Name: Generazione di pluripotenti indotte cellule staminali da umani periferici T Cellule con Sendai virus in condizioni di libera-Feeder (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: Scopri come generare cellule staminali pluripotenti indotte da linfociti T periferici umani utilizzando vettori Sendai virus in condizioni senza feeder. Questo metodo sicuro supporta applicazioni in medicina rigenerativa.

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Ringraziamo Yoshiko Miyake, Sayaka Kanaami, Chihana Fujita, Miho Yamaguchi, Natsuko Henmi, e Rei Ohno della scuola dell&#39;università Keio di Medicina per l&#39;assistenza tecnica. Questo lavoro è stato in parte finanziato da un programma di R &amp; D Systems sostegno per accelerare l&#39;uso pratico dei risultati della ricerca di salute, e il programma di strada per la realizzazione di Medicina Rigenerativa.

1. Preparare cellule T attivate umana <ol><li> Raccogliere 10 ml di sangue intero eparinizzati da un donatore mediante prelievo venoso. <ol><li> Ottenere il consenso informato dei donatori in anticipo di prelievo venoso. Venipuntura deve essere effettuata da personale qualificato ed addestrato. </li><li> Maneggiare i campioni di sangue ottenuti con materiale sterile e seguenti linee guida di biosicurezza adeguate. </li></ol></li><li> Diluire 10 ml di sangue intero eparinizzati con 10 ml D-PBS (-). </li><li> Mettere 15 ml di soluzione di Ficoll (PREMIUM Ficoll-Paque) in un nuovo tubo conico da 50 ml. </li><li> Strato la soluzione di sangue da 20 ml preparata al punto 1.2 sulla soluzione di Ficoll al punto 1.3. L&#39;utilizzo di un pipetta elettrico, della soluzione di sangue preparata al punto 1.2 correre lentamente lungo la parete interna del tubo. Fare attenzione a non mescolare la soluzione di sangue e la soluzione Ficoll. </li><li> Centrifugare a 400 xg per 30 minuti a RT. Impostare la velocità di decelerazione centrifuga per &quot;lento&quot;. Nota: Dopo la centrifugazione, un bianco sottilestrato emerge tra uno strato di plasma lattiginoso superiore e uno strato di Ficoll bassa chiara. Questo strato sottile bianca contiene cellule mononucleate. </li><li> Trasferire lo strato di cellule mononucleate in una nuova provetta conica da 50 ml con una pipetta 1 ml. Fare attenzione a non includere la soluzione di Ficoll. </li><li> Aggiungere D-PBS (-) per le cellule mononucleate ad un volume totale di 10 ml e centrifugare a 200 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Scartare il surnatante. Aggiungere 10 ml di D-PBS (-) alle cellule mononucleari, e centrifugare a 200 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Eliminare il surnatante, aggiungere 1 ml di KBM502 medio per le cellule mononucleate raccolti, e contare le cellule utilizzando un emocitometro. Oltre 5 × 10 6 cellule mononucleari possono essere ottenuti da 10 ml di sangue intero eparinizzati con separazione appropriato utilizzando Ficoll. </li><li> Preparare una soluzione di anticorpo CD3 anti-umano ad una concentrazione di 10 ug / ml in PBS-D (-). Aggiungere la soluzione di anticorpi anti-CD3 umana a una 6-pozzetti, immergere il surfasso di ogni pozzetto e incubare il piatto a 37 ° C in un incubatore CO 2 5% per almeno 30 min. </li><li> Rimuovere la soluzione di anticorpi CD3 anti-umano da ciascun pozzetto e lavare una volta con PBS-D (-) appena prima semina delle cellule. </li><li> Cellule mononucleate Seed che sono stati preparati nel passo 1.9 ad una densità di 2,5 x 10 5 cellule / cm 2 sui CD3 antiumano 6 pozzetti rivestiti con anticorpo in KBM502 media. Incubare a 37 ° C in un incubatore -CO 2 5% per 3-7 giorni senza mezzo di cambiamento fino a quando le cellule T raggiungono confluenza. Le cellule T in questo periodo sono sia le cellule in sospensione e aderenti. </li></ol> 2. Infettare T umano Celle con SEV Vettori <ol><li> Dopo 3-7 giorni la cultura, raccogliere le cellule T attivate con medio esistente pipettando. Trasferirli su un tubo da 15 ml e centrifugare a 200 g per 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Rimuovere il surnatante e aggiungere 1 ml di mezzo KBM502 fresco. Contare le cellule e la piastra 1.5 × 10 6 celle (in 2 ml di media KBM502 fresco) in ciascun pozzetto di una piastra da 6 pozzetti anti-CD3 anticorpo-rivestito. </li><li> Scongelare le soluzioni SEV di Oct3 / 4-SEV / TSΔF, SOX2-SEV / TSΔF, Klf4-SEV / TSΔF, e c-Myc (HNL) -sev / TS15ΔF