Name: Il BM12 inducibile modello di Lupus Eritematoso Sistemico (LES) in C57BL / 6 Mice (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 4 s
Description: Scopri il modello BM12 di Lupus Eritematoso Sistemico in topi C57BL/6 per caratterizzare le cellule T follicolari helper, le cellule B del centro germinativo e i plasmacellule mediante citometria a flusso. Questo metodo consente di studiare la progressione della malattia e valutare nuove terapie.

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Questo lavoro è stato sostenuto in parte dal Lupus Research Institute, dalla sovvenzione NCI CA138617, dalla sovvenzione NIDDK DK090978, dal Charlotte Schmidlapp Award (a E.M.J.) e dalla Albert J. Ryan Fellowship (a J.K.). Siamo grati per il supporto e la strumentazione forniti dal Research Flow Cytometry Core nella Divisione di Reumatologia del Cincinnati Children's Hospital Medical Center, supportato in parte da NIH AR-47363, NIH DK78392 e NIH DK90971.

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il modello inducibile BM12 è un modo relativamente semplice ed efficace per studiare i processi cellulari e molecolari del LES. Attivazione cronica di adoptively trasferiti cellule T CD4 diretti contro antigeni auto porta all&#39;accumulo di Tfh, cellule GC B, e le plasmacellule che può essere misurato mediante citometria di flusso, come descritto qui. Futuri studi che utilizzano questo modello può interrogare rapidamente e facilmente il ruolo dei geni candidati e nuove terapie nei processi centro germinale autoimmuni c...

Il lupus eritematoso sistemico (LES) è una malattia autoimmune complessa caratterizzata prototipicamente da anticorpi anti-nucleo (ANA) la produzione e la glomerulonefrite. Numerose altre sequele, tra cui dermico, cardio-polmonare e lesioni epatiche sono associati con la malattia in alcuni individui. Le stime sulla prevalenza negli Stati Uniti variano ampiamente, da 150,000-1,500,000 1,2, con incidenza particolarmente elevata nelle donne e le minoranze 3. Sebbene l&#39;eziologia del LES è stato difficile da discernere, si pensa a sorgere dall&#39;interazione di diversi fattori genetici e ambientali, che culminano in autoimmunità sistemica. Numerosi modelli animali sono stati impiegati per studiare i fattori di insorgenza della malattia e la progressione. Modelli classici murini di SLE includono ceppi di topi geneticamente predisposti, tra cui il modello di X NZB NZW F1 e suoi derivati ​​di potenza NZM, il ceppo / lpr MLR, e il ceppo BXSB / Yaa, e sistemi inducibili, come il pristane e malattia cronica del trapianto contro l&#39;ospite (GVHD cronica) modelli 4. I primi rapporti di produzione di autoanticorpi nei modelli GVHD usati diversi ceppi di topi o ceppi criceto per genitore in trasferimenti F1 5 - 8; metodi più comuni utilizzati per studiare le malattie simil-lupus attualmente includono il genitore DBA / 2 → (C57BL / 6 x DBA / 2) F1, ed il modello di trasferimento BM12 descritto qui. Ogni modello ha i suoi avvertimenti, ma in genere condividono un set comune di funzioni che sono correlate alle caratteristiche cliniche della malattia umana. I parametri più spesso segnalati in modelli murini includono splenomegalia, linfoadenopatia, nefrite, la produzione ANA, e a livello cellulare, l&#39;espansione delle cellule T helper follicolari (TFH), le cellule B germinali centro (GC), e le cellule del plasma. Il modello BM12 inducibile si ottiene il trasferimento adottivo di linfociti da IA BM12 B6 (C) - H2 - Ab1 BM12 / KhEgJ (BM12) topo, un ceppo identical a C57BL / 6 ad eccezione di 3 aminoacidi sostituzioni su MHC di classe II, in IA b C57BL / 6 (B6) topi. Alloactivation di donatori cellule T CD4 di destinatario APC porta a cGVHD con sintomi molto simili LES. In particolare, questi includono l&#39;espansione di Tfh donatore-derivati, espansione delle cellule B GC destinatario di derivazione e plasmacellule, e la produzione di ANA tra cui anti-dsDNA, anti-ssDNA, anti-cromatina, e gli anticorpi anti-RBC 9. Nel corso del tempo, topi riceventi sviluppano glomerulonefrite associata a depositi di IgG nel glomerulare, interstiziale e regioni vascolari dei reni 10. Abbiamo recentemente dimostrato che, simile alla malattia umana, c&#39;è anche un ruolo critico per tipo IFN in questo modello 11. In particolare, i criteri di definizione per il LES umano includono lo sviluppo di nefrite compatibile con SLE ​​in presenza di anticorpi anti-dsDNA anticorpi 12, entrambi i quali sono caratteristiche importanti di questo modello di topo. Ci sono sevantaggi Veral del modello BM12 rispetto ai modelli spontanee. Modelli classici che sviluppano segni SLE-come spontaneamente si basano su entrambi i ceppi di topi ibridi, ceppi inbred di topo non sullo sfondo B6, o grande loci genetici sullo sfondo B6, che rendono attraversando a knockout o topi geneticamente modificati altrimenti difficile e richiede tempo. Con il modello inducibile BM12, topi geneticamente modificati possono servire sia come donatore o ricevente, consentendo più rapida identificazione del compartimento cellulare in cui alcuni geni possono essere importanti per la malattia. Inoltre, lo sviluppo della malattia nel modello BM12 è molto più veloce, che richiede solo 2 settimane fino alla comparsa di ANA, rispetto a diversi mesi per i modelli più spontanee. Inoltre, a differenza dei modelli spontanei che sviluppano la malattia in diversi momenti, l&#39;insorgenza e la progressione della malattia nel modello B6 BM12 → è altamente sincronizzati. Questo permette la generazione di coorti di dimensioni appropriate che possono Be utilizzato per strategie di intervento o terapeutici in qualsiasi fase della sviluppo della malattia. Quello che segue è un protocollo dettagliato per l&#39;avvio SLE-come autoimmunità dal trasferimento adottivo di linfociti BM12 in topi C57BL / 6, o varianti genetiche sullo sfondo B6. Inoltre, si descrive un protocollo di colorazione citometria a flusso per l&#39;enumerazione Tfh, cellule GC B, e tipi di cellule del plasma-cella associata con la malattia umana. È importante sottolineare che questi protocolli possono anche essere utilizzati per caratterizzare la malattia nella maggior parte dei modelli murini di LES e identificare Tfh, cellule GC B le plasmacellule in altri modelli di malattia.

