente 4-6 x 10 7 cellule BM sono ottenuti da un topo) in 100 microlitri tampone FACS (PBS 1x + 2% FBS + 1 mM EDTA). </li></ol> 3. FACS Analisi e ordinamento di CLPS <ol><li> Aggiungi anti-CD16 / 32 (ibridoma supernant clone 2.4G2, 50 ml / reazione o 1-2 mg / reazione) in cellule in tampone FACS (passo 2.9) per 1-2 minuti, al fine di bloccare i recettori Fc. Nota: Anti-CD16 / 32 è anche chiamato blocco Fc, che si aggiunge a prevenire legame non specifico degli anticorpi di cellule esprimenti recettori Fc, tra cui i granulociti, monociti e linfociti B. </li><li> Contemporaneamente colorare le cellule con i seguenti anticorpi fluorescenti colorante marcati (per 4x10 7 cellule) per 15 min in ghiaccio, evitando luce ambientale. Anticorpi: marcatori lignaggio PE-coniugati (0,2 mcg ciascuna) tra cui anti-CD3 (17A2), anti-CD8 (53-6,7), anti-B220 (RA3-6B2), anti-CD19 (eBio1D3), anti-CD11b (M1 / 70), anti-Gr-1 (RB6-8C5), anti- Thy1.1 (HIS51), anti-NK1.1 (PK136), anti-TER119 (TER-119), e anti-MHC-II (NIMR-4), 0.2 mg anti-c-Kit-PerCP-Cy5.5 (2B8), 1 mg anti-Sca-1-FITC (D7), 0.4 mg anti-M-CSFR-APC (AFS98), e 0,2 mg anti-IL-7Rα-PE-Cy7 (A7R34). </li><li> Lavare le cellule con 3 ml di tampone FACS, e centrifugare per 5 min a 500 x g. </li><li> Risospendere le cellule in 300 microlitri di buffer FACS e celle filtranti attraverso un colino cella di 40 micron. </li><li> Lavare il tubo con un 100 microlitri di buffer FACS aggiuntivo per recuperare tutte le cellule residue e filtrare in un FACS sterile ordinamento tubo con la stessa colino cella. </li><li> Eseguire immediatamente citometria a flusso dopo la colorazione utilizzando filtri e tensioni appropriati per il rilevamento del segnale. Utilizzare 488 nm laser per rilevare gli anticorpi FITC, PerCP-Cy5.5-etichettati, 561 nm laser per rilevare il PE e PE-anticorpi Cy7-labelded e 633 nm laser per rilevare l&#39;anticorpo marcato APC. </li><li> Classificare CLPS secondo i seguenti marcatori lin - c-kit int Sca-1 int M-CSFR - IL-7Rα + (come macchiato al punto 3.2) utilizzando un cell sorter. Raccogliere le cellule ordinati in una provetta da 15 ml contenente 8 ml di RPMI completo come un cuscino. </li><li> Registrare il numero assoluto di cellule ordinati come mostrato dalla cell sorter alla fine della corsa. Tipicamente, 5x10 4 CLPS possono essere ottenuti dal BM di un topo. </li></ol> 4. coculture CLPS e AC-6 <ol><li> Centrifugare le cellule ordinati dal punto 3.7 per 10 minuti a 500 xg, rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare con abbastanza completo RPMI per ottenere una densità cellulare intorno 5x10 4 cellule / ml. Seed 500 cellule / pozzetto in 12-pozzetti contenenti cellule di alimentazione previste al punto 1.4. </li><li> Aggiungere 100 ng / ml FL 19 (hu-Flt3L-Ig generato internamente utilizzando un sistema di espressione fornita da M. Manz, University Hospital Zurigo, Svizzera) e incubare a 37 ° C, 5% CO 2 con controllo visivo periodico di sviluppo DC al microscopio. Nota: disponibile in commercio FL umana ricombinante o il mouse FL può essere utilizzato come un sostituto per hu-Flt3L-Ig per sostenere lo sviluppo continua. </li><li> Raccogliere le cellule nel supernatante a giorno 12 e lavare i pozzetti una volta con 0,5 ml di terreno RPMI completare combinando sovranatanti risultanti. Aggiungere 0,5 ml di mezzo fresco e rottami le cellule aderenti con un raschietto cellulare. </li><li> Combinare il mezzo cellulare contenente da entrambe le parti e centrifugare per 5 min a 500 x g. </li><li> Surnatante e risospendere le cellule decantare in 50 microlitri di buffer FACS. Aggiungere 50 microlitri anti-CD16 / 32 ibridomi surnatante e incubare per 1-2 minuti per bloccare i recettori Fc. </li><li> Enumerare e macchia tutte le celle con i seguenti anticorpi (0,05 mcg ciascuna) anti-CD11c-APC (N418), anti-CD11b-FITC e anti-B220-PE. </li><li> Lavare e centrifugare le cellule come descrivered al punto 3.3. </li><li> Risospendere le cellule in 100 microlitri di buffer FACS, cancello CD11c + e analizzare per CDC (CD11c + CD11b + B220 -) e pDCs (CD11c + CD11b - B220 +) 17. </li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Qui si descrive un sistema in vitro in coltura per la robusta generazione di DC, e pDCs in particolare, da un piccolo numero di CLPS. L&#39;unicità di questo sistema di coltura è dovuto all&#39;uso di AC-6 cellule, una linea cellulare stromale, come alimentatori. Questo approccio ha dimostrato di fornire non solo le citochine, come IL-7, SCF, M-CSF e FL 20, ma anche il contatto cellula-cellula 21 necessario per sostenere lo sviluppo DC. AC-6 cellule sono state usate in precedenza per facil...