sul ghiaccio. </li><li> Aggiungere le soluzioni SEV contenenti Oct3 / 4-SEV / TSΔF, SOX2-SEV / TSΔF, Klf4-SEV / TSΔF, e c-Myc (HNL) -sev / TS15ΔF individualmente ai pozzi, ciascuna ad una molteplicità di infezione (MOI) 10. Incubare a 37 ° C in un incubatore -CO 2 5% per altre 24 ore. </li></ol> 3. Rimuovere Sev Vettori da T cellule umane <ol><li> 24 ore dopo l&#39;infezione, raccogliere le cellule infettate con una pipetta. Se ci sono cellule aderenti, possono facilmente essere staccati li pipettando ripetutamente su e giù. Trasferirli su un tubo da 15 ml e centrifugare a 200 g per 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Eliminare il surnatante contenente i vettori Sev, e aggiungere 2 ml di mezzo KBM502 fresco. Cellule replate a each dei pozzetti. Incubare a 37 ° C in un incubatore -CO 2 5% per altre 24 ore. </li></ol> 4. Cellule reseed su uno strato Matrigel <ol><li> Preparare la soluzione di matrice membrana basale da gel matrice scongelamento (si veda l&#39;elenco dei materiali per il marchio specifico utilizzato in questo studio) a 4 ° C e sciogliendo 0,2 ml in 10 ml di terreno DMEM / F12. Nota: Gel Matrix (si veda l&#39;elenco dei materiali per il marchio specifico utilizzato in questo studio) deve scongelare O / N a 4 ° C per essere completamente scongelati. Tenerlo in ghiaccio fino al momento dell&#39;uso. </li><li> Piatto soluzione matrice membrana basale 5 ml per piastra in piastre da 100 mm e lasciare a temperatura ambiente per almeno 30 minuti prima della semina cellule. Almeno due piatti da 100 mm sono necessari per un esperimento. </li><li> Raccogliere le cellule SEV-infettate pipettando, trasferirli su un tubo da 15 ml e centrifugare a 200 g per 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Rimuovere il surnatante e aggiungere 1 ml di mezzo KBM502 fresco. Contare il numero di cells con un emocitometro, rimuovere la soluzione di matrice membrana basale da piatti da 100 mm preparati nel passaggio 4.2 e piastra 1 × 10 5 e 1 × 10 6 celle (in 10 ml di media mTeSR fresco) su un 100 mm membrana basale matrice rivestita piatti. Infine, utilizzare la piastra in cui le colonie sono facilmente raccolti. </li><li> Incubare il piatto a 37 ° C in 5% -CO 2 incubatore O / N. </li><li> Cambiare il medio 10 ml di incarnarsi mTeSR medio a giorni alterni. Nota: Circa 20-30 giorni dopo l&#39;infezione, colonie che ricordano da vicino le cellule staminali embrionali (ESC) apparirà. </li></ol> 5. Espandere T iPSCs derivati ​​dalle cellule <ol><li> Preparare la soluzione di matrice membrana basale da gel matrice scongelamento (si veda l&#39;elenco dei materiali per il marchio specifico utilizzato in questo studio) a 4 ° C e sciogliendo 0,2 ml in 10 ml di terreno DMEM / F12. </li><li> Piastra 1 ml di soluzione di matrice membrana basale per bene in un 6-pozzetti e lasciare a temperatura ambiente per un periodoalmeno 30 minuti prima di prendere colonie. </li><li> Riempire una piastra a 96 pozzetti con 20 ml di mTeSR media per pozzetto. </li><li> Selezionare colonie che assomigliano CES allo stereomicroscopio con una pipetta 20 ml. Nota: Le colonie di CES e iPSCs sono rotondi e piatta come mostrato in Figura 1B. </li><li> Trasferire colonie selezionate nella piastra a 96 pozzetti pieni di mTeSR medie punto 5.3. </li><li> Aggiungere 200 ml di mTeSR media ad ogni bene e con attenzione pipetta su e giù per rompere la colonia in piccoli ciuffi con lo stereomicroscopio con una pipetta 200 l. Rimuovere la soluzione di matrice membrana basale dalla ben preparato in 5.2 e mettere ogni colonia in un pozzetto della membrana basale matrice rivestite 6 pozzetti con 2 ml di mTeSR media per pozzetto. </li><li> Cambiare il medio-2 ml di incarnarsi mTeSR medio a giorni alterni. </li></ol> 6. Mantenere T iPSCs derivati ​​dalle cellule Le iPSCs derivati ​​dalle cellule T possono essere mantenutie memorizzati utilizzando le stesse tecniche per iPSCs umane e CES umani. Una volta che le colonie IPSC crescono, li espandersi in piatti più grandi ripetendo la stessa procedura. <ol><li> Cambia il mezzo mTeSR ogni 1-2 giorni. </li><li> Quando le colonie diventano confluenti ogni 5-7 giorni, di passaggio le cellule utilizzando soluzione dissociazione per iPSCs umani e CES umani in base alle istruzioni del produttore. </li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno alcuna competizione o in conflitto gli interessi da dichiarare.

