Name: Multifunzionale, Metodo Micropipetta-based per la Costituzione e la stimolazione della batteriche meccanosensibili Ion Canali in Droplet Interface bilayers (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 54 s
Description: Scopri un metodo micropipetta-based per costituire bilayer interfaccia goccia e stimolare canali meccanosensibili batterici. Questa tecnica combina vantaggi di patch clamp e miniaturizzazione per studiare attività meccanoelettriche.

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Ricerca riportata in questa pubblicazione è sostenuta dall&#39;Ufficio Air Force di ricerca scientifica di base dell&#39;iniziativa di Grant FA9550-12-1-0464.

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Mechanosensation significa una delle prime vie di trasduzione sensoriale che si sono evoluti negli organismi viventi. L&#39;utilizzo di questo fenomeno per lo studio e la comprensione delle proprietà meccano-elettrica del DIB, è un passo cruciale verso materiali stimoli-reattiva funzionali. Essa implica l&#39;incorporazione e l&#39;attivazione di un canale meccanosensibili, MscL, nel DIB come trasduttore mechanoelectrical e un estensimetro per rilevare aumento tensione nell&#39;interfaccia doppio strato lipidico. In un&#39;altra nota, la funzione di canali SM potrebbe essere regolata tramite le proprietà del materiale di base di bistrati lipidici, quali spessore, curvatura intrinseca e compressibilità. Alla luce di quanto sopra, la tecnica basata micropipetta-fornisce un valido strumento che consente al ricercatore la capacità di studiare canali MS in DIB e fornisce lo studio della struttura del doppio strato lipidico, nonché le interazioni proteina-lipide. Negli ultimi tre decennios, patch-clamp era il metodo primario per studiare canali MS, in quanto consente di bloccaggio sia tensione e tensione. Tuttavia, patch-clamp richiede attrezzature ingombranti e non adatto per la miniaturizzazione, una proprietà necessaria per la progettazione di dispositivi sensoriali e di conversione. DIB per la loro semplicità, stabilità, e compattezza rappresentano un ambiente adatto per studiare l&#39;attività di MscL. Qui, estendiamo precedenti progressi nelle tecniche di formazione DIB proponendo una tecnica basata micropipetta-, con la capacità di controllare la dimensione delle goccioline e l&#39;interfaccia doppio strato, la composizione chimica di ogni goccia, e la tensione all&#39;interfaccia attraverso la stimolazione dinamica. La tecnica consiste di ancorare goccioline acquose, contenente proteoliposomi, fino alla punta delle coassiale opposte capillari di vetro. Le goccioline sono poste in un bagno di solvente organico e quando vengono portate in contatto un doppio strato lipidico forme all&#39;interfaccia. Le micropipette sono collegati a poscillatori iezoelectric, permettendo lo spostamento orizzontale delle goccioline. Dinamicamente comprimendo le goccioline, determina un aumento della tensione interfacciale all&#39;interfaccia olio acqua e quindi un aumento della tensione doppio strato. Due importanti aspetti differenziano questo metodo dal simile e recentemente pubblicato contatto bolla doppio strato (CBB) tecnica 37. Utilizzando la tecnica qui presentata, la dimensione del doppio strato è controllato usando micromanipolatori e quindi i volumi delle goccioline rimangono costanti, a differenza del metodo CBB. Inoltre, la tecnica CBB richiede pompe a pressione, che non sono necessari nel metodo presentato in questo documento rendendo più semplice e più facile da costruire. Possiamo incorporare e stimolare batterica MscL per la prima volta senza l&#39;uso di una pipetta patch o modificazioni chimiche 38. Poiché il sistema facilita la formazione di robuste membrane asimmetriche doppio strato lipidico, imita più da vicino il lasimmetria IPID trovato nelle membrane biologiche. Questo ci permette di studiare gli effetti di composizione della membrana controllato o asimmetria sull&#39;attività di MscL. Inoltre, attraverso tecniche di elaborazione delle immagini, questo metodo permette di stimare la tensione all&#39;interfaccia doppio strato. Questa tecnica aiuta a comprendere i principi di interconversione tra le forze di massa e di superficie nel DIB, facilita le misure delle proprietà di membrana fondamentali, e migliora la comprensione della risposta MscL a membrana tensione. Anche se questo metodo ci porta un passo avanti verso un sistema materiale stimoli-responsive biomolecolari e ad un ambiente fisiologico diverso per studiare MscL, vi sono limitazioni al sistema. Tensione in questo sistema non può essere bloccato a causa della presenza del serbatoio lipidi in forma di liposomi in ogni goccia, che tende per alleviare la tensione all&#39;interfaccia acqua / olio. Pertanto, attualmente i canali meccanosensibili può essere stimolatoin DIB solo in un regime dinamico. La presenza di bolle d&#39;aria nel sistema influenza significativamente la precisione e la riproducibilità degli esperimenti. Le bolle d&#39;aria presenti nel idrogel potrebbe provocare perdita se il collegamento elettrico. Mentre si descrive l&#39;uso del metodo basato micro-pipetta per la stimolazione della MscL, la tecnica potrebbe essere utilizzata per studiare altri tipi di canali SM e ha il potenziale per essere utilizzato dai ricercatori per studiare una varietà di biomolecole. Per esempio, configurazione simile è stata utilizzata nel nostro laboratorio per studiare la risposta mechanoelectrical di un&#39;interfaccia gocciolina membrana a doppio strato libero-channel. Varie proteine ​​potrebbero essere ricostituito e attivate con questa configurazione altamente controllato, prendendo in considerazione che gli ambienti di ricostituzione di ogni biomolecole variano. Il metodo descritto in questo articolo tocca una potenziale applicazione notevolmente più ampio che è limitato solo alla fantasia del ricercatore.