Le cellule dendritiche (DC) sono cellule presentanti l&#39;antigene professionale che svolgono un ruolo importante nel controllo risposte immunitarie 1. Mentre DC sono eterogenei, possono essere classificati in due popolazioni, DC convenzionale (CDC) e cellule dendritiche plasmacitoidi (PDC) 2,3. Oltre agli organi linfoidi, CDC e pDCs si trovano anche in tessuti tra cui polmone, intestino, pelle e 2. La morfologia di CDC e pDCs differenzia, con CDC espositrici proiezioni dendriti-simili e la forma di pDCs essere più plasma alveolare. Inoltre, il marcatore DC comune topo, CD11c, è più altamente espresso su CDCS che su pDC. Inoltre, CDC può essere ulteriormente suddivisa in CD11b + CD24 - CDC e CD11b - CD24 + CDC, entrambi i quali esprimono alti livelli di MHC di classe II e molecole costimolatorie di fare pDCs 2. PDC mature, d&#39;altra parte, hanno mostrato di esprimere selettivamente Siglec-H e BST2 4. Functionally, CDC sono antigene migliori presentano cellule rispetto sono pDCs; tuttavia, pDCs in grado di produrre una grande quantità di interferone di tipo I dopo l&#39;infezione da virus o la stimolazione infiammatoria 5. Entrambi i CDC e pDCs sono di breve durata, e di conseguenza, devono essere costantemente rifornite da progenitori all&#39;interno del midollo osseo (BM) 6,7. Trasferimento adottivo di progenitori comuni mieloidi (CMP) e progenitori linfoidi comuni (CLPS) in topi irradiati letalmente dimostra che i CDC e pDCs possono essere generati da entrambe le linee 8-10. Tuttavia, vi è un sottoinsieme di pDC che esprimono RAG1 / 2 e possiedono segmenti DJ riarrangiati al locus IgH 11,12. Queste cellule condividono anche analogie molecolari con linfociti B, tra cui l&#39;espressione del marcatore B220, recettori dell&#39;acido nucleico-sensing (TLR7 / TLR9), e fattori di trascrizione (SPIB e BCL11A) 13, dispone di tutto che si ritiene essere le firme del lignaggio linfoide. Pertanto, CLPs possono essere buone scelte per la generazione in vitro di pDCs causa di lignaggio somiglianza. Mentre la frequenza sia CDC e pDC negli esseri umani e nei topi è molto basso 6, DC, particolarmente CDC, può essere generato in vitro da BM o progenitori in presenza di citochine quali GM-CSF o 11,14 Flt3 ligand (FL ) utilizzando sistemi privi di alimentazione 11,15,16. Purtroppo, però, non è possibile produrre un gran numero di pDC in vitro su FL 11,15,16. In precedenza abbiamo dimostrato che pDCs possono essere efficacemente generati in vitro da CLPS utilizzando il sistema 17 AC-6 alimentatore. Il vantaggio di usare la linea cellulare stromale AC-6 nel sistema di coltura è che fornisce il contatto cellula-cellula e la secrezione di citochine che supportano la generazione di un gran numero di pDC da CLPS. Anche se la produzione con questo sistema è molto robusto, attento replica delle procedure descritte di seguito i è necessariol fine di garantire la generazione efficiente di pDCs.

