Name: Facile e preciso meccano-profiling su micropost Array (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: Scopri il meccano-profiling su micropost array per studiare le interazioni cella-substrato in cellule ossee tumorali umane. Questa tecnica ad alto rendimento utilizza microscopia a luce standard e il software MechProfiler.

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Questo lavoro è stato supportato dal Comitato per la Tecnologia e l'Innovazione (CTI) Svizzera grant 14796-PFLS-LSCTI. Gli array MicroPost sono stati generosamente forniti da MicroDuits GmbH.

1. coltura di cellule su micropost Array Nota: Tutte le operazioni devono essere eseguite in un armadio biosicurezza per garantire la sterilità. I volumi qui indicate sono per T25 fiasche di coltura cellulare. La coltura cellulare medio ricetta e la semina delle cellule densità sono ottimizzati per le linee di cellule di cancro osseo HuO9 e M132. <ol><li> Preparare una coltura cellulare per la semina su una matrice micropost. <ol><li> Controllare la qualità coltura cellulare posizionando il pallone di coltura su un microscopio ottico standard. Assicurarsi che le cellule mostrano una crescita e morfologia tipica stimando quanto del fondo pallone di coltura è coperto. Una copertura del 70% -80% riflette un tasso di crescita sana. Prestare attenzione alla quantità di cellule galleggiante in quanto rappresentano le cellule morte e / o una cultura troppo cresciuto. </li><li> Trypsinize cellule rimuovendo medie e lavaggio con 4 ml 1x tampone fosfato (PBS). Aggiungere 0,8 ml 1x tripsina / acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) e incubare a RT finché la cellas sloggiare, che dura circa 2-4 minuti. Controllare il processo con il microscopio e di tanto in tanto toccare il pallone con delicatezza per sostenere il sloggiare. </li><li> Aggiungere 5 ml di mezzo di coltura cellulare (Modified Eagle Medium di Dulbecco (DMEM) / F12 con 10% di siero bovino fetale (FBS), 1% di penicillina / streptavidina (Pen / Strep)) per arrestare la reazione e per lavare le cellule residue che ancora siedono sul fondo della beuta. Successivamente pipetta questa sospensione su e giù più volte per ottenere una miscela omogenea. Assicurati di pipetta tutte le soluzioni in tutta l&#39;area di crescita originale del pallone per ottenere un efficace sloggiare. </li><li> Trasferire la sospensione cellulare in una provetta da 15 ml e centrifugare utilizzando una centrifuga da tavolo a 0,5 xg per 3 min. </li><li> Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 5 ml di mezzo pipettando su e giù 5 volte. Assicurati di evitare la generazione di bolle, mentre farlo. </li><li> Determinare densità cellulare utilizzando una camera di conteggio cellulare e un microsco lucepe. Controllare la sospensione cellulare in camera di conteggio delle cellule per aggregati di cellule e garantire avere solo singole cellule per il successivo esperimento. Pipetta di nuovo su e giù parecchie volte se le cellule tendono a formare aggregati per separarli. </li><li> Diluire la sospensione cellulare con il mezzo sufficiente per ottenere una soluzione di cellule di 25.000 cellule / ml. Mescolare bene invertendo la provetta chiusa più volte. </li></ol></li><li> Preparare una matrice micropost per la semina delle cellule. NOTA CRITICA: Non pipetta sulla matrice micropost direttamente in quanto ciò potrebbe potenzialmente danneggiare le microposts, soprattutto quando vengono introdotti bolle indesiderate. Inoltre, assicurarsi che la matrice micropost non si asciuga come si verificano forze capillari portano al collasso delle microposts. <ol><li> Posizionare il substrato di vetro con l&#39;array micropost affrontare in un pozzetto di una piastra 12 pozzetti utilizzando un paio di pinzette e bagnare con l&#39;aggiunta di 1 ml di etanolo (99%). Incubare a temperatura ambiente per 20-30 secondi. </li><li> Diluire l&#39;etanolograduale con l&#39;aggiunta di circa 1 ml di acqua deionizzata sterile (acqua DI) sul lato pozzo ed aspirando circa 1 ml utilizzando una pipetta di trasferimento o di dispositivo di aspirazione. Ripetere questa operazione almeno 3 volte. </li><li> Sostituire l&#39;acqua demineralizzata con PBS-buffer nella stessa maniera aggiungendo ed aspirando circa 1 ml. Ripetere questa operazione per 3 volte. </li><li> Sostituire la PBS-buffer con media aggiungendo e aspirando circa 1 ml di terreno. Ripetere questa operazione per 3 volte. </li></ol></li><li> Pipettare 1 ml di soluzione di cellule (25.000 celle) sulla parte superiore di ciascun array micropost preparati. Chiudi piastra multi-pozzo e trasferirlo in un incubatore (5% CO 2, 37 ° C). Lasciate che le cellule aderiscono e crescono in cima microposts per 6 -7 ore. </li><li> Controllare il processo di adesione di tanto in tanto, utilizzando una luce microscopio. Controllare che la maggior parte delle cellule appaiono sparsi su più microposts. </li></ol> 2. fissaggio e colorazione delle cellule Nota: Tutti i passi evolumi qui indicate sono per un singolo pozzetto di una piastra 12 pozzetti. Si raccomanda di processo non più di quattro dei dodici pozzetti alla volta per evitare un prosciugamento dei pozzi dopo l&#39;aspirazione di qualsiasi liquido, che si tradurrà in un collasso delle microposts. <ol><li> Aspirare il terreno dal pozzo e lavare le cellule 2x con 1 ml di PBS-buffer. Assicurarsi di applicare una forza gentile durante il lavaggio con PBS per rimuovere i detriti cellulari che si sono accumulati sulla matrice micropost durante l&#39;incubazione e di staccare le cellule morte. </li><li> Fissare le cellule con 0,5 ml di 3,7% soluzione di formaldeide tamponata per 5 min. </li><li> Sostituire la soluzione di formaldeide lavando i 2x matrice micropost con 1 ml di acqua deionizzata sterile. </li><li> Macchiare le cellule con colorante (0,05% Coomassie Brilliant Blue a 50% di acqua, 40% di etanolo e 10% di acido acetico) per circa 90 sec. Lavare soluzione colorante in eccesso 2x con 1 ml di acqua deionizzata sterile. Aggiungere acqua deionizzata 1 ml di micropost array. </li><li> Controllare risultato colorazione utilizzando un microscopio ottico. Ripetere tegli la colorazione passo, se il corpo cellulare è troppo debole per essere visualizzato. </li><li> Array Conservare micropost con le cellule colorate sulla parte superiore in un frigorifero a 4 ° C. Assicurarsi di tenerli sotto l&#39;acqua in ogni momento. </li></ol> Imaging 3. cellulare Nota: Passo 4 si applica solo ai microscopi senza corretto all&#39;infinito ottica. <ol><li> Aggiungere 2 ml