<table><tbody><tr><td>B6. SJL-Ptprca Pepcb/BoyJ</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>001162</td><td>CD45.1+ BoyJ ceppo di topo</td></tr><tr><td>B6(C)-H2-Ab1bm12/KhEgJ</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>001162</td><td>Ceppo di topo Bm12</td></tr><tr><td>FastDigest PsuI</td><td>Life Technologies</td><td>FD1554</td><td>Enzima digest di restrizione per la genotipizzazione</td></tr><tr><td>1X RBC Lysis Buffer</td><td>eBioscience</td><td>00-4333-57</td><td></td></tr><tr><td>IMDM</td><td>GE Healthcare</td><td>SH30228.01</td><td></td></tr><tr><td>Provetta per la separazione del plasma (PST)</td><td>BD</td><td>365974</td><td>Provetta per la raccolta del sangue con EDTA dipotassico</td></tr><tr><td>Provetta per la separazione del siero (SST)</td><td>BD</td><td>365967</td><td>Provetta per la raccolta del sangue con attivatore del coagulo / SST Gel</td></tr><tr><td>Ficoll</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-02&nbsp;</td><td>Soluzione di separazione cellulare ad alta densità</td></tr><tr><td>Lympholyte-M</td><td>Cedarlane</td><td>CL5030</td><td>Soluzione di separazione cellulare ad alta densità</td></tr><tr><td>GL-7-biotina</td><td>eBioscience</td><td>13-5902-82&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidina-BUV395</td><td>BD</td><td>564176</td><td></td></tr><tr><td>CD138-BV421</td><td>BioLegend</td><td>142508</td><td></td></tr><tr><td>CD4-BV510</td><td>BioLegend</td><td>100559</td><td></td></tr><tr><td>TCR&beta;-BV605</td><td>BD</td><td>562840</td><td></td></tr><tr><td>CD45.1-BV711</td><td>BioLegend</td><td>110739</td><td></td></tr><tr><td>CD45.2-FITC</td><td>BioLegend</td><td>109806</td><td></td></tr><tr><td>PD-1-PE</td><td>BioLegend</td><td>135206</td><td></td></tr><tr><td>CD19-PerCP</td><td>BioLegend</td><td>115532</td><td></td></tr><tr><td>Fas-PE-Cy7</td><td>BD</td><td>557653</td><td></td></tr><tr><td>CXCR5-APC</td><td>BioLegend</td><td>145506</td><td></td></tr><tr><td>Colorante di vitalità fissabile ef780</td><td>eBioscience</td><td>65-0865-18</td><td></td></tr><tr><td>CD4-BV421</td><td>BioLegend</td><td>100443</td><td></td></tr><tr><td>inserti per provette FACS da 1,2 ml, travasato</td><td>USA Scientific</td><td>1412-1400</td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon&trade; Tubi a fondo tondo</td><td>BD</td><td>352017</td><td></td></tr></tbody></table>