Negli ultimi dieci anni, il montaggio di doppi strati lipidici artificiali è stata sostanzialmente avanzato attraverso lo sviluppo del metodo di doppio strato di interfaccia delle gocce. Conosciuto come stabile e robusto, DIB si imposero come sistemi modello alternativi alla classica dipinta (Mueller) e piegati bistrati (Montal-Mueller) planari 1. Anche se l&#39;idea di utilizzare gocce per creare doppi strati lipidici risale al 1960 2, non ha guadagnato la popolarità fino a tempi recenti. Il primo tentativo di successo è stato segnalato dal gruppo Takeushi 3, seguito da diversi studi che dimostrano formazione doppio strato utilizzando una rete di goccioline dal gruppo Bayley 4-6. Più recentemente, tecniche di incapsulamento sono stati proposti dal gruppo Leo 7-9, che ha introdotto il concetto di usando DIB come elementi costitutivi di nuovi sistemi materiali stimoli-reattiva 10. In studi precedenti, DIB hanno dimostrato la loro capacità di rispondere alle elettrica 9,11, chemiCal 10,12, e ottica 13 stimoli. Vari biomolecole con diverse funzionalità stimoli-reattiva sono stati effettivamente stimolato quando ricostituita nel DIB 10,14. Alla luce di questi tentativi riusciti una domanda importante è sollevata: potrebbe rispondono DIB di stimolo meccanico quando biomolecole appropriate sono incorporati? Le forze interfacciali che agiscono su un DIB differiscono da quelli degli altri 15,16 sistema doppio strato. Pertanto, la tensione nel doppio strato in possesso delle goccioline potrebbe essere controllata regolando la tensione alle interfacce acqua-lipide-olio; un concetto non applicabile con i sistemi doppio strato dipinti o piegati. Canali MscL, notoriamente conosciuto come valvole di rilascio osmolyte e gli elementi fondamentali della membrana citoplasmatica dei batteri, reagiscono ad un aumento della tensione della membrana 17,18. In caso di shock ipo-osmotico, più canali residente nella membrana di una piccola cella 19 può generare un masrisposta permeabilità sive di rilasciare rapidamente ioni e piccole molecole, salvando i batteri da lisi 20. Biofisico, MscL è ben studiato e caratterizzato in primo luogo attraverso la patch clamp prominente tecnica 21-23. Modelli strutturali affidabili che spiegano il meccanismo di gating 24,25 del MscL sono proposti in base alla struttura del suo omologo di cristallo 26,27, modellando 28, e risultati di un&#39;ampia sperimentazione 24,29-31. Sotto una tensione applicata di ~ 10 mN / m, il canale chiuso che consiste in uno stretto fascio di eliche transmembrana, si trasforma in un anello di eliche fortemente inclinate formando un ~ 28 Å di riempimento d&#39;acqua dei pori conduttivo 21,24,32. È stato anche dimostrato che l&#39;idrofobicità del cancello stretto, posizionato all&#39;intersezione dei domini TM1 interne, determina la soglia di attivazione del canale 33. Corrispondentemente, si è constatato che diminuendo la idrofobicità del cancello, la tension soglia potrebbe essere abbassata 22. La struttura, di MscL reso possibile la progettazione di varie valvole controllabili 34, principalmente per motivi di consegna della droga. Per tutte le proprietà di cui sopra e in base al suo ruolo fondamentale di tradurre membrana cellulare tensioni eccessive in attività elettrofisiologiche, MscL rende una grande misura come trasduttore mechanoelectrical in DIB. In questo articolo, vi presentiamo un metodo basato micropipetta-originale per formare DIB e misurare l&#39;attività dei canali MscL incorporati sotto stimolazione meccanica. Segnaliamo per la prima volta, la risposta di DIB di stimolo meccanico e la ricostituzione funzionale del mutante V23T a bassa soglia di MscL in DIB 35. Il sistema sperimentale è costituito da lipidi incassato goccioline acquose ancorate alla punta delle due opposte micropipette vetro borosilicato. Quando le goccioline vengono portati a contatto un&#39;interfaccia doppio strato lipidico è foconfermate. Questa tecnica offre il controllo sulla composizione chimica e le dimensioni di ogni goccia (bulk), nonché le dimensioni dell&#39;interfaccia doppio strato. Inoltre, le membrane asimmetriche con varie composizioni lipidiche in ciascun foglio potrebbero essere facilmente formate. Avere uno dei micropipette collegati ad un attuatore piezoelettrico armonica, fornisce la possibilità di applicare un ciclo singolo preprogrammato o stimolo oscillatorio. La tensione è consegnato alla membrana artificiale attraverso la compressione dei due goccioline sostengono. Come risultato della gocciolina deformazione, le aree di interfacce aumento acqua-lipide-olio, e contemporaneamente l&#39;angolo tra le goccioline diminuisce, causando un aumento della tensione della membrana e l&#39;attivazione transiente MscL. Attraverso l&#39;analisi delle forme delle goccioline durante la deformazione, la tensione creata all&#39;interfaccia potrebbe essere stimato. Anche se l&#39;attenzione in questo articolo è sulle proprietà meccano-trasduzione del DIB, abbiamo anche sottolineare che altri tipi di biomolecole, come alameticina, possono essere attivati ​​da questa piattaforma multifunzionale. Presentiamo qui, tutti gli aspetti tecnici della preparazione, assemblaggio, e prendendo le misure con questo nuovo metodo in modo step-by-step.

