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Developmental Biology

Un'introduzione alla genetica dello sviluppo

An Introduction to Developmental Genetics

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JoVE Science Education Developmental Biology

An Introduction to Developmental Genetics

2.2: Gene Silencing with Morpholinos

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09:06 min

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April 30, 2023

Overview

Lo sviluppo è il complesso processo attraverso il quale un embrione unicellulare si trasforma in un organismo multicellulare. I processi di sviluppo sono guidati da informazioni codificate nel DNA di un organismo e i genetisti stanno cercando di capire come queste informazioni portano a un organismo completamente formato.

Questo video esamina la ricerca seminale nel campo della biologia dello sviluppo, compresa l’identificazione di geni specifici che controllano vari processi embrionali. Viene inoltre fornita un’introduzione alle principali domande poste dai genetisti dello sviluppo e ai metodi di spicco utilizzati per rispondere. Infine, vengono discusse diverse applicazioni di questi metodi di spicco, al fine di mostrare esperimenti specifici attualmente in esecuzione in questo campo.

Procedure

Lo sviluppo di ogni organismo è guidato dalle informazioni genetiche codificate nel suo DNA. Studiando come i geni controllano i processi di sviluppo, come la migrazione e la differenziazione cellulare, gli scienziati nel campo della genetica dello sviluppo stanno cercando di capire meglio come si formano le complesse strutture degli organismi multicellulari.

Questo video presenterà alcune delle principali scoperte in questo campo, una serie di domande fondamentali poste dai genetisti dello sviluppo, i principali strumenti che gli scienziati usano per rispondere a queste domande e, infine, studi specifici condotti sulla genetica dello sviluppo oggi.

Iniziamo esaminando alcune delle importanti scoperte che hanno plasmato il campo della genetica dello sviluppo.

Nel 1865, un monaco austriaco, Gregor Mendel, eseguì esperimenti di riproduzione con i piselli. Ha osservato che i tratti visibili dei piselli o “fenotipi”, come il colore dei semi, sono stati ereditati secondo regole coerenti. Proponendo che questi fenotipi siano in realtà controllati da alcuni fattori ereditari invisibili e discreti, Mendel ha piantato i semi del campo della genetica.

Questi fattori ereditari furono chiamati “geni” dal botanico danese Wilhelm Johannsen nel 1909. Poi, nel 1910, Thomas Hunt Morgan e i suoi studenti usarono il moscerino della frutta Drosophila come organismo modello per scoprire che i geni si trovano su strutture fisiche nel nucleo cellulare chiamato cromosomi.

Nel 1938, Salome Gluecksohn-Waelsch dimostrò che era necessario un gene specifico per lo sviluppo di una struttura embrionale nota come notocorda. Questa è stata una delle prime prove che i geni controllano i primi processi di sviluppo.

Nel 1940, Conrad Hal Waddington propose che le cellule di un embrione si differenziano lungo percorsi, o “destini”, che sono controllati dai geni. Ha formulato una metafora per questo processo, raffinato nei successivi 17 anni, chiamato “paesaggio epigenetico”, in cui una cellula è vista come un marmo che rotola giù da una collina verso diversi destini cellulari. I percorsi intrapresi dalla cellula seguono le creste e le valli del paesaggio, che a loro volta sono controllate dai geni e dai loro modelli di espressione.

Nel 1952, Wolfgang Beermann confermò che mentre cellule diverse in un organismo hanno lo stesso contenuto genetico, diverse regioni dei cromosomi sono attive e questa espressione genica differenziale definisce l’identità cellulare.

Una volta determinato che l’espressione genica influenza lo sviluppo, la domanda successiva è stata: quali geni? Per rispondere a questo, nel 1970, Edward B. Lewis, Christiane Nusslein-Volhard ed Eric Weischaus hanno usato sostanze chimiche per mutare casualmente i geni nei moscerini della frutta. Attraverso questi screening di mutazione, gli scienziati hanno identificato un gran numero di geni che controllano ogni fase del processo di sviluppo.

