Ordinamento delle cellule staminali neurali e di cellule progenitrici del topo adulto subventricolare Zone e Live-imaging loro dinamiche del ciclo cellulare

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di seguire la progressione del ciclo cellulare delle cellule staminali neurali selezionate e della loro progenie isolata dalla zona subventricolare del ciclo cellulare di ubiquitinazione della fluorescenza transgenica noto come topi FCI. Ciò si ottiene sezionando prima la zona subventricolare di cervelli di topi adulti transgenici. Il secondo passo consiste nel dissociare il tessuto neuronale in una sospensione a singola cellula utilizzando un trattamento con papaia.

Successivamente, le diverse popolazioni di cellule neurogeniche della zona subventricolare vengono marcate utilizzando anticorpi al fine di identificare le cellule staminali neurali di quiescenza, le cellule staminali neurali attivate, le cellule che amplificano il transito e i neuroblasti immaturi e migratori. Il passaggio finale consiste nell'utilizzare i fatti per selezionare le cellule direttamente in un terreno di coltura fresco prima di placcarle su piastre rivestite di poli-D lisina. In definitiva, la microscopia video time-lapse continua viene utilizzata per studiare la progressione del ciclo cellulare delle cellule piastre, poiché le varie cellule transgeniche emettono fluorescenza in diversi punti temporali durante il loro ciclo cellulare.

La combinazione della tecnica di cell sorting con la tecnologia Fuji consente la visualizzazione e l'isolamento delle diverse popolazioni cellulari dalla zona subventricolare, consentendo lo studio delle proprietà e delle dinamiche nel cervello del movimento adulto. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel contesto dell'invecchiamento e delle patologie cerebrali Il giorno prima dell'esperimento. A circa 200 microlitri di una soluzione di poli-D lisina da 10 microgrammi per millilitro in ciascun pozzetto di una piastra sterile a 96 pozzetti con pareti nere per rivestire il fondo del coperchio dei pozzetti e incubare la piastra durante la notte a 37 gradi Celsius il giorno successivo.

Rimuovere la soluzione di poli-D lisina e sciacquare i pozzetti tre volte con acqua distillata sterile prima di lasciare asciugare la piastra nella cappa a flusso laminare per almeno due ore. Se non utilizzato immediatamente. Conservare la piastra rivestita essiccata a quattro gradi Celsius per un massimo di sette giorni.

Successivamente, preparare la soluzione di dissociazione della papaina e sterilizzarla passando la miscela attraverso un filtro da 0,2 micron. Preriscaldare la soluzione a 37 gradi Celsius prima di utilizzarla. Inoltre, preparare una soluzione di inibitore della proteasi aggiungendo 0,7 milligrammi per millilitro di tripsina in inibitore di tipo due a TM F 12 medio sterile.

Filtrare la soluzione utilizzando un filtro da 0,2 micron e preriscaldare la soluzione a 37 gradi Celsius prima di utilizzarla. Posizionare la zona sottoventricolare appena sezionata dal cervello di un topo rosso Fucci adulto in una capsula di Petri contenente lo 0,6% di glucosio in PBS tritare il tessuto fino a quando non rimangono pezzi di grandi dimensioni. Quindi trasferisci il tutto in una provetta da 15 millilitri e centrifuga a 200 volte G per cinque minuti.

Una volta che il tessuto è stato pellettato, scartare la trappola e risus. Sospendi il tessuto in un millilitro di papaina preriscaldata, integrata con 0,01 milligrammi per millilitro di dna. Uno. Incubare la miscela per 10 minuti a bagnomaria a 37 gradi Celsius.

Quindi centrifugare nuovamente a 200 volte G per cinque minuti e scartare lo snat. Aggiungere un millilitro della soluzione Prewarm OVO MOID per arrestare la digestione enzimatica. Successivamente, utilizzare un puntale per micropipette P 1000 per pipettare delicatamente su e giù 20 volte per dissociare meccanicamente il tessuto macinato in una singola sospensione cellulare durante il pipettaggio.

Evitare di introdurre bolle d'aria nella miscela che causerebbero ulteriore stress alle cellule. Passare la sospensione cellulare attraverso un filtro sterile da 20 micron in una nuova provetta da 15 millilitri. Lavare il filtro della cella con due millilitri di PBS contenente lo 0,15% di BSA per evitare di perdere le cellule.

Quindi centrifugare la sospensione cellulare a 200 volte G per 10 minuti. Scartare il surnatante. Eseguire la colorazione dei fatti sospendendo prima le cellule di ciascun topo in 100 microlitri di PBS contenenti lo 0,15% di BSA.