<table><tbody><tr><td>0,22 &micro; m filter</td><td>Corning</td><td>430624</td><td></td></tr><tr><td>1,2-diphytanoy-sn-glycero-3-phosphocholine (DPhPC)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850356P</td><td>Acquistato come polvere liofilizzata</td></tr><tr><td>Microfil calibro 34</td><td>World Precision Instruments</td><td>MF24G-5</td><td></td></tr><tr><td>400 mL Centrifughe Flanel</td><td>ThermoFisher</td><td>3141</td><td>Nalgene</td></tr><tr><td>Agilent Function/Generatore di forme d'onda arbitrarie, 20 MHz</td><td>Keysight Technologies</td><td>33220A</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillian</td><td>ThermoFisher</td><td>BP1760</td><td>ACS Grado</td></tr><tr><td>Avanti&reg; Mini-estrusore</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610000</td><td></td></tr><tr><td>Axio Scope.A1</td><td>Carl Zeiss-AxioCam</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>HSm</td><td>Carl Zeiss-Axopatch</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>200B Amplificatore&nbsp;</td><td>Molecular</td> <td>Devices-Kit</td><td></td></tr> <tr><td>per il dosaggio delle proteine BCA</td><td>Pierce&nbsp;</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>BK Precision 4017B 10 MHz DDs Generatore di scansione/funzione</td> Capillari in vetro borosilicato <td>Digi-Key</td><td>BK4017B-ND</td><td></td></tr><tr><td></td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100F-4</td><td></td></tr><tr><td>Tubo per dialisi</td> 7 <td>Spectra/Por</td><td>132113</td><td>MWCO 8000, diametro 7,5 mm</td></tr><tr><td>Sistema DigiData 1440A</td><td>Molecular</td> <td>Devices-DNAse</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Servocontrollore Sigma-Aldrich</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>DPhPC</td><td>Avanti</td><td>850356C</td><td></td></tr><tr><td>E-625 PGT&nbsp;</td><td>Physik Instrumente</td><td>E-526</td><td></td></tr><tr><td>FPLC System</td><td>Pharmacia</td> <td>Biotech-HCl</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>J.T. Baker</td><td>9535-33</td><td></td></tr><tr><td>Esadecano, 99%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>544-76-3</td><td></td></tr><tr><td>Omogeneizzatore</td><td>Wheaton</td><td>357426</td><td>15 mL</td></tr><tr><td>Imidazolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5513</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Affymetrix</td><td>17886</td><td></td></tr><tr><td>IRGACURE 2959</td><td>IRGACURE</td><td></td><td></td>555047962</tr><tr><td>Filtri a membrana isopore&nbsp;</td><td>EMD Millipore</td><td>VCTP02500</td><td></td></tr><tr><td>Alcool isopropilico</td><td>VWR International</td><td>BDH1133-4LP</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td>ACS Grado</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Mallinckrodt</td><td>7100</td><td>ACS Grado</td></tr><tr><td>Kimble-Chase</td><td>Kontes</td><td>420401-1515</td><td></td></tr><tr><td>Fotopolimerizzazione UV a LED Flex-100 Sistema</td><td>Electro-Lite, corp.</td><td>81170</td><td></td></tr><tr><td>Lysozyme</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6876</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipolatori manuali Patch-Clamp</td><td>Thorlabs</td><td>PCS-520N</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>ThermoFisher</td><td>M33</td><td>ACS Grade</td></tr><tr><td>Microelectrode Holder&nbsp;</td><td>World Precision Instruments</td> Estrattore per micropipette <td>MEH1S</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sutter Instruments</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>MOPS, titolazione minima del 99,5%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1254-100G</td><td></td></tr><tr><td>N2 Gas</td><td>Airgas</td><td>UN1066</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>EMD</td><td>SX0420-1</td><td>Perle di</td></tr><tr><td>agarosio ACS Grade Ni NTA</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td>1000632</tr><tr><td>Tubo acrilico colato otticamente trasparente, 2-1/2" OD x 2" ID</td><td>McMaster-Carr</td><td>8486K545</td><td></td></tr><tr><td>P-601 PiezoMove Attuatore lineare guidato da flessione</td><td>Physik Instrumente</td><td>P-601</td><td></td></tr><tr><td>PAGE gel</td><td>Bio-Rad</td><td>456-9033</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M&reg; Pellicola da laboratorio per tutti gli usi</td><td>Parafilm&reg;</td><td>PM999</td><td></td></tr><tr><td>Fenilmetilsulfonilfluoruro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>Poli(glicole etilenico)1000 dimetacrilato</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>15178-100</td><td></td></tr><tr><td>Filtri a membrana in policarbonato (PCTE), nero, 0,4 micron, 25 mm, 100/PK</td><td>Sterlitech Corporation</td><td><a href="http://www.sterlitech.com/filters/membrane-disc-filters/polycarbonate-membranes/hydrophilic-polycarbonate-membrane-filters/hydrophilic-polycarbonate-membrane-filter-pctb0425100.html">PCTB0425100</a></td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di potassio&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5405-500G</td><td></td></tr><tr><td>Guanti da esplorazione in nitrile morbido senza polvere&nbsp;</td><td>VWR International</td><td>CA89-38-272</td><td></td></tr><tr><td>Guarnizione di ricambio 1,0 mm</td><td>World Precision Instruments</td><td>GO1-100</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L5750</td><td></td></tr><tr><td>Filo d'argento</td><td>GoodFellow</td><td>147-346-94</td><td>È possibile utilizzare diametri diversi a seconda dell'applicazione&nbsp;</td></tr><tr><td>Sodio azide</td><td>Affymetrix</td><td>21610</td><td></td></tr><tr><td>Provette</td><td>ThermoFisher</td><td>14-961-27</td><td>12 x 130 mm</td></tr><tr><td>Triptone</td><td>ThermoFisher</td><td>BP1421</td><td></td></tr><tr><td>Ultracal 30K</td><td>Millipore</td><td>UFC803024</td><td>Amicore Ultra 30 MWCO</td></tr><tr><td>VWR Tergicristalli per tessuti leggeri</td><td>VWR International</td><td>82003-820</td><td></td></tr><tr><td>VWR Scientific 50D Ultrasonic Detergente</td><td>VWR International</td><td>13089</td><td></td></tr><tr><td>Depuratore d'acqua</td><td>Barnstead</td><td>D11931</td><td></td></tr><tr><td>Lievito</td><td>ThermoFisher</td><td>BP1422</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-ottilglucopiranoside</td><td>Anatrace</td><td>O311S</td><td></td></tr></tbody></table>

