Multifunzionale, Metodo Micropipetta-based per la Costituzione e la stimolazione della batteriche meccanosensibili Ion Canali in Droplet Interface bilayers

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di ricostituire funzionalmente i canali del mezcal in un'interfaccia a goccioline, in un sistema a doppio strato, e di esaminare la risposta di questi canali meccanosensibili agli stimoli meccanici armonici. Questo metodo consente lo studio dell'attività meccanoelettrica del mutante mescal V 23 T in risposta all'eccitazione meccanica armonica dopo la ricostituzione in un'interfaccia gocciolina per sistema a strati. Il vantaggio principale di questa tecnica è che utilizza i vantaggi tecnici sia della tecnica del patch clamp che dell'interfaccia droplet con metodi a strati con la possibilità di essere miniaturizzati e la capacità di controllare la composizione chimica di ciascun lato della membrana.

Per formulare, liposomi, preparare 10 millilitri di una soluzione lipidica da due milligrammi per millilitro aggiungendo 10 millilitri di tampone cloruro di potassio a 20 milligrammi di lipidi sintetici D-P-H-P-C acquistati come polvere liofilizzata. Assicurarsi che sia i veicoli lipidici che la soluzione tampone siano accuratamente miscelati. La miscela dovrebbe apparire omogenea e nebulosa quando tutto è sciolto.

Congelare la miscela a meno 20 gradi Celsius ora scongelare completamente la nuova miscela lipidica, lasciando scongelare la miscela a temperatura ambiente e non in un ambiente riscaldato. Dopo un totale di sei cicli di congelamento e scongelamento, utilizzare un estrusore disponibile in commercio per estrudere i lipidi forzando l'intera sospensione lipidica prima attraverso un filtro a membrana in policarbonato da 0,4 micron e poi sei volte attraverso un filtro a membrana da 0,1 micron. Questo processo produce particelle con diametri vicini ai 100 nanometri.

Per fabbricare il serbatoio dell'olio, praticare due fori opposti attraverso la parete di un cilindro acrilico di due pollici di diametro e lungo 1,5 centimetri. I fori devono avere un diametro di un millimetro e un centimetro dal fondo. Quindi praticare due fori da quattro millimetri concentrici ai fori da un millimetro precedentemente praticati.

La profondità dei fori dovrebbe essere di un millimetro ciascuno. Fare attenzione a non forarli completamente. Questi fori sono realizzati per adattarsi alle guarnizioni in gomma.

Posizionare e incollare due guarnizioni in gomma con diametro interno di un millimetro nei fori più grandi per evitare perdite di olio. Quindi incollare la macchina al cilindro in un foglio acrilico sottile 10 centimetri per 10 centimetri utilizzando qualsiasi resina epossidica multiuso il giorno dell'esperimento, tagliare una lunghezza di sette centimetri di 2 fili d'argento di 250 micron di diametro e quindi immergere le punte in candeggina per due ore. Per formare un rivestimento di cloruro d'argento, un colore grigio indica che si è formato un rivestimento di cloruro d'argento.

Utilizzando un tagliavetro, dividere un capillare di vetro silicato lungo 10 centimetri di diametro esterno di un millimetro e puntare il diametro interno di 58 millimetri in due capillari di cinque centimetri. Utilizzando una siringa da un millilitro con un ago a punta smussata calibro 18, riempire i capillari con l'idrogel P-E-G-D-M-A per evitare che l'idrogel idratato fuoriesca dal capillare. Mantieni uno spazio libero di tre millimetri sulle punte e assicurati che non ci siano bolle d'aria nei capillari.

Inserire gli elettrodi d'argento e cloruro d'argento nei capillari riempiti di idrogel. Polimerizzare l'idrogel P-E-G-D-M-A attraverso la fotopolimerizzazione dei radicali liberi dopo l'esposizione alla luce ultravioletta per due minuti a un watt utilizzando un punto ultravioletto, l'esperimento è impostato sotto una gabbia di Faraday collegata a terra a una connessione di terra sull'amplificatore patch. Collegare una delle micropipette a un portamicroelettrodo diritto dotato di un connettore maschio.