<table><tbody><tr><td>Anti-topo Ly6g/Ly6c (PE), clone RB6-8C5</td><td>Biolegend</td><td>108408</td><td>marcatore di lignaggio</td></tr><tr><td>Anti-topo NK1.1 (PE), clone PK136</td><td>Biolegend</td><td>108708</td><td>marcatore di lignaggio</td></tr><tr><td>Anti-topo&nbsp; CD11b (PE), cloneM1/70</td><td>Biolegend</td><td>101208</td><td>marcatore di lignagine</td></tr><tr><td>Anti-topo CD19 (PE), clone eBio1D3</td><td>Biolegend</td><td>115508</td><td>marcatore di lignagine</td></tr><tr><td>Anti-topo B220 (PE), clone RA3-6B2</td><td>Biolegend 103208</td><td></td><td>marcatore di lindro/FACS</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD3 (PE), clone 17A2</td><td>Biolegend</td><td>100308</td><td>marcatore di lignagine</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD8a (PE), clone 53-6.7</td><td>Biolegend</td><td>100707</td><td>marcatore di lignagine</td></tr><tr><td>Anti-topo MHC-II (PE), clone NIMR-4</td><td>Biolegend</td><td>107608</td><td>marcatore di lignagine</td></tr><tr><td>Anti-topo Ter119 (PE), clone TER-119</td><td>Biolegend</td><td>116208</td><td>marcatore di lignagine</td></tr><tr><td>Anti-topo Thy1.1 (PE), clone HIS51</td><td>eBioscience</td><td>12-0900-83</td><td>marcatore di lignaggio</td></tr><tr><td>Anti-topo M-CSFR (APC), clone AFS98</td><td>Biolegend</td><td>135510</td><td>FACS</td></tr><tr><td>C-Kit anti-topo (PerCP/Cy5.5), clone 2B8</td><td>Biolegend</td><td>105824</td><td>FACS</td></tr><tr><td>Anti-mouse Sca-1 (FITC), clone D7</td><td>Biolegend</td><td>108106</td><td>FACS</td></tr><tr><td>Anti-mouse IL-7Ra (PE/Cy7), clone A7R34</td><td>Biolegend</td><td>135014</td><td>FACS</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD11c (PerCP/Cy5.5), clone N418</td><td>Biolegend</td><td>117328</td><td>FACS</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD11b (FITC), clone M1/70</td><td>Biolegend</td><td>101206</td><td>FACS</td></tr><tr><td>FACSAria III</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Selezionatore cellulare</td></tr><tr><td>FACS tubo di smistamento</td><td>BD Biosciences</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>FlowJo LLC</td><td></td><td>Sofrware per l'analisi del flusso</td></tr></tbody></table>

in vitro generazione di murine plasmacitoidi dendritiche cellule dal comune linfoide progenitori utilizzando l&#39;ac-6 alimentatore sistema

In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System

Cellule dendritiche plasmacitoidi (PDC) sono di tipo potente che interferone (IFN-I) che producono cellule che si attivano in risposta a infezioni o durante le risposte infiammatorie. Purtroppo, studio della funzione pDC è ostacolato dalla loro bassa frequenza in organi linfoidi, e metodi esistenti per la generazione vitro DC prevalentemente favoriscono la produzione di CDC sopra pDC. Qui vi presentiamo un approccio unico per generare efficientemente pDCs da progenitori linfoidi comuni (CLPS) in vitro. In particolare, il protocollo ha descritto i dettagli come purificare CLPS dal midollo osseo e generano pDCs da coculturing con AC-6 cellule di alimentazione gamma-irradiati in presenza di Flt3 ligando. Una caratteristica unica di questo sistema di coltura è che i CLPS migrano sotto le celle AC-6 e diventano cellule territoriali che formano acciottolate, un passaggio fondamentale per l&#39;espansione pDCs. DC morfologicamente distinte, vale a dire PDC e CDC, sono stati generati dopo circa due settimane con una composizione di 70-90% pDCs in condizioni ottimali. Tipicamente, il numero di pDC generati da questo metodo è circa 100 volte del numero di CLPS seminati. Pertanto, questo è un nuovo sistema con cui generare robusto il gran numero di pDC necessarie per agevolare ulteriori studi sviluppo e la funzione di queste cellule.