multifunzionale, metodo micropipetta-based per la costituzione e la stimolazione della batteriche meccanosensibili ion canali in droplet interface bilayers

Multifunctional, Micropipette-based Method for Incorporation And Stimulation of Bacterial Mechanosensitive Ion Channels in Droplet Interface Bilayers

MscL, un canale meccanosensibili grande conduttanza (MSC), è una valvola di rilascio osmolyte onnipresente che aiuta i batteri sopravvivono shock ipo-osmotico bruschi. E &#39;stato scoperto e rigorosamente studiato con la tecnica del patch-clamp per quasi tre decenni. Il suo ruolo essenziale di tradurre tensione applicata alla membrana cellulare in risposta permeabilità rende un candidato forte per funzionare come un trasduttore mechanoelectrical nei dispositivi biomolecolari basati sulle membrane artificiali. Servire come elementi costitutivi di tali dispositivi, doppi strati di interfaccia gocciolina (DIB) possono essere utilizzati come una nuova piattaforma per l&#39;integrazione e la stimolazione dei canali MscL. Qui, si descrive un metodo basato micropipetta a formare DIB e misurare l&#39;attività dei canali MscL incorporati. Questo metodo consiste di goccioline lipidiche acquose-incassato ancorati alle estremità delle due opposte (coassialmente) posizionate micropipette vetro borosilicato. Quando le goccioline vengono portati a contatto, un&#39;interfaccia doppio strato lipidico èformata. Questa tecnica offre il controllo sulla composizione chimica e la dimensione di ogni gocciolina, nonché le dimensioni dell&#39;interfaccia doppio strato. Avere uno dei micropipette collegati ad un attuatore piezoelettrico armonico fornisce la capacità di fornire uno stimolo oscillatorio desiderato. Attraverso l&#39;analisi delle forme delle goccioline durante la deformazione, la tensione creata all&#39;interfaccia può essere stimata. Usando questa tecnica, viene riportata la prima attività di canali in un sistema MscL DIB. Oltre canali MS, attività di altri tipi di canali possono essere studiate usando questo metodo, dimostrando la multifunzionalità di questa piattaforma. Il metodo qui presentato permette di misurare proprietà di membrana fondamentale, fornisce un maggiore controllo sulla formazione delle membrane simmetrici e asimmetrici, ed è un modo alternativo per stimolare e studiare canali meccanosensibili.

