Generazione di pluripotenti indotte cellule staminali da umani periferici T Cellule con Sendai virus in condizioni di libera-Feeder

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di generare cellule staminali pluripotenti indotte o IPC da cellule T periferiche umane in condizioni di feeder free. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della medicina rigenerativa, incluso il modo in cui le cellule IPS possono essere applicate nell'uso clinico. Il vantaggio principale di questa tecnica è che le cellule IPS possono essere curate senza l'inclusione di un possibile refactoring del danno, che riduce il rischio di patogenicità.

L'implicazione di questa tecnica estende le terapie cellulari IPS clinicamente rilevanti a livello mondiale a causa del campionamento cellulare invasivo combinato con la riduzione del rischio di esporre le cellule IPS in via di sviluppo a patogeni non definiti. Quindi questo metodo può fornire informazioni sulla terapia clinica del servizio IPS. Può essere applicato anche ad altre aree, come le condizioni di modellazione delle malattie.

Iniziare a preparare le cellule T umane attivate diluendo 10 millilitri di sangue intero eparinizzato con 10 millilitri di pipetta DPBS. 15 millilitri di soluzione fol in una provetta conica da 50 millilitri. Pipettare lentamente il sangue diluito che scorre lungo la parete interna della provetta per sovrapporlo alla soluzione.

Fare attenzione a non disturbare l'interfaccia. Centrifugare la provetta a 400 volte G per 30 minuti a temperatura ambiente. Dopo la centrifugazione, osservare tre strati, tra cui uno strato trasparente inferiore, un sottile strato bianco contenente cellule mononucleate e uno strato superiore di plasma lattiginoso.

Trasferire lo strato di celle mononucleate in un nuovo tubo conico da 50 millilitri senza trasferire alcuna soluzione per il foro di inserimento. Quindi, aggiungi DPBS per portare il volume totale a 10 millilitri. Centrifugare la provetta a 200 volte G per cinque minuti a temperatura ambiente.

Scartare il surnatante, lavare le cellule con 10 millilitri di DPBS, centrifugare la provetta a 200 volte G per cinque minuti e rimuovere il surnatante. Quindi aggiungere un millilitro di terreno KBM 5, 0, 2 alle cellule e contare utilizzando un emocitometro per preparare la piastra di coltura cellulare, rivestire i pozzetti di una piastra a sei pozzetti con 10 microgrammi per millilitro di soluzione anticorpale anti-CD umana in PBS. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per almeno 30 minuti.

Dopo l'incubazione, rimuovere la soluzione di anticorpi dalla piastra otto e lavare una volta con PBS seminare le cellule mononucleate a una densità di 2,5 volte 10 fino alla quinta cellula per centimetro quadrato in un volume totale di due millilitri di terreno KBM 5 0 2 nelle piastre a sei pozzetti rivestite incubare le cellule per tre-sette giorni senza cambiare il terreno, a quel punto la cellula T dovrebbe raggiungere la confluenza dopo i tre-sette giorni. Trasferire le cellule T attivate con un terreno in una provetta conica da 15 millilitri e centrifugare a 200 volte G per cinque minuti. Rimuovere lo SNAT e aggiungere un millilitro di KBM 5 0 2 medio fresco.

Contare le cellule e la piastra 1,5 volte 10 per le sei cellule in due millilitri di terreno KBM 5 0 2 in ciascun pozzetto di una piastra a sei pozzetti rivestita di anticorpi anti-CD, quindi scongelare le soluzioni OC tre SOX due, KLF quattro e C-M-Y-C-H e L sendi sul ghiaccio in ogni virus Sendai ingegnerizzato individualmente in ciascun pozzetto e una molteplicità di infezione di 10. Incubare a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per 24 ore. Quindi raccogliere le cellule infette con una pipetta e trasferirle in una provetta conica da 15 millilitri.

Centrifugare le celle a 200 volte G per cinque minuti. Rimuovere il surnatante e aggiungere due millilitri di terreno fresco KBM 5 0 2. Riposizionare le cellule nei pozzetti di una piastra a sei pozzetti e incubare per 24 ore in un incubatore per colture cellulari.

Per recedere le cellule, scongelare prima la soluzione della matrice della membrana basale a quattro gradi Celsius durante la notte, sciogliere 0,2 millilitri della soluzione pensata in 10 millilitri di DMM F 12 piastra media, cinque millilitri della soluzione della matrice della membrana basale in piastre da 100 millimetri. Lasciare le piastre a temperatura ambiente per almeno 30 minuti per consentire alla matrice di ricoprire la piastra prima di seminare le cellule. Nel frattempo, raccogliere le cellule T infette dal virus SAI in una provetta conica da 15 litri e centrifugare a 200 volte G per cinque minuti.

Quindi risospendere il palato in un millilitro di terreno fresco KBM 5 0 2 e contare le cellule utilizzando un emocitometro dopo il periodo di incubazione di 30 minuti. Rimuovere la soluzione della matrice della membrana basale dalle due piastre, quindi risospendere una volta 10 alla quinta cellula e separatamente una volta 10 alle sei cellule in 10 millilitri di terreno fresco M-T-E-S-R, un terreno di coltura privo di cellule di alimentazione per ipsc. Pipettare ciascuna sospensione cellulare in una piastra separata da 100 millimetri

Incubare la piastra in un incubatore per colture cellulari. Cambiare il mezzo a giorni alterni dopo 20-30 giorni. Dovrebbero apparire colonie che assomigliano a colonie di cellule staminali embrionali.

Preparare sei piastre a parete per l'espansione IPSC incubando un millilitro di soluzione di matrice a membrana basale in ciascun pozzetto per 30 minuti a temperatura ambiente. Nel frattempo, osserva le piastre di coltura contenenti colonie di IPSC sotto uno stereomicroscopio e isola le singole colonie raschiandole con una pipetta da 20 microlitri. Trasferire ogni colonia in un pozzetto e in una piastra a 96 pareti contenente 20 microlitri di terreno M-T-E-S-R.

Dopo aver trasferito le colonie, aggiungere 200 microlitri di terreno M-T-E-S-R a ciascun pozzetto e pipettare su e giù per interrompere la colonia. Dopo aver rimosso la soluzione della matrice della membrana basale dalle piastre a sei pozzetti, trasferire le cellule da una singola colonia a ciascun pozzetto, quindi aggiungere due millilitri di terreno M-T-E-S-R, incubare le cellule in un incubatore per colture cellulari e cambiare il terreno a giorni alterni utilizzando colture prive di alimentatore e terreni privi di siero ipsc sono stati generati da cellule T periferiche umane. La colorazione immunofluorescente ha rivelato l'espressione di tipici marcatori cellulari pluripotenti, tra cui nano T tre quattro SSEA quattro, TRA uno 60 e TRA 180 1.

In queste linee IPSE derivate. Durante il tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di eseguire tutti i passaggi, tenendo conto di tutte le importanti considerazioni sulla sterilità e sulla biosicurezza.