Quindi collegare il portamicroelettrodo allo stadio principale dell'amplificatore patch. Per collegare lo stadio principale a terra, saldare un filo di rame isolato calibro 18 a un connettore appropriato per lo stadio principale, montare lo stadio principale su un micromanipolatore manuale a tre assi fissando prima la piastra di montaggio dello stadio principale al micromanipolatore, quindi collegando lo stadio principale alla piastra di montaggio. Utilizzando le viti appropriate, collegare la seconda micropipetta all'attuatore lineare tramite un connettore realizzato in laboratorio e quindi montarle entrambe su un secondo manipolatore microm.

Le micropipette devono essere opposte l'una all'altra, allineate e livellate orizzontalmente. Successivamente, in un flaconcino di vetro, mescolare 0,1 millilitri di liposomi D-P-H-P-C con 0,01 millilitri di soluzione di liposomi di protea V 23 T. Utilizzando un ago per microfill da 34 gauge, riempire le punte di entrambe le micropipette con una soluzione di proteosoma.

Posizionare il serbatoio sulla parte superiore di un microscopio verticale e far passare le micropipette attraverso i fori opposti di un millimetro. Quindi riempire il serbatoio fino alla superficie con decano esagonale per formare le goccioline sferiche sulla punta delle micropipette. Utilizzare una terza micropipetta in vetro silicato bo da 10 micron di diametro montata su un terzo manipolatore microm per erogare la soluzione diluita di liposoma di protea V 23 T mescal sulle punte delle micropipette e formare le goccioline.

Controlla la dimensione delle goccioline diminuendo o aumentando il volume a piacere e lasciale riposare per 10 minuti affinché i monostrati si formino completamente. Quindi portare le goccioline a contatto per strato. La formazione avverrà entro uno o due minuti.

Dopo aver configurato il software e l'apparecchiatura come descritto nel protocollo di testo, utilizzare un cavo BNC per collegare l'uscita di un generatore di forme d'onda all'interruttore frontale dell'ingresso del comando esterno. Invia una forma d'onda triangolare tope di picco da 10 hertz, 500 millivolt allo stadio principale. Utilizzando il manipolatore microm.

Muovere le micropipette di vetro orizzontalmente per portare le goccioline a contatto fino a quando non si toccano leggermente e attendere che si verifichi l'assottigliamento del doppio strato. La progressione del processo di formazione del doppio strato può essere vista visivamente attraverso il microscopio e può essere monitorata mediante misurazione della corrente. Regolare la dimensione del doppio strato a circa 250 micron di diametro controllando la posizione della gocciolina montata sull'attuatore utilizzando il manipolatore, la dimensione del doppio strato può essere stimata visivamente attraverso il microscopio.

Una volta che il doppio strato si è formato ed è stabile, stimolare le goccioline inviando un segnale sinusoidale utilizzando un generatore di funzioni per stimolare la proteina mescal incorporata nel doppio strato. Invia una forma d'onda sinusoidale con un'ampiezza picco-picco di 175 micron, una frequenza di 0,2 hertz e un ciclo di lavoro del 50% al controller del server elettrico Pieto. Qui viene mostrata la registrazione atipica della corrente in tempo reale.

La capacità misurata del doppio strato aumenta improvvisamente, indicando l'assottigliamento e la formazione del doppio strato prima che raggiunga uno stato stazionario. Il doppio strato potrebbe essere controllato modificando la posizione delle goccioline quando il DIB viene stimolato meccanicamente, mantenendo un potenziale CC costante attraverso la membrana. Il mutante V 23 T del mezcal genera attività affidabili, tra cui principalmente stati subconduttivi e occasionalmente eventi di apertura completa.

Il gating si verifica principalmente al picco di compressione, indicando che è correlato ad un aumento della tensione del doppio strato, come mostrato nel grafico polare. Qui, viene evidenziata la capacità di questa tecnica di essere utilizzata per testare altri tipi di biomolecole. Ethin, che è un canale ionico voltaggio-dipendente, aumenta la permeabilità della membrana dopo l'applicazione di un potenziale transmembrana CC One master.

Questa tecnica può essere eseguita in due ore se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di non rompere accidentalmente i capillari di vetro o altro. È necessario riavviare la configurazione e assicurarsi che tutti i cavi siano collegati dopo il suo sviluppo.

Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dei canali attivati dall'allungamento per esplorare nuovi metodi attraverso i quali le forze esterne possono essere convogliate al gate dei canali sensibili al meccanismo incorporato DIB. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come formare l'interfaccia delle goccioline a strati, incorporare canali sensibili ai meccano nelle membrane artificiali e stimolare meccanicamente questi canali.