Ordinamento delle cellule staminali neurali e di cellule progenitrici del topo adulto subventricolare Zone e Live-imaging loro dinamiche del ciclo cellulare

L'obiettivo generale di questa procedura è seguire la progressione del ciclo cellulare di cellule staminali neurali ordinate e delle loro progenie isolate dalla zona subventricolare di topi transgenici con ubiquitinazione fluorescente del ciclo cellulare, noti come topi FCI. Questo viene realizzato innanzitutto dissezionando la zona subventricolare di cervelli di topi adulti transgenici. Il secondo passaggio consiste nel dissociare il tessuto neuronale in una sospensione monocellulare mediante un trattamento a base di papaia.

Successivamente, le diverse popolazioni cellulari neurogeniche della zona subventricolare vengono marcate mediante l'uso di anticorpi al fine di identificare le cellule staminali neurali quiescenti, le cellule staminali neurali attivate, le cellule di amplificazione transitoria e i neuroblasti immaturi e migranti. L'ultimo passaggio consiste nell'utilizzare un ordinatore cellulare per isolare direttamente le cellule in un mezzo di coltura fresco prima di seminarle su piastre rivestite con poli-D-lisina. Infine, si utilizza la microscopia video in time-lapse continua per studiare il progressione del ciclo cellulare delle cellule seminate, poiché le diverse cellule transgeniche fluorescono in diversi momenti del loro ciclo cellulare.

Combinando la tecnica di sorting cellulare con la tecnologia Fuji è possibile visualizzare e isolare le diverse popolazioni cellulari dalla zona subventricolare, permettendo lo studio delle proprietà e della dinamica nel cervello adulto in movimento. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel contesto dell'invecchiamento e delle patologie cerebrali. Il giorno prima dell'esperimento, aggiungere circa 200 microlitri di una soluzione di poli-D-lisina a 10 microgrammi per millilitro in ciascun pozzetto di una piastra sterile da 96 pozzetti con pareti nere, al fine di rivestire il fondo dei pozzetti; coprire la piastra e incubarla tutta la notte a 37 gradi Celsius.

Rimuovere la soluzione di poli-D-lisina e sciacquare le pozzette tre volte con acqua distillata sterile, quindi lasciare asciugare la piastra nell'incubatrice a flusso laminare per almeno due ore. Se non utilizzata immediatamente, conservare la piastra rivestita e asciutta a quattro gradi Celsius per un massimo di sette giorni.

Successivamente, preparare la soluzione di dissociazione con papaina e sterilizzarla facendo passare la miscela attraverso un filtro da 0,2 micron. Riscaldare preventivamente la soluzione a 37 gradi Celsius prima dell'uso. Inoltre, preparare una soluzione di inibitore della proteasi aggiungendo 0,7 milligrammi per millilitro di tripsina nell'inibitore di tipo due al mezzo TM F 12 sterile.

Filtrare la soluzione utilizzando un filtro da 0,2 micron e preriscaldare la soluzione a 37 gradi Celsius prima dell'uso. Posizionare la zona subventricolare appena dissezionata dal cervello di un topo adulto fucci rosso in una piastra di Petri contenente 0,6% Glucosio in PBS e tritare il tessuto fino a quando non rimangono pezzi di grandi dimensioni. Successivamente, trasferire il tutto in un tubo da 15 millilitri e centrifugare a 200 × g per cinque minuti.

Dopo aver centrifugato il tessuto, eliminare il soprannatante e risospendere. Sospendere il tessuto in un millilitro di papaina preriscaldata, integrata con 0,01 milligrammi per millilitro di dna.One. Incubare la miscela per 10 minuti in un bagno termico a 37 gradi Celsius.

Quindi, centrifugare nuovamente a 200 volte G per cinque minuti e scartare il soprannatante. Aggiungere un millilitro della soluzione OVO MOID preriscaldata per arrestare la digestione enzimatica. Successivamente, utilizzare una punta per micropipetta P1000 per pipettare delicatamente su e giù 20 volte al fine di dissociare meccanicamente il tessuto tritato in una sospensione di singole cellule durante la pipettaggio.

Evitare di introdurre bolle d'aria nella miscela, poiché causerebbero stress aggiuntivo alle cellule. Far passare la sospensione cellulare attraverso un filtro sterile da 20 micron in un nuovo tubo da 15 millilitri. Lavare il filtro cellulare con due millilitri di PBS contenente 0,15% di BSA per evitare la perdita di cellule.

Quindi centrifugare la sospensione cellulare a 200 ×g per 10 minuti. Eliminare il soprannatante. Eseguire la colorazione con anticorpi specifici sospendendo innanzitutto le cellule di ciascun topo in 100 microlitri di PBS contenente lo 0,15% di BSA.

