Un'introduzione alla biologia delle cellule staminali
Come suggerisce il nome, le cellule staminali sono i precursori da cui molti diversi tipi di cellule "staminali". Sono caratterizzati dalla loro potenza, o capacità di differenziarsi in cellule da tutti e tre gli strati germinali, così come la loro rinnovabilità, o capacità di generare più cellule staminali. Nella speranza di far progredire i campi della biologia dello sviluppo e della medicina rigenerativa, i ricercatori di cellule staminali stanno lavorando per capire come queste cellule uniche compiono un'impresa così importante.
Questo video copre le principali scoperte nel campo della biologia delle cellule staminali, le domande chiave poste dagli scienziati in questo campo, i metodi di spicco utilizzati dai ricercatori sulle cellule staminali e le applicazioni della ricerca sulle cellule staminali.
Ora che abbiamo introdotto il concetto di cellule staminali, immergiamoci nella ricca storia della ricerca sulle cellule staminali.
Nel 1960, i dottori Ernest McCulloch e James Till scoprirono alcune delle prime prove definitive dell'esistenza di cellule staminali ematopoietiche nel midollo osseo dei mammiferi adulti. Queste cellule hanno la capacità di auto-rinnovarsi e sono multipotenti, il che significa che possono differenziarsi in molteplici, ma limitati, tipi di cellule, vale a dire le cellule del sangue e del sistema immunitario.
Nel 1988, Irving Weissman e colleghi hanno perfezionato un metodo per la purificazione delle cellule staminali ematopoietiche dal midollo osseo del topo.
Nel 1981, la professoressa Gail Martin ha coniato il termine "cellula staminale embrionale". A differenza delle cellule staminali ematopoietiche, le cellule staminali embrionali sono pluripotenti, avendo la capacità di differenziarsi in tutti i tipi di cellule del corpo. Lei e gli scienziati Martin Evans e Matthew Kaufman, contemporaneamente, ma separatamente, hanno sviluppato metodi per estrarre la massa cellulare interna dalle blastocisti di topo e colturarle in vitro come cellule staminali.
Nel 1998, oltre dieci anni dopo l'isolamento delle cellule staminali embrionali di topo, il Dr. James Thomson ha stabilito con successo le prime linee di cellule staminali embrionali umane.
Nel 2006, un importante passo avanti si è verificato con l'avvento delle cellule staminali pluripotenti indotte, come ideato dal Dr. Shinya Yamanaka. Basandosi sul lavoro di John Gurdon, Yamanaka ha sviluppato un metodo per riprogrammare le cellule differenziate in uno stato pluripotente utilizzando il retrovirus per indurre l'espressione di un piccolo insieme di fattori di trascrizione ora noti come "fattori Yamanaka". Le cellule risultanti sono state chiamate "cellule staminali pluripotenti indotte" o "iPSC". Questi esperimenti sono stati considerati così di fondamentale importanza che Yamanaka e Gurdon hanno ricevuto il Premio Nobel nel 2012.
Al momento, ora abbiamo modelli iPSC di diverse malattie umane e piattaforme di rigenerazione in più tessuti.
Oggi, la ricerca sulle cellule staminali è guidata da diverse domande generali.
Una delle domande più importanti è: come fanno le cellule staminali a mantenere la pluripotenza e la rinnovabilità? Ci sono due caratteristiche correlate delle cellule staminali che conferiscono queste proprietà. Il primo è l'espressione di geni specifici essenziali per la staminalità e l'auto-rinnovamento. Il secondo è la reattività delle cellule staminali ai fattori regolatori che influenzano l'espressione di questi geni.
La prossima domanda logica è: come è diretta la differenziazione delle cellule staminali? Quando una cellula staminale si sviluppa in una cellula matura, l'attivazione di specifici percorsi di differenziazione induce cambiamenti nell'espressione genica, disattivando i geni delle cellule staminali e attivando i geni specifici del tessuto, il che si traduce in una crescente specializzazione della funzione e della morfologia cellulare.
Infine, affrontiamo la questione principale che guida il finanziamento della ricerca sulle cellule staminali: le cellule staminali possono essere utilizzate per curare le malattie? La medicina rigenerativa sta affrontando questa questione in due modi: 1) ricrescendo gli organi in laboratorio e 2) fornendo cellule staminali tramite trapianto per trattare la degenerazione dei tessuti.