di acqua demineralizzata per una capsula di Petri con un fondo di vetro sottile per immagini ad alta risoluzione. </li><li> Trasferire matrice micropost con un paio di pinzette nel piatto di imaging con le microposts rivolto verso l&#39;alto. </li><li> Porre la capsula Petri di imaging su una fase mobile di un microscopio ottico. </li><li> Ruotare l&#39;anello di compensazione della lente utilizzata per l&#39;imaging finché il numero sulla scala rappresenta lo spessore totale di tutti i materiali lungo il percorso ottico per compensare la mancata corrispondenza indici di rifrazione del substrato di vetro, l&#39;elastomero di silicone e il liquido sulla parte superiore. Ciò dovrebbe portare ad un aspetto brillante dei micropostscore. </li><li> Chiudere il diaframma sul lato illuminazione fino al 50% e rimuovere eventuali anelli contrasto di fase dal percorso ottico consente un&#39;innovativa modalità campo chiaro ordinario. </li><li> Allineare la matrice micropost che i microposts formano una linea orizzontale attraverso il campo di osservazione. Definire un punto di partenza (ad esempio, in alto a sinistra) e spostare il piatto graduale Petri sul palco la scansione dell&#39;array micropost durante l&#39;assunzione di numerose immagini. </li><li> Prendete tutte le immagini con l&#39;impostazione di massima risoluzione per la telecamera con un obiettivo 20X o 40X. Lo scopo di avere una singola cella nel centro dell&#39;immagine. </li><li> Sweep lungo l&#39;asse z attraverso il substrato fino a che le punte micropost sono a fuoco. Usare la multa volante fuoco sintonizzazione del microscopio e girarlo verso concentrandosi sul fondo micropost per circa 2-3 micron. </li><li> Stabilire una procedura di imaging normale prendendo serie di immagini di prova di una sezione matrice spazzare attraverso i parametri di imaging uno alla volta (ad esempio, il tempo di esposizione,impostazione del diaframma, Impostazioni lampada ecc). Analizzare le immagini con MechProfiler e determinare un set di parametri adatto per un&#39;analisi veloce e affidabile. </li></ol> Analisi 4. Immagine con Software Open Source &quot;MechProfiler&quot; Nota: tutte le funzioni del software possono essere attivate con un dispositivo di puntamento con il tasto sinistro del mouse. Tuttavia, un operatore esperto userà la scorciatoia documentate progettati per essere nella metà sinistra della tastiera per consentire una efficiente elaborazione delle immagini a due mani. <ol><li> Avviare l&#39;analisi delle immagini software MechProfiler e aprire una serie di immagini che devono essere analizzati facendo clic su &quot;Apri&quot;. </li><li> Inserire tutti i parametri nella sezione &quot;Impostazioni&quot; proposta dal sviluppatore di software. Determinare i parametri che devono essere configurati personalizzati (cioè, la soglia di contorno e distanza minima) secondo le modalità descritte in dettaglio nel manuale del software. </li><li> Analizzare immagines uno per uno per loro ritaglio per l&#39;area di interesse usando &quot;Crop&quot; (fare clic e trascinare con il pulsante del mouse premuto). Fare doppio clic all&#39;interno del rettangolo disegnato per completare questa azione. </li><li> Marcatura ogni profilo cellulare visibile uno per uno cliccando su &quot;Pareggio contorni cellulari&quot; e utilizzare il cursore cross hair per il disegno comprese tutte microposts la cella è collegata. </li><li> Eliminare le microposts indesiderate facendo clic su &quot;Scartare Messaggi&quot; e utilizzare il cursore cross hair per disegnare. Racchiudere tutti microposts che appartengono a una cella di fuori della sezione dell&#39;immagine o che vengono deviati per qualsiasi altro motivo, ma non dalla cella di interesse. </li><li> Avviare il sottoprogramma software &quot;Trova Centroidi&quot; con un clic del mouse. Regolare l&#39;impostazione proprio accanto al pulsante &quot;Cerca Centroidi&quot; fino a quando vengono registrati tutti i microposts, che è visibile da una croce rossa nel loro centro filtro. Se l&#39;impostazione del filtro è troppo basso microposts verranno ignorati, se è troppo alto muposizioni ltiple saranno contrassegnati per un singolo micropost. Mantenere l&#39;impostazione costante nel corso di una sessione di analisi del filtro. </li><li> Utilizzare la funzione di editing manuale &quot;Modifica manuale&quot; per i baricentri con più o mancati posizioni micropost. Utilizzare i capelli del mouse croce per selezionare la micropost in questione facendo clic e trascinandola attraverso. Fare doppio clic all&#39;interno del rettangolo e posizionare l&#39;indicatore rosso mancante nella sezione ingrandita, che si chiude automaticamente. Scarta una tale micropost se è al di fuori della struttura di cella disegnato (vedi punto 4.5) prima di procedere. </li><li> Trova la griglia micropost ideale attivando la funzione &quot;Crea Grid&quot; con un clic del mouse. Assicurarsi che la posizione corrisponde con il vero capo micropost, dimostrato da un anello blu, all&#39;interno della struttura di cella disegnato. </li><li> Correggere qualsiasi produttore di griglia fuori luogo all&#39;interno della cella dove necessario utilizzando la funzione corrispondente &quot;Manuel Edit&quot; con un clic del mouse. Utilizzare il mirino per selezionare il micropost in question cliccando e trascinando trasversalmente. Fare doppio clic all&#39;interno del rettangolo che appare e posizionare il mancante indicatore blu nella sezione ingrandita, che si chiude automaticamente. </li><li> Utilizzare il pulsante &quot;Calcola flessioni&quot; di clic del mouse per ottenere un istogramma dei valori di deflessione calcolati in base alla differenza tra la posizione di un micropost all&#39;interno della sezione delle immagini e la griglia ideale generato. </li><li> Salvare l&#39;analisi completa comprese le tabelle di valori da un clic del mouse su &quot;Salva&quot;. </li><li> Continuare l&#39;analisi delle immagini facendo clic su &quot;Reset View&quot; e analizzare un&#39;altra sezione immagine o click del mouse su &quot;Avanti Immagine&quot;, che comodamente può essere fatto con il tasto cursore della tastiera destra. </li></ol> 5. Analisi dei dati - Mechanoprofiling <ol><li> Aprire il file &quot;Results.xls&quot; con un programma di Office foglio dalla cartella con le immagini analizzate. Esso contiene i dati con altril valori calcolati tra cui tutte le deviazioni micropost e misure standard derivati ​​quali il lavoro (ad esempio, energia substrato deformazione) da parte della cellula analizzata. </li></ol>