Nel 2007, un consorzio internazionale di scienziati ha iniziato a lavorare alla creazione di una collezione di topi in cui ogni singolo gene, uno in ogni topo, viene eliminato o “eliminato”. Il fenotipo di ciascuno di questi topi è attualmente in fase di caratterizzazione e ci fornirà il primo catalogo della funzione di tutti i geni in un mammifero.

Ora che abbiamo esaminato le radici del campo, diamo un’occhiata ad alcune domande chiave a cui i genetisti dello sviluppo stanno cercando di rispondere.

Alcuni ricercatori si stanno concentrando sui primi eventi durante la trasformazione di uova fecondate, o zigoti, in embrioni multicellulari. Questi eventi dipendono dagli RNA e dalle proteine che vengono depositate nell’uovo dalla madre, in un fenomeno noto come “contributo materno” o “effetto materno”. Gli scienziati sono interessati a imparare come il genotipo di una madre influenza il fenotipo di un embrione.

Un’altra domanda centrale nella genetica dello sviluppo è: in che modo le cellule geneticamente identiche adottano destini cellulari diversi? Gli scienziati stanno identificando i molti fattori che controllano l’espressione genica differenziale tra le diverse cellule, comprese le vie di segnalazione che dicono alla cellula quali geni esprimere e quando esprimerli durante lo sviluppo.

Infine, gli scienziati si chiedono anche come fa l’embrione precoce, una massa amorfa di cellule, a trasformarsi in un organismo complesso con parti distinte e funzionali. La formazione di questo piano corporeo è chiamata morfogenesi e gli scienziati stanno cercando di identificare i geni e i percorsi che governano questo processo.

Ora che conosci alcune delle domande che i genetisti dello sviluppo si stanno ponendo, esaminiamo le tecniche che stanno usando per rispondere a queste domande.

Gli scienziati possono studiare il ruolo di geni specifici nello sviluppo interrompendo la loro espressione. Un modo per farlo è “eliminare” il gene nel DNA dell’organismo introducendo mutazioni o sostituendolo con DNA non funzionale. In alternativa, l’espressione genica può essere “abbattuta” introducendo oligonucleotidi che si legano alle sequenze di mRNA bersaglio e impediscono la produzione di proteine funzionali.

Per identificare quali geni sono responsabili di particolari fenotipi, gli scienziati possono effettuare screening genetici. In uno screening genetico in avanti, le mutazioni sono generate casualmente negli organismi da radiazioni o sostanze chimiche note come mutageni. Quando si trova che un mutante mostra un fenotipo di interesse, il gene sconosciuto che è stato mutato può quindi essere identificato. L’approccio opposto è uno schermo genetico inverso, in cui gli scienziati prima prendono di mira un gran numero di geni candidati specifici per la rottura, e poi guardano i fenotipi risultanti dei mutanti.

Infine, i biologi sono anche interessati a determinare l’espressione genica in diverse fasi dello sviluppo. Uno strumento per misurare l’espressione genica è il microarray, che è un chip punteggiato di oligonucleotidi contenenti sequenze dei geni da testare. In un tipico esperimento, l’RNA estratto da organismi in due diversi stadi di sviluppo viene utilizzato per generare due diversi set di sonde etichettate fluorescentemente, che vengono poi ibridate al microarray. I cambiamenti nell’espressione genica possono quindi essere interpretati dal segnale fluorescente in corrispondenza di ciascun punto dell’array.

Con queste tecniche sperimentali in mente, diamo un’occhiata a come i ricercatori le stanno applicando per studiare la genetica dello sviluppo.