Ora che abbiamo presentato alcune delle domande chiave riguardanti la biologia delle cellule staminali, esaminiamo alcuni dei metodi di spicco utilizzati per affrontarle.
La tecnologia microarray può essere impiegata per scoprire quali geni conferiscono potenza e rinnovabilità nelle cellule staminali. In questa tecnica, l'RNA totale è isolato da una popolazione di cellule, che funge da istantanea dell'attuale espressione genica. In una serie di passaggi, questo mRNA viene convertito in una sonda marcata fluorescentemente e ibridato in un chip contenente trascrizioni dell'intero genoma umano. La scansione di questo chip fornisce una lettura dei relativi profili di espressione genica. Come puoi vedere, una cellula staminale esprime un insieme specifico di geni che differisce da una cellula differenziata.
Un altro test per i geni di pluripotenza coinvolge il sistema di rilevamento Oct4-GFP. Oct4 è necessario per l'auto-rinnovamento ed è rapidamente down-regolato durante la differenziazione. Pertanto, la sua espressione funge da indicatore affidabile di "stemness". In questo esperimento, le cellule esprimono proteine fluorescenti verdi sotto il controllo del promotore Oct4. Queste cellule possono quindi essere manipolate sperimentalmente e i cambiamenti nell'espressione della GFP vengono analizzati per identificare nuovi geni o fattori solubili che modulano l'auto-rinnovamento.
Per studiare le cellule staminali in vitro,dobbiamo prima capire come farle colturare. Le cellule staminali richiedono un particolare microambiente per mantenere la staminalità. Ciò può essere ottenuto co-coltivando cellule staminali con cellule feeder, come fibroblasti embrionali di topo o MEF. I MEF secernono una miscela complessa di pluripotenza necessaria e fattori di auto-rinnovamento.
A volte, è auspicabile avere colture di cellule staminali prive di alimentatore. Il metodo principale per mantenere linee cellulari prive di alimentatore è quello di integrare i mezzi di coltura cellulare con reagenti di crescita e fattori inibitori.
La differenziazione delle cellule staminali in vitro si ottiene utilizzando diversi metodi. L'espressione genica differenziale è in ultima analisi responsabile della specializzazione delle cellule. Nel metodo in due fasi che vedete qui, le cellule staminali embrionali di topo coltivate sono innescate per un destino neuronale prima di essere ulteriormente differenziate con il mezzo di induzione del motoneurone. Questi fattori attivano specifiche vie di espressione genica, con conseguenti cambiamenti morfologici e proteomici caratteristici dei motoneuroni.
Uno dei principali svantaggi della differenziazione tradizionale in vitro è che le piastre piatte limitano la crescita 3D delle cellule. Il metodo a goccia sospesa e i metodi a microcapsula aggirano questi problemi. Nella tecnica della goccia sospesa, piccole gocce di sospensioni di cellule staminali vengono placcate sul coperchio di una capsula di Petri e coltivate a testa in giù per formare aggregati di cellule staminali note come corpi embrioidi.
Nei metodi di microincapsulazione, le cellule staminali vengono miscelate con una membrana semipermeabile biocompatibile chiamata alginato e depositate come perline in piastre di coltura cellulare. Entrambi i metodi consentono un'ulteriore differenziazione in cellule specializzate, come i neuroni dopaminergici e i cardiomiociti.
Sapere come dirigere la differenziazione è un passo importante verso l'utilizzo delle cellule staminali nella medicina rigenerativa. La terapia di trapianto di cellule staminali mira a trattare e curare le malattie degenerative riparando i tessuti danneggiati con cellule staminali. In questo esperimento, le cellule somatiche dei pazienti vengono riprogrammate in cellule iPS tramite infezione lentivirale dei fattori Yamanaka. Dal loro stato pluripotente, le cellule vengono differenziate in specifici tipi di cellule e restituite all'ospite per riparare il tessuto danneggiato.
Ora che conosci alcuni dei metodi utilizzati per studiare le cellule staminali, diamo un'occhiata a come questi metodi vengono applicati in esperimenti specifici.