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L'autore principale (NG) è co-fondatore di MicroDuits GmbH, il fornitore commerciale degli array di micropost utilizzati in questo studio. Nessun altro autore ha potenziali conflitti di interesse con questo lavoro.

Questo lavoro si propone di avanzare il campo della microscopia a forza di trazione da una consistente riduzione delle barriere tecniche e pratiche all&#39;ingresso. Queste barriere provengono da due lati. In primo luogo sono le numerose sfide tecniche non banali che devono essere superati per la produzione riproducibile e commissionare una matrice micropost sperimentalmente. In secondo luogo, è similmente non banale necessità di una affidabile analisi semiautomatico delle forze monocellulari - tenendo presente che un t...

Saggi cellulari meccano-sensibili permettono di indagare cellule aderenti, con una vasta gamma di applicazioni che riflettono il ruolo centrale che la meccanica possono giocare in biologia cellulare. Queste applicazioni spesso si concentrano sui meccanismi di base che guidano i processi subcellulare o comportamenti a cellule intere. Da un lato, i fattori ambientali esterni come composizione della matrice extracellulare o rigidità matrice possono influenzare notevolmente la risposta meccanica e biologica di una cella. 1 Lo stesso può essere osservato dopo l&#39;uso di numerose classi di composti farmaceuticamente attivi, i cui effetti sono spesso caratterizzate usando modelli di coltura cellulare. 2 D&#39;altro canto proprietà genotipici, come quelle causate da mutazioni genetiche spontanee o indotta sperimentalmente, può indurre forti variazioni fenotipo cellulare che sono associati ad alterazioni nella struttura e funzione del citoscheletro. 3 Questi esempi sono solo alcune delle molte possibiliArgomenti per i quali fenotipizzazione meccanica delle cellule è rilevante, e tutti questi sono stati utilmente studiati con gli array micropost. Al momento in cui scriviamo, circa 200 articoli sono stati pubblicati descrivono l&#39;interazione cellule-micropost. Queste opere discutono aspetti teorici della micropost principi di deflessione e le istruzioni pratiche su loro fabbricazione. Il primo articolo descrive l&#39;interazione delle cellule e array micropost flessibili è stata pubblicata da Tan e colleghi nel 2003. 4 In contrasto classica microscopia a forza di trazione (TFM) dove substrati molli continui sono utilizzati per stimare contrattilità cellulare nanonewton scala, Tan et al. descritto un metodo che utilizza multipli travi verticali strettamente distanziati di elastomero siliconico. I principali vantaggi di questa tecnica emergono due caratteristiche principali. Prima, per cambiare il substrato rigidità cellulare apparente basti cambiare le dimensioni micropost mantenendola composizione del substrato altrimenti costante ed evitando differenze di topologia superficiale e chimica. Seconda microposts agiscono come singole sorgenti che possono essere analizzati in modo discreto con forza e risoluzioni spaziali dell&#39;ordine di singole adesioni focali e in grado di ridurre le sfide analitiche che sono inerenti all&#39;analisi analoga dalla norma TFM. Oggi la gamma di applicazioni per le matrici micropost supera di gran lunga solo la mappatura delle forze per un paio di singole cellule. Ad esempio, Akiyama riporta l&#39;uso di un isolato tessuto vaso dorsale da un bruco falena come attuatore per una matrice micropost, al fine di sviluppare un insetto propulsione muscolare autonoma micro-robot. 5 Tuttavia, le applicazioni più pubblicati di microposts sono concentrati su studi di condizioni mediche come infezioni o cancro. Ad esempio, gli array micropost sono stati utilizzati per studiare la costituzione della forza di tipo IV in bundle pili di Neisseria gonorrhcolonie OEA che è associato con cascate di segnale migliorando infezione. 6 Altri hanno utilizzato microposts studiare le cellule del cancro al seno trattate con composti farmaceutici rivolte al citoscheletro. 7 Flessione di un micropost viene spesso descritto con la teoria classica del fascio per un cantilever con un carico fine assumendo la cellula si attacca solo alla punta estrema della micropost. Qui la forza applicata F che causa una deviazione δ dipende k &quot;rigidezza flessionale&quot; del micropost ed è calcolato mediante: <img alt="Equazione 1" src="/files/ftp_upload/53350/53350eq1.jpg" /> (1) con E, I e L essendo il modulo di Young, superficie momento di inerzia e fascio lunghezza rispettivamente. Tuttavia, i risultati di questa equazione solo dare un&#39;approssimazione generale delle forze in gioco dal fascio tranciatura e piegatura e deformazione substrato non vengono presi in accontare. Considerando che microposts sono in genere realizzati con materiali morbidi come il polidimetilsilossano (PDMS) a base di gomma siliconica di questi fattori devono essere inclusi. . Schoen et al hanno dimostrato che vi è un tale fattore di correzione in base al rapporto di aspetto del micropost (L / D) e il rapporto di Poisson del polimero corrispondente v 8 Si è dato da.: <img alt="Equazione 2" src="/files/ftp_upload/53350/53350eq2.jpg" /> (2) Con T inclinazione (v) essendo un coefficiente di inclinazione che include il parametro un raccordo = 1,3 come si possono trovare nello stesso articolo: <img alt="Equazione 3" src="/files/ftp_upload/53350/53350eq3.jpg" /> (3) Ciò significa rigidità corretto del micropost k corr è il prodotto del puro curvatura rigidezza k = k bend e il fattore di correzione corrin: <img alt="Equazione 4" src="/files/ftp_upload/53350/53350eq4.jpg" /> (4) Pertanto, i calcoli di forza delle cellule devono essere effettuate utilizzando la variazione più raffinata dell&#39;equazione (1) ora di lettura: <img alt="Equazione 5" src="/files/ftp_upload/53350/53350eq5.jpg" /> (5) L&#39;impatto della correzione diventa più evidente non appena vengono utilizzati i valori tipici per le quote micropost. Ad esempio, una lunga micropost 15 micron con una sezione trasversale circolare e un diametro di 5 micron in gomma siliconica a base di PDMS porta ad un fattore di correzione di 0,77 e quindi un calcolo non corretta