Quantificazione del colon le mutazioni delle cellule staminali

L'obiettivo generale di questa procedura è quantificare le mutazioni somatiche fenotipiche nel gene della glucosio sei fosfato deidrogenasi o G six PD nelle cellule staminali del colon. Dopo il trattamento degli animali con agenti genotossici ipotetici, si procede innanzitutto trattando gli animali con l'agente e attendendo un tempo appropriato per consentire alla progenie di una cellula staminale portatrice di una mutazione G six PD di popolare completamente un cripto, sacrificando quindi l'animale, rimuovendo il colon e arrotolandolo a "Swiss roll", per poi congelare il tessuto in azoto liquido. Il secondo passaggio consiste nel preparare sezioni congelate di sette micron di spessore su vetrini, prelevate dal colon, utilizzando un criostato.

Il tessuto viene riscaldato a 37 gradi Celsius, quindi vengono create camere per colorazione intorno alle sezioni di tessuto. L'ultimo passaggio consiste nell'incubare le sezioni di tessuto con la miscela di colorazione per la G6PD e successivamente analizzare le sezioni al microscopio ottico: le cellule con attività G6PD si colorano di blu, mentre quelle con mutazioni fenotipiche appaiono di colore biancastro. Infine, la quantificazione delle cripte mutate viene utilizzata per determinare la frequenza di mutazione.

Questa tecnica misura le mutazioni somatiche della glucosio-6-fosfato deidrogenasi nelle cellule staminali, che rappresentano la popolazione cellulare critica nella carcinogenesi del colon. Identificando le mutazioni somatiche delle cellule staminali, è possibile correlare la frequenza delle mutazioni agli episodi di cancro del colon negli animali trattati. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulle mutazioni delle cellule staminali nel colon, può essere applicato anche ad altri organismi modello o sistemi organici.

Se è possibile identificare una nicchia di cellule staminali, in genere i principianti incontreranno difficoltà nella preparazione della soluzione MBT. Solubilizzazione. La soluzione MBT richiede un'attenzione scrupolosa alle istruzioni dettagliate. Per iniziare a preparare la soluzione istologica per la colorazione, aggiungere due millilitri di tampone fosfato a pH 7,4 a 35 millilitri di mezzo OCT (optimal cutting temperature) in un tubo da 50 millilitri e agitare vigorosamente per favorire l’unione, utilizzando carta indicatrice di pH.

Verificare che la soluzione abbia un pH di circa 7,4. Successivamente, aggiungere esosio fosfato, ADP e una soluzione di cloruro di magnesio disciolti in tampone fosfato, come indicato nel protocollo del testo e, ancora una volta, verificare che il pH della soluzione rimanga circa 7,4. Aggiungere la soluzione M-M-P-M-S e mescolare vigorosamente.

Questo dovrebbe produrre un omogeneizzato rosso scuro e limpido; avvolgere la soluzione nella pellicola di alluminio per ridurre al minimo l'esposizione alla luce. Se la soluzione diventa torbida, deve essere scartata mentre il bagno d'olio si sta riscaldando. Separatamente, preparare una soluzione di nitro blu tetrazolio o MBT a cinque millimolari mescolando 0,4 millilitri di dimetilformammide, 0,4 millilitri di etanolo anidro e MBT in un tubo da due millilitri con tappo a guarnizione, sigillare leggermente il tubo e portarlo a ebollizione vigorosa nel bagno d'olio fino a quando l'MBT non si sarà sciolto.

Successivamente, lasciare raffreddare la soluzione MBT a temperatura ambiente e quindi aggiungerla alla miscela di reazione OCT. La soluzione può cambiare colore passando dal rosso arancio iniziale a un rosso scuro o viola nel tempo. Dopo il trattamento degli animali e la preparazione di sezioni congelate come indicato nel protocollo testuale, costruire pozzi per la colorazione dei tessuti utilizzando due anelli metallici uniti insieme con grasso siliconico adatto alla base dell'anello e rimuovendo la parte centrale dove verrà posizionata la soluzione.

Preriscaldare le sezioni di tessuto congelato su vetrini in una stanza umida a 37 gradi Celsius per 10 minuti. Successivamente, posizionare le camere sul vetrino in modo da circondare le sezioni di tessuto, aggiungendo circa mezzo millilitro della soluzione di colorazione G6PD precedentemente preparata in ciascuna camera contenente una sezione di tessuto, e incubare per 45-50 minuti. Rimuovere i vetrini dalla stanza calda ed eliminare con attenzione le camere in acciaio inossidabile dai vetrini.

Posizionare i vetrini sul bordo lungo e far defluire la miscela di reazione, seguita da un lavaggio di 30-60 minuti con tampone fosfato 100 millimolare. Per rimuovere le ultime tracce della soluzione di colorazione della G6PD, risciacquare i vetrini con acqua deionizzata per cinque-dieci minuti al fine di eliminare il tampone fosfato residuo. Infine, sigillare il tessuto aggiungendo goccia a goccia il fluoro gel sul vetrino e lasciare asciugare per 30 minuti prima di acquisire le immagini per un'analisi successiva.

Posizionare il vetrino su un microscopio ottico e regolare l'ingrandimento a quattro volte. Successivamente, acquisire immagini della sezione di tessuto colorata mediante una fotocamera da 5,0 megapixel per stimare il numero totale di cripte analizzate. Per ogni topo, selezionare una sezione del livello con la superficie più piccola e acquisirne l'immagine a un ingrandimento di 10 volte.

Contare il numero di cripte mutanti. Secondo i seguenti criteri, l'intera cripta è priva di colore blu. La struttura esterna della cripta è integra.

Il mutante viene osservato su sezioni adiacenti di sette micron e due osservatori identificano lo stesso cripto come mutante. Contare visivamente il numero di cripti in questa sezione e moltiplicare per il numero di livelli analizzati per ciascun colon. Esempi di cripti mutanti osservati in topi trattati con l'agente danneggiante il DNA, azossimetano, sono visibili qui a sinistra, dove si vede una vista verticale o dall'alto verso il basso di un cripto mutante.

Se a destra è mostrata una vista orizzontale o laterale, affinché un cripto venga considerato mutante, tutte le cellule all'interno del cripto devono permanere. I cripti bianchi con una piccola quantità di bianco sono dovuti alla produzione di muco da parte delle cellule caliciformi. La frequenza di mutazione è calcolata come il numero di mutanti osservati diviso per il numero totale di cripti analizzati senza mutante.

Nei colon di topi di controllo sono state osservate cripte con una frequenza di mutazione inferiore a 1 × 10⁻⁵, mentre nei topi trattati con azossimetano si è osservata una frequenza di mutazione delle cellule staminali pari a 4,44 × 10⁻⁴ a seguito di questa procedura. Altri metodi, come l'analisi genetica del tipo di mutazioni della glucosio-6-fosfato deidrogenasi, possono essere eseguiti per rispondere ad ulteriori domande, ad esempio in che modo l'agente chimico induce un appaiamento errato durante la mutazione. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come misurare le mutazioni delle cellule staminali somatiche in topi trattati con composti potenzialmente mutageni e cancerogeni.