Figure 1 e 2 mostra la configurazione e attrezzature sperimentale utilizzato per registrare l&#39;attività della proteina in corso di stimolazione meccanica della membrana doppio strato lipidico. Per ridurre al minimo il rumore elettrico nelle nostre misurazioni, la workstation viene collocato all&#39;interno di una gabbia di Faraday laboratorio artigianale, a terra per un collegamento a terra sul Axopatch 200 B amplificatore. La formazione di una stabile isolante doppio strato lipidico è un passo fondamentale in questo studio. In questa disposizione, un monostrato lipidico assembla all&#39;interfaccia olio / acqua delle goccioline acquose immersi in un bagno di un solvente organico. Quando le goccioline sono posti in contatto, l&#39;olio in eccesso viene eliminato, e monostrati lipidici opposti fino ad una spessa due molecola doppio strato lipidico. La tecnica più comunemente usata nella caratterizzazione doppio strato è voltage-clamp. Con tensione-clamp, la tensione attraverso il doppio strato è mantenuta ad un valore costante mentre la corrente viene misurata. Figura 4 </strong&gt; ritrae un tipico registrazione corrente in tempo reale della formazione doppio strato iniziale. Conoscendo la capacità specifica (~ 0,6 mF / cm 2) 5 del doppio strato lipidico DPhPC, l&#39;area del doppio strato formato potrebbe essere calcolato. L&#39;area doppio strato può essere controllato variando la posizione delle gocce (Figura 4A). Utilizzando l&#39;attuatore piezoelettrico, diversi tipi di forme d&#39;onda (sinusoidale, quadra, triangolare, ecc.) A diverse frequenze, ampiezze, e cicli di lavoro possono essere applicate alle goccioline di orizzontalmente ed assialmente li oscillano e, quindi, la tensione doppio strato e la zona potrebbero essere alterati (Figura 4B). Quando il DIB è stimolato meccanicamente, pur mantenendo un potenziale DC costante attraverso la membrana, una bassa soglia (guadagno di funzione) V23T mutante di MscL genera attività affidabili compresi gli stati principalmente sub-conduttivi ed eventi di apertura occasionalmente completi (figura 5) . Questi evEnt sono identici a quelli registrati con la tecnica del patch-clamp da intatte interne membrane di E. coli e liposomi ricostituiti con la V23T purificato MscL. I risultati in figura 5 dimostrano che gating si verifica in risposta ad un aumento della tensione, poiché tutti picchi di corrente sono osservati a compressione picco. A compressione picco, l&#39;espansione areale relativa delle goccioline è massima e quindi, la tensione all&#39;interfaccia è massima. Alameticina, un canale ionico voltaggio-dipendenti e uno dei peptidi più studiati, aumenta la permeabilità della membrana quando viene applicata una tensione continua attraverso la membrana 36. La capacità dell&#39;interfaccia doppio strato lipidico per ospitare proteine ​​transmembrana e peptidi è anche testato eseguendo registrazioni corrente-tensione gating utilizzando alameticina peptide. Alameticina viene miscelato con la soluzione fosfolipide ad una concentrazione finale di 100 ng / ml. La Figura 6 mostra le misure di corrente sotto<html> morsetto di tensione (115 mV). Le goccioline in questo esperimento sono allontanati per conseguire piccola interfaccia doppio strato e quindi una maggiore resistenza e minore capacità. Il comportamento gating del peptide alameticina si manifesta attraverso i passi discreti di corrente (Figura 6). L&#39;istogramma sul lato destro del grafico mostra le variazioni di conduttanza dal livello di base (0.0962 nS), che è sostanzialmente il primo livello di conduttanza del canale stesso. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53362/53362fig1.jpg" /> Figura 1:. Uno schema che descrive le parti principali e le dimensioni del serbatoio dell&#39;olio Il serbatoio dell&#39;olio è fabbricato in officina al Virginia Tech. È costituito da un tubo acrilico cilindrica lavorata incollata alla superficie di un foglio acrilico. Le dimensioni e il design possono essere modificati per ospitare diverse applicazioni o più di due micropipette./53362/53362fig1large.jpg &quot;Target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53362/53362fig2.jpg" /> Figura 2:. Experimental setup e micropipette preparazione (A) La workstation standard per formare meccanicamente stimolante, e caratterizzare i bistrati interfaccia comprende un microscopio, manipolatori 3 assi, una fotocamera digitale, oscillatore piezoelettrico, tavolo isolamento dalle vibrazioni, e una gabbia di Faraday (non mostrato). (B) L&#39;apparato sperimentale è costituito da due opposti PEG-DMA idrogel riempita micropipette posizionati orizzontalmente all&#39;interno di un bagno d&#39;olio Esadecano. Ciascuna delle micropipette contiene un elettrodo Ag / AgCl per fornire collegamento elettrico. Un terzo micropipetta riempito con proteoliposome soluzione viene utilizzata per formare le goccioline sulla punta delle altre micropipette. (C) La risposta attuale DIB potrebbe essere misuratautilizzando una combinazione dell&#39;amplificatore cerotto e il sistema di acquisizione dati a basso rumore. (D) Un chiuso immagine che mostra le goccioline acquose formate sulla punta delle micropipette. Elettrodi (E) Ag / AgCl sono fatti immergendo la punta di due 250 micron fili d&#39;argento in candeggina. Gli elettrodi vengono poi alimentati attraverso due capillari di vetro borosilicato riempiti con PEG-DMA idrogel, che viene curato con luce UV a solidificare. Un supporto microelettrodo diritto con connettore maschio viene utilizzato per collegare una delle micropipette al headstage dell&#39;amplificatore patch. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53362/53362fig3.jpg" /> Figura 3:. Immagini che illustrano la formazione di bistrati interfaccia gocciolina (A) A 10 micron micropipetta riempito con proteoliposomi è posizionato sotto il microscopio in prossimità delle punte micropipetta. Utilizzando una siringa collegata alla micropipetta, dispensare piccoli volumidei proteoliposomi per formare goccioline sferiche a volume desiderato. Lasciate che il modulo monostrato, consentendo le goccioline di sedersi per dieci minuti. Portare le goccioline in contatto; il doppio strato formerà dopo tutto l&#39;olio all&#39;interfaccia è eliminato. (B) Mentre il doppio strato è formato, la composizione chimica su entrambi i lati della interfaccia potrebbe essere controllata iniettando chimici desiderati utilizzando una micropipetta micro dimensioni. (C) Le goccioline al momento del primo contatto. (D) Le goccioline quando si forma il doppio strato lipidico. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53362/53362fig4.jpg" /> Figura 4: tempo reale misurazioni mostrano sia il diradamento iniziale e successiva espansione dell&#39;interfaccia (A) Corrente misurata nel corso della formazione di doppio strato attraverso l&#39;applicazione di un potenziale elettrico triangolare.. L&#39;entità della corrente misurata è direttamente proporzionale alla Capacitanza, e così l&#39;area dell&#39;interfaccia doppio strato. Più le goccioline sono riuniti, maggiore è l&#39;area dell&#39;interfaccia e viceversa. (B) In applicazione di eccitazione meccanica, l&#39;area dell&#39;interfaccia doppio strato aumenta e diminuisce con la stessa frequenza del segnale di stimolazione. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/53362/53362fig5.jpg" /> Figura 5:. Misurazioni in tempo reale mostrano la risposta del doppio strato all&#39;eccitazione meccanica e il gating del mutante V23T di MscL La forma della risposta corrente è sinusoidale, che si riferisce ad una variazione sinusoidale in bistrato capacità come risultato di la modifica dell&#39;area doppio strato. I picchi di corrente, che si verificano al picco di ciascun ciclo, indicano sub-conduttanza gating del mutante V23T. Un diagramma polare indica inoltre che gating verifica a compressione di picco, che riflette un aumento della tensione all&#39;interfaccia doppio strato. Figura 6:. Misure di corrente sotto tensione morsetto e corrispondente istogramma dei livelli di conduttanza per l&#39;attività di controllo dell&#39;immagine canali alameticina incorporati Il comportamento gating del peptide alameticina è mostrato attraverso l&#39;aumento graduale discreta corrente. I livelli di conduttanza abbinano molto bene con le misurazioni precedenti eseguite dal nostro gruppo di ricerca al Virginia Tech 7.

