Coltura e differenziazione di cellule staminali embrionali

Le cellule staminali embrionali, o cellule ES, hanno una serie di proprietà uniche che le distinguono dalle normali cellule adulte. Pertanto, gli scienziati hanno ideato speciali tecniche di coltivazione per mantenere o sfruttare queste proprietà. Se coltivate correttamente, le cellule ES possono dividersi indefinitamente per fare di più di se stesse. Allo stesso tempo, alterando le condizioni di coltura, le cellule ES possono essere indirizzate a differenziarsi in quasi tutti i tipi di cellule presenti nel nostro corpo; questa capacità delle cellule ES è chiamata "pluripotenza".

In questo video, imparerai come coltivare e passare le cellule ES in modo che mantengano le loro proprietà uniche, come indurre la differenziazione nelle cellule ES per formare specifici tipi di cellule e i modi in cui le tecniche di coltivazione e differenziazione delle cellule ES vengono utilizzate e perfezionate dai ricercatori oggi.

Prima di entrare nei dettagli delle procedure per la manutenzione delle cellule ES, è importante prima capire cosa impedisce o guida la differenziazione delle cellule ES. Affinché le cellule ES mantengano le loro proprietà uniche di pluripotenza e auto-rinnovamento, devono essere coltivate con fattori specifici nel loro mezzo di crescita che sopprimono la differenziazione spontanea.

Questo è più comunemente fatto coltivando cellule ES su uno strato di "alimentatori", di solito fibroblasti embrionali di topo, o MEF. Le cellule di alimentazione "alimentano" le cellule ES con alcuni fattori, come l'activina A, che aiutano a mantenere le cellule ES nel loro stato indifferenziato.

Recentemente, gli scienziati hanno anche sviluppato metodi di coltivazione senza alimentatore in cui le cellule ES vengono coltivate in mezzi con i fattori necessari aggiunti in una ricetta definita. Questo approccio riduce la variabilità e rimuove la componente non umana dalle colture cellulari ES, che è un prerequisito per le applicazioni cliniche.

Un'altra caratteristica delle cellule ES è che crescono naturalmente in cluster o colonie e tendono ad avere un basso tasso di sopravvivenza quando dissociate in singole cellule, in particolare cellule ES umane. Di conseguenza, il passaggio di cellule ES umane richiede generalmente di trattenerle in grumi intatti attraverso il "picking" meccanico.

Quando le cellule ES vengono coltivate in condizioni non aderenti, formano aggregati 3D noti come corpi embrioidi, o EB, in cui le cellule ES si differenzieranno in tutti i diversi tipi di cellule. Variando le condizioni di differenziazione, come l'aggiunta di specifici fattori di crescita al mezzo, gli scienziati stanno sviluppando metodi per dirigere la differenziazione delle cellule ES in specifici tipi di cellule.

Ora che hai compreso i principi alla base del mantenimento e della differenziazione delle cellule ES, diamo un'occhiata a come coltura e passaggio delle cellule ES sugli alimentatori MEF.

I MEF sono ottenuti da embrioni di topo in fase iniziale e vengono quindi inattivati da sostanze chimiche o radiazioni per impedire loro di dividersi ulteriormente. I MEF inattivati devono essere placcati su piatti di coltura di tessuti gelatinizzati almeno un giorno prima di iniziare a coltura di cellule ES. Quando gli alimentatori sono completamente sistemati, le cellule ES vengono scongelate e seminate sulle piastre.

Nei prossimi giorni, le cellule ES cresceranno in grandi colonie. Prima che le colonie inizino a toccare e fondersi, la cultura ES dovrebbe essere attraversata. Si dovrebbe osservare la morfologia delle cellule ES per vedere se stanno mostrando segni di differenziazione. Le colonie di ES indifferenziate sembrano generalmente ben definite e omogenee, mentre le cellule differenziate apparirebbero come "ciottoli" opachi e di forma irregolare.

Se le colonie mostrano il 70% o più di differenziazione, o se sono sparse, tagliare meccanicamente le colonie indifferenziate e trasferirle in una nuova piastra di alimentazione. Altrimenti, rimuovi semplicemente le aree o le colonie differenziate e procedi con il passaggio.