il bm12 inducibile modello di lupus eritematoso sistemico (les) in c57bl / 6 mice

The bm12 Inducible Model of Systemic Lupus Erythematosus (SLE) in C57BL/6 Mice

Il lupus eritematoso sistemico (LES) è una malattia autoimmune con diverse manifestazioni cliniche e immunologiche. Diversi modelli animali spontanei e inducibili rispecchiano componenti comuni della malattia umana, incluso il modello di trasferimento bm12. Dopo il trasferimento di splenociti bm12 o cellule T CD4 purificate, i topi C57BL/6 sviluppano rapidamente grandi frequenze di cellule T helper follicolari (Tfh), cellule B del centro germinale (GC) e plasmacellule seguite da alti livelli di anticorpi anti-nucleo circolanti. Poiché questo modello utilizza topi su un background C57BL/6 puro, i ricercatori possono studiare rapidamente e facilmente la progressione della malattia in ceppi di topi transgenici o knockout in un periodo di tempo relativamente breve. Qui descriviamo i protocolli per l'induzione del modello e la quantificazione di Tfh, cellule GC B e plasmacellule mediante citometria a flusso multicolore. È importante sottolineare che questi protocolli possono essere utilizzati anche per caratterizzare la malattia nella maggior parte dei modelli murini di LES e identificare le cellule Tfh, GC B e plasmacellule in altri modelli di malattia.

Topi malati sviluppano splenomegalia in appena 14 giorni, esibendo milza 2-3 volte le dimensioni di topi sani in termini di massa e cellularità (Figura 2). Splenociti sono sequenzialmente gate sulla dispersione della luce (FSC-A da SSC-A), l&#39;eliminazione di doppiette (FSC-W o -H da FSC-A), cellule vitali (basso colorazione della vitalità tintura) e CD4 + TCRβ + (Figura 3A). Cellule del donatore si distinguono dalle cellule riceventi...

Il trasferimento di linfociti bm12 in un ricevente C57BL/6 è un modello consolidato di lupus eritematoso sistemico. Qui descriviamo come iniziare la malattia utilizzando questo modello e come caratterizzare le cellule T follicolari helper, le cellule B del centro germinale e le plasmacellule mediante citometria a flusso.

Il BM12 inducibile modello di Lupus Eritematoso Sistemico (LES) in C57BL / 6 Mice

Systemic lupus erythematosus (SLE) is an autoimmune disease with diverse clinical and immunological manifestations. Several spontaneous and inducible ...