Descriviamo un protocollo per la generazione di iPSC da cellule T periferiche umane in condizioni prive di siero e di feeder utilizzando una combinazione di vettori matrigel, terreno mTeSR e SeV. Per le applicazioni cliniche delle iPSC, è importante disporre di un protocollo per la generazione stabile di iPSC e di un metodo meno invasivo per il campionamento cellulare. Sebbene la generazione di iPSC con la combinazione di matrigel e terreno mTeSR abbia mostrato un'efficienza di riprogrammazione inferiore rispetto a quella con il terreno di sostituzione del siero knockout (KSR) e le cellule feeder, questa combinazione consente di ottenere una generazione stabile di iPSC dai donatori16. La generazione stabile di iPSC e il campionamento cellulare meno invasivo hanno il vantaggio di poter aumentare il numero di donatori per la generazione di iPSC. 
I vettori SeV, un virus a RNA a filamento meno, non sono integrati nel genoma ospite. Pertanto, i rischi di tumorigenesi possono essere evitati nella fase di riprogrammazione dell'induzione del fattore20-24. Inoltre, le condizioni di assenza di alimentatore, che utilizzano una combinazione di terreno di coltura definito e matrigel invece di uno strato di alimentazione, consentono di ridurre al minimo i potenziali rischi di esposizione a fattori esogeni sconosciuti. La fusione di queste tecniche fornisce una tecnologia iPSC meno invasiva e più sicura per la medicina rigenerativa16.
Passaggi importanti in questo protocollo sono la fase di attivazione delle cellule T umane (Fase 1) e l'infezione con vettori SeV (Fase 2). Quando non si ottiene alcuna colonia simile all'ESC nella piastra di coltura in un momento ottimale dopo l'infezione da SeV, si deve considerare quanto segue. In primo luogo, la confluenza delle cellule mononucleate prima dell'attivazione delle cellule T potrebbe non essere appropriata perché l'attivazione ottimale delle cellule T è fondamentale per l'infezione da SeV25,26. Una densità troppo elevata di cellule mononucleate porta alla morte cellulare, interferendo con la corretta attivazione delle cellule T. Una densità troppo bassa di cellule mononucleate disturba anche la corretta attivazione e proliferazione delle cellule T. Pertanto, la confluenza delle cellule mononucleate deve essere controllata e regolata di conseguenza. In secondo luogo, il dosaggio dei vettori SeV potrebbe non essere sufficiente. L'efficienza di induzione delle colonie di iPSC dipende dal dosaggio del virus6. Se non si osserva alcuna colonia simile all'ESC dopo l'infezione da SeV, si deve prendere in considerazione l'opzione di aumentare il dosaggio del virus fino a un MOI di 15-20. Se si osservano segni di differenziazione delle colonie di iPSC, la frequenza con cui il terreno viene cambiato può essere aumentata fino a giorni alterni o a tutti i giorni in cui le colonie sono più grandi. 
La limitazione di questo protocollo consiste nel fatto che questo metodo non è privo di virus. Sebbene SeV per la riprogrammazione cellulare sia disponibile in commercio con facilità, gli utenti devono preparare l'apparecchiatura in base al livello di biosicurezza appropriato. Come altro metodo per generare iPSC prive di integrazione, i vettori episomiali sono stati utilizzati fino ad ora27-29. Sebbene i vettori episomiali possano essere utilizzati con apparecchiature con un livello inferiore di biosicurezza, i vettori episomiali potrebbero inserirsi nel genoma dell'ospite a velocità estremamente basse. Pertanto, sono necessari ulteriori controlli per confermare la scomparsa dei transgeni, come quando si utilizza SeV.
C'è un altro limite in quanto questa tecnica non è assolutamente esente da prodotti di origine animale. Alcuni substrati, come il matrigel, gli anticorpi monoclonali anti-CD3, la soluzione di dissociazione e la soluzione di SeV sono derivati da prodotti animali e sono quindi associati a un rischio di trasferimento di patogeni xenogenici. Tuttavia, la riduzione dei substrati di origine animale nel sistema di coltura è significativa per l'applicazione clinica della tecnologia iPSC a causa del minor rischio.