Un totale di 7 4-6x10 cellule BM sono in genere isolate da femori e tibie di un 6-8 sett-vecchio, wild-type C57BL / 6 del mouse. Per risolvere CLPS, cellule totali BM sono colorate con anticorpi coniugati PE contro marcatori lignaggio (CD3, CD8, B220, CD19, CD11b, Gr-1, Thy1.1, NK1.1, TER119, e MHC-II), anti -c-Kit-PerCP / Cy5.5, anti-Sca-1-FITC, anti-M-Cecoslovacchia-APC e anti-IL-7Rα-PE / Cy7, analizzati e ordinati con un cell sorter. La strategia di ordinamento per CLP è mostrato in Figura...

In questo studio presentiamo un sistema di coltura in vitro in grado di generare in modo efficiente pDC co-coltivando progenitori linfoidi comuni con cellule feeder AC-6 in presenza del ligando Flt3.

In Vitro Generazione di Murine plasmacitoidi dendritiche Cellule dal comune linfoide Progenitori utilizzando l&#39;AC-6 Alimentatore Sistema

Plasmacytoid dendritic cells (pDCs) are powerful type I interferon (IFN-I) producing cells that are activated in response to infection or during ...

L'obiettivo generale di questa procedura è fornire un metodo efficiente per generare cellule dendritiche plasmacitoidi, o PDC, allo scopo di studiarne lo sviluppo. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo dell'immunologia, come ad esempio: in che modo viene regolato lo sviluppo delle PDC? Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente l'uso di un piccolo numero di cellule progenitrici per generare in modo efficiente elevate quantità di PDC.Le implicazioni di questa tecnica puntano alla terapia delle malattie autoimmuni associate al PDC, come il lupus eritematoso sistemico, l'atetosi e la psoriasi. A dimostrare la procedura oggi sarà Xang, un ottimo studente del laboratorio. Il giorno prima del prelievo delle cellule del midollo osseo, seminare le cellule della linea cellulare stromale AC6 in 12 pozzetti, con una densità di 5,9 × 10⁴ cellule per pozzetto, e incubare le piastre a 37 °C e 5% di anidride carbonica durante la notte. La mattina seguente, irradiare con raggi gamma le cellule AC6 a 3000 rad e sostituire il mezzo di coltura con un millilitro di mezzo completo.Successivamente, posizionare il numero appropriato di topi adulti di tipo selvatico C57 Black Six in un vassoio da dissezione e sterilizzare gli animali con etanolo al 70%. Trasferire quindi il vassoio in una cappa semi sterile ed effettuare incisioni nella regione mediale dell'addome di ciascun animale, rimuovendo la pelle dalle parti distali, comprese le estremità inferiori, per esporre femori e tibie; recidere il femore sopra e la tibia sotto le articolazioni del ginocchio ed utilizzare le forbici per staccare i muscoli dalle ossa man mano che vengono raccolte. Posizionare le ossa in una piastra di Petri da sei centimetri contenente cinque millilitri di RPMI completo e trasferire la piastra in una cappa da coltura sterile.Ora riempire una siringa da tre millilitri dotata di un ago da 27 gauge con RPMI completo e utilizzare delle forbici per tagliare entrambe le estremità di ciascun osso. Inserire l'ago in ciascun osso ed eseguire un'irrigazione delicata del midollo con un'iniezione di RPMI completo una volta da ciascuna estremità. Successivamente, senza l'ago, aspirare e dispensare delicatamente le cellule da tre a cinque volte nella piastra di coltura per ottenere una sospensione di cellule singole.Dopo aver centrifugato le cellule, lisare i globuli rossi con un millilitro di buffer CK, arrestando la reazione con 10 volumi di RPMI completo. Dopo un minuto, lasciare sedimentare per cinque minuti gli aggregati di cellule morte e i detriti, quindi decantare con attenzione il sopranatante in un nuovo tubo. Successivamente, dopo aver centrifugato nuovamente le cellule, sospenderemo le cellule totali del midollo osseo in 100 microlitri di buffer fax per analizzare i precursori linfoidi comuni, o CLP, mediante citometria a flusso.Successivamente, bloccare le cellule con anti-CD16/32 per uno o due minuti, seguito dalla colorazione simultanea delle cellule con il cocktail