Mappatura spazio-temporale di motilità in Ex Vivo Preparazioni di intestini

L'obiettivo generale per la creazione di una mappa spazio-temporale completa degli intestini ex vivo è quello di studiare la risposta al contenuto luminale osservando il movimento dettagliato della parete intestinale in un intero segmento. Il vantaggio principale di questa tecnica è che l'attività all'interno di diverse regioni dello stesso segmento di tessuto può essere registrata e confrontata nello spazio e nel tempo, consentendo l'identificazione di modelli complessi di motilità piuttosto che la semplice contrazione o rilassamento. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla normale motilità intestinale, può anche essere applicato all'ideazione degli effetti di vari farmaci e agenti intraluminali, come i nutrienti o i modelli di motilità.

In generale, le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché inizialmente le mappe spazio-temporali possono essere difficili da interpretare. Ma con il tempo, si possono discernere modelli complessi a colpo d'occhio. Per iniziare, rimuovi il colon o l'intestino da una cavia soppressa.

Fissalo con una soluzione calda di Krebs. Nel vassoio di dissezione, rimuovere tutto il contenuto intraluminale perfondendo delicatamente il tampone Krebs attraverso il lume. Utilizzare una siringa con un catetere a estremità smussata ed evitare di distendere eccessivamente il segmento del colon durante la perfusione.

Successivamente, ho collegato due lunghezze di tre millimetri di tubo di polietilene a due cateteri tubolari di vetro lucidato a fuoco, che hanno un diametro di tre millimetri. In un vassoio di dissezione riscaldato, inserire un catetere nell'estremità orale della preparazione tissutale e legare una sutura dietro il piccolo pezzo di tubo, circondando il catetere con un nodo da chirurgo. Tentare delicatamente di estrarre il catetere per assicurarsi che il nodo sia aderente.

Il piccolo pezzo di tubo in polietilene impedisce lo scivolamento della sutura. Ripetere questo processo utilizzando l'altro catetere sull'estremità aborale del tessuto. Quindi rimuovere il mesentere dalla preparazione del tessuto.

Con entrambi i cateteri fissati, trasferire la preparazione dal vassoio di dissezione in uno dei bagni per organi GIMM e posizionare il tessuto con l'estremità orale rivolta lontano dall'utente. Quindi, fissare i cateteri del tubo di vetro alla vasca d'organo utilizzando l'argilla dei modellisti attaccando l'estremità del tubo di vetro al lato della vasca o utilizzando clip di plastica per fissare i cateteri ai pali sopra la vasca utilizzati per fissare le telecamere. Ora attacca un pezzo di tubo di cinque centimetri all'estremità aperta di ciascun catetere.

Per il catetere orale, collegare il pezzo di tubo corto a un pezzo di tubo più lungo con un attacco luer lock. Quindi collegare la siringa da cinque millilitri al raccordo luer lock. Questo verrà utilizzato per iniettare il tampone nella preparazione tissutale.

Per il catetere aborale, utilizzare il tubo per dirigere il deflusso luminale in un contenitore di raccolta. Ora, utilizzando la siringa collegata, sciacquare lentamente il tessuto con un tampone Krebs riscaldato per assicurarsi che ci sia un buon flusso, come si vede dal liquido che esce dal catetere aborale. Procedere calibrando il sistema di registrazione video mentre il tessuto si equilibra per 30 minuti.

Calibra l'altezza, il posizionamento della telecamera, le impostazioni video per luminosità e contrasto e la distanza orizzontale utilizzando il software GIMM. Fare clic sulla scheda dell'esperimento per calibrare la fotocamera. Quindi, nel menu File, fare clic su Calibra.

Una volta che il video viene visualizzato nella finestra della workstation di calibrazione, posizionare la telecamera a un'altezza in cui l'immagine includa le estremità dei cateteri inseriti nel lume del colon. Quindi calibra la distanza orizzontale visualizzata nell'immagine sullo schermo utilizzando l'adesivo del righello traslucido attaccato a ciascun bagno. Nella stessa finestra della workstation di calibrazione, impostare le linee guida verticali rosse in modo che siano distanti 10 millimetri l'una dall'altra.

Quindi digita questa distanza nella finestra del cursore della distanza e fai clic sul pulsante Cal. Quindi, regola i cursori di guadagno, luminosità e otturatore all'interno della finestra della workstation di calibrazione per far apparire il segmento di tessuto come una silhouette scura su uno sfondo chiaro. Quindi regola le manopole di messa a fuoco e apertura sulla fotocamera stessa per migliorare ulteriormente l'immagine.

Per completare la calibrazione dell'immagine, fare clic su Salva seguito da Sì nella schermata pop-up. Infine, fai clic su Esci. Dopo il periodo di equilibratura di mezz'ora, iniziare l'esperimento.

Inizia con il nome della prova sperimentale. Quindi, occludere il lume del tubo che sporge dal catetere aborale con la pinza di plastica. Quindi iniettare circa 7 millilitri di tampone Krebs nel lume prossimale del colon.