Canali meccanosensibili batteriche possono essere usati come trasduttori mechanoelectrical nei dispositivi biomolecolari. Bistrati interfaccia Droplet (DIB), cellula di ispirazione blocchi di costruzione di tali dispositivi, rappresentano nuove piattaforme per incorporare e stimolare canali meccanosensibili. Qui, dimostriamo un nuovo metodo basato micropipetta-di formare DIB, permettendo lo studio di canali meccanosensibili sotto stimolazione meccanica.

Multifunzionale, Metodo Micropipetta-based per la Costituzione e la stimolazione della batteriche meccanosensibili Ion Canali in Droplet Interface bilayers

MscL, a large conductance mechanosensitive channel (MSC), is a ubiquitous osmolyte release valve that helps bacteria survive abrupt hypo-osmotic shocks. ...

L'obiettivo generale di questa procedura è ricostruire funzionalmente i canali del mezcal in un sistema a doppio strato tramite interfaccia tra gocce e analizzarne la risposta a stimoli meccanici armonici. Questo metodo consente lo studio dell'attività meccano-elettrica del mutante V23T del mescal in risposta a stimolazione meccanica armonica, dopo la sua ricostruzione in un sistema a doppio strato tramite interfaccia tra gocce. Il principale vantaggio di questa tecnica è che sfrutta i vantaggi tecnici sia della tecnica del patch clamp sia dei metodi a doppio strato tramite interfaccia tra gocce, con la possibilità di essere miniaturizzata e di controllare la composizione chimica di ciascun lato della membrana.Per formulare i liposomi, preparare 10 millilitri di una soluzione lipidica di due milligrammi per millilitro aggiungendo 10 millilitri di tampone cloruro di potassio a 20 milligrammi di lipidi sintetici D-P-H-P-C acquistati come polvere liofilizzata. Assicurarsi che i veicoli lipidici e la soluzione tampone siano mescolati completamente. La miscela deve apparire omogenea e torbida quando tutti i componenti sono sciolti.Congelare la miscela a meno 20 gradi Celsius, quindi scongelare completamente la nuova miscela lipidica, lasciandola scongelare a temperatura ambiente e non in un ambiente riscaldato. Dopo un totale di sei cicli di congelamento e scongelamento, utilizzare un estrusore disponibile in commercio per estrudere i lipidi, forzando l'intera sospensione lipidica prima attraverso un filtro in membrana di policarbonato da 0,4 micron e poi sei volte attraverso un filtro in membrana da 0,1 micron. Questo processo produce particelle con diametri vicini a 100 nanometri.Per realizzare il serbatoio dell'olio, praticare due fori opposti attraverso la parete di un cilindro in acrilico di due pollici di diametro e 1,5 centimetri di lunghezza. I fori devono essere di un millimetro di diametro e posizionati a un centimetro dal fondo. Successivamente, praticare due fori di quattro millimetri di diametro concentrici ai fori di un millimetro precedentemente realizzati.La profondità dei fori deve essere di un millimetro ciascuno. Fare attenzione a non forarli completamente da parte a parte. Questi fori sono realizzati per alloggiare le guarnizioni di gomma.Posizionare e incollare due guarnizioni di gomma con diametro interno di un millimetro nei fori più grandi per evitare perdite di olio. Successivamente, incollare la macchina al cilindro su un foglio di acrilico sottile di 10 centimetri per 10 centimetri utilizzando un qualsiasi adesivo epossidico universale nel giorno dell'esperimento, tagliare un tratto di sette centimetri di filo di argento con diametro di 250 micron e immergerne le punte in candeggina per due ore. Per formare un rivestimento di cloruro di argento, un colore grigio indica che si è formato un rivestimento di cloruro di argento.Utilizzando un tagliavetro, dividere una capillare di vetro borosilicato lunga 10 centimetri, con diametro esterno di un millimetro e diametro interno di 0,58 millimetri, in due capillari da cinque centimetri. Utilizzando una siringa da un millilitro con ago a punta smussata da 18 gauge, riempire i capillari con l'idrogel P-E-G-D-M-A per impedire che l'idrogel idratato si espanda fuori dal capillare. Lasciare un'area libera di tre millimetri alle estremità e assicurarsi che non ci siano bolle d'aria all'interno dei capillari.Inserire gli elettrodi in argento, cloruro d'argento nei capillari riempiti di idrogel. Polimerizzare l'idrogel di P-E-G-D-M-A mediante polimerizzazione fotoindotta a radicali liberi esponendo alla luce ultravioletta per due minuti a un watt utilizzando una sorgente UV puntiforme; l'esperimento viene allestito all'interno di una gabbia di Faraday collegata a massa tramite il collegamento a terra dell'amplificatore per registrazione in patch. Collegare una delle micropipette a un supporto dritto per microelettrodi dotato di connettore maschio.Quindi collegare il supporto per microelettrodi allo stadio testa dell'amplificatore per patch. Per