potrebbe sovrastimare le forze esercitate cellulari del 23%. Questo diventa ancora più grave per microposts con proporzioni minori. Tradizionalmente, micropost analisi delle immagini si è basato anche sulla teoria flessione fascio idealizzato. Nel 2005 il gruppo che aperto la strada all&#39;uso di MICRarray opost pubblicato un software di analisi delle immagini adatto per l&#39;analisi micropost 9 Il software richiede una licenza software e l&#39;utente deve prendere tre immagini per ogni posizione.; uno ciascuno da piani superiore e inferiore del micropost in trasmissione e un altro in modalità fluorescenza con la cellula colorata. Dopo aver confrontato le posizioni superiore e inferiore per ogni micropost il software determina un campo di forza vettoriale e calcola i parametri correlati come forza per posta. Esistono altri pacchetti software e loro principi di analisi sono brevemente menzionati negli articoli corrispondenti che li descrivono, ma questi pacchetti software di analisi non sono generalmente disponibili al pubblico. 10,11 Gli array micropost progettati per forze cellulari mappatura possono essere classificati come essendo in un layout micropost ortogonali o uno esagonale, l&#39;ultima delle quali hanno il vantaggio di lacune equidistanti tra tutti microposts vicini. Microposts tipici ettarive una sezione trasversale circolare e le loro dimensioni variano da 1,0 micron a 10 micron di diametro e 2 a 50 micron di lunghezza. 4 Tuttavia, sono stati riportati anche microposts a sezione ellittica o quadrata. 12,13 L&#39;uso di miscele a base di silicone-PDMS come materiale micropost permette di aggiungere nanoparticelle nella miscela. Per esempio l&#39;aggiunta di cobalto nano-barre consente un&#39;attivazione magnetico della micropost e quindi dà un grado di libertà per i potenziali progetti sperimentali. 14 maggior parte dei gruppi producono i loro allineamenti micropost su substrati rigidi piatti come copertura in vetro o all&#39;interno di una capsula di Petri. Tuttavia, Mann e collaboratori recentemente riportato una matrice micropost formata su una membrana elastica. 15 Ciò consente l&#39;applicazione di cellule che si estende forze di cellule aderenti durante gli studi live-cell subcellulare risposte dinamiche in termini di contrattilità delle cellule. L&#39;e più isti largamente impiegatoprocesso tuito per rendere gli array micropost è basato su litografia soft, come descritto nei protocolli penetranti di Sniadecki e colleghi. 16-18 Nei processi standard, camere bianche brevi sono usati per generare le microstrutture sulla cima di un wafer di silicio con photoresist SU8. Questa è seguita da un processo di copia in cui la gomma di silicone è gettato sulle strutture che li trasferiscono in stampi. In una seconda fase questi stampi sono utilizzati per replicare la microstruttura iniziale utilizzando gomma siliconica su di un substrato scelto. Tuttavia, nonostante il grande e crescente numero di pubblicazioni relative alla loro applicazione, stabilendo un processo di fabbricazione per microposts richiede una notevole quantità di tempo anche per gli esperti di micro-ingegneria; ci sono molte fasi di processo che richiedono ottimizzazione e adattamento all&#39;ambiente specifico laboratorio e la layout micropost per produrre un livello di qualità accettabile. Array micropost commerciali sono ora disponibili in un ready-tformato o-uso (&quot;off-the-shelf&quot;) con una qualità elevata e costante. Come tali sono un&#39;alternativa al lungo e complesso processo di produzione necessarie per la produzione in loco. In questo lavoro un allineamento micropost disponibile in commercio è stato utilizzato per la mappatura delle forze cellulari utilizzando una singola immagine al microscopio un campo chiaro. Ancora più importante questo articolo descrive e documenta un software open-source pienamente funzionale denominato MechProfiler, che è disponibile per il download come materiale supplementare di questo manoscritto. Una versione attivamente mantenuto del software si possono trovare anche in http://www.orthobiomech.ethz.ch. La combinazione di un saggio &quot;off-the-shelf&quot; e una compatibile con software di analisi open source riduce notevolmente l&#39;ostacolo ingresso per raggiungere esperimenti TFM accurate. I ricercatori non hanno accesso a entrambi i servizi in camera puliti o esperienza di sviluppo di software in grado di analizzare le forze cellulari con successo. Esso consente all&#39;utente di concentrarsi sulle mechanosensitivity uscita test piuttosto che la tecnologia stessa, e fa misure di forza di trazione disponibili a una comunità più ampia. Inoltre, questo è un passo importante per spianare la strada verso lo screening completamente automatica di array micropost. Il software di analisi MechProfiler elabora le immagini in file di formato tiff, png, bmp e jpg. Le immagini possono essere scattate con la fluorescenza, contrasto di fase o in campo chiaro microscopia ottica. Il programma standalone funziona insieme con la libera Matlab compilatore runtime (disponibile presso: Figura 12) e gli algoritmi sottostanti consentire l&#39;elaborazione delle immagini semplificata, che permette all&#39;utente di elaborare immagini con cellule singole o multiple in circa 1 min. Inoltre, queste cellule possono essere o vivere o &quot;fissi&quot;. Il software MechProfiler è in grado di aumentare notevolmente la velocità di analisi dei dati basandosi su riproducibilità di array micropost qualità commerciale, più specificamente, il default e #8220, non deviato &quot;posizione di ogni post nella matrice si può presumere contro una griglia ideale (tolleranze di fabbricazione per la griglia in matrici utilizzate per questo studio sono stati inferiori a 100 nm). In breve si apre una selezione di file di immagine per l&#39;analisi, le colture per la regione di interesse, definisce i posti coperti dalle cellule o che devono essere scartati, determina le posizioni postali, calcola le deformazioni / forze contro la griglia ideale, e, infine, salva tutti i dati specifici delle cellule con la possibilità per l&#39;esportazione, tra cui a un ufficio foglio elettronico standard.