In questo esperimento che utilizza un modello murino di sclerosi multipla, le cellule staminali neurali vengono iniettate per via endovenosa nei topi affetti. Le fette di cervello dei topi trattati vengono raccolte e riprese al microscopio per valutare il successo del trapianto. Le cellule derivate da cellule precursori neuronali donatrici vengono tracciate utilizzando il gene reporter LacZ. Come puoi vedere, un certo numero di cellule staminali donatrici si sono differenziate e integrate nel sistema nervoso centrale dei topi malati.
Non tutti i disturbi possono essere trattati con iniezioni sistemiche. Le lesioni della cartilagine, ad esempio, richiedono un'impalcatura specializzata per ricostruire. In questo esperimento, una miscela di cellule staminali mesenchimali e fattori della coagulazione vengono coltivati insieme per formare un coagulo. Il coagulo viene quindi inserito nella cartilagine del ginocchio danneggiata di un coniglio e lasciato integrare. Seguendo questa procedura, si può osservare il rimodellamento della cartilagine del ginocchio in un'articolazione liscia e funzionale.
A volte, i ricercatori di cellule staminali e gli ingegneri tissutali si uniscono per ricostruire interi organi. In questo esperimento, i polmoni dei primati vengono lavati per decellularizzare l'organo, lasciando dietro di sé solo componenti strutturali non cellulari. Questo polmone "fantasma" viene poi trasferito in un bioreattore, dove viene seminato con cellule staminali vascolari ed epiteliali. Per imitare ulteriormente la pressione e il comportamento che un polmone naturale sperimenta, il bioreattore fa circolare i mezzi, mantiene la pressione e i livelli di gas e gonfia i polmoni.
Hai appena visto la panoramica della biologia delle cellule staminali di JoVE. Per ricapitolare, in questo video abbiamo discusso le cellule staminali e la loro storia, i metodi di manutenzione, differenziazione e consegna e le applicazioni delle cellule staminali. Grazie per l'attenzione!
Le cellule che possono differenziarsi in una varietà di tipi di cellule, note come cellule staminali, sono al centro di uno dei campi più eccitanti de…
Come suggerisce il nome, le cellule staminali sono i precursori da cui molti diversi tipi di cellule "staminali". Sono caratterizzati dalla loro potenza, o capacità di differenziarsi in cellule da tutti e tre gli strati germinali, così come la loro rinnovabilità, o capacità di generare più cellule staminali. Nella speranza di far progredire i campi della biologia dello sviluppo e della medicina rigenerativa, i ricercatori di cellule staminali stanno lavorando per capire come queste cellule uniche compiono un'impresa così importante.
Questo video copre le principali scoperte nel campo della biologia delle cellule staminali, le domande chiave poste dagli scienziati in questo campo, i metodi di spicco utilizzati dai ricercatori sulle cellule staminali e le applicazioni della ricerca sulle cellule staminali.
Ora che abbiamo introdotto il concetto di cellule staminali, immergiamoci nella ricca storia della ricerca sulle cellule staminali.
Nel 1960, i dottori Ernest McCulloch e James Till scoprirono alcune delle prime prove definitive dell'esistenza di cellule staminali ematopoietiche nel midollo osseo dei mammiferi adulti. Queste cellule hanno la capacità di auto-rinnovarsi e sono multipotenti, il che significa che possono differenziarsi in molteplici, ma limitati, tipi di cellule, vale a dire le cellule del sangue e del sistema immunitario.
Nel 1988, Irving Weissman e colleghi hanno perfezionato un metodo per la purificazione delle cellule staminali ematopoietiche dal midollo osseo del topo.
Nel 1981, la professoressa Gail Martin ha coniato il termine "cellula staminale embrionale". A differenza delle cellule staminali ematopoietiche, le cellule staminali embrionali sono pluripotenti, avendo la capacità di differenziarsi in tutti i tipi di cellule del corpo. Lei e gli scienziati Martin Evans e Matthew Kaufman, contemporaneamente, ma separatamente, hanno sviluppato metodi per estrarre la massa cellulare interna dalle blastocisti di topo e colturarle in vitro come cellule staminali.
Nel 1998, oltre dieci anni dopo l'isolamento delle cellule staminali embrionali di topo, il Dr. James Thomson ha stabilito con successo le prime linee di cellule staminali embrionali umane.