L'obiettivo generale di questa procedura è caratterizzare l'espansione delle cellule T follicolari helper, delle cellule B del centro germinale e delle cellule plasmatiche mediante citometria a flusso nel modello BM 12 di lupus eritematoso sistemico con ptosi, o LES. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo del lupus, come ad esempio se il targeting di specifici percorsi molecolari mediante terapie possa arrestare o rallentare la progressione della malattia. Il principale vantaggio di questo modello di LES è che utilizza topi con un background genetico puramente CPD sette nero sei, consentendo ai ricercatori di studiare rapidamente e facilmente la progressione della malattia in ceppi di topi transgenici o knockout in un periodo di tempo relativamente breve.Dopo aver isolato e iniettato le cellule donatrici BM 12 nei topi, determinato l'efficienza dell'innesto ed eutanasia dei topi secondo il protocollo descritto nel testo, spruzzare leggermente etanolo al 70% per inumidire l'addome del topo con una forbice chirurgica. Praticare una piccola incisione superficiale di circa un centimetro sopra i genitali, tirare indietro la pelle dell'addome verso lo sterno mantenendo intatta la fascia peritoneale. Montare una siringa da cinque millilitri con un ago da 18 gauge, orientando l'ago verso la testa dell'animale, e aggiungere un angolo di 15 gradi rispetto al piano della fascia.Inserire l'ago nel quadrante inferiore destro dell'addome. Posizionare l'ago vicino alla punta del cieco per aiutare a prevenire l'ostruzione dell'ago con l'intestino durante l'aspirazione dell'ascite. Successivamente, ruotare con attenzione il topo sul fianco.Quindi aspirare lentamente l'ascite nella siringa. Una volta recuperata l'ascite, rimuovere la siringa e registrare il volume dell'aspirato leggendo le tacche sul lato della siringa. Scaricare l'ascite in un tubo rotondo da cinque millilitri e conservarlo sul ghiaccio per la successiva lavorazione al fine di raccogliere il sangue tramite.Prellevare dalla vena cava o dalla vena cava inferiore (IVC) come descritto in pubblicazioni precedenti. Utilizzare pinze da bambola per spostare delicatamente gli intestini sul lato sinistro del topo, esponendo l'IVC. Inserire un ago da 27,5 gauge collegato a una siringa da un millilitro nell'IVC e aspirare lentamente da 400 a 500 microlitri di sangue per minimizzare l'emolisi.Iniettare lentamente il sangue in un tubo da microcentrifuga, per siero o per plasma da 0,5 millilitri per dissezionare ulteriori tessuti rilevanti. Riposizionare delicatamente gli intestini sul lato destro dell'animale e tirare sul pancreas per rimuovere la milza. Rimuovere qualsiasi tessuto pancreatico o linfonodi splenici ancora attaccati.Quindi, immediatamente dopo la dissezione, utilizzare una bilancia di precisione per pesare la milza, poiché la splenomegalia macroscopica è un parametro comunemente riportato. Nei modelli murini di LES, collocare i tessuti linfoidi in provette individuali da 1,5 millilitri contenenti un millilitro di mezzo completo, mantenute sul ghiaccio. Entro due ore dal prelievo, centrifugare il sangue a 10.000 × g e a 4 °C per tre minuti.Rimuovere il siero e aliquotare da 0 a 20 microlitri per provetta per minimizzare i cicli di congelamento e scongelamento. Conservare a meno 80 gradi Celsius per analisi successive di un NA mediante Eliza. Successivamente centrifugare l'ascite a 400 ×g per cinque minuti.Con una pipetta da un millilitro, rimuovere il soprannatante S e trasferirlo in diversi tubi da 0,5 millilitri. Congelare a meno 80 gradi Celsius per analisi successive. Risospendere la frazione cellulare in circa un millilitro di mezzo completo e trasferire 200 microlitri in una piastra a 96 pozzetti con fondo a U.Per la colorazione in flusso. Macerare ogni milza attraverso filtri cellulari da 70 micrometri in tubi separati e utilizzare mezzo completo per centrifugare a 400 ×g per cinque minuti prima di decantare. Il surnatante con un millilitro di tampone freddo per la lisi dei globuli rossi risospendere.Sospendere i globuli per un minuto e mescolare delicatamente agitando con mezzo completo freddo. Portare il volume a 10 millilitri e centrifugare a 400 ×g per cinque minuti, quindi decantare il sopranatante. Utilizzare 5 millilitri di mezzo completo per risospendere il pellet cellulare e, con un emocitometro, contare le cellule; regolare il volume in modo che 200 microlitri contengano da 1 a 3 milioni di cellule. Per la colorazione per citometria a flusso.Trasferire da uno a