L'obiettivo è fornire una distensione sufficiente per avviare le contrazioni propulsive. Una volta che il segmento è stato dilatato dal fluido luminale, avviare la registrazione video. Nel software, fare doppio clic sulla prova denominata per aprire la vista sperimentale della telecamera, quindi fare clic sull'interruttore in posizione di accensione per visualizzare il campo della telecamera.

Raccogli una lunghezza predeterminata di dati video. Al termine di questa prova iniziale di distensione controllata, allentare o rimuovere il morsetto per consentire al segmento di tessuto di spingere il liquido distensore fuori dal lume. Ha permesso al tessuto di riequilibrarsi per 10-20 minuti e poi ha ripetuto la procedura utilizzando il trattamento.

Una singola preparazione tissutale può essere sottoposta a un massimo di cinque trattamenti di 10 minuti per i periodi di riposo appropriati tra i test. Prestare attenzione alla desquamazione della mucosa, che segnala la degradazione del tessuto. per analizzare la registrazione, fare doppio clic sul nome di una prova specifica per aprire la finestra di analisi per la costruzione di una mappa ST.

All'interno dell'area di riproduzione video, regolare i cursori del contrasto e della luminosità per rendere l'immagine appropriata per l'analisi. Crea una silhouette di tessuto nero su uno sfondo chiaro. Quindi, impostare le linee guida rosse orizzontali e verticali all'interno della finestra dell'immagine video per isolare la regione del tessuto per l'analisi e rimuovere le aree contenenti artefatti.

Quindi imposta il tempo per l'analisi. Fare clic sul pulsante verde A per selezionare il punto di inizio e fare clic sul pulsante giallo B per il punto di arresto quando il dispositivo di scorrimento del tempo è nelle posizioni corrette. Quindi, seleziona la scheda Analisi motore per aprire la finestra della mappa ST, quindi fai clic sul pulsante del cronometro.

Inizia la generazione della mappa ST facendo clic sul cursore del mirino all'interno della sagoma nera del tessuto. Il completamento della generazione della mappa potrebbe richiedere alcuni minuti. Dopo aver costruito la mappa ST, selezionare la funzione di zoom per ingrandire l'immagine.

Quindi seleziona l'opzione colore per vedere l'immagine a colori anziché in scala di grigi. Quindi, seleziona Abilita in modo che il cursore possa essere utilizzato per selezionare il pixel per l'analisi. Per il tessuto associato ai pixel selezionati, la variazione del diametro luminale nel tempo viene analizzata e visualizzata come un tracciato del diametro del grano a destra della mappa ST.

Dopo le analisi, selezionare Esci. A questo punto, esportare la mappa ST per altri scopi selezionando File, quindi Esporta dati e quindi Metafile. Assegna un nome al file e salvalo come file emf facendo clic su Salva.

Le mappe generate da questa tecnica mostrano i cambiamenti nel diametro luminale del tessuto sia in distanza che nel tempo. La distanza orizzontale è sull'asse X e il tempo sull'asse Y, con l'ora di inizio in alto e l'ora di fine in basso. Nell'angolo in alto a destra c'è una legenda, che mostra i diametri minimo e massimo della luminalità, nonché la scala per entrambi gli assi X e Y.

Pertanto, diverse tonalità di pixel all'interno dell'immagine in scala di grigi corrispondono a diversi diametri luminali. I pixel più scuri corrispondono a diametri più larghi, mentre i pixel più chiari corrispondono a diametri più piccoli. Le onde contrattili del muscolo circolare appariranno come regioni di pixelizzazione più chiara a causa della riduzione del diametro luminale.

Al contrario, la distensione luminale dovuta al rilassamento muscolare circolare o a un grande bolo di liquido viene mostrata con pixel più scuri. Oltre alle onde di una contrazione propagante, è possibile visualizzare anche il modello di motilità di miscelazione noto come segmentazione. Piccole contrazioni stazionarie si verificano contemporaneamente in diverse aree.

Con il tempo, queste piccole contrazioni si spostano verso l'estremità anale aborale. La mesentere che rimane sul tessuto può causare artefatti, che si presentano come linee verticali scure. Il movimento orizzontale di queste linee verticali artefatte può essere utilizzato per determinare i tempi del movimento muscolare longitudinale.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare i segmenti intestinali per la registrazione video e di come generare la successiva rappresentazione della motilità intestinale come mappe spaziotemporali. Seguendo questa procedura, diversi nutrienti possono essere aggiunti alla soluzione luminale al fine di determinare in che modo i componenti naturali inducono specifici modelli di motilità al fine di facilitare la digestione e l'assorbimento. L'uso di specifici agonisti farmacologici o antagonisti dei recettori per gli agenti neurali umorali può essere utilizzato per determinare i meccanismi attraverso i quali la motilità viene avviata e propagata.

Questa tecnica potrebbe aiutare a produrre dati utili per determinare composti utili per il trattamento dei disturbi della motilità.