<table><tbody><tr><td>Palloni per colture cellulari T25</td><td>Nunc</td><td>156367</td><td></td></tr><tr><td>1x tampone PBS</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>0,5% Tripsina-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>15400054</td><td></td></tr><tr><td>Medio DMEM/F12</td><td>Sigma</td><td>D8437</td><td></td></tr><tr><td>FBS South America</td><td>Life Technologies</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina 100x</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Fiale da centrifuga da 15 ml</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.502&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Micropost array pre-rivestito con Collagene I/Fibronectina</td><td>MicroDuits</td><td>MPA-col1/FN</td><td>Dimensioni Micropost: &Oslash;=6.4&#160; &micro; m, l=18,2 &micro; m; griglia=13 &micro; m, kcorr=2.87&#160; nN/&micro; m</td></tr><tr><td>Etanolo abs p.A.</td><td>Merck</td><td>100.983</td><td></td></tr><tr><td>Piastra a 12 pozzetti</td><td>Nunc</td><td>150628</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di formalina, tampone neutro 10%</td><td>Sigma</td><td>HT5011</td><td></td></tr><tr><td>Blu brillante G-250</td><td>Sigma</td><td>27815</td><td>Blu di Coomassie</td></tr><tr><td>Metanolo ACS p.A.</td><td>Merck</td><td>1.06009</td><td></td></tr><tr><td>Acido acetico</td><td>Sigma</td><td>695092</td><td></td></tr><tr><td>Piatto inferiore in vetro</td><td>WillCo Wells BV</td><td>GWSb-3522</td><td>Diametro 35 mm, apertura 22&nbsp; mm</td></tr><tr><td>T-100 Eclipse</td><td>Nikon</td><td>n/a</td><td>Microscopio invertito</td></tr><tr><td>D3-L3</td><td>Nikon</td><td>n/a</td><td>Controllo fotocamera</td></tr><tr><td>DS Fi2</td><td>Nikon</td><td></td><td>Camera</td></tr></tbody></table>