Nel 2006, un importante passo avanti si è verificato con l'avvento delle cellule staminali pluripotenti indotte, come ideato dal Dr. Shinya Yamanaka. Basandosi sul lavoro di John Gurdon, Yamanaka ha sviluppato un metodo per riprogrammare le cellule differenziate in uno stato pluripotente utilizzando il retrovirus per indurre l'espressione di un piccolo insieme di fattori di trascrizione ora noti come "fattori Yamanaka". Le cellule risultanti sono state chiamate "cellule staminali pluripotenti indotte" o "iPSC". Questi esperimenti sono stati considerati così di fondamentale importanza che Yamanaka e Gurdon hanno ricevuto il Premio Nobel nel 2012.
Al momento, ora abbiamo modelli iPSC di diverse malattie umane e piattaforme di rigenerazione in più tessuti.
Oggi, la ricerca sulle cellule staminali è guidata da diverse domande generali.
Una delle domande più importanti è: come fanno le cellule staminali a mantenere la pluripotenza e la rinnovabilità? Ci sono due caratteristiche correlate delle cellule staminali che conferiscono queste proprietà. Il primo è l'espressione di geni specifici essenziali per la staminalità e l'auto-rinnovamento. Il secondo è la reattività delle cellule staminali ai fattori regolatori che influenzano l'espressione di questi geni.
La prossima domanda logica è: come è diretta la differenziazione delle cellule staminali? Quando una cellula staminale si sviluppa in una cellula matura, l'attivazione di specifici percorsi di differenziazione induce cambiamenti nell'espressione genica, disattivando i geni delle cellule staminali e attivando i geni specifici del tessuto, il che si traduce in una crescente specializzazione della funzione e della morfologia cellulare.
Infine, affrontiamo la questione principale che guida il finanziamento della ricerca sulle cellule staminali: le cellule staminali possono essere utilizzate per curare le malattie? La medicina rigenerativa sta affrontando questa questione in due modi: 1) ricrescendo gli organi in laboratorio e 2) fornendo cellule staminali tramite trapianto per trattare la degenerazione dei tessuti.
Ora che abbiamo presentato alcune delle domande chiave riguardanti la biologia delle cellule staminali, esaminiamo alcuni dei metodi di spicco utilizzati per affrontarle.
La tecnologia microarray può essere impiegata per scoprire quali geni conferiscono potenza e rinnovabilità nelle cellule staminali. In questa tecnica, l'RNA totale è isolato da una popolazione di cellule, che funge da istantanea dell'attuale espressione genica. In una serie di passaggi, questo mRNA viene convertito in una sonda marcata fluorescentemente e ibridato in un chip contenente trascrizioni dell'intero genoma umano. La scansione di questo chip fornisce una lettura dei relativi profili di espressione genica. Come puoi vedere, una cellula staminale esprime un insieme specifico di geni che differisce da una cellula differenziata.
Un altro test per i geni di pluripotenza coinvolge il sistema di rilevamento Oct4-GFP. Oct4 è necessario per l'auto-rinnovamento ed è rapidamente down-regolato durante la differenziazione. Pertanto, la sua espressione funge da indicatore affidabile di "stemness". In questo esperimento, le cellule esprimono proteine fluorescenti verdi sotto il controllo del promotore Oct4. Queste cellule possono quindi essere manipolate sperimentalmente e i cambiamenti nell'espressione della GFP vengono analizzati per identificare nuovi geni o fattori solubili che modulano l'auto-rinnovamento.
Per studiare le cellule staminali in vitro,dobbiamo prima capire come farle colturare. Le cellule staminali richiedono un particolare microambiente per mantenere la staminalità. Ciò può essere ottenuto co-coltivando cellule staminali con cellule feeder, come fibroblasti embrionali di topo o MEF. I MEF secernono una miscela complessa di pluripotenza necessaria e fattori di auto-rinnovamento.
A volte, è auspicabile avere colture di cellule staminali prive di alimentatore. Il metodo principale per mantenere linee cellulari prive di alimentatore è quello di integrare i mezzi di coltura cellulare con reagenti di crescita e fattori inibitori.
La differenziazione delle cellule staminali in vitro si ottiene utilizzando diversi metodi. L'espressione genica differenziale è in ultima analisi responsabile della specializzazione delle cellule. Nel metodo in due fasi che vedete qui, le cellule staminali embrionali di topo coltivate sono innescate per un destino neuronale prima di essere ulteriormente differenziate con il mezzo di induzione del motoneurone. Questi fattori attivano specifiche vie di espressione genica, con conseguenti cambiamenti morfologici e proteomici caratteristici dei motoneuroni.