Gli scienziati stanno eseguendo screening genetici su larga scala in organismi modello, come C. elegans, per cercare geni che influenzano lo sviluppo. Questo di solito viene fatto attraverso l’interferenza dell’RNA, o RNAi, un processo in cui i geni vengono silenziati usando piccole molecole di RNA. Qui, gli scienziati hanno alimentato i vermi con batteri contenenti una libreria RNAi progettata contro un gran numero di geni di vermi e hanno analizzato l’effetto dell’abbattimento dei geni sullo sviluppo degli animali.

Altri ricercatori stanno eseguendo screening genetici avanzati utilizzando mutagenesi casuale per identificare fenotipi di sviluppo. In questo esperimento, i ricercatori hanno utilizzato la tecnica della trappola genetica per mutagenizzare gli embrioni di zebrafish, in cui un costrutto reporter è mirato in modo casuale agli introni di geni e li rende non funzionali. Gli scienziati possono quindi identificare facilmente gli animali in cui il gene viene interrotto con successo cercando il segnale del reporter, e quelli che presentano un difetto di sviluppo possono avere il gene responsabile identificato.

Infine, l’espressione genica di diversi tipi di cellule in un organismo in via di sviluppo può essere profilata da microarray per identificare quali geni vengono attivati o disattivati durante la differenziazione e la specializzazione cellulare. In questo studio, singole cellule neuronali di diversi tipi di cellule sono state isolate dalla retina in via di sviluppo. L’RNA è stato quindi estratto da queste cellule per l’analisi dei microarray per identificare i geni che svolgono un ruolo nello sviluppo di ogni specifico tipo di cellula.

Hai appena visto l’introduzione di JoVE alla genetica dello sviluppo. Questo video ha esaminato alcuni punti salienti storici di questo campo, le grandi domande poste dai genetisti dello sviluppo, alcuni dei metodi di spicco attualmente utilizzati nei laboratori e applicazioni specifiche di questi approcci allo studio della biologia dello sviluppo. Come sempre, grazie per aver guardato!

Transcript

The development of every organism is guided by the genetic information encoded in its DNA. By studying how genes control developmental processes, such as cell migration and differentiation, scientists in the field of developmental genetics are trying to better understand how the complex structures of multicellular organisms are formed.

This video will present some of the major discoveries in this field, a number of fundamental questions asked by developmental geneticists, major tools that scientists use to answer these questions, and finally, specific studies being conducted on developmental genetics today.

Let’s begin by reviewing some of the important discoveries that have shaped the field of developmental genetics.

In 1865, an Austrian monk, Gregor Mendel, performed breeding experiments with peas. He observed that the peas’ visible traits or “phenotypes,” such as seed color, were inherited according to consistent rules. By proposing that these phenotypes are actually controlled by some invisible, discrete heredity factors, Mendel planted the seeds of the field of genetics.

These heredity factors were named “genes” by Danish botanist Wilhelm Johannsen in 1909. Then, in 1910, Thomas Hunt Morgan and his students used the fruit fly Drosophila as a model organism to discover that genes are found on physical structures in the cell nucleus called chromosomes.

In 1938, Salome Gluecksohn-Waelsch showed that a specific gene was needed for the development of an embryonic structure known as the notochord. This was among the earliest evidence that genes control early developmental processes.

In 1940, Conrad Hal Waddington proposed that cells in an embryo differentiate along paths, or “fates,” that are controlled by genes. He formulated a metaphor for this process, refined over the next 17 years, called the “epigenetic landscape,” where a cell is seen as a marble rolling down a hillside towards different cell fates. The paths taken by the cell follow the ridges and valleys in the landscape, which in turn are controlled by genes and their expression patterns.

In 1952, Wolfgang Beermann confirmed that while different cells in an organism have the same genetic content, different regions of the chromosomes are active, and this differential gene expression defines cell identity.

Once it was determined that gene expression influences development, the next question was, which genes? To answer this, in the 1970s, Edward B. Lewis, Christiane Nusslein-Volhard and Eric Weischaus used chemicals to randomly mutate genes in fruit flies. Through these mutation screens, the scientists identified a large number of genes controlling every step of the development process.