iPSCs hanno suscitato notevole attenzione come fonte innovativa di cellule per la medicina rigenerativa 1-3. Ad oggi, diversi metodi per la generazione di iPSCs sono stati segnalati 4,5. Tra questi, iPSCs generato da cellule T umane sono stati di particolare interesse a causa del metodo meno invasivo del campionamento delle cellule 6-8. Inoltre, iPSCs derivati ​​da cellule T contiene riarrangiamenti del gene del recettore delle cellule T (TCR) e sono quindi una fonte di cellule T antigene-specifiche 9,10. Pertanto, generando cellule derivate iPSCs T è sicuro utile per progredire la medicina rigenerativa. Questo metodo si basa sul concetto di ridurre il rischio di patogenicità imprevedibile. Per applicazione clinica sicura di iPSCs è importante ridurre il rischio di esposizione ad agenti patogeni 11. Precedentemente in molti sistemi di coltura di cellule staminali pluripotenti, cellule di siero fetale bovino e alimentatore sono stati utilizzati come reagente essenziales 12. Tuttavia, la rimozione di entrambi questi reagenti del sistema di coltura è preferibile per la generazione COPSI per ridurre il rischio di patogenicità imprevedibile. Inoltre, questo metodo ha il vantaggio di evitare il campionamento delle cellule invasive da pazienti e laboriosa preparazione di cellule feeder. Perché cellule T iPSCs derivati ​​sono già stati utilizzati con successo nella ricerca sulle malattie 13,14, questo metodo è applicabile e utile per generare iPSCs malattie specifiche da pazienti anche. Tra i metodi di riprogrammazione delle cellule T, utilizzando il virus Sendai (SeV) vettore come veicolo gene è un metodo che può generare iPSCs con alta efficienza 7,16. Inoltre, poiché SeV è un singolo filamento RNA virus e non necessita di una fase di DNA per la replicazione, il suo uso nella generazione COPSI evita la rottura del genoma ospite 17-19. Pertanto, abbiamo stabilito protocolli per la generazione di iPSCs da cellule T periferico umano nel siero-frEE e condizioni senza alimentazione utilizzando una combinazione di matrigel, mTeSR media, e Sev vettori.

<table><tbody><tr><td>Ficoll-Paque PREMIUM</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5442-02</td><td></td></tr><tr><td>Purificato NA/LE topo anti-umano CD3</td><td>BD Pharmingen</td><td>555336</td><td></td></tr> Soluzione V per <tr><td>frazione di albumina bovina</td><td>Gibco</td><td>15260-037</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1 kit medio</td><td>STEM CELL</td><td>5850</td><td>Riscaldare a temperatura ambiente prima dell'uso</td></tr><tr><td>Soluzione di dissociazione</td><td>ReproCELL</td><td>RCHETP002</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS(&ndash;)</td><td>Wako</td><td>045-29795</td><td></td></tr><tr><td>Kit vettoriale SeV CytoTune-iPS ver.1.0</td><td>DNAVEC</td><td>DV-0303c</td><td>Scongelare su ghiaccio prima dell'uso Piastra per</td></tr><tr><td>coltura tissutale da 100 mm</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Piastra per coltura tissutale a 96 pozzetti</td><td>Falcon</td><td>353078</td><td></td></tr><tr><td>Piastra per coltura tissutale a 6 pozzetti</td><td>Falcon</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>15&#160; ml Provetta da centrifuga</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>50&#160; ml Provetta da centrifuga</td><td>Greiner Bio-One</td><td>227261</td><td></td></tr></tbody></table>

generazione di pluripotenti indotte cellule staminali da umani periferici t cellule con sendai virus in condizioni di libera-feeder