Una volta ripulite le colonie differenziate, vengono aggiunti enzimi proteolitici, come la collagenasi, per sollevare le cellule dalla piastra con incubazione a 37 ° C per il periodo di tempo appropriato. Vengono quindi aggiunti nuovi mezzi ES per fermare le reazioni enzimatiche. Le colonie vengono spostate meccanicamente dalla piastra e trasferite in un tubo centrifugo, dove vengono suddivise nelle dimensioni desiderate con un delicato pipettaggio. Le cellule ES vengono raccolte mediante centrifugazione, ricaspenate in mezzi ES e placcate sulle piastre di alimentazione preparate.

Dopo aver imparato come passare le cellule ES, diamo un'occhiata a una delle tecniche più comuni utilizzate per differenziare le cellule ES in corpi embrioidi: il metodo della goccia sospesa.

Per iniziare, le cellule ES vengono staccate con l'aiuto di enzimi proteolitici come la collagenasi e diluite alla concentrazione desiderata in mezzi contenenti fattori di differenziazione specifici del lignaggio. La sospensione cellulare ES viene quindi depositata in gocce sul coperchio di una capsula di Petri batterica. Il coperchio viene rapidamente invertito e posizionato sul piatto, quindi le gocce di supporto si appendono a testa in giù e consentono ai corpi embrioidi di svilupparsi.

Dopo circa due giorni, le gocce con EB possono essere raccolte e placcate su piastre non aderenti per un'ulteriore coltivazione. Nel momento appropriato per il lignaggio cellulare desiderato, i corpi embrioidi vengono placcati di nuovo su piatti di coltura tissutale aderente gelatinizzati per un'ulteriore differenziazione.

Ora che abbiamo trattato le tecniche di base per la coltura e la differenziazione delle cellule ES, diamo un'occhiata a come sono adattate a specifiche esigenze sperimentali.

Come accennato in precedenza, le cellule ES possono essere indirizzate a differenziarsi in specifici tipi di cellule in diverse condizioni di coltura. In questo esperimento, gli scienziati hanno prodotto motoneuroni da cellule ES umane. Ciò è stato fatto aggiungendo prima fattori alla differenziazione dei corpi embrioidi che li dirigono verso il lignaggio neurale, seguiti da sostanze chimiche e condizioni di placcatura che trasformano queste cellule specificamente in motoneuroni. Utilizzando approcci simili, i ricercatori hanno avuto successo nel differenziare le cellule ES in cellule del muscolo cardiaco che battono ritmicamente.

Poiché la differenziazione delle cellule ES imita gli eventi che si verificano quando gli embrioni si sviluppano naturalmente, possiamo anche usarle per studiare la biologia dello sviluppo embrionale precoce. Uno dei fenomeni studiati è l'inattivazione del cromosoma X, o XCI, il processo cruciale in cui uno dei due cromosomi X viene silenziato in ogni cellula di un mammifero femminile. Visualizzando la distribuzione di specifici RNA e proteine nello sviluppo di EB, gli scienziati hanno acquisito preziose informazioni sulla biologia di XCI.

Infine, per aumentare la coerenza e l'efficienza della sperimentazione delle cellule ES, gli scienziati cercano continuamente di escogitare tecniche migliori per la coltura di cellule ES. Un approccio è quello di far crescere le cellule ES in un singolo strato, chiamato coltura monostrato di tipo non colonia, o NCM.

Ricordate che le cellule ES umane tendono ad essere infelici quando non crescono come aggregati 3D? Gli scienziati hanno dimostrato che le sostanze chimiche note come inibitori ROCK aumentano la sopravvivenza delle cellule ES dissociate, che consentono loro di essere passaggio come sospensioni monocellulari e di essere placcate ad alta densità. Il vantaggio della tecnica NCM è che ogni cellula sarà più equamente esposta ai fattori di crescita e ai nutrienti nel mezzo, riducendo l'eterogeneità all'interno della coltura e rendendo più facile la coltivazione di cellule ES in gran numero.

Hai appena visto il video di JoVE su come colturare e differenziare le cellule staminali embrionali. Ora dovresti sapere quali fattori sono importanti per mantenere le cellule ES nel loro stato indifferenziato e come possiamo sfruttare la pluripotenza delle cellule ES per generare tipi di cellule specifici in un piatto. In futuro, gli scienziati lavoreranno per sviluppare condizioni di coltura e differenziazione più efficienti e ben definite per produrre tipi di cellule specializzate che possono essere utilizzate in applicazioni di medicina rigenerativa. Grazie per l'attenzione!