Uno dei principali svantaggi della differenziazione tradizionale in vitro è che le piastre piatte limitano la crescita 3D delle cellule. Il metodo a goccia sospesa e i metodi a microcapsula aggirano questi problemi. Nella tecnica della goccia sospesa, piccole gocce di sospensioni di cellule staminali vengono placcate sul coperchio di una capsula di Petri e coltivate a testa in giù per formare aggregati di cellule staminali note come corpi embrioidi.
Nei metodi di microincapsulazione, le cellule staminali vengono miscelate con una membrana semipermeabile biocompatibile chiamata alginato e depositate come perline in piastre di coltura cellulare. Entrambi i metodi consentono un'ulteriore differenziazione in cellule specializzate, come i neuroni dopaminergici e i cardiomiociti.
Sapere come dirigere la differenziazione è un passo importante verso l'utilizzo delle cellule staminali nella medicina rigenerativa. La terapia di trapianto di cellule staminali mira a trattare e curare le malattie degenerative riparando i tessuti danneggiati con cellule staminali. In questo esperimento, le cellule somatiche dei pazienti vengono riprogrammate in cellule iPS tramite infezione lentivirale dei fattori Yamanaka. Dal loro stato pluripotente, le cellule vengono differenziate in specifici tipi di cellule e restituite all'ospite per riparare il tessuto danneggiato.
Ora che conosci alcuni dei metodi utilizzati per studiare le cellule staminali, diamo un'occhiata a come questi metodi vengono applicati in esperimenti specifici.
In questo esperimento che utilizza un modello murino di sclerosi multipla, le cellule staminali neurali vengono iniettate per via endovenosa nei topi affetti. Le fette di cervello dei topi trattati vengono raccolte e riprese al microscopio per valutare il successo del trapianto. Le cellule derivate da cellule precursori neuronali donatrici vengono tracciate utilizzando il gene reporter LacZ. Come puoi vedere, un certo numero di cellule staminali donatrici si sono differenziate e integrate nel sistema nervoso centrale dei topi malati.
Non tutti i disturbi possono essere trattati con iniezioni sistemiche. Le lesioni della cartilagine, ad esempio, richiedono un'impalcatura specializzata per ricostruire. In questo esperimento, una miscela di cellule staminali mesenchimali e fattori della coagulazione vengono coltivati insieme per formare un coagulo. Il coagulo viene quindi inserito nella cartilagine del ginocchio danneggiata di un coniglio e lasciato integrare. Seguendo questa procedura, si può osservare il rimodellamento della cartilagine del ginocchio in un'articolazione liscia e funzionale.
A volte, i ricercatori di cellule staminali e gli ingegneri tissutali si uniscono per ricostruire interi organi. In questo esperimento, i polmoni dei primati vengono lavati per decellularizzare l'organo, lasciando dietro di sé solo componenti strutturali non cellulari. Questo polmone "fantasma" viene poi trasferito in un bioreattore, dove viene seminato con cellule staminali vascolari ed epiteliali. Per imitare ulteriormente la pressione e il comportamento che un polmone naturale sperimenta, il bioreattore fa circolare i mezzi, mantiene la pressione e i livelli di gas e gonfia i polmoni.
Hai appena visto la panoramica della biologia delle cellule staminali di JoVE. Per ricapitolare, in questo video abbiamo discusso le cellule staminali e la loro storia, i metodi di manutenzione, differenziazione e consegna e le applicazioni delle cellule staminali. Grazie per l'attenzione!
Come suggerisce il nome, le cellule staminali sono i precursori da cui molti diversi tipi di cellule "staminali". Sono caratterizzati dalla loro potenza, o capacità di differenziarsi in cellule da tutti e tre gli strati germinali, così come la loro rinnovabilità, o capacità di generare più cellule staminali. Nella speranza di far progredire i campi della biologia dello sviluppo e della medicina rigenerativa, i ricercatori di cellule staminali stanno lavorando per capire come queste cellule uniche compiono un'impresa così importante.