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral T Cells Using Sendai Virus in Feeder-free Conditions

Recentemente, iPSCs hanno attirato l&#39;attenzione come una nuova fonte di cellule per terapie rigenerative. Sebbene il metodo iniziale per iPSCs generano invocata fibroblasti dermici ottenuti mediante biopsia invasiva e retrovirali inserimento genomica di transgeni, ci sono stati molti sforzi per evitare questi inconvenienti. Le cellule T periferiche umani sono una fonte di cellule unico per la generazione di iPSCs. iPSCs derivati ​​da cellule T contengono riarrangiamenti del recettore delle cellule T (TCR) geni e sono una fonte di cellule T antigene-specifiche. Inoltre, T cell receptor riarrangiamento nel genoma ha il potenziale di etichettare linee di cellule individuali e di distinguere tra le cellule trapiantate e donatori. Per applicazione clinica sicura di iPSCs, è importante ridurre al minimo il rischio di esporre iPSCs appena generato ad agenti nocivi. Anche se le cellule di siero fetale bovino e di alimentazione sono stati fondamentali per la coltura di cellule staminali pluripotenti, è preferibile rimuoverli dal sistema di coltura per ridurre il rischiodi patogenicità imprevedibile. Per far fronte a questo, abbiamo stabilito un protocollo per la generazione di iPSCs dalle cellule T periferico umano mediante virus di Sendai per ridurre il rischio di esposizione agli agenti patogeni iPSCs indefiniti. Anche se la gestione Sendai virus richiede attrezzature con il livello di biosicurezza adeguato, virus infetta Sendai cellule T attivate, senza inserimento del genoma, ma con alta efficienza. In questo protocollo, dimostriamo la generazione di iPSCs dalle cellule T periferici umani in condizioni di assenza di alimentazione utilizzando una combinazione di attivo coltura delle cellule T e virus di Sendai.

<html> Usando questo protocollo, gli utenti sono in grado di generare iPSCs dalle cellule T periferico umano stabile. generazione IPSC dalle cellule T con SeV e matrigel ha mostrato circa il 0,002% -. 0,005% di efficienza della riprogrammazione delle cellule tra diversi casi donatori e SeV non sono stati individuati dopo vari passaggi 16 Figura 1A mostra uno schema del protocollo per la generazione di cellule T-derivato iPSCs in condizioni di assenza di alimentazione con matrigel e mTeSR media. Intorno 20-30 giorni dopo l&#39;infezione con SeV, colonie IPSC sono riconosciuti per la loro colonia ESC-come morfologia (Figura 1B). Immunofluorescenza rivela espressione di marcatori tipici delle cellule pluripotenti (Nanog, Oct3 / 4, SSEA4, TRA-1-60, e TRA-1-81) in iPSCs derivati ​​dalle cellule T ottenuti in condizioni di libero-feeder (Figura 1C). &quot;Width =&quot; 700 &quot;/&gt; Figura 1. (A): Uno schema del protocollo di riprogrammazione delle cellule T in condizioni senza feeder in questo studio. (B): Una tipica colonia ESC-come IPSC il giorno 27 dopo il prelievo di sangue in condizioni di libero-feeder. (C): ALP colorazione e immunofluorescenza per pluripotenza e superficiali marcatori (Nanog, Oct3 / 4, SSEA4, TRA-1-60, e TRA-1-81) in iPSCs derivati ​​dalle cellule T in condizioni di libero-feeder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53225/53225fig1highres.jpg" target="_blank">Si prega clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

Questo protocollo descrive come generare cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) da cellule T periferiche umane in condizioni di feeder-free utilizzando una combinazione di vettori virali matrigel e Sendai contenenti fattori di riprogrammazione.

Generazione di pluripotenti indotte cellule staminali da umani periferici T Cellule con Sendai virus in condizioni di libera-Feeder

Recently, iPSCs have attracted attention as a new source of cells for regenerative therapies. Although the initial method for generating iPSCs relied on ...

