2.11: Fate Mapping

I biologi dello sviluppo usano la mappatura del destino come strumento per tracciare le linee cellulari mentre un organismo matura. Questo viene fatto etichettando le cellule in uno stadio embrionale e quindi monitorando loro e la loro progenie durante lo sviluppo dell'organismo. La mappatura del destino viene utilizzata anche per studiare la migrazione e la differenziazione cellulare durante lo sviluppo, nonché la rigenerazione e la riparazione durante l'età adulta.

Questo video fornirà una panoramica della mappatura del destino, spiegherà un protocollo utilizzato per generare una mappa del destino nel pesce zebra e mostrerà alcuni modi in cui questa tecnica viene attualmente applicata nei laboratori.

Prima di entrare nei dettagli procedurali, discutiamo cos'è una mappa del destino e come è costruita.

Nei classici esperimenti di mappatura del destino, gli scienziati hanno colorato gruppi di cellule in un embrione precoce, come quelle allo stadio di gastrula, con un colorante che sarebbe stato trasmesso a tutti i discendenti di queste cellule. Dopo aver lasciato che l'embrione si sviluppasse per un certo periodo di tempo, hanno osservato le cellule colorate nell'organismo più maturo. È stata quindi notata la posizione delle cellule colorate nell'organismo maturo. I risultati aggregati di diversi esperimenti simili hanno permesso la costruzione di un diagramma noto come mappa del destino.

Pertanto, una mappa del destino è un piano generale che delinea il destino di ogni parte di un embrione precoce. Queste mappe aiutano gli scienziati a determinare cose come quali cellule embrionali si differenziano in quali cellule adulte funzionali e come migrano e si organizzano in strutture mature.

Gli scienziati hanno utilizzato molti organismi modello per creare mappe del destino, tra cui rane, nematodi, pesci, pulcini e topi. Alcuni organismi modello, come il pesce zebra Danio rerio, hanno un ulteriore vantaggio in questo tipo di esperimento. Poiché sono piccoli e rimangono trasparenti per gran parte del processo di sviluppo, gli scienziati possono facilmente tracciare le cellule osservando i pesci al microscopio ottico. È importante sottolineare che i progressi nelle tecniche di marcatura cellulare ora consentono agli scienziati di contrassegnare con precisione le singole cellule e tracciarle man mano che l'organismo si sviluppa, il che aiuta nella creazione di una mappa del destino estremamente dettagliata.

Ora che hai un'idea di cosa sono le mappe del destino, discutiamo di un protocollo per la mappatura del destino nel pesce zebra che utilizza la fotoattivazione. Questo approccio relativamente nuovo dipende dalle proteine fotoattivabili. Si tratta di speciali proteine fluorescenti, che sono "ingabbiate", cioè sono mantenute in una conformazione specifica per prevenire la fluorescenza. L'applicazione di un impulso laser controllato provoca un cambiamento conformazionale, noto come "uncage", che si traduce in una fluorescenza visibile.

Per eseguire questo esperimento, queste proteine specializzate in gabbia vengono prima sintetizzate e poi iniettate in embrioni di zebrafish in uno o due stadi cellulari. Successivamente, gli embrioni vengono lasciati maturare fino allo stadio di sviluppo desiderato prima della fotoattivazione.

Quindi, per preparare i pesci alla fotoattivazione, gli embrioni vengono dechorionati per rendere accessibile il tessuto bersaglio. Successivamente, vengono montati in un mezzo otticamente trasparente, come l'agarosio a bassa temperatura di fusione, che li mantiene in modo sicuro in una posizione stabile. I campioni sono allineati per esporre l'area di interesse e montati su un microscopio dotato di laser. Un impulso laser viene applicato all'area mirata contenente le cellule di interesse, inducendo la fotoattivazione.

Dopo il trattamento laser, gli embrioni vengono accuratamente rimossi dall'agarosio e riportati nel loro ambiente naturale fino al raggiungimento dello stadio di sviluppo desiderato. Al fine di rintracciare le cellule fotoattivate, gli embrioni vengono nuovamente immersi nell'agarosio a bassa temperatura di fusione e le cellule fotoattivate possono quindi essere visualizzate e tracciate utilizzando la fluorescenza diretta o l'immunocolorazione.

Ora che si dispone di una comprensione generale di un protocollo di mappatura del destino, è possibile esaminare alcuni esperimenti di laboratorio che sfruttano questa procedura.

Oltre a studiare lo sviluppo embrionale, la mappatura del destino può essere utilizzata per esaminare la riparazione nei sistemi maturi. In questo esperimento, uno specifico sottotipo di cellula è stato ablato da una retina transgenica di pesce zebra. Gli scienziati hanno quindi rintracciato cellule staminali adulte residenti geneticamente marcate per determinare il loro destino dopo una lesione. Infine, è stata eseguita l'analisi delle immagini, che ha dimostrato l'attivazione delle cellule staminali adulte e la successiva riparazione dei tessuti.

Gli scienziati stanno anche utilizzando protocolli simili per comprendere il destino delle cellule staminali trapiantate. Qui, le cellule staminali embrionali umane geneticamente marcate, o hESC, sono state trapiantate in un modello murino immunocompromesso. Le cellule impiantate sono state lasciate differenziare per 8-12 settimane, dopodiché il teratoma risultante, che è un tumore che contiene tessuto da più strati germinali, è stato raccolto, fissato e immunocolorato per determinare il destino delle cellule staminali impiantate. Questo tipo di esperimento aiuta gli scienziati a confermare il potenziale differenziativo in vivo delle cellule staminali in coltura.

Come accennato in precedenza, gli scienziati eseguono procedure di mappatura del destino in vari organismi modello, compresi i mammiferi. In questo particolare studio, gli scienziati hanno marcato le cellule in una regione specifica di un embrione di topo precoce utilizzando approcci genetici inducibili. Questo viene fatto somministrando un agente induttore a un topo gravido che porta prole geneticamente modificata. Le cellule marcate sono state monitorate durante le fasi successive dello sviluppo, il che ha aiutato gli scienziati a determinare il loro destino finale.

Hai appena visto il video di JoVE sulla mappatura del destino. Questo video ha fornito alcune informazioni sulla creazione di mappe del destino, ha esaminato uno specifico protocollo di mappatura del destino e ha discusso alcune delle modifiche e delle applicazioni di questa tecnica estremamente utile. Come sempre, grazie per la visione!