Questo video copre le principali scoperte nel campo della biologia delle cellule staminali, le domande chiave poste dagli scienziati in questo campo, i metodi di spicco utilizzati dai ricercatori sulle cellule staminali e le applicazioni della ricerca sulle cellule staminali.
Ora che abbiamo introdotto il concetto di cellule staminali, immergiamoci nella ricca storia della ricerca sulle cellule staminali.
Nel 1960, i dottori Ernest McCulloch e James Till scoprirono alcune delle prime prove definitive dell'esistenza di cellule staminali ematopoietiche nel midollo osseo dei mammiferi adulti. Queste cellule hanno la capacità di auto-rinnovarsi e sono multipotenti, il che significa che possono differenziarsi in molteplici, ma limitati, tipi di cellule, vale a dire le cellule del sangue e del sistema immunitario.
Nel 1988, Irving Weissman e colleghi hanno perfezionato un metodo per la purificazione delle cellule staminali ematopoietiche dal midollo osseo del topo.
Nel 1981, la professoressa Gail Martin ha coniato il termine "cellula staminale embrionale". A differenza delle cellule staminali ematopoietiche, le cellule staminali embrionali sono pluripotenti, avendo la capacità di differenziarsi in tutti i tipi di cellule del corpo. Lei e gli scienziati Martin Evans e Matthew Kaufman, contemporaneamente, ma separatamente, hanno sviluppato metodi per estrarre la massa cellulare interna dalle blastocisti di topo e colturarle in vitro come cellule staminali.
Nel 1998, oltre dieci anni dopo l'isolamento delle cellule staminali embrionali di topo, il Dr. James Thomson ha stabilito con successo le prime linee di cellule staminali embrionali umane.
Nel 2006, un importante passo avanti si è verificato con l'avvento delle cellule staminali pluripotenti indotte, come ideato dal Dr. Shinya Yamanaka. Basandosi sul lavoro di John Gurdon, Yamanaka ha sviluppato un metodo per riprogrammare le cellule differenziate in uno stato pluripotente utilizzando il retrovirus per indurre l'espressione di un piccolo insieme di fattori di trascrizione ora noti come "fattori Yamanaka". Le cellule risultanti sono state chiamate "cellule staminali pluripotenti indotte" o "iPSC". Questi esperimenti sono stati considerati così di fondamentale importanza che Yamanaka e Gurdon hanno ricevuto il Premio Nobel nel 2012.
Al momento, ora abbiamo modelli iPSC di diverse malattie umane e piattaforme di rigenerazione in più tessuti.
Oggi, la ricerca sulle cellule staminali è guidata da diverse domande generali.
Una delle domande più importanti è: come fanno le cellule staminali a mantenere la pluripotenza e la rinnovabilità? Ci sono due caratteristiche correlate delle cellule staminali che conferiscono queste proprietà. Il primo è l'espressione di geni specifici essenziali per la staminalità e l'auto-rinnovamento. Il secondo è la reattività delle cellule staminali ai fattori regolatori che influenzano l'espressione di questi geni.
La prossima domanda logica è: come è diretta la differenziazione delle cellule staminali? Quando una cellula staminale si sviluppa in una cellula matura, l'attivazione di specifici percorsi di differenziazione induce cambiamenti nell'espressione genica, disattivando i geni delle cellule staminali e attivando i geni specifici del tessuto, il che si traduce in una crescente specializzazione della funzione e della morfologia cellulare.
Infine, affrontiamo la questione principale che guida il finanziamento della ricerca sulle cellule staminali: le cellule staminali possono essere utilizzate per curare le malattie? La medicina rigenerativa sta affrontando questa questione in due modi: 1) ricrescendo gli organi in laboratorio e 2) fornendo cellule staminali tramite trapianto per trattare la degenerazione dei tessuti.
Ora che abbiamo presentato alcune delle domande chiave riguardanti la biologia delle cellule staminali, esaminiamo alcuni dei metodi di spicco utilizzati per affrontarle.
La tecnologia microarray può essere impiegata per scoprire quali geni conferiscono potenza e rinnovabilità nelle cellule staminali. In questa tecnica, l'RNA totale è isolato da una popolazione di cellule, che funge da istantanea dell'attuale espressione genica. In una serie di passaggi, questo mRNA viene convertito in una sonda marcata fluorescentemente e ibridato in un chip contenente trascrizioni dell'intero genoma umano. La scansione di questo chip fornisce una lettura dei relativi profili di espressione genica. Come puoi vedere, una cellula staminale esprime un insieme specifico di geni che differisce da una cellula differenziata.