di anticorpi appropriato. Dopo 15 minuti sul ghiaccio, lavare le cellule in tre millilitri di buffer fax e risospendere il pellet in 300 microlitri di buffer fax fresco. Quindi filtrare la sospensione cellulare attraverso un filtro da 40 micrometri e ordinare immediatamente le cellule mediante citometria a flusso utilizzando i filtri e le tensioni appropriati.Raccogliere le cellule di interesse in un tubo da 15 millilitri contenente otto millilitri di RPMI completo. Per generare una popolazione di PDCM altamente arricchita, è fondamentale selezionare la popolazione corretta di CLP dalle cellule del midollo osseo raccolte, per la loro coltura in vitro con un sistema di alimentazione Z six. Al termine del sorting, centrifugare le cellule e risospendere il pellet di cellule CLP con un volume sufficiente di RPMI completo per ottenere una densità cellulare di circa cinque per 10 alla quarta cellule per millilitro.Successivamente, seminare 500 cellule per pozzetto in una piastra a 12 pozzetti contenente le cellule stromali AC6 e integrare le colture in co-coltura con 100 nanogrammi per millilitro di ligando FL3, quindi incubare le cellule a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica, monitorando periodicamente lo sviluppo delle cellule dendritiche o DC mediante microscopio. Al giorno 12, raccogliere le cellule nel sopranatante della co-coltura e lavare ogni pozzetto una volta con mezzo millilitro di mezzo RPMI completo, raccogliendo il sopranatante e i lavaggi. Quindi aggiungere mezzo millilitro di mezzo fresco in ogni pozzetto e utilizzare una spatola per cellule per staccare le cellule aderenti.Combinare le cellule distaccate con le cellule in sospensione e centrifugare la sospensione cellulare ottenuta. Risospendere il pellet in 50 microlitri di buffer fax. Quindi contare le cellule e colorarle per l'espressione di CD11c, CD11b e B220 dopo il blocco FC.Come appena dimostrato, le cellule in co-coltura possono essere analizzate per la presenza di popolazioni di cellule dendritiche convenzionali CD11c-positive, CD11b-positive, B220-negative e plasmacitoidi CD11c-positive, CD11b-negative, B220-positive, per un totale di quattro-sei volte 10 alla settima. Le cellule del midollo osseo vengono tipicamente isolate dai femori e dalle tibie di un topo wild-type C57BL/6 di età compresa tra le sei e le otto settimane, con circa 5 × 10⁴ CLP comunemente ottenuti da un singolo topo C57BL/6. Dopo il sorting mediante citometria a flusso, come appena descritto, tra il terzo e il quarto giorno di co-coltura con cellule feeder AC6, iniziano ad apparire cellule formanti aree tipo selciato, sulle quali si osservano cellule dendritiche plasmacitoidi di forma rotondeggiante sospese.All'ottavo giorno, il numero di DC plasmacitoidi circolanti raggiunge un picco tra il dodicesimo e il quattordicesimo giorno, momento in cui le cellule iniziano ad andare incontro ad apoptosi dopo aver completato il loro sviluppo, e il loro numero comincia a diminuire gradualmente. Le colonie di DC convenzionali compaiono successivamente, tra il sesto e l'ottavo giorno, e sono aderenti, con una morfologia allungata a forma di fuso. L'analisi citometrica in flusso dimostra che le colture co-associate sono per il 91% CD11c+, CD11b−, B220+ (DC plasmacitoidi) e per il 6% CD11c+, CD11b+, B220− (DC convenzionali), rivelando un'espansione di cento volte del numero di DC plasmacitoidi rispetto alla popolazione iniziale di CLP mediante questo metodo.Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante assicurarsi che la cellula a sei C sia in buone condizioni e che la densità di C sia corretta prima di aggiungere il CLP dopo uno sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia delle DC per superare il limite rappresentato dall'uso di un piccolo numero di proiettori per studiare lo sviluppo delle DC a partire da diversi proiettori. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come generare PC in vitro a partire da CLP utilizzando un sistema C sei BEAT.