facile e preciso meccano-profiling su micropost array

Easy and Accurate Mechano-profiling on Micropost Arrays

I substrati di coltura cellulare con micropost flessibili integrati consentono all'utente di studiare le interazioni meccaniche tra le cellule e l'ambiente circostante. In particolare, le interazioni cellula-substrato sono l'interesse principale. Oggi, gli array di micropost sono un metodo ben caratterizzato e consolidato, con un'ampia gamma di applicazioni che sono state pubblicate nell'ultimo decennio. Tuttavia, sembra esserci una riserva tra i biologi nell'adattare la tecnica a causa del lungo e impegnativo processo di produzione dei micropost insieme alla mancanza di un software facilmente accessibile per l'analisi delle immagini delle cellule che interagiscono con i micropost. 
La lettura della forza dai micropost è sorprendentemente facile. Un microperno agisce come una molla con la cella idealmente attaccata alla sua punta. A seconda delle dimensioni, una cellula applica la forza dal suo citoscheletro attraverso uno o più punti di adesione focale al microperlo, deviando così il micropalo. La quantità di deflessione è direttamente correlata alla forza applicata in direzione e in grandezza. Il numero di micropost coperti da una cellula e i modelli di deflessione dei post sono caratteristici e consentono la determinazione di valori come la forza per perno e molti parametri biologicamente rilevanti che consentono la "profilazione meccanica" dei fenotipi cellulari.
Un metodo conveniente per la profilazione meccanica è descritto qui combinando la prima generazione di micropost pronti all'uso disponibili in commercio con un pacchetto software sviluppato internamente che è ora accessibile a tutti i ricercatori. Come dimostrazione dell'applicazione tipica, sono state scattate singole immagini di cellule tumorali ossee in microscopia a campo chiaro per la meccanoprofilazione di modelli di metastasi di linee cellulari. Questa combinazione di sensori di forza di trazione commerciali e software open source per l'analisi consente per la prima volta una rapida implementazione della tecnica del micropost array nel lavoro di laboratorio di routine svolto da utenti non esperti. Inoltre, un processo di analisi robusto e semplificato consente all'utente di analizzare un gran numero di immagini micropost in modo altamente efficiente in termini di tempo.

Il vantaggio principale della tecnica descritto risiede nella sua semplicità e potenziale di integrazione rapida ed efficace nel lavoro di laboratorio di routine. La combinazione di array di sensori commerciali di alta qualità abbinati a software open source fornisce informazioni sulla sensibilità meccano che altrimenti richiede l&#39;accesso ai servizi camera bianca e una conoscenza approfondita di analisi di immagine e di sviluppo del software. La Figura 1 illustra il flusso di lavoro...