In 2007, an international consortium of scientists began work on creating a collection of mice in which every single gene, one in each mouse, is deleted or “knocked out.” The phenotype of each of these mice is currently being characterized, and will give us the first catalogue of the function of all genes in a mammal.

Now that we’ve reviewed the roots of the field, let’s look at a few key questions that developmental geneticists are trying to answer.

Some researchers are focusing on the early events during the transformation of fertilized eggs, or zygotes, into multicellular embryos. These events depend on RNAs and proteins that are deposited in the egg by the mother, in a phenomenon known as “maternal contribution” or “maternal effect.” Scientists are interested in learning how a mother’s genotype influences an embryo’s phenotype.

Another central question in developmental genetics is: how do genetically identical cells adopt different cell fates? Scientists are identifying the many factors that control differential gene expression among different cells, including the signaling pathways that tell the cell what genes to express, and when to express them, during development.

Finally, scientists are also asking how does the early embryo, an amorphous mass of cells, transform into a complex organism with distinct, functional parts. The formation of this body plan is called morphogenesis, and scientists are trying to identify the genes and pathways that govern this process.

Now that you know some of the questions that developmental geneticists are asking, let’s review the techniques they are using to answer these questions.

Scientists can study the role of specific genes in development by disrupting their expression. One way to do this is by “knocking out” the gene in the organism’s DNA by introducing mutations, or replacing it with nonfunctional DNA. Alternatively, gene expression can be “knocked down” by introducing oligonucleotides that will bind to the target mRNA sequences and prevent the production of functional proteins.

To identify which genes are responsible for particular phenotypes, scientists can carry out genetic screens. In a forward genetic screen, mutations are randomly generated in organisms by either radiation or chemicals known as mutagens. When a mutant is found to display a phenotype of interest, the unknown gene that was mutated can then be identified. The opposite approach is a reverse genetic screen, where scientists first target a large number of specific candidate genes for disruption, and then look at the resultant phenotypes of the mutants.

Finally, biologists are also interested in determining gene expression at different developmental stages. One tool for measuring gene expression is the microarray, which is a chip dotted with oligonucleotides containing sequences of the genes to be tested. In a typical experiment, RNA extracted from organisms at two different developmental stages is used to generate two different sets of fluorescently labeled probes, which are then hybridized to the microarray. Changes in gene expression can then be interpreted from the fluorescent signal at each dot on the array.

With these experimental techniques in mind, let’s take a look at how researchers are applying them to study developmental genetics.

Scientists are performing large-scale genetic screens in model organisms, such as C. elegans, to look for genes that affect development. This is usually done through RNA interference, or RNAi, a process whereby genes are silenced using small RNA molecules. Here, scientists fed worms with bacteria containing an RNAi library designed against a large number of worm genes, and analyzed the effect of gene knockdown on the animals’ development.

Other researchers are performing forward genetic screens using random mutagenesis to identify developmental phenotypes. In this experiment, researchers used the gene-trap technique to mutagenize zebrafish embryos, where a reporter construct is randomly targeted to introns of genes and render them nonfunctional. Scientists can then easily identify the animals in which the gene is successfully disrupted by looking for the reporter signal, and those that exhibit a developmental defect can have the responsible gene identified.

Finally, the gene expression of different cell types in a developing organism can be profiled by microarrays to identify which genes are turned on or off during cell differentiation and specialization. In this study, single neuronal cells of different cell types were isolated from the developing retina. RNA was then extracted from these cells for microarray analysis to identify genes that play a role in the development of each specific cell type.

You’ve just watched JoVE’s introduction to developmental genetics. This video reviewed some historical highlights of this field, the big questions asked by developmental geneticists, a few of the prominent methods currently being used in labs, and specific applications of these approaches to studying developmental biology. As always, thanks for watching!

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