Quantificazione del colon le mutazioni delle cellule staminali

L'obiettivo generale di questa procedura è quantificare le mutazioni somatiche fenotipiche nel gene del glucosio sei fosfato deidrogenasi o G sei PD nelle cellule staminali del colon. Dopo il trattamento degli animali con agenti genotossici putativi, ciò si ottiene trattando prima gli animali con l'agente che attende un periodo di tempo adeguato per consentire alla progenie di una cellula staminale portatrice di una mutazione G 6 PD di popolare completamente una cripta, sacrificando l'animale, rimuovendo il colon e formandolo in un rotolo svizzero e congelando il tessuto in azoto liquido. Il secondo passo consiste nel preparare sezioni congelate spesse sette micron su vetrini dal colon utilizzando un criostato.

Il tessuto viene riscaldato a 37 gradi Celsius e quindi vengono costruiti pozzetti per colorazione del tessuto attorno alle sezioni di tessuto. Il passaggio finale consiste nell'incubare le sezioni di tessuto con la miscela di colorazione G six PD e quindi analizzare le sezioni al microscopio ottico Le cellule con attività G six PD si colorano di blu, mentre quelle con mutazioni fenotipiche appaiono biancastre. In definitiva, la quantificazione dei crips mutati viene utilizzata per determinare la frequenza di mutazione.

Questa tecnica misura le mutazioni somatiche della glucosio sei fosfato deidrogenasi nelle cellule staminali, e questa è la popolazione cellulare critica nella carcinogenesi del colon. Identificando le mutazioni delle cellule staminali somatiche, è possibile correlare la frequenza delle mutazioni agli incidenti di cancro del colon negli animali trattati. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulle mutazioni delle cellule staminali nel colon, può essere applicato anche ad altri organismi modello o sistemi di organi.

Se è possibile identificare una nicchia di cellule staminali, generalmente le persone nuove a questo metodo avranno difficoltà con la preparazione della soluzione MBT. Solubilizzante. La soluzione MBT richiede un'attenta attenzione alle istruzioni dettagliate. Per iniziare a preparare la soluzione di colorazione istologica a due millilitri di pH 7,4 tampone fosfato a 35 millilitri di temperatura di taglio ottimale, o terreno OCT in una provetta da 50 millilitri e agitare energicamente per combinare utilizzando carta pH.

Confermato che la soluzione ha un pH di circa 7,4. Successivamente, al glucosio sei fosfato e una soluzione di DP e cloruro di magnesio disciolti nel tampone fosfato come indicato nel protocollo di testo e, ancora una volta, hanno confermato che il pH della soluzione rimane di circa 7,4. AGGIUNGERE LA SOLUZIONE M-M-P-M-S e mescolare energicamente.

Ciò dovrebbe risultare in un omogeneizzato limpido di colore rosso scuro che avvolge la soluzione in un foglio per ridurre al minimo l'esposizione alla luce. Se la soluzione diventa torbida, deve essere scartata mentre un bagno d'olio si sta riscaldando. Separatamente, preparare una soluzione di cinque millimolari di nitro blu a teraz oleum o MBT mescolando 0,4 millilitri di dimetilformammide, 0,4 millilitri di etanolo anidro e MBT in una provetta da due millilitri con un coperchio O-ring, sigillare liberamente la provetta e portarla a ebollizione vigorosa nel bagno d'olio fino a quando la MBT non si sarà sciolta.

Quindi, lasciare raffreddare la soluzione MBT a temperatura ambiente e poi aggiungerla alla miscela di reazione OCT. La soluzione può cambiare colore dal rosso arancione iniziale a un rosso scuro o viola nel tempo. Dopo aver trattato gli animali e preparato le sezioni congelate come indicato nel protocollo di testo, costruire dei pozzetti per la colorazione dei tessuti utilizzando due rondelle di acciaio legate insieme con grasso al silicone, montare il profumo alla base della rondella e ritagliare il centro dove verrà posizionata la soluzione sostituita.

Prima della guerra, il tessuto congelato scivolava in una stanza umida a 37 gradi Celsius per 10 minuti. Successivamente, posizionare i pozzetti sul vetrino per circondare le sezioni di tessuto a circa mezzo millilitro della miscela di colorazione G 6 PD precedentemente preparata su ciascun pozzetto della sezione di tessuto e incubare per 45-50 minuti. Rimuovere i vetrini dalla stanza calda e rimuovere con cura i pozzetti in acciaio inossidabile dai vetrini.

Posizionare i vetrini sul lato lungo e scolare la miscela di reazione, seguita da un lavaggio da 30 a 60 minuti e da 100 millimolare di tampone fosfato. Per rimuovere le tracce finali della soluzione colorante G six PD, sciacquare i vetrini e l'acqua deionizzata per cinque-10 minuti per rimuovere il tampone fosfato residuo. Infine, sigillare il tessuto aggiungendo gel di fluoro goccia a goccia al vetrino e asciugare per 30 minuti per acquisire le immagini per l'analisi successiva.

Posizionare il vetrino su un microscopio ottico e regolare su quattro ingrandimenti DX. Quindi scatta foto della sezione di tessuto colorato con una fotocamera da 5,0 megapixel per stimare il numero totale di cripte esaminate. Per ogni mouse, selezionare una sezione dal livello con la superficie più piccola e visualizzarla con un ingrandimento di 10x.

Conta il numero di crip mutanti. Secondo i seguenti criteri, l'intera cripta è priva di colore blu. La struttura esterna della cripta è intatta.

Il mutante viene osservato su sezioni adiacenti di sette micron e due osservatori identificano la stessa cripta come mutante. Conta visivamente il numero di cripte in questa sezione e moltiplica per il numero di livelli esaminati per ogni due punti. Esempi di Crips mutanti osservati nei topi trattati con l'agente dannoso per il DNA, l'azossimetano, possono essere visti qui a sinistra, si vede una vista verticale o dall'alto verso il basso di una cripta mutante.

Mentre sulla destra c'è una vista orizzontale o laterale, affinché una cripta sia dichiarata mutante, tutte le celle all'interno della cripta devono rimanere. Le cripte bianche con una piccola quantità di bianco sono dovute alla produzione di muco dalle cellule caliciformi. La frequenza delle mutazioni è calcolata come il numero di mutanti osservati diviso per il numero totale di cripte sottoposte a screening senza mutanti.

I crip sono stati osservati nel colon di topi di controllo che rappresentano una frequenza di mutazione inferiore a una volta 10 al meno quinto, mentre i topi trattati con azossimetano hanno mostrato una frequenza di mutazione delle cellule staminali compresa tra 4,44 volte 10 e meno quattro Seguendo questa procedura. Altri metodi, come l'analisi genetica del tipo di mutazioni della glucosio x fosfato deidrogenasi, possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande, come il modo in cui l'agente chimico codifica erroneamente per una mutazione. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come misurare le mutazioni delle cellule staminali somatiche nei topi trattati con potenziali composti mutageni e cancerogeni.