Descritti sono i protocolli per quantificare le interazioni meccaniche tra cellule aderenti e substrati microstrutturati. Queste interazioni sono strettamente legate a comportamenti cellulari essenziali tra cui la migrazione, la proliferazione, la differenziazione e l'apoptosi. I protocolli presentano un software di analisi delle immagini open source chiamato MechProfiler, che consente di determinare le forze coinvolte per ogni micropalo.

Facile e preciso meccano-profiling su micropost Array

Cell culture substrates with integrated flexible microposts enable a user to study the mechanical interactions between cells and their immediate ...

L'obiettivo generale di questa tecnica è raccogliere proprietà meccanobiologiche rilevanti da singole cellule isolate, visualizzando le forze generate dalle loro caratteristiche interazioni con il substrato cellulare mediante microscopia ottica standard. Il metodo presentato rappresenta una tecnologia di piattaforma per la meccanobiologia. Può contribuire a indagare domande fondamentali nella ricerca sul cancro, come il ruolo della contrazione cellulare nella metastasi delle cellule tumorali.I principali vantaggi della tecnica sono che estrae in modo robusto informazioni neurobiologiche con un minimo addestramento dell'utente. È compatibile con la microscopia ottica standard ed è orientata ad un'elevata produttività. In terzo luogo, questo metodo fornisce informazioni sulle proprietà meccanobiologiche delle cellule umane del cancro osseo.Si può applicare anche a tipi cellulari auto come cellule muscolari lisce o cardiomiociti. Iniziare posizionando il substrato di vetro in modo che l'array di microperni sia rivolto verso l'alto all'interno della pozzetta di una piastra a 12 pozzette; aggiungere indirettamente un millilitro di etanolo al 99% nella pozzetta, in modo da coprire il substrato. Assicurarsi che non si formino bolle durante tutte le fasi di manipolazione dei liquidi e che l'array di microperni sia sempre ricoperto da un sottile strato di liquido.Quindi incubare la matrice a temperatura ambiente per 20-30 secondi prima di aggiungere un millilitro di acqua deionizzata sterile lungo il bordo del pozzetto. Una volta che si è mescolata con l'etanolo, aspirare circa un millilitro della soluzione di etanolo dal pozzetto e aggiungere un ulteriore millilitro di acqua deionizzata. Ripetere questo processo almeno tre volte per inumidire il campione.Successivamente, sostituire l'acqua deionizzata nel pozzetto con PBS, nello stesso modo, aggiungendo ed aspirando circa un millilitro alla volta per tre ripetizioni. Quindi utilizzare questo stesso procedimento per sostituire il PBS con il mezzo. Ora che l'array è ricoperto con circa un millilitro di mezzo, pipettare 25.000 cellule di interesse in un millilitro di mezzo nel pozzetto con un array di microperni preparato.Quindi chiudere la piastra a pozzetti e trasferirla in un incubatore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Lasciare che le cellule aderiscano e crescano sulla sommit&agrave; dei microperni per sei o sette ore, monitorando il processo di adesione. Di tanto in tanto, utilizzando un microscopio ottico, aspirare il mezzo dal pozzetto e quindi lavare le cellule due volte con un millilitro di PBS.Assicurarsi di applicare una forza delicata durante il lavaggio con PBS per rimuovere i detriti cellulari accumulati sull'array di micropilastri durante l'incubazione e per staccare le cellule morte. Successivamente, aggiungere 0,5 millilitri di una soluzione di formaldeide tamponata al 3,7% per cinque minuti per fissare le cellule. Quindi rimuovere la soluzione di formaldeide e lavare l'array di micropilastri due volte utilizzando un millilitro di acqua deionizzata sterile.Per ogni lavaggio, coprire le cellule fissate con colorante kumasi brillante blu 0,05% in una soluzione al 50% di acqua, 40% di etanolo e 10% di acido acetico per circa 90 secondi, rimuovere il colorante in eccesso con due risciacqui in un millilitro di acqua deionizzata sterile. Successivamente, aggiungere un millilitro di acqua deionizzata all'array di microperni e verificare il risultato della colorazione al microscopio ottico. Iniziare aggiungendo due millilitri di acqua deionizzata a una piastra di Petri con fondo in vetro sottile utilizzando una pinzetta, quindi trasferire l'array di microperni dalla piastra a 12 pozzetti alla piastra per imaging, posizionandolo con il microperno rivolto verso l'alto.Quindi posizionare la piastra di Petri per l'immagine sullo stage mobile di un microscopio ottico. Se l'obiettivo del microscopio non è corretto all'infinito, ruotare l'anello di compensazione dell'obiettivo utilizzato per l'acquisizione dell'immagine finché il numero sulla scala non rappresenta lo spessore totale di tutti i materiali lungo il percorso ottico. Successivamente, rimuovere eventuali anelli di contrasto di fase dal percorso ottico per abilitare la modalità ordinaria in campo chiaro, quindi ridurre l'iride sul lato di illuminazione al 50%. Allineare la piastra di Petri in modo che i micro-pilastri dell'array formino una linea orizzontale o verticale attraverso il campo di osservazione.Definire un punto di partenza nell'angolo in alto a sinistra e spostare la piastra di Petri in modo progressivo lungo il palchetto. Scansionare l'array di micropilastri