2.8: Coltura e differenziazione di cellule staminali embrionali

Le cellule staminali embrionali, o cellule ES, hanno una serie di proprietà uniche che le distinguono dalle normali cellule adulte. Pertanto, gli scienziati hanno ideato speciali tecniche di coltura per mantenere o sfruttare queste proprietà. Se coltivate correttamente, le cellule ES possono dividersi all'infinito per produrre di più. Allo stesso tempo, alterando le condizioni di coltura, le cellule ES possono essere indirizzate a differenziarsi in quasi tutti i tipi di cellule presenti nel nostro corpo; questa capacità delle cellule ES è chiamata "pluripotenza".

In questo video imparerai come coltivare e far passare le cellule ES in modo che mantengano le loro proprietà uniche, come indurre la differenziazione nelle cellule ES per formare tipi di cellule specifici e i modi in cui le tecniche di coltura e differenziazione delle cellule ES vengono utilizzate e perfezionate dai ricercatori di oggi.

Prima di entrare nei dettagli delle procedure per la manutenzione delle cellule ES, è importante capire cosa impedisce o guida la differenziazione delle cellule ES. Affinché le cellule ES mantengano le loro proprietà uniche di pluripotenza e autorinnovamento, devono essere coltivate con fattori specifici nel loro mezzo di crescita che sopprimono la differenziazione spontanea.

Questo è più comunemente fatto coltivando cellule ES su uno strato di "alimentatori", di solito fibroblasti embrionali di topo, o MEF. Le cellule alimentatrici "nutrono" le cellule ES di alcuni fattori, come l'activina A, che aiutano a mantenere le cellule ES nel loro stato indifferenziato.

Recentemente, gli scienziati hanno anche sviluppato metodi di coltura senza alimentatore in cui le cellule ES vengono coltivate in terreni con l'aggiunta dei fattori necessari in una ricetta definita. Questo approccio riduce la variabilità e rimuove la componente non umana dalle colture cellulari ES, che è un prerequisito per le applicazioni cliniche.

Un'altra caratteristica delle cellule ES è che crescono naturalmente in gruppi o colonie e tendono ad avere un basso tasso di sopravvivenza quando dissociate in singole cellule, in particolare cellule ES umane. Di conseguenza, il passaggio delle cellule ES umane richiede generalmente di trattenerle in grumi intatti attraverso il "prelievo" meccanico.

Quando le cellule ES vengono coltivate in condizioni non aderenti, formano aggregati 3D noti come corpi embrioidi, o EB, in cui le cellule ES si differenziano in tutti i diversi tipi di cellule. Variando le condizioni di differenziazione, come l'aggiunta di specifici fattori di crescita al terreno, gli scienziati stanno sviluppando metodi per dirigere la differenziazione delle cellule ES in specifici tipi di cellule.

Ora che hai compreso i principi alla base del mantenimento e della differenziazione delle cellule ES, diamo un'occhiata a come coltivare e far passare le cellule ES sui feeder MEF.

I MEF sono ottenuti da embrioni di topo in fase iniziale e vengono quindi inattivati da sostanze chimiche o radiazioni per evitare che si dividano ulteriormente. I MEF inattivati devono essere piastrati su piastre di coltura di tessuto gelatinizzato almeno un giorno prima di iniziare a coltivare cellule ES. Quando gli alimentatori sono completamente stabilizzati, le cellule ES vengono scongelate e seminate sulle piastre.

Nei prossimi giorni, le cellule ES cresceranno in grandi colonie. Prima che le colonie inizino a toccarsi e fondersi, la cultura ES dovrebbe essere passata. Si dovrebbe osservare la morfologia delle cellule ES per vedere se mostrano segni di differenziazione. Le colonie di ES indifferenziate appaiono generalmente ben definite e omogenee, mentre le cellule differenziate apparirebbero come "ciottoli" opachi e di forma irregolare.

Se le colonie mostrano il 70% o più di differenziazione, o se sono sparse, tagliare meccanicamente le colonie indifferenziate e trasferirle su una nuova piastra di alimentazione. In caso contrario, è sufficiente rimuovere le aree differenziate o le colonie e procedere con il passaggio.