L'obiettivo generale di questa procedura è generare cellule staminali pluripotenti indotte o IPC a partire da linfociti T periferici umani in condizioni prive di cellule di supporto. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della medicina rigenerativa, ad esempio su come le cellule IPS possano essere applicate nell'uso clinico. Il vantaggio principale di questa tecnica è che le cellule IPS possono essere ottenute senza l'inclusione di fattori di rischio potenzialmente dannosi, riducendo così il rischio di patogenicità.L'implicazione di questa tecnica si estende a livello mondiale a terapie cliniche basate su cellule IPS, grazie a questo prelievo cellulare meno invasivo combinato con una riduzione del rischio di esporre le cellule IPS in via di sviluppo a patogeni non definiti. Pertanto, questo metodo può fornire informazioni utili per la terapia clinica basata su cellule IPS. Può inoltre essere applicato ad altri ambiti, come la modellizzazione delle condizioni patologiche.Iniziare la preparazione delle cellule T umane attivate diluendo 10 millilitri di sangue intero eparinizzato con 10 millilitri di DPBS. Pipettare 15 millilitri di soluzione Fol in un tubo conico da 50 millilitri. Pipettare lentamente il sangue diluito lungo la parete interna del tubo in modo da formare uno strato sulla sommità della soluzione.Attenzione a non disturbare l'interfaccia. Centrifugare il tubo a 400 volte G per 30 minuti a temperatura ambiente. Al termine della centrifugazione, osservare tre strati, compreso uno strato inferiore limpido, uno strato bianco sottile contenente cellule mononucleate e uno strato superiore di plasma lattiginoso.Trasferire lo strato di cellule mononucleate in un nuovo tubo conico da 50 millilitri senza trasferire alcuna soluzione del filtro. Successivamente, aggiungere DPBS per portare il volume totale a 10 millilitri. Centrifugare il tubo a 200 × g per cinque minuti a temperatura ambiente.Eliminare il soprannatante, lavare le cellule con 10 millilitri di DPBS, centrifugare il tubo a 200 × g per cinque minuti ed eliminare il soprannatante. Successivamente, aggiungere un millilitro di mezzo KBM 5 0 2 alle cellule e contare utilizzando un emocitometro per preparare la piastra per coltura cellulare. Rivestire i pozzetti di una piastra a sei pozzetti con una soluzione di anticorpo anti-umano CD3 a 10 microgrammi per millilitro in PBS. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per almeno 30 minuti.Dopo l'incubazione, rimuovere la soluzione di anticorpo dalla piastra otto e lavare una volta con PBS. Seminare le cellule mononucleate a una densità di 2,5 × 10⁵ cellule per centimetro quadrato in un volume totale di due millilitri di mezzo KBM 5 0 2 nelle piastre a sei pozzetti rivestite. Incubare le cellule per tre a sette giorni senza cambiare il mezzo, fino a quando le cellule T dovrebbero raggiungere la confluenza. Dopo i tre a sette giorni, trasferire le cellule T attivate con il mezzo in un tubo conico da 15 millilitri e centrifugare a 200 × g per cinque minuti. Rimuovere il surnatante e aggiungere un millilitro di mezzo KBM 5 0 2 fresco.Contare le cellule e seminare 1,5 volte 10 alla sesta cellule in due millilitri di mezzo KBM 5 0 2 in ciascun pozzetto di una piastra da sei pozzetti rivestita con anticorpo anti-CD3; successivamente scongelare le soluzioni del virus Sendai ingegnerizzato OC3 SOX2, KLF4 e C-MYC-H, e aggiungere ciascun virus Sendai ingegnerizzato singolarmente in ogni pozzetto con una multiplicità di infezione pari a 10. Incubare a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per 24 ore. Quindi raccogliere le cellule infette con una pipetta e trasferirle in un tubo conico da 15 millilitri.Centrifugare le cellule a 200 ×g per cinque minuti. Rimuovere il soprannatante e aggiungere due millilitri di mezzo KBM 5 0 2 fresco. Ricollocare le cellule nei pozzetti di una piastra a sei pozzetti e incubare per 24 ore in un incubatore per colture cellulari.Per ricoprire le cellule, scongelare innanzitutto la soluzione di matrice della membrana basale a quattro gradi Celsius durante la notte, sciogliere 0,2 millilitri della soluzione ottenuta in 10 millilitri di mezzo DMM F 12 e distribuire 5 millilitri della soluzione di matrice della membrana basale in piastre da 100 millimetri. Lasciare le piastre a temperatura ambiente per almeno 30 minuti per consentire alla matrice di ricoprire la piastra prima di seminare le cellule. Nel frattempo, raccogliere le cellule T infettate dal virus SAI in un tubo conico da 15 litri e centrifugare a 200 ×g per cinque minuti.Quindi risospendere il palato in un millilitro di mezzo KBM 5 0 2 fresco e contare le cellule utilizzando un emocitometro dopo il periodo di incubazione di 30 minuti. Rimuovere la soluzione di matrice della membrana basale dalle due piastre, quindi risospendere separatamente una volta 10 alla quinta cellule e una volta 10 alla sesta cellule in 10 millilitri di mezzo M-T-E-S-R fresco, un mezzo di coltura privo di cellule feeder per ipsc. Pipettare ciascuna sospensione cellulare in una piastra separata da 100 millimetri.Incubare la piastra in un incubatore per colture cellulari. Cambiare il mezzo ogni due giorni dopo 20-30 giorni. Dovrebbero apparire colonie che assomigliano a colonie di cellule staminali embrionali.Preparare sei piastre a parete per l'espansione di IPSC incubando un millilitro di soluzione di matrice della membrana basale in ciascun pozzetto per 30 minuti a temperatura ambiente. Nel frattempo, osservare le piastre di coltura contenenti colonie di IPSC al microscopio stereoscopico e isolare le singole colonie raschiandole con una pipetta da 20 microlitri. Trasferire ciascuna colonia in un pozzetto di una piastra a 96 pozzetti contenente 20 microlitri di mezzo M-T-E-S-R.Dopo aver trasferito le colonie, aggiungere 200 microlitri di mezzo M-T-E-S-R in ogni pozzetto e pipettare su e gi&ugrave; per rompere la colonia. Dopo aver rimosso la soluzione di matrice della membrana basale dalle piastre a sei pozzetti, trasferire le cellule di una singola colonia in ciascun pozzetto, quindi aggiungere due millilitri di mezzo M-T-E-S-R, incubare le cellule in un incubatore per colture cellulari e cambiare il mezzo ogni due giorni utilizzando una coltura libera da cellule sentinella e mezzi liberi da siero. Le cellule staminali pluripotenti indotte sono state generate da linfociti T periferici umani. La colorazione immunofluorescente ha rivelato l'espressione di marcatori tipici delle cellule pluripotenti, tra cui nano T tre quattro, SSEA quattro, TRA uno 60 e TRA 180 1.In queste linee IPSE derivate. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di eseguire tutti i passaggi, tenendo conto di tutte le considerazioni fondamentali relative alla sterilità e alla sicurezza biologica.