acquisendo numerose immagini ad alta risoluzione con un obiettivo 20x o 40x. L'obiettivo è avere una singola cellula al centro di ciascuna immagine in ogni nuova posizione.Scansione lungo gli ZXs dalla base del microperno verso la punta del microperno finché la punta non è a fuoco, utilizzando la manopola di messa a fuoco fine del microscopio. Successivamente, abbassare il piano di fuoco di due-tre micrometri verso la base del microperno.Cominciare caricando il software mec, profiler, e importando un insieme di immagini da analizzare cliccando su apri e selezionando le immagini. Successivamente, accedere alla sezione impostazioni e inserire i parametri come indicato nel manuale del software. Quindi analizzare le immagini una alla volta.Iniziare selezionando il pulsante di ritaglio, quindi fare clic e trascinare per creare un contorno rettangolare intorno all'area di interesse. Al termine, fare doppio clic all'interno del rettangolo disegnato per completare l'azione. Successivamente, selezionare Disegna contorno della cellula e utilizzare il cursore a croce per tracciare un contorno intorno a tutti i micro-pilastri coperti dalla cellula visibile nell'immagine.Eliminare tutti i micro-punti indesiderati facendo clic per scartare i punti e utilizzare il cursore a crocino per disegnare. Quindi racchiudere tutti i micro-punti che appartengono a una cellula al di fuori della sezione dell'immagine o che sono deviati per qualsiasi altro motivo, ma non dalla cellula di interesse. Successivamente, fare clic su Trova OIDs per avviare la subroutine del software.Regolare l'impostazione del filtro accanto al pulsante "trova OID" finché tutti i micro punti non vengono rilevati, il che viene indicato da una croce rossa al centro di ciascuno. Se ci sono posizioni multiple o mancanti dei micro punti, utilizzare la funzione di modifica manuale facendo clic su "modifica manuale" e usare il mirino del mouse per selezionare il micro punto in questione. Fare doppio clic all'interno del rettangolo e posizionare un singolo marcatore rosso nell'area ingrandita dell'immagine, che si chiuderà automaticamente.Trova la griglia micro post ideale attivando la funzione di generazione della griglia con un clic del mouse. Assicurati che la posizione corrisponda al vero micro post individuato da un anello blu all'interno del contorno disegnato della cellula. Successivamente, correggi eventuali marcatori di griglia posizionati in modo errato all'interno dell'area della cellula, se necessario.Utilizzando la corrispondente funzione di modifica manuale con un clic del mouse, usare il mirino per selezionare la domanda relativa al micro inserimento cliccando e trascinandolo attraverso l'area. Fare doppio clic all'interno del rettangolo che appare e posizionare il marker blu corretto nella sezione dell'immagine ingrandita, che si chiude automaticamente. Quindi fare clic su "calcola deviazioni" per ottenere un istogramma dei valori di deviazione calcolati, basati sulla differenza tra la posizione di un micro inserimento all'interno della sezione dell'immagine e la griglia ideale generata.Infine, salvare l'analisi completa, inclusi i tavoli dei valori. Continuare l'analisi dell'immagine facendo clic su "resetta vista" per analizzare un'altra sezione dell'immagine oppure su "immagine successiva da mostrare". Di seguito è riportato un esempio di profilo di meno di due linee cellulari di cancro osseo: le cellule Q oh nove, che presentano un basso potenziale metastatico, e le cellule M 132 altamente metastatiche, coltivate su un rialzo proveniente dallo stesso lotto di produzione.L'esito mostra che le cellule Q oh nine tendono ad applicare una forza maggiore nei loro punti di attacco rispetto alle cellule altamente metastatiche, classificando i valori di forza. Rispetto alla superficie cellulare, si osserva che la forza media per cellula è più elevata nelle cellule huo nine rispetto alle M 132. Inoltre, la forza media per micro-posto aumenta all’aumentare della distensione delle cellule, fino a quando la forza media per posto non raggiunge un valore più stabile.Oltre alle differenze morfologiche, le varianze possono essere quantificate con risultati interessanti. Ad esempio, a differenza delle cellule M 132 altamente metastatiche, che tendono a occupare un numero minore di micropilastri, le cellule HU oh nine presentano un profilo più eterogeneo in termini di copertura dei micropilastri. In sintesi, il profilo Meno per la linea cellulare parentale HU oh nine rivela che queste cellule coprono tipicamente un'area maggiore ed esercitano una forza leggermente superiore sui micropilastri.Mentre la linea cellulare metastatica M 132 e il tipo cellulare aggressivo coprono tipicamente un numero inferiore di micropilastri ed esercitano una forza minore per micropilastro. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di pipettare con estrema cautela e mai direttamente sull'array di micropilastri. È necessario evitare l'introduzione di bolle d'aria, poiché provocano il collasso dei micropilastri.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come estrarre informazioni biologiche dettagliate da singole cellule isolate utilizzando micro post Aries in combinazione con il nostro software mesh profile. Goditi i tuoi risultati.

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