Un altro test per i geni di pluripotenza coinvolge il sistema di rilevamento Oct4-GFP. Oct4 è necessario per l'auto-rinnovamento ed è rapidamente down-regolato durante la differenziazione. Pertanto, la sua espressione funge da indicatore affidabile di "stemness". In questo esperimento, le cellule esprimono proteine fluorescenti verdi sotto il controllo del promotore Oct4. Queste cellule possono quindi essere manipolate sperimentalmente e i cambiamenti nell'espressione della GFP vengono analizzati per identificare nuovi geni o fattori solubili che modulano l'auto-rinnovamento.
Per studiare le cellule staminali in vitro,dobbiamo prima capire come farle colturare. Le cellule staminali richiedono un particolare microambiente per mantenere la staminalità. Ciò può essere ottenuto co-coltivando cellule staminali con cellule feeder, come fibroblasti embrionali di topo o MEF. I MEF secernono una miscela complessa di pluripotenza necessaria e fattori di auto-rinnovamento.
A volte, è auspicabile avere colture di cellule staminali prive di alimentatore. Il metodo principale per mantenere linee cellulari prive di alimentatore è quello di integrare i mezzi di coltura cellulare con reagenti di crescita e fattori inibitori.
La differenziazione delle cellule staminali in vitro si ottiene utilizzando diversi metodi. L'espressione genica differenziale è in ultima analisi responsabile della specializzazione delle cellule. Nel metodo in due fasi che vedete qui, le cellule staminali embrionali di topo coltivate sono innescate per un destino neuronale prima di essere ulteriormente differenziate con il mezzo di induzione del motoneurone. Questi fattori attivano specifiche vie di espressione genica, con conseguenti cambiamenti morfologici e proteomici caratteristici dei motoneuroni.
Uno dei principali svantaggi della differenziazione tradizionale in vitro è che le piastre piatte limitano la crescita 3D delle cellule. Il metodo a goccia sospesa e i metodi a microcapsula aggirano questi problemi. Nella tecnica della goccia sospesa, piccole gocce di sospensioni di cellule staminali vengono placcate sul coperchio di una capsula di Petri e coltivate a testa in giù per formare aggregati di cellule staminali note come corpi embrioidi.
Nei metodi di microincapsulazione, le cellule staminali vengono miscelate con una membrana semipermeabile biocompatibile chiamata alginato e depositate come perline in piastre di coltura cellulare. Entrambi i metodi consentono un'ulteriore differenziazione in cellule specializzate, come i neuroni dopaminergici e i cardiomiociti.
Sapere come dirigere la differenziazione è un passo importante verso l'utilizzo delle cellule staminali nella medicina rigenerativa. La terapia di trapianto di cellule staminali mira a trattare e curare le malattie degenerative riparando i tessuti danneggiati con cellule staminali. In questo esperimento, le cellule somatiche dei pazienti vengono riprogrammate in cellule iPS tramite infezione lentivirale dei fattori Yamanaka. Dal loro stato pluripotente, le cellule vengono differenziate in specifici tipi di cellule e restituite all'ospite per riparare il tessuto danneggiato.
Ora che conosci alcuni dei metodi utilizzati per studiare le cellule staminali, diamo un'occhiata a come questi metodi vengono applicati in esperimenti specifici.
In questo esperimento che utilizza un modello murino di sclerosi multipla, le cellule staminali neurali vengono iniettate per via endovenosa nei topi affetti. Le fette di cervello dei topi trattati vengono raccolte e riprese al microscopio per valutare il successo del trapianto. Le cellule derivate da cellule precursori neuronali donatrici vengono tracciate utilizzando il gene reporter LacZ. Come puoi vedere, un certo numero di cellule staminali donatrici si sono differenziate e integrate nel sistema nervoso centrale dei topi malati.
Non tutti i disturbi possono essere trattati con iniezioni sistemiche. Le lesioni della cartilagine, ad esempio, richiedono un'impalcatura specializzata per ricostruire. In questo esperimento, una miscela di cellule staminali mesenchimali e fattori della coagulazione vengono coltivati insieme per formare un coagulo. Il coagulo viene quindi inserito nella cartilagine del ginocchio danneggiata di un coniglio e lasciato integrare. Seguendo questa procedura, si può osservare il rimodellamento della cartilagine del ginocchio in un'articolazione liscia e funzionale.