tre milioni di cellule spleniche in mezzo completo in singoli tubi rotondi da cinque millilitri oppure in pozzetti separati di una piastra da 96 pozzetti con fondo a U. Centrifugare la piastra a 500 × g e 4 °C per tre minuti. Quindi, eliminare con un colpetto il sovrannatante nel piatto in un apposito contenitore per rifiuti biologici per risospendere i pellet cellulari.Utilizzare 100 microlitri di buffer di flusso contenente un colorante vitalizio fissabile alla concentrazione raccomandata dal produttore e un cocktail di anticorpi purificati anti-CD16, anti-CD32 a un microgrammo per millilitro. Incubare le cellule a 20-25 gradi Celsius per 10 minuti al riparo dalla luce, quindi aggiungere 100 microlitri di mezzo completo freddo per bloccare il colorante vitalizio; centrifugare la piastra a 500 ×g per tre minuti. Successivamente, scartare il sopranatante nel contenitore per rifiuti biologici.Reese, sospendere le cellule in 200 microlitri di buffer per citofluorimetria e centrifugare nuovamente prima di eliminare il soprannatante S per quantificare la differenziazione e l'espansione delle cellule T CD4 del donatore e delle cellule B del ricevente. Utilizzare un pannello anticorpale esteso come mostrato qui e marcare le cellule per citofluorimetria. Utilizzare 50 microlitri di buffer per citofluorimetria contenente un cocktail di anticorpi.Risospendere le cellule e incubare a quattro gradi Celsius per 20 minuti. Quindi aggiungere ulteriori 150 microlitri di buffer di flusso e centrifugare a 500 ×g per tre minuti. Rimuovere il surnatante e aggiungere 200 microlitri di buffer di flusso prima di centrifugare nuovamente e scartare il surnatante con 100 microlitri di paraformaldeide al 2% in PBS.Risospendere le cellule e incubare a quattro gradi Celsius per 30 minuti. Aggiungere 150 microlitri di buffer per citometria e lavare le cellule come appena dimostrato. Risospendere le cellule in 200 microlitri di buffer per citometria e trasferire nei pozzetti per citometria o in provette standard per citometria.Aggiungere ulteriori 100-200 microlitri di buffer di flusso e conservare a quattro gradi Celsius al buio fino all'esecuzione della citometria a flusso per ottenere risultati affidabili. Acquisire almeno 1000 cellule donatrici per campione nei campioni provenienti da topi modificati geneticamente o comunque manipolati. Nei topi che mostrano una minima espansione delle cellule donatrici, raccogliere un numero equivalente di linfociti totali, poiché la raccolta di un così alto numero di cellule donatrici potrebbe non essere fattibile, come mostrato qui.I topi con lupus eritematoso sistemico sviluppano splenomegalia in appena 14 giorni, mostrando milze da due a tre volte più grandi rispetto ai topi sani in termini di massa e cellularità. Le cellule vengono selezionate in modo sequenziale mediante scatter plot, escludendo i doppietti, le cellule vitali e quelle positive per CD4. Positive per TCR beta.Le cellule donatrici vengono distinte dalle cellule riceventi in base a CD45.1 e CD45.2. La maggior parte delle cellule donatrici si differenzia in cellule T follicolari ausiliarie doppio positive CXCR5 PD1 o TFH; una parte della popolazione di cellule T CD4 riceventi si differenzia anche in TFH. La classificazione delle TFH può essere confermata utilizzando marcatori aggiuntivi, tra cui BCL6 e ICOS.Questo grafico illustra che, dopo un'iniziale morte cellulare e/o migrazione delle cellule trasferite, l'espansione delle cellule TFH di origine donatrice è logaritmica, raggiungendo da 10 a 20 milioni di cellule nella milza dei topi a 14 giorni dall'iniezione. La marcatura con CSFE dei linfociti trasferiti ha dimostrato che le cellule T CD4 di origine donatrice si differenziano precocemente in TFH dopo l'attivazione, poiché tutte le cellule divise osservate ai giorni tre, sette e 14 hanno aumentato l'espressione di CXCR5 e PD1, come mostrato qui. L'espansione delle cellule TFH di origine donatrice è accompagnata da un corrispondente accumulo di cellule plasmatiche endogene e di cellule GCB. L'accumulo di cellule plasmatiche nella milza è ritardato rispetto a quello delle cellule TFH, non mostrando alcun aumento rispetto agli animali naïve al giorno tre o sette.Una volta padroneggiata questa procedura, è possibile testare in modo efficiente i ruoli di geni candidati e l'efficacia di nuove terapie in un modello ben consolidato di LES. Questa tecnica può essere completata in due giorni se eseguita correttamente.

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