In Vitro Generazione di Murine plasmacitoidi dendritiche Cellule dal comune linfoide Progenitori utilizzando l'AC-6 Alimentatore Sistema

L'obiettivo generale di questa procedura è fornire un metodo efficiente per generare cellule dendritiche plasmacitoidi, o PDC, allo scopo di studiarne lo sviluppo. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo dell'immunologia, come ad esempio: in che modo viene regolato lo sviluppo delle PDC? Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente l'uso di un piccolo numero di cellule progenitrici per generare in modo efficiente elevate quantità di PDC.

Le implicazioni di questa tecnica puntano alla terapia delle malattie autoimmuni associate al PDC, come il lupus eritematoso sistemico, l'atetosi e la psoriasi. A dimostrare la procedura oggi sarà Xang, un ottimo studente del laboratorio. Il giorno prima del prelievo delle cellule del midollo osseo, seminare le cellule della linea cellulare stromale AC6 in 12 pozzetti, con una densità di 5,9 × 10⁴ cellule per pozzetto, e incubare le piastre a 37 °C e 5% di anidride carbonica durante la notte. La mattina seguente, irradiare con raggi gamma le cellule AC6 a 3000 rad e sostituire il mezzo di coltura con un millilitro di mezzo completo.

Successivamente, posizionare il numero appropriato di topi adulti di tipo selvatico C57 Black Six in un vassoio da dissezione e sterilizzare gli animali con etanolo al 70%. Trasferire quindi il vassoio in una cappa semi sterile ed effettuare incisioni nella regione mediale dell'addome di ciascun animale, rimuovendo la pelle dalle parti distali, comprese le estremità inferiori, per esporre femori e tibie; recidere il femore sopra e la tibia sotto le articolazioni del ginocchio ed utilizzare le forbici per staccare i muscoli dalle ossa man mano che vengono raccolte. Posizionare le ossa in una piastra di Petri da sei centimetri contenente cinque millilitri di RPMI completo e trasferire la piastra in una cappa da coltura sterile.

Ora riempire una siringa da tre millilitri dotata di un ago da 27 gauge con RPMI completo e utilizzare delle forbici per tagliare entrambe le estremità di ciascun osso. Inserire l'ago in ciascun osso ed eseguire un'irrigazione delicata del midollo con un'iniezione di RPMI completo una volta da ciascuna estremità. Successivamente, senza l'ago, aspirare e dispensare delicatamente le cellule da tre a cinque volte nella piastra di coltura per ottenere una sospensione di cellule singole.

Dopo aver centrifugato le cellule, lisare i globuli rossi con un millilitro di buffer CK, arrestando la reazione con 10 volumi di RPMI completo. Dopo un minuto, lasciare sedimentare per cinque minuti gli aggregati di cellule morte e i detriti, quindi decantare con attenzione il sopranatante in un nuovo tubo. Successivamente, dopo aver centrifugato nuovamente le cellule, sospenderemo le cellule totali del midollo osseo in 100 microlitri di buffer fax per analizzare i precursori linfoidi comuni, o CLP, mediante citometria a flusso.

Successivamente, bloccare le cellule con anti-CD16/32 per uno o due minuti, seguito dalla colorazione simultanea delle cellule con il cocktail di anticorpi appropriato. Dopo 15 minuti sul ghiaccio, lavare le cellule in tre millilitri di buffer fax e risospendere il pellet in 300 microlitri di buffer fax fresco. Quindi filtrare la sospensione cellulare attraverso un filtro da 40 micrometri e ordinare immediatamente le cellule mediante citometria a flusso utilizzando i filtri e le tensioni appropriati.

Raccogliere le cellule di interesse in un tubo da 15 millilitri contenente otto millilitri di RPMI completo. Per generare una popolazione di PDCM altamente arricchita, è fondamentale selezionare la popolazione corretta di CLP dalle cellule del midollo osseo raccolte, per la loro coltura in vitro con un sistema di alimentazione Z six. Al termine del sorting, centrifugare le cellule e risospendere il pellet di cellule CLP con un volume sufficiente di RPMI completo per ottenere una densità cellulare di circa cinque per 10 alla quarta cellule per millilitro.

Successivamente, seminare 500 cellule per pozzetto in una piastra a 12 pozzetti contenente le cellule stromali AC6 e integrare le colture in co-coltura con 100 nanogrammi per millilitro di ligando FL3, quindi incubare le cellule a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica, monitorando periodicamente lo sviluppo delle cellule dendritiche o DC mediante microscopio. Al giorno 12, raccogliere le cellule nel sopranatante della co-coltura e lavare ogni pozzetto una volta con mezzo millilitro di mezzo RPMI completo, raccogliendo il sopranatante e i lavaggi. Quindi aggiungere mezzo millilitro di mezzo fresco in ogni pozzetto e utilizzare una spatola per cellule per staccare le cellule aderenti.

Combinare le cellule distaccate con le cellule in sospensione e centrifugare la sospensione cellulare ottenuta. Risospendere il pellet in 50 microlitri di buffer fax. Quindi contare le cellule e colorarle per l'espressione di CD11c, CD11b e B220 dopo il blocco FC.

Come appena dimostrato, le cellule in co-coltura possono essere analizzate per la presenza di popolazioni di cellule dendritiche convenzionali CD11c-positive, CD11b-positive, B220-negative e plasmacitoidi CD11c-positive, CD11b-negative, B220-positive, per un totale di quattro-sei volte 10 alla settima. Le cellule del midollo osseo vengono tipicamente isolate dai femori e dalle tibie di un topo wild-type C57BL/6 di età compresa tra le sei e le otto settimane, con circa 5 × 10⁴ CLP comunemente ottenuti da un singolo topo C57BL/6. Dopo il sorting mediante citometria a flusso, come appena descritto, tra il terzo e il quarto giorno di co-coltura con cellule feeder AC6, iniziano ad apparire cellule formanti aree tipo selciato, sulle quali si osservano cellule dendritiche plasmacitoidi di forma rotondeggiante sospese.

All'ottavo giorno, il numero di DC plasmacitoidi circolanti raggiunge un picco tra il dodicesimo e il quattordicesimo giorno, momento in cui le cellule iniziano ad andare incontro ad apoptosi dopo aver completato il loro sviluppo, e il loro numero comincia a diminuire gradualmente. Le colonie di DC convenzionali compaiono successivamente, tra il sesto e l'ottavo giorno, e sono aderenti, con una morfologia allungata a forma di fuso. L'analisi citometrica in flusso dimostra che le colture co-associate sono per il 91% CD11c+, CD11b−, B220+ (DC plasmacitoidi) e per il 6% CD11c+, CD11b+, B220− (DC convenzionali), rivelando un'espansione di cento volte del numero di DC plasmacitoidi rispetto alla popolazione iniziale di CLP mediante questo metodo.

Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante assicurarsi che la cellula a sei C sia in buone condizioni e che la densità di C sia corretta prima di aggiungere il CLP dopo uno sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia delle DC per superare il limite rappresentato dall'uso di un piccolo numero di proiettori per studiare lo sviluppo delle DC a partire da diversi proiettori. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come generare PC in vitro a partire da CLP utilizzando un sistema C sei BEAT.