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Dimostriamo il protocollo per la generazione di cellule staminali pluripotenti indotte da cellule somatiche umane utilizzando lentivirus-mediata consegna dei fattori umani Oct4, Sox2, Nanog, e Lin28. Pluripotenza è stata confermata dalla morfologia e la presenza di staminali embrionali (ES) cellulo-specifici marcatori.

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Generazione indotte pluripotenti cellule staminali (IPSC) linee produce linee di diverso potenziale di sviluppo, anche quando passano i test standard per la pluripotenza. Qui si descrive un protocollo per la produzione di topi ottenute interamente da iPSCs, che definisce le linee IPSC come in possesso di pluripotenza...

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Qui vi presentiamo il nostro metodo stabilito per riprogrammare cellule somatiche umane in libera-transgene iPSCs umane con virus di Sendai, che mostra esito coerente e una maggiore efficienza.

Efficiente generazione indotta umane pluripotenti cellule staminali da cellule somatiche umane con Sendai-virus

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Generazione di cellule staminali pluripotenti indotte da melanoma umano Linfociti infiltranti il ​​tumore

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Generazione di pluripotenti indotte cellule staminali da umani periferici T Cellule con Sendai virus in condizioni di libera-Feeder (Video) | JoVE Journal

Generazione di pluripotenti indotte cellule staminali da umani periferici T Cellule con Sendai virus in condizioni di libera-Feeder

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