Utilizzare un decimo delle cellule provenienti da uno dei topi per preparare ciascuno dei quattro controlli come descritto nel protocollo testuale allegato. Aggiungere gli anticorpi primari elencati qui di seguito in ciascuna delle provette utilizzate per l'ordinamento cellulare e incubare le miscele per 20 minuti al buio a quattro gradi Celsius. Dopo l'incubazione con gli anticorpi primari, lavare le cellule con un millilitro di PBS contenente 0,15% di BSA, quindi centrifugare le cellule a 200 × g per 10 minuti.

Risospendere le cellule in 200 microlitri di PBS contenente lo 0,15% di BSA per cervello e trasferirle nei tubi di raccolta appropriati. Posizionare i tubi per l'ordinamento cellulare sul ghiaccio e aggiungere immediatamente prima dell'ordinamento cellulare un colorante vitale come il colorante Hoechst 33258 a due microgrammi per millilitro alle cellule, al fine di discriminare le cellule vive da quelle morte.

Successivamente, analizzare le cellule nel tubo di controllo negativo mediante la citofluorimetria e selezionare le cellule utilizzando i parametri di scattering laterale e scattering anteriore. Escludere le cellule morte selezionando solo gli eventi corrispondenti alla frazione negativa e i doppietti selezionando l'impulso con frazione negativa. Eseguire i controlli monocromatici e regolare, se necessario, le tensioni dei tubi fotomoltiplicatori.

Eseguire la compensazione del colore nella finestra di compensazione del software. Eseguire i tre controlli con fluorescenza meno uno e tracciare i gate di selezione. Una volta impostati tutti i gate, selezionare direttamente le cellule marcate in 100 microlitri di coltura.

Piastrare in piastra a 96 pozzetti rivestita con poli-l-lisina le cellule appena ordinate a una densità di 1000-3000 cellule per pozzetto con 300 microlitri di mezzo di coltura. Incubare le piastre di coltura a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per almeno un'ora.

Per consentire l'adesione cellulare, preparare un microscopio confocale a scansione laser per l'acquisizione delle immagini preriscaldando la camera controllata in temperatura, collegata, a 37 gradi Celsius in un'atmosfera di anidride carbonica al 5%. Posizionare la piastra a 96 pozzetti all'interno della camera preriscaldata del microscopio e mettere a fuoco il primo pozzetto. Quindi aprire il software di acquisizione e fare clic con il tasto destro nella finestra principale per selezionare i controlli di acquisizione e l'acquisizione DEAC.

Per aprire il pad TI e selezionare successivamente l'obiettivo plan A PO VC 20 XDIC, fare clic su acquisisci controlli di acquisizione e quindi aprire le opzioni di time-lapse. Impostare il centro di ogni pozzetto come posizione del palchetto e selezionare l'opzione di immagine grande a sette per sette millimetri quadrati. Osservare un'immagine a mosaico intorno al centro di ciascuno.

Impostare l'overlap per l'immagine a mosaico di grandi dimensioni al 5% e regolare la frequenza in modo che le immagini vengano acquisite ogni 20 minuti per 24 ore. Nelle impostazioni di uno più, selezionare il livello di tensione del tubo fotomoltiplicatore per ciascuna fluorescenza elencata nella barra del menu. Selezionare l'acquisizione delle immagini utilizzando uno scanner risonante ad alta velocità in un formato di 512 per 512 pixel e utilizzare il contrasto di interferenza differenziale (DIC) per visualizzare le cellule.

Quindi selezionare una cartella in cui salvare i file di dati. Selezionare il pulsante "esegui ora" nella finestra di acquisizione ND per iniziare l'acquisizione. Seguire l'elaborazione sul computer per tutta la durata di almeno un ciclo per assicurarsi che tutto funzioni correttamente.

I topi rossi Fuji sono stati utilizzati per seguire la fase G1 mediante fluorescenza rossa, impiegando la microscopia video a intervalli di tempo. Le cellule isolate sono fluorescenti in rosso durante la prima fase di crescita e rimangono tali durante la sintesi, la seconda fase di crescita e la mitosi. Lex positivo eeg FR positivo e eeg.

Le cellule positive al FR da topi giovani adulti e di mezza età sono state seminate e monitorate mediante microscopia. La durata delle fasi S e G2/M non ha mostrato differenze tra cellule positive a Lex, positive a EGFR e positive a EGFR, sia nei topi giovani che in quelli di mezza età. Tuttavia, si è riscontrato che la lunghezza della successiva fase di crescita, dalla prima divisione fino allo spegnimento del segnale fluorescente rosso, era maggiore nelle cellule più anziane a causa dell'aumento della durata della fase G1.

Le neurosfere ottenute cinque giorni dopo la semina sono più piccole nelle cellule Lex positive e EGFR positive ottenute dai topi più anziani. L'intero protocollo non dovrebbe superare le tre ore per la dissezione e la preparazione del fax e altre tre ore per il sorting cellulare quando si lavora con 12 topi. Tener presente che lavorare con troppi topi nello stesso giorno porterà a un aumento della durata del sorting cellulare e possibilmente a un incremento della morte cellulare o della differenziazione cellulare.