Baffo-segnalato Eyeblink condizionamento classico nei topi Head-fisso

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di utilizzare i progressi genetici nei topi e la nostra comprensione del sistema dei baffi, per studiare le basi neurobiologiche del condizionamento del battito delle palpebre, un paradigma traducibile per studiare l'apprendimento e la memoria. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande meccanicistiche nell'apprendimento e nella memoria utilizzando l'imaging del calcio e l'elettrofisiologia in topi geneticamente manipolati, stimolando baffi specifici durante il condizionamento. Il vantaggio principale di questa tecnica è la capacità di fissare le teste dei topi riducendo al minimo lo stress, consentendo ai topi di deambulare al proprio ritmo su un tapis roulant cilindrico.

Le implicazioni di questa tecnica si estendono a potenziali trattamenti per i disturbi della memoria, compresi quelli associati al normale invecchiamento e al morbo di Alzheimer. La preparazione del cilindro e il sistema di stimolazione dei baffi sono trattati nel protocollo di testo. Questa sezione riguarda la preparazione del copricapo.

La striscia del copricapo è una striscia a sette fori stampata in 3D modellata dalla striscia di nylon della serie Amphenol 221 che non è più prodotta commercialmente. Dal pezzo stampato in 3D, tocca il primo foro nella striscia per una vite a macchina da 0-80 per un pollice e lascia un foro vuoto dopo il primo foro. Quindi, usando una morsa, metti cinque spilli placcati in oro nei restanti cinque fori.

Spingere i perni attraverso i fori più stretti della plastica. Quindi, utilizzando uno sverniciatore termico, rimuovere mezzo centimetro di rivestimento in poliimmide. Quindi, saldare l'estremità spelata a uno dei pin in cui il pin ha un'apertura.

Tagliare il filo saldato a una distanza compresa tra sei e sette millimetri e spellare circa due millimetri di filo. Ora, ripeti questo processo per collegare quattro fili in totale ai cinque pin. I primi due fili registreranno le risposte EMG delle palpebre, mentre i secondi due forniranno una stimolazione elettrica alla regione periorbitale.

Al quinto pin, saldare un filo di acciaio inossidabile di cinque centimetri non isolato che funga da messa a terra elettrica. Dopo aver effettuato tutti i collegamenti, controllare ciascuno di essi con un multimetro per garantirne la continuità elettrica. Inizia con un animale completamente anestetizzato, confermato da un pizzico di dita.

Iniettare una dose di buprenorfina cloridrato come analgesico. Quindi applicare una piccola quantità di unguento oftalmico sulle cornee e radere la parte superiore della testa dell'animale. Successivamente, fissa la testa dell'animale a una cornice stereotassica e disinfetta il cuoio capelluto con tre scrub alternati di iodio povidone e alcol.

Con una lama di bisturi numero 10 o 15, praticare un'incisione lungo la linea mediana del cuoio capelluto, esponendo il cranio dalla parte anteriore degli occhi fino a oltre l'osso interparietale. Ritrarre i lembi della pelle con sei microclip, esponendo il più possibile il cranio, compresi i lati e la parte posteriore. Quindi, usa il bisturi per raschiare il periostio dal cranio.

Quindi pulire la parte superiore del cranio con perossido di idrogeno al 3% tre volte. Una volta che il cranio si è asciugato, praticare due fori con una fresa a cono rovesciato di misura 34, facendo attenzione a non danneggiare il cervello. Posiziona un foro davanti al bregma e posiziona l'altro foro davanti al lambda, a sinistra della linea mediana quando si condiziona l'occhio destro, o viceversa.

Questi fori devono essere praticati con cura per adattarsi alle viti e deve essere fatto un grande sforzo per non danneggiare il cervello. Nei fori, posizionare le viti per i collegamenti elettrici. Ogni giro completo abbasserà la vite di 0,28 millimetri, quindi due giri completi sono sufficienti.

Quindi, crea diverse piccole immersioni sul cranio per aumentare la superficie del cemento. Dal copricapo completato, avvolgere il filo di terra in una configurazione a forma di otto attorno alle due viti. Lasciare un po' di gioco nel filo di terra in modo che il copricapo possa essere posizionato correttamente.