Una volta che le colonie differenziate sono state ripulite, vengono aggiunti enzimi proteolitici, come la collagenasi, per sollevare le cellule dalla piastra con incubazione a 37 anni? C per il periodo di tempo appropriato. Viene quindi aggiunto un terreno ES fresco per fermare le reazioni enzimatiche. Le colonie vengono rimosse meccanicamente dalla piastra e trasferite in una provetta da centrifuga, dove vengono frantumate nelle dimensioni desiderate con un pipettaggio delicato. Le cellule ES vengono raccolte mediante centrifugazione, risospese in mezzi ES e piastrate sulle piastre di alimentazione preparate.

Dopo aver appreso come far passare le cellule ES, diamo un'occhiata a una delle tecniche più comuni utilizzate per differenziare le cellule ES in corpi embrioidi: il metodo della goccia sospesa.

Per iniziare, le cellule ES vengono staccate con l'aiuto di enzimi proteolitici come la collagenasi e diluite alla concentrazione desiderata in terreni contenenti fattori di differenziazione specifici del lignaggio. La sospensione di cellule ES viene quindi depositata in gocce sul coperchio di una capsula di Petri batterica. Il coperchio viene rapidamente capovolto e posizionato sul piatto, in modo che le gocce del terreno rimangano appese a testa in giù e permettano ai corpi embrioidi di svilupparsi.

Dopo circa due giorni, le gocce con EB possono essere raccolte e impiattate su piastre non aderenti per un'ulteriore coltivazione. Al momento opportuno per la linea cellulare desiderata, i corpi embrioidi vengono riplaccati su piastre di coltura tissutale aderenti gelatinizzate per un'ulteriore differenziazione.

Ora che abbiamo coperto le tecniche di base per la coltura e la differenziazione delle cellule ES, diamo un'occhiata a come sono adattate per specifiche esigenze sperimentali.

Come accennato in precedenza, le cellule ES possono essere indirizzate a differenziarsi in tipi di cellule specifiche in diverse condizioni di coltura. In questo esperimento, gli scienziati hanno prodotto motoneuroni da cellule ES umane. Questo è stato fatto aggiungendo prima fattori alla differenziazione dei corpi embrioidi che li dirigono verso la linea neurale, seguiti da sostanze chimiche e condizioni di placcatura che trasformano queste cellule specificamente in motoneuroni. Utilizzando approcci simili, i ricercatori sono riusciti a differenziare le cellule ES in cellule muscolari cardiache che battono ritmicamente.

Poiché la differenziazione delle cellule ES imita gli eventi che si verificano durante lo sviluppo naturale degli embrioni, possiamo anche usarle per studiare la biologia dello sviluppo embrionale precoce. Uno dei fenomeni studiati è l'inattivazione del cromosoma X, o XCI, il processo cruciale per cui uno dei due cromosomi X viene silenziato in ogni cellula di un mammifero femmina. Visualizzando la distribuzione di specifici RNA e proteine nello sviluppo di EB, gli scienziati hanno acquisito preziose informazioni sulla biologia dell'XCI.

Infine, per aumentare la coerenza e l'efficienza della sperimentazione sulle cellule ES, gli scienziati cercano continuamente di ideare tecniche migliori per coltivare le cellule ES. Un approccio consiste nel far crescere le cellule ES in un singolo strato, chiamato coltura monostrato di tipo non colonico, o NCM.

Ricordate che le cellule ES umane tendono ad essere infelici quando non crescono come aggregati 3D? Gli scienziati hanno dimostrato che le sostanze chimiche note come inibitori ROCK aumentano la sopravvivenza delle cellule ES dissociate, che consentono loro di essere fatte passare come sospensioni a singola cellula e di essere piastrate ad alta densità. Il vantaggio della tecnica NCM è che ogni cellula sarà esposta in modo più equo ai fattori di crescita e ai nutrienti nel terreno, riducendo l'eterogeneità all'interno della coltura e facilitando la crescita di cellule ES in gran numero.

Hai appena visto il video di JoVE su come coltivare e differenziare le cellule staminali embrionali. Ora dovresti sapere quali fattori sono importanti per mantenere le cellule ES nel loro stato indifferenziato e come possiamo sfruttare la pluripotenza delle cellule ES per generare tipi di cellule specifici in un piatto. In futuro, gli scienziati lavoreranno per sviluppare condizioni di coltura e differenziazione più efficienti e ben definite per produrre tipi di cellule specializzate che possono essere utilizzate in applicazioni di medicina rigenerativa. Grazie per l'attenzione!