Utilizzare un decimo delle cellule di uno dei topi per preparare ciascuno dei quattro controlli come descritto nel protocollo di testo allegato. Aggiungere gli anticorpi primari qui elencati a ciascuna delle provette utilizzate per la selezione cellulare e incubare le miscele per 20 minuti al buio a quattro gradi Celsius. Dopo l'incubazione con gli anticorpi primari, lavare le cellule con un millilitro di PBS contenente lo 0,15% di BS, A, quindi centrifugare le cellule a 200 volte G per 10 minuti.

Risospendere le cellule in 200 microlitri di PBS contenente lo 0,15% di BSA per cervello e trasferirle in effetti appropriati. Tubi di smistamento. Posizionare le provette di selezione delle cellule sul ghiaccio e aggiungere un colorante vitale come la colorazione 3 3 2 5 8 a due microgrammi per millilitro alle cellule immediatamente prima della selezione delle cellule per discriminare le cellule vive da quelle morte.

Quindi, fai scorrere le celle nel tubo di controllo negativo attraverso i fatti e seleziona le celle utilizzando i parametri di dispersione laterale e di dispersione diretta. Escludere le celle morte limitando gli uncini alla frazione negativa e i doppietti selezionando l'impulso con frazione negativa. Esegui i controlli a colore singolo e regola le tensioni del tubo moltiplicatore di foto, se necessario.

Eseguire la compensazione del colore nella finestra di compensazione del software. Esegui i tre controlli di fluorescenza meno uno e disegna le porte di smistamento. Una volta che tutti i cancelli sono stati installati, ordina le cellule marcate direttamente in 100 microlitri di coltura.

Piastra media le cellule appena selezionate a una densità da 1000 a 3000 cellule per pozzetto sul rivestimento in polietilene. Piastre a 96 pozzetti con 300 microlitri di terreno di coltura. Incubare le piastre di coltura a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per almeno un'ora.

Per consentire l'adesione cellulare, preparare un microscopio a scansione laser confocale per l'imaging preriscaldando la camera a temperatura controllata collegata a 37 gradi Celsius in un'atmosfera di anidride carbonica al 5%. Posizionare la piastra a 96 pozzetti all'interno della camera del microscopio di preriscaldamento e mettere a fuoco il primo pozzetto. Quindi aprire il software di imaging e fare clic con il pulsante destro del mouse nella finestra principale per selezionare acquisisci controlli di acquisizione e Acquisizione DEAC.

Per aprire il pad TI e selezionare l'obiettivo A PO VC 20 XDIC successivo, fare clic su acquisisci controlli di acquisizione e quindi aprire le opzioni time-lapse. Impostate il centro di ogni pozzetto come posizione scenica e selezionate l'opzione dell'immagine grande su sette per sette millimetri quadrati. Osserva un'immagine a mosaico attorno al centro di ciascuno.

Bene, imposta la sovrapposizione per l'immagine a mosaico grande al 5% e imposta la frequenza in modo che le foto vengano scattate ogni 20 minuti per 24 ore. In un'impostazione più uno, selezionare il livello di tensione del tubo moltiplicatore fotografico per ogni fluorescenza elencata nella barra dei menu. Selezionare questa opzione per acquisire le immagini utilizzando uno scanner a risonanza ad alta velocità con un formato di cinque 12 x cinque 12 pixel e utilizzare DIC per visualizzare le celle.

Quindi selezionare una cartella in cui salvare i file di dati. Selezionare il pulsante Esegui ora nella finestra di acquisizione ND per avviare l'acquisizione. Segui il lavoro al computer per la durata di almeno un ciclo per essere sicuro che tutto funzioni correttamente.

I topi rossi Fuji sono stati utilizzati per seguire la fase G one con fluorescenza rossa utilizzando la microscopia video time-lapse. Le cellule isolate sono rosse fluorescenti durante la prima fase di crescita e la nostra lista di colori durante la sintesi, la seconda fase di crescita e la mitosi. Lex positivo, eeg FR positivo e eeg.

Le cellule FR positive di topi giovani adulti e di mezza età sono state piastrate e tracciate al microscopio. La lunghezza di fase S e G di due M non ha mostrato differenze tra le cellule Lex positive, EGFR positive e EG FFR positive sia nei topi giovani che in quelli di mezza età. Tuttavia, la lunghezza della successiva fase di crescita dalla prima divisione fino allo spegnimento della fluorescenza rossa è risultata più lunga nelle cellule più vecchie a causa dell'aumento della lunghezza di una fase G.

Le neurosfere ottenute cinque giorni dopo la placcatura sono più piccole nelle cellule EGFR positive Lex positive ottenute dai topi più anziani. L'intero protocollo non deve superare le tre ore per la dissezione e la preparazione del fax e altre tre ore per lo smistamento delle cellule quando si lavora con 12 topi. Tieni presente che lavorare con troppi topi nello stesso giorno porterà a un aumento della durata dello smistamento cellulare e possibilmente a un aumento della morte cellulare o della differenziazione cellulare.