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Immunologia e Infezioni

Questo video mostra la procedura per la differenziazione delle cellule dendritiche mieloidi dal midollo osseo dei topi. Isolamento di tibia e femore del mouse, e la lavorazione del midollo osseo sono dimostrati. Immagini che dimostrano morfologia cellulare prima e dopo la differenziazione, e le figure raffiguranti fenotipo delle cellule e IL-12 maturazione di produzione utilizzando i seguenti CpG sono mostrati.

Cultura di cellule dendritiche mieloidi dai precursori del midollo osseo

Presentazione dell'antigene in organi linfatici secondari da parte delle cellule dendritiche è cruciale per l'avvio della cellula T mediata risposta immunitaria adattativa. Qui mostriamo la cultura del midollo osseo derivate le cellule dendritiche murine, di attivazione e di etichettatura per 2-fotoni imaging.

Generazione di cellule derivate dal midollo osseo dendritiche murini per l&#39;uso in 2-fotone Imaging

Questo video descrive un protocollo per la generazione di cellule dendritiche - cellule chiave che presentano l'antigene che attivano le cellule T - dal midollo osseo di un topo adulto.

Generazione di cellule dendritiche derivate dal midollo osseo: un metodo per generare cellule dendritiche dal midollo osseo di topo

Fonte: Cruz-Adalia, A., et al. Le cellule T catturano i batteri mediante transinfezione dalle cellule dendritiche. J. Vis. Exp. (2016).Questo video mostra la transinfezione batterica attraverso interazioni tra cellule T antigene-cellule dendritiche. Le cellule dendritiche infettate da batteri che presentano il peptide dell'ovoalbumina vengono incubate con cellule T, direttamente o separate da una membrana. Il contatto diretto consente la formazione di sinapsi immunologiche, consentendo il...

Transinfezione batterica in vitro delle cellule T tramite formazione di sinapsi immunologiche

Questo video mostra un test in vitro per generare cellule dendritiche plasmacitoidi (pDC) da cellule progenitrici linfoidi comuni (CLP). Dopo la co-coltura di CLP purificati con cellule feeder irradiate con γ in presenza del ligando tirosin-chinasi-3 (FL) Fms-like, i CLP si differenziano in pDC non aderenti, la cui presenza è confermata mediante citometria a flusso.

Generazione in vitro di cellule dendritiche plasmacitoidi da progenitori linfoidi comuni

Questo protocollo descrive procedure sperimentali per valutare la differenziazione delle cellule dendritiche plasmacitoidi in placche di Peyer da progenitori comuni cellule dendritiche, utilizzando tecniche che comportano l'isolamento FACS-mediata delle cellule, il trasferimento genico idrodinamico, e analisi del flusso di sottoinsiemi immuni in placche di Peyer.

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Un metodo del rendimento efficiente e di alta per l&#39;isolamento di mouse dendritiche sottopopolazioni cellulari

Le cellule dendritiche immature possono essere differenziate selettivamente in cellule dendritiche tolleranti o mature per regolare l'equilibrio tra immunità e tolleranza. Questo lavoro presenta un mezzo per generare da cellule dendritiche immature derivate da monociti (moDC), moDC in vitro tollerogeniche e mature che differiscono nei fenotipi metabolici.

Generazione di Immaturo, matura e tollerogenico dendritiche cellule con differenti fenotipi metabolica

Qui, presentiamo un protocollo per sviluppare e caratterizzare le cellule dendritiche tollerogeniche (TolDCs) e valutare la loro utilità di immunoterapia.

Sviluppo e caratterizzazione funzionale delle cellule dendritiche tollerogeniche murino

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Un sistema di coltura timica tridimensionale per generare emigrati timici derivati da murine

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In Vivo Augmentazione dell'induzione delle cellule T regolatorie Gut-Homing

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In Vitro Generazione di Murine plasmacitoidi dendritiche Cellule dal comune linfoide Progenitori utilizzando lAC-6 Alimentatore Sistema (Video) | JoVE Journal

In Vitro Generazione di Murine plasmacitoidi dendritiche Cellule dal comune linfoide Progenitori utilizzando l'AC-6 Alimentatore Sistema

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