Ora, applica il cemento di cementazione a freddo. Rivestire abbondantemente il cranio e le viti e lasciare asciugare il cemento. Una volta che il cemento si è asciugato, posiziona il copricapo verticalmente, con i perni in piedi sopra il cranio.

Fissare il copricapo con un supporto fissato a un braccio dal telaio. Il supporto deve avere cinque prese placcate in oro per accettare i perni del copricapo. Posizionare i due fili EMG sul muscolo orbicolare dell'occhio sopra l'orbita oculare.

Quindi, posizionare i due fili stimolanti. Metti le estremità spogliate sotto la pelle da due a quattro millimetri direttamente caudalmente all'occhio. Non lasciare che le loro estremità si tocchino.

Se i fili sono così lunghi da poter graffiare l'occhio dell'animale, tagliali all'indietro o piegali all'indietro. Un po' di filo scoperto deve rimanere esposto. Ora, cementa la base dei fili del cranio con un po' più di cemento da fissaggio e lascialo asciugare.

Utilizzare circa la metà del volume precedentemente utilizzato. Per procedere, rimuovere le microclip e riposizionare la pelle. Lascia che la pelle si depositi naturalmente per evitare tensioni sulla pelle che distorcerebbero la palpebra, inibendo l'ammiccamento e quindi rovinando l'esperimento.

Una volta che la pelle si è stabilizzata, rimuovere il supporto del copricapo e sigillare l'area esposta con cemento dentale. Evitare di gocciolare cemento sugli occhi o sui perni del copricapo. Quindi utilizzare un batuffolo di cotone inumidito con solvente per cemento dentale per levigare e manipolare il cemento parzialmente polimerizzato secondo necessità.

Una volta che il cemento si è asciugato completamente, rimuovere l'animale dal telaio stereotassico e lasciarlo riprendersi su una superficie calda prima di rimetterlo nella gabbia di casa. Inizia ad abituare i topi dopo che hanno avuto almeno cinque giorni di recupero. Per fissare il topo, trattenetelo brevemente per la coda per pizzicarlo dietro le spalle.

Quindi sollevare il topo da sotto l'addome e il busto. Quindi, collegare un connettore al copricapo e ruotare la vite di bloccaggio. Quindi, posiziona delicatamente il mouse sul cilindro e tienilo fermo mentre usi due viti per fissare il connettore alle barre sopra il cilindro.

Quindi rilasciare il mouse. Nelle prime due sedute, lasciare che il mouse si abitui al cilindro per lo stesso periodo di tempo di una sessione di condizionamento. Durante l'assuefazione, registrare la frequenza di battito spontaneo.

Inoltre, pre-esporre i topi allo stimolatore di vibrazioni dei baffi senza applicare la stimolazione elettrica. Con il sistema piezoelettrico vicino al lato condizionato, infilare i denti del pettine sui singoli baffi. Seleziona gli stessi baffi per ogni sessione.

Quindi procedi con l'allenamento di condizionamento classico come presentato nel testo. Topi maschi C57 Black 6J di età compresa tra otto e dieci settimane sono stati addestrati con il condizionamento del battito di ciglia a traccia nel tapis roulant cilindrico fissato alla testa. Sono state effettuate registrazioni EMG di ogni prova.

Gli EMG sono stati rettificati e integrati con una costante di tempo di 10 millisecondi, quindi mediati in tutte le prove. L'evoluzione delle risposte condizionate nell'arco di 10 sessioni di allenamento mostra che gradualmente la risposta è aumentata in ampiezza e la latenza di risposta è diventata più breve. Questa evoluzione non si vede nelle risposte dei topi psuedocondizionati, dove gli stimoli sono presentati in ordine casuale.

L'evoluzione delle risposte condizionate ben tempestive, e quindi ben apprese, può essere vista anche negli istogrammi del tempo fino al picco della risposta dopo l'insorgenza del CS. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare il copricapo, impiantare chirurgicamente il copricapo su un mouse e posizionare il mouse sul tapis roulant cilindrico, per il condizionamento del battito di ciglia fissato alla testa. I tuoi topi dovrebbero mostrare una buona curva di apprendimento durante i giorni man mano che acquisiscono il condizionamento.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in un'ora se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di rimanere vigili nell'osservare qualsiasi angoscia da parte degli animali. Dovrebbero essere prese misure appropriate per ridurre al minimo lo stress per gli animali.