collegare lo stadio testa a massa, saldare un filo di rame isolato calibro 18 a un connettore appropriato per lo stadio testa, quindi montare lo stadio testa su un micromanipolatore manuale a tre assi attaccando prima la piastra di montaggio dello stadio testa al micromanipolatore, e poi collegando lo stadio testa alla piastra di montaggio. Utilizzando le viti appropriate, fissare la seconda micropipetta all'attuatore lineare tramite un connettore realizzato in laboratorio, quindi montare entrambi su un secondo micromanipolatore.I micro pipetti devono essere posizionati uno di fronte all'altro, allineati e in livello orizzontale. Successivamente, in un vial di vetro, mescolare 0,1 millilitro di liposomi D-P-H-P-C con 0,01 millilitro di soluzione di liposomi protea V 23 T mescal. Utilizzando un ago microfill da 34 gauge, riempire le estremità di entrambi i micro pipetti con una soluzione di proteosoma.Posizionare il serbatoio sulla parte superiore di un microscopio verticale e far passare le micropipette attraverso i fori opposti di un millimetro. Quindi riempire il serbatoio fino alla superficie con esadecano per formare gocce sferiche alla punta delle micropipette. Utilizzare una terza micropipetta in vetro borosilicato di 10 micron di diametro montata su un terzo micromanipolatore per dispensare una soluzione diluita di protea liposoma V 23 T mescal alla punta delle micropipette e formare le gocce.Controllare la dimensione delle gocce riducendo o aumentando il volume a piacimento e lasciarle riposare per 10 minuti affinché si formino completamente i monocapotti. Successivamente, mettere a contatto le gocce per strato. La formazione avverrà entro uno o due minuti.Dopo aver configurato il software e l'attrezzatura come descritto nel protocollo testuale, utilizzare un cavo BNC per collegare l'uscita di un generatore di forme d'onda all'ingresso del comando esterno dell'interruttore frontale. Inviare un'onda triangolare di 10 hertz e 500 millivolt di picco alla testa dello stadio. Utilizzando il micromanipolatore.Spostare orizzontalmente le micropipette di vetro per portare le gocce a contatto fino a quando si toccano leggermente e attendere che avvenga l'assottigliamento del bilayer. L'avanzamento del processo di formazione del bilayer può essere osservato visivamente al microscopio e monitorato mediante misurazione della corrente. Regolare le dimensioni del bilayer a circa 250 micron di diametro controllando la posizione della goccia montata sull'attuatore tramite il manipolatore; le dimensioni del bilayer possono essere stimate visivamente attraverso il microscopio.Una volta formato e stabilizzato il doppio strato lipidico, stimolare le goccioline inviando un segnale sinusoidale mediante un generatore di funzioni per attivare la proteina mescal incorporata nel doppio strato. Inviare un'onda sinusoidale con un'ampiezza picco-picco di 175 micron, una frequenza di 0,2 hertz e un duty cycle del 50% al controller piezoelettrico. Di seguito è mostrata una registrazione tipica della corrente in tempo reale.La capacità misurata del bilayer aumenta improvvisamente, indicando un assottigliamento del bilayer e la sua formazione, prima di raggiungere uno stato stazionario. Il bilayer può essere controllato modificando la posizione delle gocce quando la DIB viene stimolata meccanicamente, mantenendo costante il potenziale in corrente continua attraverso la membrana. Il mutante V 23 T del mezcal genera attività affidabili, comprendenti principalmente stati subconduttivi e occasionalmente eventi di apertura completa.La gating si verifica principalmente in corrispondenza della compressione massima, indicando che è legata a un aumento della tensione del doppio strato lipidico, come mostrato nel grafico polare. Qui viene evidenziata la capacità di questa tecnica di essere utilizzata per testare altri tipi di biomolecole. Ethin, che è un canale ionico attivato da voltaggio, aumenta la permeabilità della membrana in seguito all'applicazione di un potenziale transmembrana in corrente continua One master.Questa tecnica può essere eseguita in due ore se effettuata correttamente. Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di non rompere accidentalmente le capillari di vetro o altro. È necessario riavviare l'allestimento e assicurarsi che tutti i fili siano collegati dopo il suo sviluppo.Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dei canali attivati dalla trazione, permettendo di esplorare nuovi metodi attraverso cui forze esterne possono essere trasmesse al canale sensibile al meccanismo incorporato nell’interfaccia tra gocce (DIB). Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come formare un’interfaccia tra gocce mediante strati, incorporare canali sensibili alle forze meccaniche nelle membrane artificiali e stimolare meccanicamente questi canali.

