Un metodo semplice per la dimensione sintesi controllata di stabili oligomeriche Grappoli di oro nanoparticelle in condizioni ambientali

L'obiettivo generale di questa procedura è produrre aggregati oligomerici di nanoparticelle d'oro, che siano: altamente stabili, facilmente funzionalizzabili e con diametri ben controllati, ottenuti mediante la riduzione dell'acido cloroaurico con tiocianato di sodio. Le particelle che abbiamo esaminato oggi sono particelle interessanti perché le loro dimensioni sono estremamente controllate e, di conseguenza, possono essere utilizzate per studiare la permeabilità delle membrane a particelle di dimensioni diverse. Poiché sono molto stabili in soluzioni biologiche, questa è una proprietà molto importante delle particelle.

Il vantaggio principale di questo metodo è che consente una sintesi ben controllata di oligocluster di oro ad alta qualità in condizioni da banco, ed è facilmente eseguibile utilizzando attrezzature di laboratorio standard e un numero limitato di reagenti. Dopo aver preparato tutte le soluzioni necessarie come indicato nel protocollo testuale, iniziare la sintesi con tempo di ritardo degli oligocluster di oro aggiungendo 7 millilitri della soluzione di borace in una bottiglia di vetro pulita da 125 millilitri contenente 59,5 millilitri di acqua sotto agitazione. Successivamente, aggiungere 2,8 millilitri della soluzione di cloruro d'oro alla bottiglia, avviando così il tempo di ritardo che determina la dimensione degli oligocluster.

Aggiungere 700 microlitri di soluzione di tiocianato di sodio al flacone al termine del periodo di attesa. Continuare a mescolare per tutta la notte per completare la sintesi degli oligocluster. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante aggiungere rapidamente cloruro d'oro e soluzione di tiocianato di sodio a tutti i reagenti in volumi maggiori di questa soluzione, utilizzando dispenser a bocca larga.

Per la crescita aggiuntiva, combinare 10 millilitri degli oligocluster d'oro con 60 millilitri della soluzione di cloruro d'oro idrossilata. Successivamente, aggiungere 900 microlitri della soluzione di tiocianato di sodio con agitazione vigorosa. Lasciare agitare la miscela per tutta la notte, fino al completamento della reazione.

Prima della derivatizzazione, aggiungere 70 millilitri degli oligocluster grezzi a un filtro centrifugo con cutoff di 30 chilodalton e centrifugare per 15 minuti a 3.000 ×g. Recuperare il concentrato ribaltando il filtro e centrifugando per 3 minuti a 500 ×g. Quindi, misurare il volume recuperato con una micropipetta.

Successivamente, aggiungere un volume di GSH pari a un nono del volume recuperato degli oligocluster. Lasciare la reazione a temperatura ambiente per non più di 10 minuti. Diluire gli oligocluster derivatizzati in 50 millilitri di soluzione salina tamponata al fosfato di Dulbecco per arrestare la reazione.

Successivamente, applicare gli oligocluster derivatizzati su un filtro centrifugo con soglia di taglio di 30 chilodalton e centrifugare per 15 minuti a 3.000 ×g. Infine, recuperare il nastro di retinina capovolgendo il filtro e centrifugando per tre minuti a 500 ×g. Conservare gli oligocluster derivatizzati con glutathione a quattro gradi Celsius.

Per analizzare i crudi oligocluster mediante elettroforesi su gel, mescolarli in un rapporto di due a uno con il buffer di caricamento. Successivamente, caricare 30 microlitri degli oligocluster su un gel preformato al gradiente di poliacrilamide. Eseguire l'elettroforesi con buffer tris-glicina per 26 minuti a 200 volt.

Per l'elettroforesi su gel di oligocluster derivatizzati, diluirli prima in rapporto uno a tre con acqua. Successivamente, diluire ulteriormente i cluster in rapporto due a uno con buffer di caricamento. Caricare 10 microlitri della miscela di oligocluster su un gel preformato al gradiente di poliacrilamide e far correre il gel con buffer tris-glicina per 26 minuti a 200 volt.

Per analizzare mediante microscopia elettronica a trasmissione, lavare 20 microlitri di oligocluster concentrati con 0,5 millilitri di acqua e caricarli su un filtro centrifugo da 0,5 millilitri con soglia di taglio di 30 chilodalton. Centrifugare a 14.000 ×g per 10 minuti. Successivamente, rimuovere il filtrato dal tubo e risospendere il pellet in 0,5 millilitri di acqua.

Ripetere il lavaggio altre due volte, quindi diluire gli oligocluster di 500 volte con acqua. Dopo aver effettuato la scarica a luce fioca sulla griglia rivestita di carbonio, depositare 0,6 microlitri degli oligocluster sulla griglia e lasciarli asciugare all'aria per 10 minuti. Infine, visualizzare gli oligocluster utilizzando un ingrandimento di 100.000 x a 80 chilovolt nel microscopio elettronico a trasmissione.

La dimensione degli oligocluster d'oro, sintetizzati utilizzando le procedure di ritardo e di aggiunta, è stata analizzata mediante elettroforesi su gel. Le corsie da due a quattro del gel hanno mostrato che la dimensione dei cluster aumenta all'aumentare del tempo di ritardo. Le corsie da cinque a otto confermano che la dimensione dei cluster aumenta anche con la quantità di oro idrossilato utilizzata durante la procedura di aggiunta.

La microscopia elettronica a trasmissione è stata utilizzata per determinare i diametri delle particelle oligocluster. I diametri sono stati calcolati effettuando misurazioni su immagini di aree a griglia di 50 nanometri per 50 nanometri contenenti le particelle. È stato riportato graficamente il rapporto tra il tempo di ritardo legato alle dimensioni delle particelle e le quantità aggiunte di oro idrossilato.

Questi dati sono stati quindi convertiti in equazioni predittive per i diametri delle particelle per ciascuna procedura. Il metodo di preparazione degli aggregati di oro, ne sono certo avete discusso, dipende dall'idrossilazione del cloruro d'oro in soluzione alcalina. Pertanto, maggiore è l'idrossilazione, minore è la probabilità di generare un aggregato di oro.

Il mio nuovo libro qui è il primo che mi interessa, perché è la prima volta che mi rendo conto che l'elemento tempo dell'esposizione all'ambiente alcalino può essere utilizzato per controllare le dimensioni degli aggregati. Quando viene eseguita correttamente, la sintesi di aggregati di oro di dimensioni comprese tra 3 e 70 nanometri può essere completata in meno di un giorno. Le nanoparticelle ottenute sono stabili in tamponi fisiologici e nel plasma, rendendole adatte per esperimenti in vitro.

Gli oligocluster d'oro descritti in questo studio presentano il vantaggio aggiuntivo di poter essere concentrati senza una pregressa derivatizzazione, consentendo così l'uso degli agenti di radicazione in volumi più ridotti.