A volte, i ricercatori di cellule staminali e gli ingegneri tissutali si uniscono per ricostruire interi organi. In questo esperimento, i polmoni dei primati vengono lavati per decellularizzare l'organo, lasciando dietro di sé solo componenti strutturali non cellulari. Questo polmone "fantasma" viene poi trasferito in un bioreattore, dove viene seminato con cellule staminali vascolari ed epiteliali. Per imitare ulteriormente la pressione e il comportamento che un polmone naturale sperimenta, il bioreattore fa circolare i mezzi, mantiene la pressione e i livelli di gas e gonfia i polmoni.
Hai appena visto la panoramica della biologia delle cellule staminali di JoVE. Per ricapitolare, in questo video abbiamo discusso le cellule staminali e la loro storia, i metodi di manutenzione, differenziazione e consegna e le applicazioni delle cellule staminali. Grazie per l'attenzione!
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Q1: What are the two key characteristics that allow stem cells to maintain pluripotency and self-renewal?
Stem cells maintain pluripotency and self-renewal through two related characteristics. First, they express specific genes essential for stemness and self-renewal. Second, stem cells are responsive to regulatory factors that affect the expression of these genes, allowing them to sustain their unique properties and capacity to generate more stem cells.
Q2: How do microarray technology and Oct4-GFP detection systems help researchers study stem cell gene expression?
Microarray technology isolates total RNA from cells and converts mRNA into fluorescently labeled probes hybridized to chips containing the entire human genome, revealing gene expression profiles. The Oct4-GFP detection system uses green fluorescent protein under Oct4 promoter control, since Oct4 is quickly down-regulated during differentiation, making it a reliable indicator of stemness for identifying genes that modulate self-renewal.
Q3: What is the difference between hematopoietic stem cells and embryonic stem cells?
Hematopoietic stem cells, discovered in the 1960s, are multipotent and can differentiate into limited cell types of the blood and immune systems. Embryonic stem cells, identified in 1981, are pluripotent and can differentiate into all cell types of the body. This fundamental difference makes embryonic stem cells more versatile for regenerative medicine applications.
Q4: How do feeder cells and feeder-free culture methods maintain stem cell stemness in vitro?
Feeder cells, such as mouse embryonic fibroblasts, secrete a complex mixture of pluripotency and self-renewal factors necessary for maintaining stemness. Feeder-free cultures achieve this by supplementing cell culture media with stock reagents of growth and inhibitory factors. Both approaches provide the particular microenvironment stem cells require to maintain their unique properties.
Q5: What breakthrough did Shinya Yamanaka achieve with induced pluripotent stem cells?
Shinya Yamanaka developed a method to reprogram differentiated cells to a pluripotent state using retrovirus to induce expression of transcription factors now called the Yamanaka factors. This breakthrough, building on John Gurdon's work, created induced pluripotent stem cells, or iPSCs, which can now model human diseases and support regeneration platforms in multiple tissues.
Q6: How do hanging drop and microencapsulation methods improve stem cell differentiation compared to traditional flat plate cultures?
Traditional flat plate cultures restrict three-dimensional cell growth. The hanging drop method forms embryoid bodies by culturing stem cell suspensions upside down in petri dish drops. Microencapsulation methods mix stem cells with alginate, a biocompatible semipermeable membrane, and deposit them as beads. Both techniques enable three-dimensional differentiation into specialized cells like dopaminergic neurons and cardiomyocytes.
Q7: How are stem cells being applied in regenerative medicine to treat degenerative diseases?
Regenerative medicine uses two main approaches: regrowing organs in the lab and delivering stem cells via transplantation to treat tissue degeneration. Somatic cells are reprogrammed into iPSCs, differentiated into specific cell types, and returned to patients to repair damaged tissue. Examples include neural stem cell injections for multiple sclerosis and mesenchymal stem cells with coagulation factors for cartilage repair.
Chapters in this video
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Overview
0:58
A Brief History of Stem Cell Research
3:22
Key Questions in Stem Cell Biology
4:46
Prominent Methods
9:01
Applications
10:56
Summary
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