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Questo protocollo descrive come utilizzare la microscopia TIRF per tracciare i singoli canali ionici e determinare la loro attività nelle membrane lipidiche supportate, definendo così l'interazione tra il movimento laterale della membrana e la funzione del canale. Descrive come preparare le membrane, registrare i dati e analizzare i risultati.

Imaging a singola molecola della mobilità laterale e dell'attività dei canali ionici in doppi strati lipidici mediante microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale (TIRF)

L'esplorazione del comportamento cellulare sotto stress meccanico è fondamentale per i progressi della meccanica cellulare e della meccanobiologia. Introduciamo la tecnica di aspirazione a fluorescenza con micropipette (fMPA), un nuovo metodo che combina la stimolazione meccanica controllata con l'analisi completa della segnalazione intracellulare nelle singole cellule. Questa tecnica indaga nuovi studi approfonditi sulla meccanobiologia delle cellule vive.

Test di aspirazione con micropipetta a fluorescenza per studiare il meccanorilevamento dei globuli rossi

Viene presentato un protocollo sperimentale per assemblare, stimolare elettricamente e analizzare i bilayer di interfaccia gocce dopate con gramicidina A. Le relazioni struttura-funzione lipido-proteina sono quantificate misurando le variazioni nell'area della membrana, nel flusso ionico e nella conduttanza a canale singolo, e collegando queste risposte a cambiamenti simili alla plasticità nella conduzione ionica in un modello di membrana ispirato alle sinapsi elettriche.

Caratterizzazione della struttura e funzione della membrana lipido-proteina utilizzando i bistrati dell'interfaccia delle gocce

Scopri un metodo micropipetta-based per costituire bilayer interfaccia goccia e stimolare canali meccanosensibili batterici. Questa tecnica combina vantaggi di patch clamp e miniaturizzazione per studiare attività meccanoelettriche.

Multifunzionale, Metodo Micropipetta-based per la Costituzione e la stimolazione della batteriche meccanosensibili Ion Canali in Droplet Interface bilayers (Video) | JoVE Journal

Multifunzionale, Metodo Micropipetta-based per la Costituzione e la stimolazione della batteriche meccanosensibili Ion Canali in Droplet Interface bilayers

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